CN114805383B - 一种从老鹰茶中提取二聚呋喃酮类化合物的方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了化学领域分离提取技术中从老鹰茶中提取分离一种新骨架结构二聚呋喃酮类成分的方法，包括回流提取，溶剂萃取，中压硅胶柱层析，MCI柱层析以及半制备高效液相分离，最终得到该二聚呋喃酮类化合物，MTT活性测试显示该化合物对人结肠癌细胞HCT‑116，人舌鳞癌细胞OSC‑19以及人胰腺癌细胞SW1990均具有显著的细胞毒作用，其IC50分别为7.436、10.88、9.476μM，可用于制备新型潜在抗癌药物。

Description

一种从老鹰茶中提取二聚呋喃酮类化合物的方法及其应用
技术领域
本发明属于分离提取技术领域，特别涉及一种从老鹰茶中提取二聚呋喃酮类化合物的方法及其应用。
背景技术
老鹰茶樟科木姜子属植物毛豹皮樟(Litsea coreana Lévl.var.lanuginosa(Migo)Yang et P.H.Huang)的嫩梢与叶，为一种药食同源草本茶，广泛分布于贵州、云南、四川等地，并且在贵州习水、务川、息烽、湄潭和开阳等地的偏远山村居民还保留老鹰茶饮用的习惯。老鹰茶具有樟科植物芳香味，有明目消暑解渴和消食去胀之功效。现代药理学研究表明老鹰茶具有抗氧化、降糖、降脂、抗炎、抗菌、抗病毒、抗肿瘤等药理活性，具有较大的开发和应用前景。
现如今对于老鹰茶中化学成分研究，报道了黄酮类、多酚类、香豆素、木脂素、挥发油、多糖等化合物，或如中国专利CN113666894 A提到的一种呋喃酮类化合物及其从老鹰茶中提取分离的方法与应用，但是未曾有二聚呋喃酮类化合物的相关报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种老鹰茶中新骨架结构二聚呋喃酮类化合物的提取分离方法。
本方案中的一种二聚呋喃酮类化合物，其化学结构通式为：
提取、分离方法如下：
1)取老鹰茶地上部分，经干燥、粉碎后，用一定浓度的甲醇回流提取得提取液，减压浓缩得到甲醇浸膏；
2)将1)中所得甲醇浸膏分散于水后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到各部位浸膏；
3)将2)中乙酸乙酯部位浸膏通过中压柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以9:1、4:1、3:2、2:3、1:4和1:0体积比进行梯度洗脱，得6个组分；
4)将3)中的石油醚:乙酸乙酯＝3:2部分利用HPLC进行分析，再次利用中压柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以9:1、4:1、3:2、2:3、1:4和1:0体积比进行梯度洗脱，分为5个亚组分；
5)将4)中得到的第2或第3亚组分利用MCI拌样，去除色素，再次用石油醚-乙酸乙酯以9:1、4:1、3:2、2:3、1:4和1:0体积比进行梯度洗脱，得到10个亚组分；
6)将5)中得到的第8或第10亚组分通过制备HPLC分离，检测波长210～280nm，流速2.0～20mL/min，用浓度90％～100％的甲醇梯度洗脱，得到20个亚组分。
7)将6)中得到的第13亚组分通过制备HPLC分离，检测波长210～280nm，流速2.0～20mL/min，用浓度80％～90％的甲醇等度洗脱，得到该二聚呋喃酮类化合物。
本发明首次从老鹰茶中提取到具有抗癌活性的二聚呋喃酮类成分，并且提供的制备方法，工艺简单，分离方法可控性和重现性好，成本低，操作简单。
结构鉴定：利用的光谱技术，主要包括核磁共振谱(1H-NMR、13C-NMR、NOESY、HSQC、DEPT135、HMBC)和质谱分析(HR-ESI-MS)鉴定化合物的结构。
该化合物为黄色油状物，通过高分辨质谱HR-ESIMS推导出化合物的分子式为C30H48O6(测量值为m/z 505.3509[M+H]+,计算值为505.3451；测量值为m/z 503.3213[M-H]-,计算值为503.3451)，通过核磁技术，确定该化合物为新骨架类型二聚呋喃酮类化合物，并命名为老鹰茶素C。
表1：化合物的核磁数据(600/150MHz，CDCl3)
进一步，所述6)中检测波长230nm，流速20m L/min。进一步，所述6)中检测波长230nm，流速4.0m L/min。进一步，所述7)中使用浓度89％甲醇等度洗脱。
