CN114573456B - 一种贝壳杉烷型二萜化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明对贵州民间药草宽叶香茶菜化学成分及其制备方法和应用进行研究，发明团队通过活性筛选发现具有开发价值的先导化合物，目前从宽叶香茶菜中分离提取得到贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K，并通过实验证明此化合物具有明显的抑制肿瘤细胞活性，可以在制备治疗癌症或肿瘤药物方面应用。

Description

一种贝壳杉烷型二萜化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药学领域，具体涉及一种贝壳杉烷型二萜化合物及其制备方法和应用，尤其涉及从宽叶香茶菜中分离得到的贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、ExcisaninK及其制备方法和应用。
背景技术
宽叶香茶菜Isodon latifolius(C.Y.Wu&H.W.Li)H.Hara系唇形科香茶菜属多年生草本，仡佬族药名为蒙秋咯。该植物仅仅分布于海拔1450-2000米的四川东部、贵州北部地区草丛等阴湿处。宽叶香茶菜作为贵州省道真县区域仡佬族特有的民间药用经验方，当地仡佬族民间医生用于治疗头痛目赤、风热表证、咽喉肿痛等症，疗效确切，使用广泛。[中国科学院中国植物志编辑委员会.中国植物志[M].第66卷.科学出版社,2004:540.]。
由于现有文献中未见宽叶香茶菜化学成分贝壳杉烷型二萜化合物Exci sanin D、Excisanin K及其制备方法的报道，也未见该化合物在制备治疗癌症或肿瘤药物方面应用的研究报道，因此为对贵州民间药草宽叶香茶菜化学成分及其制备方法和应用进行研究，本发明团队通过活性筛选发现具有开发价值的先导化合物，目前从宽叶香茶菜中分离提取得到贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K，并通过实验证明此化合物具有明显的抑制肿瘤细胞活性，可以在制备治疗癌症或肿瘤药物方面应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种从宽叶香茶菜中分离得到的贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K。
本发明的另一目的是提供一种从宽叶香茶菜中得到贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K的制备方法。
本发明的另一目的是贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K在制备治疗癌症或肿瘤药物制剂方面的应用。
本发明所述的贝壳杉烷型二萜化合物是从宽叶香茶菜中分离得到的贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K。
本发明所述的贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D，分子式为：C22H32O6，EI-MS m/z：392[M]+，白色片状晶体；溶于甲醇，微溶于二氯甲烷，难溶于石油醚、乙酸乙酯；TCL检测，10％H2SO4-EtOH溶液显色呈橙黄色，10％H3[P(Mo3O10)]4-EtOH溶液显色呈现深蓝色，化学结构式如下：
1H-NMR(600MHz,CDCl3)、13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据如下：
Data were recorded in CDCl3 on a AVANCE NEO-600MHz spectrometer.
18位为羟基取代的贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin K，白色片状晶体；溶于甲醇，微溶于二氯甲烷，难溶于石油醚、乙酸乙酯；TCL检测，10％H2SO4-EtOH溶液显色呈现棕黄色，10％H3[P(Mo3O10)]4-EtOH溶液显色呈深蓝色。EI-MS m/z：373[M+Na]+，化合物分子式为：C20H30O5，结构式：
1H-NMR(600MHz,CD3OD)、13C-NMR(150MHz,CD3OD)数据如下：
Data were recorded in CD3OD on a AVANCE NEO-600MHz spectrometer.
