CN115160337B - 1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

1α‑烷基瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法和应用，属于医药技术领域，具体涉及从瑞香科狼毒属植物瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)中，通过硅胶柱色谱、大孔树脂、ODS柱色谱、HPLC等色谱方法分离得到的三个新的1α‑烷基瑞香烷型二萜二萜类化合物stelleradaphnane A‑C。并测试其对HepG2和Hep3B细胞的抑制活性。最终发现上述化合物通过诱导HepG2和Hep3B细胞的凋亡而发挥抗肝癌活性。本发明制备方法简单，重现性好，所得化合物纯度高，其中有些化合物具有明显的抗肝癌活性。

Description

1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及从瑞香狼毒根中分离的3个新的1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物及其在抗肝癌活性方面的用途。

背景技术

瑞香狼毒，为瑞香科狼毒属有毒多茎多年生草本植物，广泛分布于中国、蒙古、俄罗斯等亚洲地区，常用于治疗疥疮、癣和肺结核，具有良好的镇痛、抗炎、细胞毒活性和伤口愈合活性。瑞香狼毒根中化学成分丰富，包括瑞香烷型二萜、双黄酮类、香豆素类和木脂素类等，其中以瑞香烷型二萜最为少见，而2’位带有羟基的1α-烷基瑞香烷型二萜的报道则更为罕见。

发明内容

本发明的目的是提供一系列从瑞香狼毒根中分离的1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物及其制备方法，以及它们在抗肿瘤药物中的应用。

本发明所述1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物结构如下：

本发明所述1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：

瑞香狼毒根用乙醇提取，提取液减压浓缩，合并提取液浓缩得浸膏，浸膏依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将乙酸乙酯萃取物继而使用硅胶柱色谱、HP-20大孔树脂、ODS、HPLC等多种色谱手段，最终分离得到以上3个新化合物。

具体操作如下：

(1)取干燥的瑞香狼毒根以乙醇提取，合并提取液浓缩得到浸膏，所得浸膏先后采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，共收集到6个馏分A-F；

(2)馏分B经HP-20柱色谱，以乙醇-水梯度洗脱，共收集到5个馏分，又将这些馏分经PR-18硅胶柱，同样使用乙醇-水梯度洗脱，共获得7个馏分B1-B7；

(3)馏分B6经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱；

(4)将洗脱后得到的馏分经半制备HPLC，并通过浓度为75％的乙腈-水系统进一步纯化得到上述3种化合物。

其中：

步骤(1)中，二氯甲烷-甲醇的梯度为：1:0-0:1。所述乙醇为浓度为70％-80％的工业乙醇，回流提取3-4次，每次2-3小时。

步骤(2)中，乙醇-水的梯度为：1:9-9:1。

步骤(3)中，二氯甲烷-甲醇的梯度为：50:1-1:1。

所述的新的1α-烷基瑞香烷型二萜化合物(stelleradaphnane A-C)的结构解析。

化合物1:白色片状固体(甲醇)。易溶于甲醇、二氯甲烷等试剂。5％香草醛硫酸显灰色；HRESIMS给出准分子离子峰[M+H]⁺m/z 713.3533(calcd for C₃₉H₅₃O₁₂,713.3532),结合¹H-NMR，¹³C-NMR和HSQC谱图可以确定该化合物的分子式为C₃₉H₅₂O₁₂，计算不饱和度为13，并对¹H-NMR，¹³C-NMR信号进行了归属，同时通过HMBC谱对平面结构进行了确定，最终将该化合物确定为一个1α-烷基瑞香烷型二萜原酸酯类结构。该化合物的相对构型是通过NOESY确定的。并通过Scifinder检索发现该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为stelleradaphnane A。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属如下表，相关图谱见附图1-图8。

stelleradaphnane A的¹H NMR谱及¹³C NMR谱数据

化合物2:白色片状固体(甲醇)，易溶于甲醇，二氯甲烷等试剂；5％香草醛硫酸显灰色。HRESIMS给出准分子离子峰[M+H]⁺m/z 793.3797(calcd for C₄₄H₅₇O₁₃,793.3794),结合¹H-NMR，¹³C-NMR和HSQC谱图可以确定该化合物的分子式为C₄₄H₅₆O₁₃，计算不饱和度为17，并对¹H-NMR，¹³C-NMR信号进行了归属，同时通过HMBC谱对平面结构进行了确定，最终将该化合物的平面结构确定为1α-烷基瑞香烷型二萜原酸酯结构。该化合物的相对构型同样是通过NOESY谱图确定的，并通过Scifinder检索发现该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为stelleradaphnane B。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属如下表，相关图谱见附图9-图16。

