CN111410645B - 一种木脂素类化合物及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种式(Ⅰ)所示木脂素类化合物及其制备与应用，经体外活性试验评价，本发明化合物在体外能显著抑制两种肝癌细胞的增殖，表明其具有潜在的抗肿瘤活性。因此，可用于制备新的抗肿瘤药物。本发明为研发新型抗肿瘤药物提供了新的来源。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体的涉及一种从球蕊五味子(Schisandrasphaerandra)茎中分离得到的新的木脂素类化合物及其制备方法和其在抑制肿瘤细胞增殖方面的应用。
背景技术
五味子科(Schisandraceae)五味子属(Schisandra)包含近30个种，概述植物广泛分布于中国境内且被中医药广泛应用于咳嗽、失眠症、慢性腹泻、早产等疾病的治疗。在五味子属植物中，研究最多的两个种为S.chinensis Turcz.Baill.和S.sphenantheraRehder&E.H.Wilson，两种植物的果实分别被中国药典收录为北五味子和南五味子两种不同的药材，前者还被日本、韩国、美国、俄罗斯等国家药典和国际药典收录。以北五味子和南五味子为例，尽管五味子属不同种植物在形态学方面的差异较小，但是其化学成分上却存在较大差异。现代植物化学和药理学研究表明，五味子属植物富含具有抗肝炎、抗肿瘤、抗HIV活性的木脂素和三萜类成分。其中，联苯环辛烯类木脂素是五味子属植物的特征性成分，他们也被称为五味子木脂素。从1961年分离得到第一个联苯环辛烯类木脂素至今，已有超过150个该类成分从五味子科植物中分离得到，且表现出了多种显著的活性。
球蕊五味子(S.sphaerandra)主要分布在中国南方地区，曾用于治疗腹部疾病。与五味子属其他种植物相比，球蕊五味子的化学成分尚未进行过系统研究。截至目前，仅有包括一个木脂素、五个三萜、两个甾体、两个脂肪酸衍生物、一个酚酸在内的十一个化合物被报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种从球蕊五味子茎中提取分离的具有药理活性的新的药用化合物及其制备方法与用途，开展球蕊五味子化学成分的系统研究，获得结构新颖、活性良好的先导化合物。
本发明采用的技术方案为：
第一方面，本发明提供一种式(Ⅰ)所示的球蕊五味子素A，分子式为C27H32O9，
第二方面，本发明还提供一种所述球蕊五味子素A的制备方法，所述方法具体为：
1)取球蕊五味子的茎，自然风干后粉碎，用有机溶剂室温浸提，提取液减压回收溶剂，得粗提物浸膏；所述有机溶剂为95％乙醇、甲醇或丙酮，优选95％乙醇；
2)将粗提物浸膏用水悬浮后，用有机溶剂进行萃取，收集有机溶剂相，减压回收溶剂，得萃取物浸膏；所述有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷，优选乙酸乙酯；
3)将步骤2)萃取物浸膏以体积比为20～1:1的石油醚(沸程60-90℃)/丙酮混合溶剂为洗脱剂进行硅胶柱层析梯度洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积，以体积比2:1的石油醚/丙酮为展开剂进行薄层层析检测，收集Rf值为0.4-0.6的组分；然后将Rf值为0.4-0.6的组分以体积比为70～100:30～0的甲醇/水为洗脱剂进行MCI CHP20P柱层析梯度洗脱，以体积比2:1的石油醚/乙酸乙酯进行薄层层析检测，收集Rf值为0.4-0.5的组分；再将Rf值为0.4-0.5的组分以体积比为70～100:30～0的甲醇/水为洗脱剂进行ODS C-18柱层析梯度洗脱，以体积比2:1的石油醚/乙酸乙酯进行薄层层析检测，收集Rf值为0.5的组分，获得式(Ⅰ)所示化合物。
进一步，步骤1)中，所述有机溶剂体积用量以球蕊五味子茎粉末重量计为2-5mL/g；所述浸提至少进行3次，每次提取时间为3-5天。
进一步，步骤2)中，水体积用量以粗提物浸膏重量计为2-5mL/g；所述有机溶剂与水的体积比为1:0.5-2；萃取3-5次。
进一步，步骤3)中，所述硅胶柱层析的洗脱条件为：依次以体积比为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚/丙酮混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱；所述MCI CHP20P柱层析的洗脱条件为：依次以体积比为70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱；所述ODS C-18柱层析的洗脱条件为：依次以体积比为70:30、80:20、90:10的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱。
