CN117771237B - 一种松香烷型二萜化合物的用途和制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于中药提取分离、天然药物化学及医药技术领域,具体涉及一种松香烷型二萜化合物的用途和制备方法,用于制备缓解和/或治疗抗肿瘤的药物,所述松香烷型二萜化合物的化学结构式如下:;本发明化合物对U251MG细胞具有增殖抑制作用,其IC50值低至13.88μM,该化合物相比现有技术公开的松香烷型二萜化合物具有更加明显的抗胶质瘤活性,可用于制备治疗或缓解胶质瘤的药物。
Description
技术领域
本发明属于中药提取分离、天然药物化学及医药技术领域,具体涉及一种松香烷型二萜化合物的用途和制备方法。
背景技术
龙骨马尾杉是石杉科的中型附生蕨类植物,药用价值高,也具有一定的观赏性和经济价值。传统中医学中,龙骨马尾杉干燥的全草常用以祛风除湿、消肿止痛和舒筋活络。
现代研究发现,龙骨马尾杉主要含生物碱类、萜类等有效成分。其中,高度氧化的萜类具有细胞毒性、抗微生物和抗炎等多种生物活性。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种松香烷型二萜化合物的用途和制备方法,提高其抗肿瘤的效果,特别是抗胶质瘤活性。
本发明实施例提供一种松香烷型二萜化合物,化学结构式如下:
。
其分子式为C20H28O4。
本发明实施例提供一种所述的松香烷型二萜化合物的制备方法,包括以下步骤:
1)龙骨马尾杉进行乙醇回流提取,减压旋蒸浓缩,得到粗提物;
2)所述粗提物加水稀释,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯萃取液,减压浓缩,得浓缩物;
3)所述浓缩物经硅胶柱层析分离,用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,合并后得到28个馏分,编号Fr.A1-A28;
4)其中一个(编号Fr.A3)馏分进行纯化分离,得到松香烷型二萜化合物。
作为一种实施例,所述龙骨马尾杉粉碎为100目粗粉。
作为一种实施例,步骤1)中,乙醇体积浓度为75%,用量为龙骨马尾杉重量的10倍。
作为一种实施例,步骤1)中,所述减压旋蒸浓缩的温度为55-65 ℃。
作为一种实施例,步骤2)中,减压浓缩的温度为40℃。
作为一种实施例,步骤3)中,梯度洗脱所用石油醚和乙酸乙酯的体积比为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40。
作为一种实施例,步骤4)中纯化分离采用的流动相乙腈-水的体积比从62:35梯度调整至95:5,时间为35min,体积流量为3mL/min。
本发明实施例提供一种松香烷型二萜化合物的用途,用于制备缓解和/或治疗抗肿瘤的药物,所述松香烷型二萜化合物的化学结构式如下:。优选的,所述肿瘤为胶质瘤。
本发明的有益效果如下:
1、本发明从龙骨马尾杉中提取分离得到了一个结构新颖的松香烷型二萜化合物,并根据波谱和光谱数据确定了其分子结构。
2、本发明提供了一种以龙骨马尾杉为原料,通过乙醇回流提取、减压旋蒸、萃取、色谱层析等步骤提取分离该松香烷型二萜化合物的方法,所述方法简便、工艺参数简单易控,适于工业化生产。
3、本发明所述松香烷型二萜化合物在体外生物活性实验中显示出对人胶质瘤有较好的抗增殖活性,在制备缓解和/或治疗胶质瘤的药物中具有广阔的应用前景。
本发明的松香烷型二萜化合物明显不同于常规的松香烷二萜化合物,其中间环为含有氧的六元杂环,而不是纯粹的碳环,其以氧元素替代了碳元素,杂环上含有羰基,苯环上含有异丙基和甲氧基,活性研究发现,本发明化合物对U251MG细胞具有增殖抑制作用,其IC50值低至13.88 μM,该化合物相比现有技术公开的松香烷型二萜化合物具有更加明显的抗胶质瘤活性,可用于制备治疗或缓解胶质瘤的药物。
附图说明
图1为本发明松香烷型二萜化合物结构图。
图2为本发明松香烷型二萜化合物高分辨质谱(HRESIMS)图。
图3为本发明松香烷型二萜化合物紫外(UV)光谱图。
图4为本发明松香烷型二萜化合物红外(IR)光谱图。
图5为本发明松香烷型二萜化合物核磁氢谱(1H-NMR)图。
图6本发明松香烷型二萜化合物核磁碳谱(13C-NMR)图。
图7为本发明松香烷型二萜化合物核磁DEPT 135谱图。
图8为本发明松香烷型二萜化合物核磁1H–1H COSY谱图。
图9为本发明松香烷型二萜化合物核磁NOESY谱图。
图10为本发明松香烷型二萜化合物核磁HSQC谱图。
图11为本发明松香烷型二萜化合物核磁HMBC谱图。
图12为本发明松香烷型二萜化合物核磁1H–1H COSY和HMBC谱图的解析。
图13为本发明松香烷型二萜化合物实验ECD曲线图。
图14为本发明松香烷型二萜化合物实验和计算ECD曲线图。
图15为本发明松香烷型二萜化合物处理后的U251MG细胞形态图。
具体实施方式
下面结合本申请具体的实施例,对本发明的技术方案做进一步的描述,以更好地理解本发明,但本发明的保护范围并不仅限于该实施例,基于本发明所做的修改和润饰均应在保护范围内。下述实施例中所述实验方法,如无特殊说明,均为技术领域内的常规方法。