本发明所述贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D和Excisanin K的制备方法如下：
1)65％～95％乙醇加热回流提取：宽叶香茶菜叶经自然风干后粉碎，取粉碎的宽叶香茶菜叶6～7Kg，加料液比为1:10～1:30mL·g-1的65％～95％乙醇在温度为75～85℃条件下加热回流提取2～4次，每次2～4小时，得稀乙醇提取液；
2)浓缩稀乙醇提取液：将稀乙醇提取液减压浓缩得乙醇浸膏，在减压浓缩过程中回收乙醇；
3)把乙醇浸膏溶于蒸馏水中呈混悬液，再用1～3倍量乙酸乙酯萃取2～5次，得稀乙酸乙酯萃取液；
4)浓缩稀乙酸乙酯萃取液：将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏，在减压浓缩过程中回收乙酸乙酯；
5)柱层析分离：将乙酸乙酯浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200～300目，用比例为V/V 10/0、9/1、4/1、7/3、6/4、0/10的石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，得到A、B、C、D、E、F、G七个部分；E部分用适量甲醇溶解，用1:1.5倍聚酰胺拌样，用MCI进行脱色处理，用50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇-水混合溶剂系统洗脱，通过HPLC检测合并，合并极性相似流分，最终按照极性由大到小分为E-1、E-2、E-3、E-4四个部分；E-1部分用比例为10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，通过薄层层析法检测，合并相似流分，最终分为E-1-1、E-1-2、E-1-3三部分，其中E-1-1部分借助硅胶柱层析，以比例为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，再经比例为1:1石油醚-乙酸乙酯系统反复分离纯化，得到白色针晶化合物Excisanin D；Excisanin D粗品用比例为90/10的甲醇/水常温条件下静置挥发，70～75小时得本发明的晶体Excisanin D；
E-1-3部分用比例为3:1二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇反复进行等度洗脱，最后得到白色针状晶体化合物Excisanin K；Excisanin K粗品用比例为85/15的甲醇/水常温条件下静置挥发，92～98小时得本发明的Excisanin K。
优选后的所述贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D和Excisanin K的制备方法如下：
1)95％乙醇加热回流提取：宽叶香茶菜叶经自然风干后粉碎，取粉碎的宽叶香茶菜叶6.5Kg，加料液比为1:20mL·g-1的95％乙醇在温度为85℃条件下加热回流提取2次，每次2小时，得稀乙醇提取液；
2)浓缩稀乙醇提取液：将稀乙醇提取液减压浓缩得乙醇浸膏1100g，在减压浓缩过程中回收乙醇；
3)萃取：把乙醇浸膏溶于蒸馏水中，再用2倍量乙酸乙酯萃取3～4次，得稀乙酸乙酯萃取液；
4)浓缩稀乙酸乙酯萃取液：将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏(53g)，在减压浓缩过程中回收乙酸乙酯；
5)柱层析分离：将乙酸乙酯浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200～300目，用比例为V/V 10/0、9/1、4/1、7/3、6/4、0/10的石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，得到A、B、C、D、E、F、G七个部分；E部分用适量甲醇溶解，用1:1.5倍聚酰胺拌样，用MCI进行脱色处理，用50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇-水混合溶剂系统洗脱，通过HPLC检测合并，合并极性相似流分，最终按照极性由大到小分为E-1、E-2、E-3、E-4四个部分；E-1部分用比例为10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，通过薄层层析法检测，合并相似流分，最终分为E-1-1、E-1-2、E-1-3三部分，其中E-1-1部分借助硅胶柱层析，以比例为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，再经比例为1:1石油醚-乙酸乙酯系统反复分离纯化，得到白色针晶化合物Excisanin D(34.5mg)；Excisanin D粗品用比例为90/10的甲醇/水常温条件下静置挥发，72小时得本发明的晶体Excisanin D；