进一步，所述7)中色谱柱用C18，5μm，10mm×250mm。进一步，所述1)中甲醇浓度为90％。
通过上述方法提取得到的二聚呋喃酮类化合物具有抗癌活性，尤其是抗结肠癌、胰腺癌以及舌鳞癌均具有显著的活性，所述的二聚呋喃酮类化合物具有制备抗结肠癌、胰腺癌以及舌鳞癌药物中的应用前景。
附图说明
图1为本发明二聚呋喃酮类化合物的结构图；
图2为本发明二聚呋喃酮类化合物的质谱图；
图3为本发明二聚呋喃酮类化合物的1H-NMR图；
图4为本发明二聚呋喃酮类化合物的13C-NMR图；
图5为本发明二聚呋喃酮类化合物的DEPT135图；
图6为本发明二聚呋喃酮类化合物的HSQC图；
图7为本发明二聚呋喃酮类化合物的HMBC图；
图8为本发明二聚呋喃酮类化合物的1H-1H NOESY图；
图9为本发明二聚呋喃酮类化合物对HCT-116、OSC-19和SW1990细胞毒作用。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
本发明的二聚呋喃酮类化合物的化学结构通式为：
实施例1：
从老鹰茶中提取分离上述二聚呋喃酮类化合物的方法，包括以下：
1)取毛豹皮樟来源的老鹰茶树叶17.81kg，经干燥、粉碎后，用90％甲醇回流提取3次，每次提取3～4h，提取液进行减压浓缩得到甲醇浸膏2020g；
2)将1)中甲醇浸膏分散于水后，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取3次，每个萃取部分减压浓缩得到各部位浸膏，其中得到乙酸乙酯浸膏889g；
3)将2)中乙酸乙酯部位浸膏通过硅胶中压柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以体积比9:1、4:1、3:2、2:3、1:4、1:0梯度洗脱，分为6个组分，编号为Fr.1～Fr.6；
4)将3)中第3个组分Fr.3(即石油醚:乙酸乙酯＝3:2部分)利用HPLC进行分析，然后通过硅胶中压柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以体积比9:1、4:1、3:2、2:3、1:4、1:0梯度洗脱，分为5个亚组分Fr.5.1～Fr.5.5；
5)将4)中得到的第Fr.5.2亚组分利用MCI拌样，去除色素，再次分离，得到10个亚组分Fr.5.2.1～Fr.5.2.10；
6)将5)中得到的第Fr.5.2.10亚组分通过制备HPLC分离，用浓度90％～100％甲醇梯度洗脱，色谱柱用C18，10μm，10mm×250mm，检测波长230nm，流速20mL/min洗脱，得到了20个亚组分Fr.5.2.10.1～Fr.5.2.10.20；
7)将6)中得到的的第Fr.5.2.10.13亚组分通过制备HPLC分离，用浓度89％甲醇梯度洗脱，色谱柱用C18，5μm，10mm×250mm，检测波长230nm，流速4mL/min洗脱，得到该二聚呋喃酮类化合物。
实施案例2：MTT法检测所述二聚呋喃酮类化合物对HCT-116、SW1990和OSC-19细胞株细胞毒作用：
选取对数生长期的HCT-116、SW1990和OSC-19细胞，用含10％胎牛血清培养液调节细胞浓度为3×104个/mL，以每孔100μL，接种到96孔平底细胞培养板，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h后，加入100μL样品，样品的浓度分别为1、5、20、40、80μM，设5个复孔。在37℃，5％，CO2培养箱中继续培养48h。然后每孔加入20μLMTT溶液(5mg/mL)继续培养3h，弃去上清液。最后，每孔加入150μLDMSO，低速振荡20min使结晶物充分溶解，在490nm波长处检测吸光值，并计算细胞存活率，细胞存活率＝实验组吸光度值/对照组吸光度值×100％。单因素方差分析各药物处理组与对照组的统计学差异性。结果显示二聚呋喃酮类化合物具有极好的抗肿瘤活性(***代表P<0.001，具有显著统计学差异性)，且呈浓度梯度依赖性。经GraphPadPrism 8软件计算，二聚呋喃酮类化合物对HCT-116、SW1990和OSC-19细胞株的IC50值分别为7.436、10.88、9.476μM，实验结果见图9。