stelleradaphnane B的¹H NMR谱及¹³C NMR谱数据

化合物3:白色片状固体(甲醇)，易溶于甲醇，二氯甲烷等试剂；5％香草醛硫酸显灰色。HRESIMS给出准分子离子峰[M+Na]⁺m/z 691.3085(calcd for C₃₇H₄₈O₁₁Na,691.3089)，结合¹H-NMR，¹³C-NMR和HSQC核磁可以确定该化合物的分子式为C₃₇H₄₈O₁₁，计算不饱和度为14，并对¹H-NMR，¹³C-NMR信号进行了归属，同时通过HMBC谱对平面结构进行了确定，最终将该化合物的平面结构确定为1α-烷基瑞香烷型二萜原酸酯结构。该化合物的相对构型同样是通过NOESY谱确定的，并通过Scifinder检索发现该化合物为一未见报道的新化合物，将其命名为stelleradaphnane C。其¹H NMR谱，¹³C NMR谱信号归属如下表，相关图谱见附图17-图24。

stelleradaphnane C的¹H NMR谱及¹³C NMR谱数据

一种药物组合物，包含所述的1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物和药学上可接受的载体或赋形剂。

所述1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物或所述药物组合物在制备抗肝癌药物中的应用。

所述1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物通过促进Hep3B和HepG2细胞凋亡来达到抗肝癌的目的。

一种瑞香狼毒根提取物，包含所述1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物，应用于制备抗肝癌药物中。

本发明的有益效果：

本发明所涉及的化合物相较于阳性药索拉菲尼对于HepG2肝癌细胞具有更好的抑制作用，并且可以从传统中药瑞香狼毒中进行制备。本发明丰富了瑞香狼毒的化学研究，完善了瑞香狼毒的药理学研究，并且为后续针对活性的结构改造工作提供了研究基础。

附图说明

图1化合物Stelleradaphnane A的UV谱图；

图2化合物Stelleradaphnane A的HRESIMS谱图；

图3化合物Stelleradaphnane A的实测ECD谱图；

图4化合物Stelleradaphnane A的¹H NMR谱图(CDCl₃,600MHz)；

图5化合物Stelleradaphnane A的¹³C NMR谱图(CDCl₃，150MHz)；

图6化合物Stelleradaphnane A的HSQC谱图(CDCl₃,600MHz)；

图7化合物Stelleradaphnane A的HMBC谱图(CDCl₃,600MHz)；

图8化合物Stelleradaphnane A的NOESY谱图(CDCl₃,600MHz)；

图9化合物Stelleradaphnane B的HRESIMS谱图；

图10化合物Stelleradaphnane B的UV谱图；

图11化合物Stelleradaphnane B的实测ECD谱图；

图12化合物Stelleradaphnane B的¹H NMR谱图(CDCl₃,600MHz)；

图13化合物Stelleradaphnane B的¹³C NMR谱图(CDCl₃,150MHz)；

图14化合物Stelleradaphnane B的HSQC谱图(CDCl₃,600MHz)；

图15化合物Stelleradaphnane B的HMBC谱图(CDCl₃,600MHz)；

图16化合物Stelleradaphnane B的NOESY谱图(CDCl₃,600MHz)；

图17化合物Stelleradaphnane C的HRESIMS谱图；

图18化合物Stelleradaphnane C的UV谱图；

图19化合物Stelleradaphnane C的实测ECD谱图；

图20化合物Stelleradaphnane C的¹H NMR谱图(CDCl₃,600MHz)；

图21化合物Stelleradaphnane C的¹³C NMR谱图(CDCl₃，150MHz)；

图22化合物Stelleradaphnane C的HSQC谱图(CDCl₃,600MHz)；

图23化合物Stelleradaphnane C的HMBC谱图(CDCl₃,600MHz)；

图24化合物Stelleradaphnane C的NOESY谱图(CDCl₃,600MHz)。

具体实施方式

实施例1

1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物1-3的制备

(1)取干燥的瑞香狼毒的根部(50kg)研磨成碎片，以70％工业乙醇加热回流提取3次，每次2小时。过滤粗提物并减压浓缩得到浸膏。所得浸膏加水，依次用石油醚，乙酸乙酯和正丁醇萃取。将乙酸乙酯层(1258g)使用硅胶柱色谱分进行离(200-300目)，用二氯甲烷-甲醇(1:0-0:1)梯度洗脱，得到馏分A-F。