E-1-3部分用比例为3:1二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇反复进行等度洗脱，最后得到白色针状晶体化合物Excisanin K(9.6mg)；Excisanin K粗品用比例为85/15的甲醇/水常温条件下静置挥发，96小时得本发明的Excisanin K。
本发明所述贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K在制备治疗癌症或肿瘤药物方面的应用。
本发明所述贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K在制备治疗癌症或肿瘤药物制剂方面的应用。
本发明所述制剂为加入药学上可接受的辅料按常规工艺制成药学上可接受的制剂。
本发明所述药学上可接受的制剂为固体制剂或液体制剂。
本发明所述固体制剂为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、冻干粉针剂。
本发明所述液体制剂为口服液、注射制剂。
本发明所述的辅料没有限定，药学上接受即可。
有益效果：
现有技术的问题：现有文献中未见宽叶香茶菜化学成分贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K及其制备方法的报道，也未见该化合物在制备治疗癌症或肿瘤药物方面应用的研究报道。
本发明的有益效果：本发明对贵州民间药草宽叶香茶菜化学成分及其制备方法和应用进行研究，发明团队通过活性筛选发现具有开发价值的先导化合物，目前从宽叶香茶菜中分离提取得到贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K，并通过体外抗肿瘤活性测试Excisanin D、Excisanin K化合物具有明显的抑制肿瘤细胞活性，可以在制备治疗癌症或肿瘤药物方面应用，尤其是在制备治疗人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞231、肝癌细胞HepG2药物或制剂方面的应用。
附图说明
图1 Excisanin D的1H-NMR谱。
图2 Excisanin D的13C-NMR谱。
图3 Excisanin K的1H-NMR谱。
图4 Excisanin K的13C-NMR谱。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。
实施例1
贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D：
分子式为：C22H32O6，EI-MS m/z：392[M]+，白色片状晶体；溶于甲醇，微溶于二氯甲烷，难溶于石油醚、乙酸乙酯；TCL检测，10％H2SO4-EtOH溶液显色呈橙黄色，10％H3[P(Mo3O10)]4-EtOH溶液显色呈现深蓝色，化学结构式如下：
1H-NMR(600MHz,CDCl3)、13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据如下：
Data were recorded in CDCl3 on a AVANCE NEO-600MHz spectrometer.
18位为羟基取代的贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin K：
白色片状晶体；溶于甲醇，微溶于二氯甲烷，难溶于石油醚、乙酸乙酯；TCL检测，10％H2SO4-EtOH溶液显色呈现棕黄色，10％H3[P(Mo3O10)]4-EtOH溶液显色呈深蓝色。EI-MSm/z：373[M+Na]+，化合物分子式为：C20H30O5，结构式：
1H-NMR(600MHz,CD3OD)、13C-NMR(150MHz,CD3OD)数据如下：
Data were recorded in CD3OD on a AVANCE NEO-600MHz spectrometer.
实施例2
贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D和Excisanin K的制备方法如下：
1)95％乙醇加热回流提取：宽叶香茶菜叶经自然风干后粉碎，取粉碎的宽叶香茶菜叶6.5Kg，加料液比为1:20mL·g-1的95％乙醇在温度为85℃条件下加热回流提取2次，每次2小时，得稀乙醇提取液；
2)浓缩稀乙醇提取液：将稀乙醇提取液减压浓缩得乙醇浸膏1100g，在减压浓缩过程中回收乙醇；
3)萃取：把乙醇浸膏溶于蒸馏水中，再用2倍量乙酸乙酯萃取3～4次，得稀乙酸乙酯萃取液；
4)浓缩稀乙酸乙酯萃取液：将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏(53g)，在减压浓缩过程中回收乙酸乙酯；