第三方面，本发明还提供一种所述木脂素化合物在制备肿瘤细胞活性抑制剂中的应用，所述肿瘤细胞为人肝癌细胞HepG2或人肝癌细胞Bel-7402。
第四方面，本发明还提供一种所述木脂素化合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明经过简单提取分离，从球蕊五味子Schisandra sphaerandra茎中获得木脂素类化合物，其具有较好的体外抑制肿瘤细胞增殖活性，优于临床用药5-氟尿嘧啶(5-Fu)。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：(1)通过有机溶剂浸提和色谱柱分离等系列流程得到化合物，制备方法具有简单、快速、获得的化合物纯度高等优点。(2)化合物具有较好的体外抑制肿瘤细胞增殖活性，优于临床用药5-Fu，可以在抗肿瘤药物研发中获得应用。以此类化合物为先导物，开展结构优化，对于新型抗肿瘤药物研发具有重要意义。
附图说明
图1是化合物1的氢谱。
图2是化合物1的碳谱。
图3是化合物1的HSQC谱。
图4是化合物1的1H-1H COSY谱。
图5是化合物1的HMBC谱。
图6是化合物1的NOESY谱。
图7是化合物1的高分辨质谱。
图8是化合物1的红外光谱。
图9是化合物1的圆二色(CD)谱。
具体实施方式
本发明结合附图和实施例，对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述的实例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明所述室温是指25-30℃。
实施例1化合物1的制备
1、粗提物的制备
将采自云南昆明梁王山山顶的球蕊五味子(S.sphaerandra)整株植物，去掉根和叶子，留取茎部，自然风干后粉碎，取10kg用95％乙醇30L室温浸提4次(每次4天)，合并提取液，减压浓缩至无液体流出或无乙醇味，得到粗提物浸膏846g。
2、萃取
将上述粗提物浸膏846g悬浮于2L水中，以乙酸乙酯萃取，每次2L，共萃取3次；合并乙酸乙酯相，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物浸膏108g。
3、分离纯化
乙酸乙酯萃取物浸膏(108g)先经硅胶柱(直径12cm高70cm)层析初步分离，以体积比为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚(沸程60-90℃)/丙酮混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱4个柱体积(2L)，以薄层层析法(展开剂为石油醚/丙酮2:1，v/v)为指导，合并Rf值相近的组分，得到九个洗脱部位(Fr.A→I)；Fr.I(2.9g，Rf值为0.4-0.6)经MCICHP20P柱层析(直径4cm高30cm)分离，以体积比为70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇/水为洗脱剂梯度洗脱，以薄层层析(展开即为石油醚/乙酸乙酯2:1，v/v)为指导，合并Rf值相近的组分，得到5个洗脱部位(Fr.I1→I5)；Fr.I2(136.2mg，Rf值为0.4-0.5)再经ODSC-18柱层析(直径2.5cm高30cm)分离，以体积比为70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇/水为洗脱剂梯度洗脱，以薄层层析(展开即为石油醚/丙酮2:1，v/v)为指导，合并Rf值约为0.5的斑点，得到化合物1(18.4mg)。
实施例2化合物1的结构鉴定
参照图1-图9，化合物1为白色无定型粉末，高分辨质谱给出准分子离子峰m/z523.1937([M+H]+，C27H32NaO9 +，Calcd.523.1939)，结合氢谱、碳谱确定其分子式为C27H32O9，不饱和度为12。旋光