以下实施例中采用的设备包括:安捷伦1260型高效液相色谱仪、上海仪电SGW-533型旋光仪、耶拿 SPECPRD PLUS-50型紫外分光光度计、Waters Xevo G2-XS TOF型高分辨质谱仪、赛默飞Nicolet iS5型红外光谱仪、JASCO J-1500型圆二色光谱仪、Bruker AV-400MHz型核磁共振仪等。
所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。
实施例1
松香烷型二萜化合物的提取分离:
1、取干燥的龙骨马尾杉全草13.8 kg,粉碎成100目左右粗粉,加入10倍重量的体积浓度75 %乙醇,回流提取3次,提取液在60 ℃下减压浓缩得到粗提物1.4 kg;所得粗提物中加入适量去离子水混悬,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,乙酸乙酯萃取液在40 ℃下减压浓缩,得到浓缩物405.5 g。
2、取上述乙酸乙酯浓缩物经硅胶柱层析分离,用石油醚-乙酸乙酯(体积比100:0、90:10、80:20、70:30、60:40)梯度洗脱,各梯度3个柱体积,每500 mL收集一份洗脱液共97份。各份洗脱液经HPLC检视后合并相同组分,得到28份馏分,编号Fr.A1-A28。
3、取上述Fr.A3馏分,以乙腈-水(体积比62:35→95:5,运行时间35 min,洗脱流量3 mL/min)为流动相,采用半制备HPLC进行分离(目标化合物 t R = 27.3 min),得到一种新的松香烷型二萜化合物(1.9 mg,纯度99.1%)。
实施例2
松香烷型二萜化合物的结构解析与鉴定:
本发明实施例1所得松香烷型二萜化合物,其为深黄色油状,微溶于水,易溶于DMSO;; />; :3421, 2928, 2870, 1760, 1436, 1356, 1215, 1104, 1007, 960,; />:/>,/>;,结合碳谱和氢谱数据(表1)确定其分子式为/>。
红外光谱显示了1个羟基和1个酯羰基/>的特征吸收峰。
1H-NMR谱数据显示了1个甲氧基信号:δ H 3.78 (3H, s, OCH3-12);5个甲基信号:δ H 1.29 (3H, d, J = 7.1 Hz, CH3-16), 1.31 (3H, 重叠信号, CH3-17), 1.18 (3H, s,CH3-18), 1.31 (3H, 重叠信号, CH3-19), 和1.23 (3H, s, CH3-20)。
13C-NMR谱和DEPT谱数据显示了20个碳信号,包括1个甲氧基碳信号,5个甲基碳信号/>,3个亚甲基碳信号/>, 36.2, 42.3,3个次甲基碳信号/>, 55.1, 96.6,1个酯羰基信号/>,7个季碳信号/>,36.9, 121.8, 132.0, 133.7, 142.3, 154.8。
1H–1H COSY谱显示存在2个离散的自旋系统:和。
NOESY谱中,H3-19与H3-20相关,H-5与H3-18相关。
HMBC谱中,与/>相关,/> 与/>相关,/>与/>、C-13/>、/>相关,与/>、C-13和C-14相关,推测为典型的松香烷型二萜化合物信号;/>与C-8、C-10、C-13相关,进一步推测为6,7-开环松香烷二萜类化合物;此外,/> 与 /> 、C-9相关,结合C-5和C-8信号的异常向上位移,表明C-5和C-8之间的“内酯环”连接。上述推测得到了HRESIMS数据的支持。
从生物合成角度看,A环和B环为反式并环,H-5为α取向,CH3-20为β取向;将实验和计算ECD曲线进行拟合,确证了该化合物的绝对构型为(5S, 10S)。
该松香烷型二萜化合物的结构式如图1;HRESIMS质谱图如图2;UV光谱图如图3;IR光谱图如图4;1H-NMR、13C-NMR、DEPT 135、1H–1H COSY、NOESY、HSQC、HMBC谱图和NOESY及HMBC谱图解析分别见图5-图12,实验ECD曲线见图13,实验和计算ECD曲线见图14,上述图谱确证了该化合物结构。
该化合物松香烷型二萜化合物的1H-NMR和13C-NMR数据整理见表1(表中“a”指重叠信号):
表 1松香烷型二萜化合物的1H-NMR和13C-NMR数据
实施例3
松香烷型二萜化合物体外抗胶质瘤活性分析
1、试验药物:阴性对照药DMSO;阳性对照药:替莫唑胺;待测药物:本发明松香烷型二萜化合物。
2、试验用细胞株:U251MG(人源性胶质瘤细胞)。
3、试验方法
采用CCK-8法测试本发明松香烷型二萜化合物对胶质瘤细胞的抗增殖活性。因胶质瘤是一种实体瘤,为了模拟体内的生理微环境,开展二维(2D)和三维(3D)细胞培养模型进行细胞活力实验。
(1)2D细胞模型:取对数生长期的U251MG细胞,胰酶消化后分散成细胞悬液,计数并调整浓度,以每孔5000个细胞接种于96孔细胞培养板。细胞贴壁后,用不同浓度试验药物处理72 h,每孔加入10 μL CCK-8试剂,37℃下孵育1小时后,用Tecan spark多功能酶标仪测定450 nm处吸光度。按照如下公式计算肿瘤细胞增殖抑制率(%)=[1-(试验孔吸光度-空白孔吸光度)/(对照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%,试验孔设置有本申请的松香烷型二萜化合物,空白孔设置有阴性对照药DMSO,对照孔设置有阳性对照药,以药物浓度对抑制率作图绘制剂量反应曲线,计算药物半数抑制浓度(IC50)。