5)柱层析分离：将乙酸乙酯浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200～300目，用比例为V/V 10/0、9/1、4/1、7/3、6/4、0/10的石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，得到A、B、C、D、E、F、G七个部分；E部分用适量甲醇溶解，用1:1.5倍聚酰胺拌样，用MCI进行脱色处理，用50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇-水混合溶剂系统洗脱，通过HPLC检测合并，合并极性相似流分，最终按照极性由大到小分为E-1、E-2、E-3、E-4四个部分；E-1部分用比例为10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，通过薄层层析法检测，合并相似流分，最终分为E-1-1、E-1-2、E-1-3三部分，其中E-1-1部分借助硅胶柱层析，以比例为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，再经比例为1:1石油醚-乙酸乙酯系统反复分离纯化，得到白色针晶化合物Excisanin D(34.5mg)；Excisanin D粗品用比例为90/10的甲醇/水常温条件下静置缓慢挥发，72小时得本发明的晶体Excisanin D；
E-1-3部分用比例为3:1二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇反复进行等度洗脱，最后得到白色针状晶体化合物Excisanin K(9.6mg)；Excisanin K粗品用比例为85/15的甲醇/水常温条件下静置缓慢挥发，96小时得本发明的Excisanin K。
应用：在制备治疗癌症或肿瘤药物方面的应用，尤其是在制备治疗人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞231、肝癌细胞HepG2药物或制剂方面的应用。
实施例3：
贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D和Excisanin K的制备方法如下：
1)65％乙醇加热回流提取：宽叶香茶菜叶经自然风干后粉碎，取粉碎的宽叶香茶菜叶6Kg，加料液比为1:10mL·g-1的65％乙醇在温度为75℃条件下加热回流提取2次，每次4小时，得稀乙醇提取液；
2)浓缩稀乙醇提取液：将稀乙醇提取液减压浓缩得乙醇浸膏，在减压浓缩过程中回收乙醇；
3)萃取：把乙醇浸膏溶于蒸馏水中，再用3倍量乙酸乙酯萃取2次，得稀乙酸乙酯萃取液；
4)浓缩稀乙酸乙酯萃取液：将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏，在减压浓缩过程中回收乙酸乙酯；
5)柱层析分离：将乙酸乙酯浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200～300目，用比例为V/V 10/0、9/1、4/1、7/3、6/4、0/10的石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，得到A、B、C、D、E、F、G七个部分；E部分用适量甲醇溶解，用1:1.5倍聚酰胺拌样，用MCI进行脱色处理，用50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇-水混合溶剂系统洗脱，通过HPLC检测合并，合并极性相似流分，最终按照极性由大到小分为E-1、E-2、E-3、E-4四个部分；E-1部分用比例为10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，通过薄层层析法检测，合并相似流分，最终分为E-1-1、E-1-2、E-1-3三部分，其中E-1-1部分借助硅胶柱层析，以比例为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，再经比例为1:1石油醚-乙酸乙酯系统反复分离纯化，得到白色针晶化合物Excisanin D；Excisanin D粗品用比例为90/10的甲醇/水常温条件下静置缓慢挥发，70～75小时得本发明的晶体Excisanin D；
E-1-3部分用比例为3:1二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇反复进行等度洗脱，最后得到白色针状晶体化合物Excisanin K；Excisanin K粗品用比例为85/15的甲醇/水常温条件下静置缓慢挥发，92小时得本发明的Excisanin K。
应用：在制备治疗癌症或肿瘤药物方面的应用，尤其是在制备治疗人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞231、肝癌细胞HepG2药物或制剂方面的应用。
实施例4：
贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D和Excisanin K的制备方法如下：