。1H-NMR谱显示两组芳香质子信号δH6.86(1H,s,H-4)和6.42(1H,s,H-11)、一组烯烃质子信号δH5.96(1H,m,H-3′)、一组二氧亚甲基质子信号δH5.97(1H,s,Ha-19)和5.88(1H,s,Hb-19)、一组连氧次甲基质子信号δH5.52(1H,s,H-6),三组甲氧基质子信号δH3.92(3H,s,OMe-2)、3.91(3H,s,OMe-3)和3.54(3H,s,OMe-1)，以及四组甲基质子信号δH1.84(3H,d,7.2,Me-4′)、1.42(3H,s,Me-5′)、1.36(3H,s,Me-17)和1.14(3H,d,7.1,Me-18)。13CNMR和DEPT谱显示27个碳信号，包括四个甲基碳δC15.8、18.8、20.0和28.3、三个甲氧基碳δC56.1、61.2和61.5两个亚甲基碳δC36.6和101.3(二氧亚甲基)、五个次甲基碳δC42.6、84.8(连氧)、102.1(芳香碳)、111.5(芳香碳)和140.1(烯烃)、以及十三个季碳。上述信号表明，化合物1中存在联苯片段。H-11与C-9,C-12、C-13、C-15之间，H-4与C-3、C-5、C-6、C-16之间的HMBC相关信号，以及紫外光谱位于214nm处的特征吸收，和红外光谱中位于3456(OH)、1709(C＝O)、1628(C＝C)cm-1的吸收带，进一步表明化合物1为含有羟基和酯基的联苯环辛烯类木脂素。在其结构中，二氧亚甲基片段位于C-12和C-13之间，因为在HMBC谱(式b)中可以观察到H-11(δH6.42)、H-(O-CH2-O)(δH5.97和5.88)与C-12(δC148.6)和C-13(δC133.5)之间的相关信号。而H3-4′(δH1.84)和H-3′(δH5.96)之间的1H-1HCOSY相关信号、H3-4′(δH1.84)、H3-5′(δH1.42)和C-2′(δC126.9)之间的HMBC相关信号、以及H-3′(δH5.96)和H3-5′(δH1.42)与C-1′(δC166.2)之间的HMBC相关信号，表明化合物1中存在angeloyloxy基团。而H-6(δH5.52)与C-1′(δC166.2)之间的相关信号则表明该基团通过酯键与环辛烯骨架的C-6位相连。核磁信号中的δH1.14(3H,d,7.1)处的双峰甲基被归属于C-18位，因为可以观察到H3-18(δH1.14)和H-8(δH2.00)之间及H-8(δH2.00)和H2-9(δH2.27and2.18)之间的1H-1HCOSY相关信号，以及H3-18(δH1.14)、H-8(δH2.00)和C-8(δC42.6)之间的HMBC相关信号。同样，根据H3-17(δH1.36)和C-6(δC84.8)、C-7(δC72.6)之间的HMBC相关信号，可以将δH1.36(3H,s)处的单峰甲基定位与C-17位。通过进一步综合分析核磁数据并与化合物schirubrisins A,B,and D的数据(Luo et al.Four newdibenzocyclooctadiene lignans from Schisandra rubriflora.Chin.J.Nat.Med.,2011,9,167-172)比较，可以将联苯环辛烯骨架上的所有碳信号进行全归属。而后，根据H3-OMe(δH3.54)与C-1(δC150.9)之间、H3-OMe(δH3.92)与C-2(δC142.0)之间、H3-OMe(δH3.91)与C-3(δC152.5)之间的HMBC相关信号，分别将三个甲氧基定位于C-1、C-2和C-3位。结合分子式，判断C-14位为羟基取代。至此，化合物1的平面结构得以确定。
式(Ⅰ)为化合物1的结构；式(Ⅱ)为主要的1H-1H COSY和HMBC相关；式(III)为主要的NOE相关。
前人研究表明，圆二色谱(CD)为确定联苯环辛烯类木脂素中联苯结构轴手性的最有效手段，并总结得出了规律：在S-型联苯结构中，化合物的CD谱会在215-225nm呈现正Cotton效应而在240–260nm处呈现负Cotton效应；而R-型联苯结构中，化合物的CD谱会在215-230nm呈现负Cotton效应而在240–260nm处呈现正Cotton效应。通过测定化合物1的CD谱，我们发现其在250和210nm左右分别呈现负和正Cotton效应，表明化合物1中的联苯构型为S型。此外，在NOESY谱中，可以观察到H-4/H-6、H-11/H-8、H-11/Hβ-9、H-8/H3-17等NOE相关信号，表明化合物1结构中的环辛烯骨架构象为twisted boat/chair型，且H-6、7-OH和H3-18为α构型，而H-8和H3-17为β构型。给予上述分析，化合物1被解析为具有式(Ⅰ)所示的结构，命名为球蕊五味子素A。
表1化合物1的核磁数据(CDCl3；氢谱、碳谱分别在600和150MHz测定)
实施例3化合物1的体外抗肿瘤活性
