CN115282135B

CN115282135B - 对映-贝壳杉烷型二萜化合物dka在制备抗肿瘤转移药物或抑制剂中的应用

Info

Publication number: CN115282135B
Application number: CN202210882466.3A
Authority: CN
Inventors: 王建斌; 薛彤; 陈丽; 赵文佳; 董家辉
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-07-26
Filing date: 2022-07-26
Publication date: 2023-07-21
Anticipated expiration: 2042-07-26
Also published as: CN115282135A

Abstract

本发明公开了对映‑贝壳杉烷型二萜化合物DKA在制备抗肿瘤侵袭转移药物或抑制剂中的应用，本发明从豨莶草中分离得到对映‑贝壳杉烷型二萜化合物DKA，并通过transwell试验、划痕试验、小鼠乳腺癌肺转移等试验证实得到的对映‑贝壳杉烷型二萜化合物DKA没有细胞毒活性，可显著抑制细胞迁移，可以显著抑制MDA‑MB‑231乳腺癌细胞肺转移。具有显著的抗肿瘤转移作用，可以用于制备抗肿瘤侵袭转移的药物或抑制剂。

Description

对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA在制备抗肿瘤转移药物或抑制剂中的应用

技术领域

本发明涉及对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA在制备抗肿瘤转移药物或抑制剂中的应用，属于生物制药技术领域。

背景技术

乳腺癌是全世界女性最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着女性的健康。乳腺癌转移是导致其临床失败的主要原因。早期乳腺癌(I期和II期)的治疗过程一般是先进行肿瘤切除手术，然后再进行化疗或放疗，对多数乳腺癌患可以达到治愈目的。然而，化疗药物蒽环霉素类药物有很强的心脏毒性，比如会引发心肌病和心源性晕厥。流行病学研究显示，蒽环霉素类药物化疗结束10-20年后，有50％的乳腺癌患者发生心脏病变，40％的患者会出现心律不齐，5％的患者出现心力衰竭。此外，乳腺癌转移或晚期患者在蒽环霉素类药物化疗结束10年的生存率仅为22％。目前临床应用的药物无法从根本上控制疾病的发生、发展，特别是激素类药物，更因它们广泛的副作用而难于坚持长期用药。因此，从临床应用广泛的传统中药中寻找疗效好、副作用少的先导化合物是抗乳腺癌肿瘤转移药物开发的一条重要途径。

豨莶为菊科(Asteraceae)豨莶属(Siegesbeckia)一年生草本植物。《中国药典》2015年版收载菊科植物豨莶(Siegesbeckia orientalis L.)、腺梗豨莶(Siegesbeckiapubescens M.)和毛梗豨莶(Siegesbeckia glabrescent M.)3种植物的干燥地上部位作为中药豨莶入药。现代药理实验表明豨莶草提取物具有抗炎、抗过敏、抗血栓、抗肿瘤、抗组胺释放的等活性，并且二萜是豨莶草的主要活性成分。对映-16,17-二羟基贝壳杉烷-19-羧酸(Ent-16β,17-dihydroxy-kauran-19-oic acid(DKA))系从豨莶草中分离得到的二萜类化合物，药理活性研究表明其具有较好的抗血栓活性，目前此化合物应用较窄，急需开发其在其他领域中的新用途。

发明内容

发明目的：针对现有技术中存在的技术问题，本发明的目的是提供对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA(对映-16β,17-二羟基贝壳杉烷-19-羧酸)在制备抗肿瘤侵袭转移药物或者抑制剂中的用途。

技术方案：本发明所述对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA在制备抗肿瘤侵袭转移药物中的应用。

本发明还包括对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA在制备抗肿瘤侵袭转移抑制剂中的应用。

其中，所述肿瘤为乳腺肿瘤。

其中，所述对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的制备方法包括如下步骤：

(1)将豨莶草地上干燥部分用乙醇回流提取多次，过滤，收集滤液；

(2)将滤液减压浓缩，得到稠浸膏；

(3)将稠浸膏分散到水中，搅拌均匀，然后用乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯溶液，将乙酸乙酯溶液减压浓缩，得乙酸乙酯部位浸膏；

(4)将乙酸乙酯部位浸膏进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统洗脱，收集氯仿甲醇洗脱部位，再进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯系统洗脱，洗脱15-20个柱体积至有白色粉末或结晶析出，收集该部分洗脱液，将洗脱液浓缩至有大量白色粉末析出，过滤，石油醚-乙酸乙酯冲洗，即得对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA纯化物。