1)95％乙醇加热回流提取：宽叶香茶菜叶经自然风干后粉碎，取粉碎的宽叶香茶菜叶7Kg，加料液比为1:30mL·g-1的95％乙醇在温度为85℃条件下加热回流提取4次，每次2小时，得稀乙醇提取液；
2)浓缩稀乙醇提取液：将稀乙醇提取液减压浓缩得乙醇浸膏，在减压浓缩过程中回收乙醇；
3)萃取：把乙醇浸膏溶于蒸馏水中，再用1倍量乙酸乙酯萃取5次，得稀乙酸乙酯萃取液；
4)浓缩稀乙酸乙酯萃取液：将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏，在减压浓缩过程中回收乙酸乙酯；
5)柱层析分离：将乙酸乙酯浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200～300目，用比例为V/V 10/0、9/1、4/1、7/3、6/4、0/10的石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，得到A、B、C、D、E、F、G七个部分；E部分用适量甲醇溶解，用1:1.5倍聚酰胺拌样，用MCI进行脱色处理，用50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇-水混合溶剂系统洗脱，通过HPLC检测合并，合并极性相似流分，最终按照极性由大到小分为E-1、E-2、E-3、E-4四个部分；E-1部分用比例为10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，通过薄层层析法检测，合并相似流分，最终分为E-1-1、E-1-2、E-1-3三部分，其中E-1-1部分借助硅胶柱层析，以比例为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，再经比例为1:1石油醚-乙酸乙酯系统反复分离纯化，得到白色针晶化合物Excisanin D；Excisanin D粗品用比例为90/10的甲醇/水常温条件下缓慢静置挥发，70～75小时得本发明的晶体Excisanin D；
E-1-3部分用比例为3:1二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇反复进行等度洗脱，最后得到白色针状晶体化合物Excisanin K；Excisanin K粗品用比例为85/15的甲醇/水常温条件下静置缓慢挥发，98小时得本发明的Excisanin K。
应用：在制备治疗癌症或肿瘤药物方面的应用，尤其是在制备治疗人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞231、肝癌细胞HepG2药物或制剂方面的应用。
实施例5：
取化合物Excisanin D、Excisanin K任意一种作为原料药，加入15倍量的药用淀粉混合均匀，制粒，得颗粒剂。
实施例6：
取化合物Excisanin D、Excisanin K任意一种作为原料药，加入13倍量的药用淀粉混合均匀，装入胶囊，得胶囊剂。
实施例7：
取化合物Excisanin D、Excisanin K任意一种作为原料药，加入16倍量的药用淀粉混合均匀，干燥，制成丸剂。
实施例8：
取化合物Excisanin D、Excisanin K任意一种作为原料药，加入14倍量的药用淀粉混合均匀，压片，得片剂。
实施例9：
取化合物Excisanin D、Excisanin K任意一种作为原料药，加入20倍量注射用水，搅拌，过滤，灭菌，得注射剂。
实施例10：
取化合物Excisanin D、Excisanin K任意一种作为原料药，加入18倍量的纯净水，混合均匀，过滤，灭菌，得口服液。
实施例11：
取化合物Excisanin D、Excisanin K任意一种作为原料药，加入8倍量的注射用水，搅拌，过滤，冻干，得冻干粉剂。
为了进一步验证本发明的可行性及有效性，发明人进行了以下实验：
一、提取工艺的考察
发明人进行了响应面优化试验，在单因素试验的基础上，按照Box-Behnken设计原理工艺优化选取提取温度(A)、乙醇浓度(B)、提取时间(C)、料液比(D)4个因素作为自变量，以Excisanin D粗品得率为响应值，依据试验因素和水平设计进行响应面试验设计，优化二萜化合物富集段的提取工艺。-1、0、1水平：A分别为65、75和85℃；B分别为65％、80％和95％；C分别为2、3和4小时；D分别为1:10、1:20和1:30mL·g-1。
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结论：通过提取工艺优化，确定了该化合物的最优提取工艺，即药材粉碎后用95％乙醇/水溶剂进行加热回流提取，温度为85℃，提取2小时，料液比为1:20，在该条件下Excisanin D粗品得率最高。
二.化合物表征及体外抗肿瘤活性测试
(一)仪器与试剂：