(2)将馏分B在HP-20大孔树脂上用乙醇-水(1:9-9:1)进行梯度洗脱，共收集到5个馏分。将这些馏分转移到PR-18硅胶柱中，采用同样的乙醇-水进行梯度洗脱，分析后获得7个馏分B1-B7。

(3)通过二氯甲烷-甲醇(50:1-1:1)梯度洗脱馏分B6。

(4)将洗脱后得到的馏分经半制备型HPLC进一步纯化，得到了1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物Stelleradaphnane A(18.0mg)、Stelleradaphnane B(6.0mg)，Stelleradaphnane C(22.0mg)。

实验例2

在体外测定化合物Stelleradaphnane A-C对HepG2和Hep3B细胞的抑制作用，进而探究其抗肝癌活性。

(1)细胞培养

人肝癌细胞HepG2和Hep3B置于含10％胎牛血清以及1％双抗的DMEM培养基中，于37℃，5％CO₂的培养箱中进行培养。稳定传代培养至对数生长的细胞用于实验。

(2)细胞分组

空白组：不含任何药物，仅用DMEM完全培养液培养。

化合物1组：细胞于DMEM完全培养液培养后，加入不同浓度(5μM、12.5μM、25μM、50μM)化合物Stelleradaphnane A培养48小时，再向每孔中加入20μL MTT，继续培养4小时。

化合物2组：细胞于DMEM完全培养液培养后，加入不同浓度(5μM、12.5μM、25μM、50μM)化合物Stelleradaphnane B培养48小时，再加入20μL MTT，继续培养4小时。

化合物3组：细胞于DMEM完全培养液培养后，加入不同浓度(5μM、12.5μM、25μM、50μM)化合物Stelleradaphnane C培养48小时，再加入20μL MTT，继续培养4小时。

加入DMSO 150μL/孔，恒温振荡器上振荡10min，并用酶标仪(Thermo ScientificMultiskan MK3,Shanghai,China)于490nm处检测各孔吸光度值。

细胞存活率(％)＝[A_(给药组)-A_{(空白对照)}]/[A_{(阴性对照)}-A_{(空白对照)}]×100％

(3)实验结果

化合物Stelleradaphnane A-C的肝癌细胞抑制作用的数据(IC₅₀)如下表，单位为μM：

实验结果显示，Stelleradaphnane C对HepG2细胞的抑制活性最好，IC₅₀值为9.73μM。

Claims (5)

1.一种1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取干燥的瑞香狼毒根以乙醇提取，合并提取液浓缩得到浸膏，所得浸膏先后采用石油醚，乙酸乙酯，正丁醇萃取，乙酸乙酯部分经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱，共收集到6个馏分A-F；

(2)馏分B经HP-20柱色谱，以乙醇-水梯度洗脱，共收集到5个馏分，又将这些馏分经PR-18硅胶柱，同样使用乙醇-水梯度洗脱，共获得7个馏分B1-B7；

(3)馏分B6经硅胶柱色谱，以二氯甲烷-甲醇系统进行梯度洗脱；

(4)将洗脱后得到的馏分经半制备HPLC，并通过浓度为75％的乙腈-水系统进一步纯化得到如下所示3种化合物；

2.根据权利要求1所述的1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中，二氯甲烷-甲醇的梯度为：1:0-0:1；所述乙醇为浓度为70％-80％的工业乙醇，回流提取3-4次，每次2-3小时。

3.根据权利要求1所述的1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中，乙醇-水的梯度为：1:9-9:1。

4.根据权利要求1所述的1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中，二氯甲烷-甲醇的梯度为：50:1-1:1。

5.根据权利要求1所述的1α-烷基瑞香烷型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物用于制备Hep3B和HepG2抑制剂。