(2)3D细胞模型:取对数生长期的U251MG细胞,胰酶消化后分散成细胞悬液,计数并调整浓度,以每孔5000个细胞接种于接种于低吸附U型底96孔板,用不同浓度试验药物处理72h。期间,于24小时、48小时和72小时分别使用显微镜观察并记录细胞状态。
4、实验结果
(1)2D细胞模型
试验药物对U251MG细胞增殖抑制作用如下表:
表 2 松香烷型二萜化合物对U251MG的抑制作用
结果显示,本发明化合物对胶质瘤细胞有明显的抑制作用,且该化合物IC50值低于阳性对照药,提示对胶质瘤细胞增殖抑制效果更强,呈现出一定的抗胶质瘤活性。
(2)3D细胞模型
3D细胞模型结果如图15所示,结果显示:24小时后,对照组的细胞聚集成球状,20μM本发明化合物处理组的细胞球明显小于对照组,而50 μM药物组的细胞则无法形成球状。48小时后,对照组细胞聚集成的球变得更加紧密,而20 μM药物组的细胞变得松散,无法保持球状,50 μM药物组的情况与之前一样,细胞未形成球状。
2D和3D细胞模型的药物分析结果提示,本发明松香烷型二萜化合物对U251MG细胞增殖有显著抑制活性,呈现出一定抗胶质瘤活性,为进一步的临床药物开发奠定了坚实的基础。
综上所述,本发明提供的松香烷型二萜化合物具有新颖的结构,且本发明提供的从龙骨马尾杉中提取分离该化合物的方法简便易行,便于产业化;研究发现,该化合物呈现出突出的抗胶质瘤细胞增殖活性,有望成为潜在的抗胶质瘤先导化合物。
所属领域的普通技术人员应当理解:以上任何实施例的讨论仅为示例性的,并非旨在暗示本申请的保护范围限于这些例子;在本申请的思路下,以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合,步骤可以以任意顺序实现,并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化,为了简明它们没有在细节中提供。
本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入本申请的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此,凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内,所做的任何省略、修改、等同替换、改进等,均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (8)
1.一种松香烷型二萜化合物的用途,其特征是,用于制备缓解和/或治疗抗肿瘤的药物,所述松香烷型二萜化合物的化学结构式如下:
;
所述肿瘤为胶质瘤。
2.一种松香烷型二萜化合物的制备方法,其特征是,包括以下步骤:
1)龙骨马尾杉进行乙醇回流提取,减压旋蒸浓缩,得到粗提物;
2)所述粗提物加水稀释,依次用石油醚、乙酸乙酯萃取,得到乙酸乙酯萃取液,减压浓缩,得浓缩物;
3)所述浓缩物经硅胶柱层析分离,用石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱,合并后得到28个馏分;
4)其中一个馏分进行纯化分离,得到松香烷型二萜化合物;所述松香烷型二萜化合物的化学结构式如下:
。
3.如权利要求2所述的松香烷型二萜化合物的制备方法,其特征是,所述龙骨马尾杉粉碎为100目粗粉。
4.如权利要求2所述的松香烷型二萜化合物的制备方法,其特征是,步骤1)中,乙醇体积浓度为75%,用量为龙骨马尾杉重量的10倍。
5. 如权利要求2所述的松香烷型二萜化合物的制备方法,其特征是,步骤1)中,所述减压旋蒸浓缩的温度为55-65 ℃。
6.如权利要求2所述的松香烷型二萜化合物的制备方法,其特征是,步骤2)中,减压浓缩的温度为40℃。
7.如权利要求2所述的松香烷型二萜化合物的制备方法,其特征是,步骤3)中,梯度洗脱所用石油醚和乙酸乙酯的体积比为100:0、90:10、80:20、70:30、60:40。
8. 如权利要求2所述的松香烷型二萜化合物的制备方法,其特征是,步骤4)中纯化分离采用的流动相乙腈-水的体积比从62:35梯度调整至95:5,时间为35 min,体积流量为3mL/min。
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Abietane diterpenoids from Phlegmariurus carinatus and their biological activities;Jia-Wei Hu et al;《Phytochemistry》;20220928;第204卷;第1-12页 * |
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