旋光Rudolph-型旋光仪(美国鲁道夫公司)测定；核磁共振氢谱1HNMR，核磁共振碳谱13CNMR和2D NMR由INOVA 400MHZ超导核磁共振波谱仪(美国瓦里安公司)测定(四甲基硅醚TMS为内标)；电喷雾质谱ESIMS由5973MSD质谱仪(安捷伦公司)测定；紫外光谱UV由HP8453紫外可见分光光度计(惠普公司)测定；红外光谱IR由VECTOR22型傅立叶变换红外光谱仪(德国BRUKER仪器公司，KBr压片)测定；熔点由XT-4双目显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司)测定；柱层析硅胶(200-300目)及薄层层析硅胶均为青岛海洋化工产；其它试剂均为分析纯。
(二)实验方法
本发明实验药材于2017年10月采自贵州省道真苗族仡佬族自治县，由贵州中医药大学孙庆文教授鉴定为宽叶香茶菜Isodon latifolius(C.Y.Wu&H.W.Li)H.Hara，植物标本存放在贵州中医药大学苗医药重点实验室(标本凭证：GY20171001)。
1.贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D和Excisanin K的制备方法：
1)95％乙醇加热回流提取：宽叶香茶菜叶经自然风干后粉碎，取粉碎的宽叶香茶菜叶6.5Kg，加料液比为1:20mL·g-1的95％乙醇在温度为85℃条件下加热回流提取2次，每次2小时，得稀乙醇提取液；
2)浓缩稀乙醇提取液：将稀乙醇提取液减压浓缩得乙醇浸膏1100g，在减压浓缩过程中回收乙醇；
3)萃取：把乙醇浸膏溶于蒸馏水中，再用2～3倍量乙酸乙酯萃取3～4次，得稀乙酸乙酯萃取液；
4)浓缩稀乙酸乙酯萃取液：将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏(53g)，在减压浓缩过程中回收乙酸乙酯；
5)柱层析分离：将乙酸乙酯浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200～300目，用比例为V/V 10/0、9/1、4/1、7/3、6/4、0/10的石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，得到A、B、C、D、E、F、G七个部分；E部分用适量甲醇溶解，用1:1.5倍聚酰胺拌样，用MCI进行脱色处理，用50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇-水混合溶剂系统洗脱，通过HPLC检测合并，合并极性相似流分，最终按照极性由大到小分为E-1、E-2、E-3、E-4四个部分；E-1部分用比例为10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，通过薄层层析法检测，合并相似流分，最终分为E-1-1、E-1-2、E-1-3三部分，其中E-1-1部分借助硅胶柱层析，以比例为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，再经比例为1:1石油醚-乙酸乙酯系统反复分离纯化，得到白色针晶化合物Excisanin D(34.5mg)；Excisanin D粗品用比例为90/10的甲醇/水常温条件下静置挥发，72小时得本发明的晶体Excisanin D；
E-1-3部分用比例为3:1二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇反复进行等度洗脱，最后得到白色针状晶体化合物Excisanin K(9.6mg)；Exc isanin K粗品用比例为85/15的甲醇/水常温条件下静置挥发，96小时得本发明的Excisanin K。
2.化合物表征
贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D：
分子式为：C22H32O6，EI-MS m/z：392[M]+，白色片状晶体；溶于甲醇，微溶于二氯甲烷，难溶于石油醚、乙酸乙酯；TCL检测，10％H2SO4-EtOH溶液显色呈橙黄色，10％H3[P(Mo3O10)]4-EtOH溶液显色呈现深蓝色，化学结构式如下：
1H-NMR(600MHz,CDCl3)、13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据如下：
Data were recorded in CDCl3 on a AVANCE NEO-600MHz spectrometer.
18位为羟基取代的贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin K：
白色片状晶体；溶于甲醇，微溶于二氯甲烷，难溶于石油醚、乙酸乙酯；TCL检测，10％H2SO4-EtOH溶液显色呈现棕黄色，10％H3[P(Mo3O10)]4-EtOH溶液显色呈深蓝色。EI-MSm/z：373[M+Na]+，化合物分子式为：C20H30O5，结构式：
1H-NMR(600MHz,CDCl3)、13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据如下：
Data were recorded in CD3OD on a AVANCE NEO-600MHz spectrometer.