1、材料
人肝癌细胞HepG2和Bel-7402购于中国科学院上海细胞库，所有细胞均由本实验室复苏、传代、培养及冻存。SpectraMax M5酶标仪(美谷分子仪器有限公司)，Ti-s倒置显微镜(Nikon)，3111-Forma CO2培养箱(Thermo Scientific)，MTT(3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐)、DMEM培养基、胎牛血清均购于北京索莱宝科技有限公司，DMSO购于sigma。
2、实验方法
将HepG2和Bel-7402细胞用DMEM培养基配成单细胞悬液，计数后，调整细胞浓度至5×107·L-1，按照每孔100μL细胞悬液分别接种于96孔板中，于37℃、5％CO2培养箱内培养24小时，弃去培养基；将化合物1和5-Fu(阳性对照)依次用含10％胎牛血清的DMEM培养基稀释为400、200、100、50、25μmol·L-1，以每孔100μL加入96孔板中，每个浓度分别设置5个平行复孔，同时设置阴性对照(替换化合物1为体积浓度0.1％DMSO水溶液)和空白对照组(扣除背景用，只有培养基，无细胞，不加药物)，于37℃、5％CO2和饱和湿度的培养箱中培养48小时；加入5mg/mL的MTT(20μL/孔)，混匀后37℃、5％CO2培养箱内孵育4小时。加入DMSO(150μL/孔)，溶解紫蓝色结晶，用酶标仪测定(570/490nm)吸光度。根据下列公式计算化合物对细胞的抑制率IC50(μM)。
本发明化合物1对HepG2和Bel-7402的增殖抑制活性见表2。
表2化合物1对肿瘤细胞的体外增殖抑制活性
从表2中数据可知，本发明涉及的化合物1对HepG2和Bel-7402两肿瘤细胞具有较好的体外增殖抑制活性，其活性均优于阳性对照5-Fu，有望开发成为新型的抗肝癌药物。
Claims (5)
1.一种式（Ⅰ）所示的球蕊五味子素A的制备方法，其特征在于所述方法为：
1）取球蕊五味子的茎，自然风干后粉碎，用有机溶剂室温浸提，提取液减压回收溶剂，得粗提物浸膏；所述有机溶剂为95%乙醇、甲醇或丙酮；
2）将粗提物浸膏用水悬浮后，用有机溶剂进行萃取，收集有机溶剂相，减压回收溶剂，得萃取物浸膏；所述有机溶剂为乙酸乙酯、氯仿或二氯甲烷；
3）将步骤2）萃取物浸膏以体积比为20~1:1的石油醚/丙酮混合溶剂为洗脱剂进行硅胶柱层析梯度洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积，以体积比2:1的石油醚/丙酮为展开剂进行薄层层析检测，收集Rf值为0.4-0.6的组分；将Rf值为0.4-0.6的组分以体积比为70~100:30~0的甲醇/水为洗脱剂进行MCI CHP20P柱层析梯度洗脱，以体积比2:1的石油醚/乙酸乙酯进行薄层层析检测，收集Rf值为0.4-0.5的组分；再将Rf值为0.4-0.5的组分以体积比为70~100:30~0的甲醇/水为洗脱剂进行ODS C-18柱层析梯度洗脱，以体积比2:1的石油醚/乙酸乙酯进行薄层层析检测，收集Rf值为0.5的组分，获得式（Ⅰ）所示化合物；
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1）有机溶剂体积用量以球蕊五味子茎粉末重量计为2-5mL/g。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1）所述浸提至少进行3次，每次提取时间为3-5天。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2）中，水体积用量以粗提物浸膏重量计为2-5mL/g；所述有机溶剂与水的体积比为1:0.5-2。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3）中，所述硅胶柱层析的洗脱条件为：依次以体积比为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚/丙酮混合溶剂为洗脱剂进行硅胶柱层析梯度洗脱；所述MCI CHP20P柱层析的洗脱条件为：依次以体积比为70:30、80:20、90:10、100:0的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱；所述ODS C-18柱层析的洗脱条件为：依次以体积比为70:30、80:20、90:10的甲醇/水混合溶剂为洗脱剂进行梯度洗脱。
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