Claims (7)

1.一种从老鹰茶中提取二聚呋喃酮类化合物的方法，其特征在于，所述二聚呋喃酮类化合物的结构式为：
提取、分离方法如下：
1)取老鹰茶地上部分，经干燥、粉碎后，用一定浓度的甲醇回流提取得提取液，减压浓缩得到甲醇浸膏；
2)将1)中所得甲醇浸膏分散于水后，依次用石油醚和乙酸乙酯萃取，减压浓缩得到各部位浸膏；
3)将2)中乙酸乙酯部位浸膏通过中压柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以9:1、4:1、3:2、2:3、1:4和1:0体积比进行梯度洗脱，得6个组分；
4)将3)中的石油醚:乙酸乙酯＝3:2部分利用HPLC进行分析，再次利用中压柱色谱分离，用石油醚-乙酸乙酯以9:1、4:1、3:2、2:3、1:4和1:0体积比进行梯度洗脱，分为5个亚组分；
5)将4)中得到的第2亚组分利用MCI拌样，去除色素，再次用石油醚-乙酸乙酯以9:1、4:1、3:2、2:3、1:4和1:0体积比进行梯度洗脱，得到10个亚组分；
6)将5)中得到的第10亚组分通过制备HPLC分离，检测波长210～280nm，流速2.0～20mL/min，用浓度90％～100％的甲醇梯度洗脱，得到20个亚组分；
7)将6)中得到的第13亚组分通过制备HPLC分离，检测波长210～280nm，流速2.0～20mL/min，用浓度89％的甲醇等度洗脱，得到该二聚呋喃酮类化合物。
2.根据权利要求1所述的一种从老鹰茶中提取二聚呋喃酮类化合物的方法，其特征在于：所述6)中检测波长230nm，流速20m L/min。
3.根据权利要求2所述的一种从老鹰茶中提取二聚呋喃酮类化合物的方法，其特征在于：所述6)中检测波长230nm，流速4.0m L/min。
4.根据权利要求3所述的一种从老鹰茶中提取二聚呋喃酮类化合物的方法，其特征在于：所述7)中色谱柱用C18，5μm，10mm×250mm。
5.根据权利要求4所述的一种从老鹰茶中提取二聚呋喃酮类化合物的方法，其特征在于：所述1)中甲醇浓度为90％。
6.根据权利要求1～5任一项所述提取方法提取的二聚呋喃酮类化合物在制备抗癌药物中的应用，所述二聚呋喃酮类化合物在的结构式为：
7.根据权利要求1～5任一项所述提取方法提取的二聚呋喃酮类化合物在制备抗结肠癌、胰腺癌以及舌鳞癌药物中的应用，所述二聚呋喃酮类化合物在的结构式为：
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CN108707133A (zh) * 2018-08-08 2018-10-26 遵义医学院 一种木脂素类化合物及其从老鹰茶中提取分离的方法与应用
CN113666894A (zh) * 2021-08-23 2021-11-19 遵义医科大学 一种从老鹰茶中提取分离呋喃酮类化合物的方法及其应用

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A review on phytochemical and pharmacological properties of Litsea coreana;Xuejing Jia等;《HARMACEUTICAL BIOLOGY》;第55卷(第1期);1368–1374 *

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