3.体外抗肿瘤活性测试
将HCT-116、MDA-MB-231和HepG2细胞在含有10％灭活的胎牛血清和10mL/L青霉素-链霉素的DMEM完全培养基上，于37℃、100％湿度、5％CO2的培养基中孵育培养。选用对数生长期的肿瘤细胞，用适量的0.25％的胰酶消化3-5分钟，使贴附的肿瘤细胞脱落，1000转，5分钟离心后用含10％胎牛血清的培养液悬浮，吹打成单个细胞悬液。细胞计数板计数，一般活细胞应在95％以上。用含10％胎牛血清的培养液调整细胞浓度为50000个/mL，96孔板每孔加入细胞悬液100μl，接种后，37℃、5％CO2培养箱培养24h。取96孔板设计为正常对照组、加药组，设6个给药剂量组，用新的培养基稀释药物到相应的终浓度。吸掉孔内原有培养基，每孔加入200μl相应药液，正常对照孔和空白孔加入培养液，每组设定4个平行孔。37℃、5％CO2培养箱培养48h。48h后，弃掉上清，每孔加入5mg/ml MTT溶液20μl，继续培养4h，小心吸取孔内上清液并遗弃，每孔加入150μl DMSO，微型振荡器上震荡约10分钟，使甲瓒溶解完全。用酶标仪在570nm波长测定每孔的OD值，以双蒸水孔凋零。按以下计算药物的肿瘤细胞生长抑制率：肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(正常对照组平均OD值-加药组平均OD值)/正常对照组平均OD值*100％。结果见表1：
表1肿瘤细胞生长抑制率
总结：Excisanin D对人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞231、肝癌细胞HepG2均有抑制生长作用，Excisanin K对人结肠癌细胞HCT-116具有细胞毒活性。Excisanin D显示出对人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞231、肝癌细胞HepG2有较强的抑制生长作用，因此Excisanin D与Excisanin K可用作制备治疗肿瘤的候选药物。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (6)

1.一种贝壳杉烷型二萜化合物的制备方法，其特征在于，所述化合物是从宽叶香茶菜中分离得到的贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K；
贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K化合物结构式为：
贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D和Excisanin K的制备方法如下：
1)95％乙醇加热回流提取：宽叶香茶菜叶经自然风干后粉碎，取粉碎的宽叶香茶菜叶6.5Kg，加料液比为1:20mL·g-1的95％乙醇在温度为85℃条件下加热回流提取2次，每次2小时，得稀乙醇提取液；
2)浓缩稀乙醇提取液：将稀乙醇提取液减压浓缩得乙醇浸膏，在减压浓缩过程中回收乙醇；
3)萃取：把乙醇浸膏溶于蒸馏水中，再用2倍量乙酸乙酯萃取3～4次，得稀乙酸乙酯萃取液；
4)浓缩稀乙酸乙酯萃取液：将乙酸乙酯萃取液减压浓缩得乙酸乙酯浸膏，在减压浓缩过程中回收乙酸乙酯；
5)柱层析分离：将乙酸乙酯浸膏与硅胶拌样，转入层析柱，硅胶粒度200～300目，用比例为V/V 10/0、9/1、4/1、7/3、6/4、0/10的石油醚-乙酸乙酯洗脱液洗脱，得到A、B、C、D、E、F、G七个部分；E部分用适量甲醇溶解，用1:1.5倍聚酰胺拌样，用MCI进行脱色处理，用50％、60％、70％、80％、90％、100％甲醇-水混合溶剂系统洗脱，通过HPLC检测合并，合并极性相似流分，最终按照极性由大到小分为E-1、E-2、E-3、E-4四个部分；E-1部分用比例为10:1、5:1、2:1、1:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，通过薄层层析法检测，合并相似流分，最终分为E-1-1、E-1-2、E-1-3三部分，其中E-1-1部分借助硅胶柱层析，以比例为20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2的二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇进行洗脱，再经比例为1:1石油醚-乙酸乙酯系统反复分离纯化，得到白色针晶化合物Excisanin D；Excisanin D粗品用比例为90/10的甲醇/水常温条件下静置挥发，72小时得本发明的晶体Excisanin D；
E-1-3部分用比例为3:1二氯甲烷-乙酸乙酯混合溶剂系统及甲醇反复进行等度洗脱，最后得到白色针状晶体化合物Excisanin K；Excisanin K粗品用比例为85/15的甲醇/水常温条件下静置挥发，96小时得本发明的Excisanin K。
2.根据权利要求1所述的制备方法制出的贝壳杉烷型二萜化合物Excisanin D、Excisanin K在制备治疗人结肠癌细胞HCT-116、人乳腺癌细胞231、肝癌细胞HepG2药物或制剂方面的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述制剂为加入药学上可接受的辅料按常规工艺制成药学上可接受的制剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药学上可接受的制剂为固体制剂或液体制剂。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述固体制剂为颗粒剂、丸剂、胶囊剂、片剂、散剂、冻干粉针剂。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述液体制剂为口服液、注射制剂。
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