其中，步骤(1)中，所述的多次为3次以上，每次1.5h。

其中，步骤(2)中，将滤液减压浓缩至密度为1.15-1.20g/ml，无明显乙醇气味。

其中，步骤(3)中，稠浸膏与水的质量比为1:20，用乙酸乙酯萃取时乙酸乙酯与水液的体积比为1.5-2:1，萃取三次以上。

其中，步骤(4)中，氯仿甲醇洗脱部位进行硅胶柱层析时使用氯仿-甲醇系统洗脱，氯仿与甲醇的体积比为30:1～10:1，具体分别为30:1、20:1、10:1。

其中，步骤(4)中，氯仿甲醇洗脱部位即氯仿与甲醇的体积比为30:1时收集的液体。

其中，步骤(4)中，将氯仿甲醇洗脱部位进行硅胶柱层析时使用石油醚-乙酸乙酯系统洗脱，石油醚-乙酸乙酯体积比为6:1，冲洗白色粉末时用体积比为6:1～10:1石油醚-乙酸乙酯系统冲洗。

本发明提供了对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的快速制备方法，并通过transwell试验、划痕试验、小鼠乳腺癌肺转移试验证实了该化合物具有显著的乳腺癌抗肿瘤转移的作用。

有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优势：

(1)本发明通过MTT法测定7个浓度下的MDA-MB-231细胞活力显示，对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA没有细胞毒活性。

(2)本发明通过Tanswell小室实验及划痕实验，证明了与Control组相比，本发明对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA可显著抑制细胞迁移。

(3)本发明对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA与Control组相比，各组小鼠体重无显著差异，对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA可以显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞肺转移。

附图说明

图1为对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的制备流程图；

图2为对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的核磁氢谱图；

图3为对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的核磁碳谱图；

图4为MTT实验结果图；

图5为对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA对MBA-MD-231转移的抑制率图；

图6为0-72小时划痕恢复情况图；

图7为划痕愈合率图；

图8为注射不同浓度对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA小鼠4周后的肺部照片；

图9为注射不同浓度对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA小鼠4周后的体重图；

图10为肺组织HE染色图；

图11为肺内转移性病变率图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明技术方案作进一步的说明。

实施例1

1、对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的制备：

制备流程如图1所示：

(1)将豨莶草地上干燥部分5kg，用40L乙醇回流提取3次，每次1.5h，过滤，收集滤液；

(2)将滤液减压浓缩至密度在1.15-1.20g/ml之间的稠浸膏，无明显乙醇味道；

(3)将稠浸膏与水按照1:20的比例分散到水中，搅拌均匀，得到水液，然后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯与水液的体积比为1.5-2:1，萃取三次，合并乙酸乙酯溶液，减压浓缩，得乙酸乙酯部位浸膏；

(4)将乙酸乙酯部位浸膏进行硅胶柱层析，用氯仿—甲醇系统洗脱(氯仿—甲醇的体积比为30:1，20:1，10:1)，收集氯仿-甲醇30:1洗脱部位，再将收集的氯仿-甲醇洗脱部位进行硅胶柱层析，用石油醚-乙酸乙酯系统(石油醚-乙酸乙酯的体积比为6:1)洗脱，洗脱15-20个柱体积至有白色粉末或结晶析出，收集该部分洗脱液，将收集的洗脱液浓缩至有大量白色粉末析出，过滤，用石油醚—乙酸乙酯系统(石油醚—乙酸乙酯体积比为6:1)冲洗，即得对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA纯化物。

2、对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA纯化物的结构确证：

将对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA纯化物白色粉末进行质谱分析，positiveESI-MS m/z 359.5[M+Na]⁺故得出分子量为336，分子式C₂₀H₃₂O₄。

将对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA纯化物进行核磁氢谱及核磁碳谱分析，结果如图2-3所示，图2为对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的核磁氢谱图，由图2可以看出，¹H NMR(Pyridine-d₅,400MHz)谱的高场区有2个单峰甲基峰信号:1.33(3H,s,Me-18),1.17(3H,s,Me-20)，低场区没有显示双键氢信号，有2个连氧碳上的氢信号：4.10(1H,d,J＝10.8Hz,Ha-17)，4.03(1H,d,J＝10.8Hz,Hb-17)。

图3为对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的核磁碳谱图，由图3可以看出，¹³C NMR(Pyridine-d₅,100MHz)给出20个碳原子信号：_C41.0(C-1),19.8(C-2),38.7(C-3),43.9(C-4),57.0(C-5),22.9(C-6),42.7(C-7),44.9(C-8),56.3(C-9),40.0(C-10),19.0(C-11),26.2(C-12),45.9(C-13),37.8(C-14),53.8(C-15),81.6(C-16),66.5(C-17),29.3(C-18),180.1(C-19),16.0(C-20)。

通过上述薄层鉴别及该化合物的核磁数据，确定该化合物为对映-16,17-二羟基贝壳杉烷-19-羧酸，结构式如下：

3、MTT实验：

将对数生长期的MBA-MD-231细胞(购自American Tissue Culture Collection)，调整密度为5000个/孔，接种于96孔板，置于37℃，5％CO₂条件下培养，直至细胞90％融合后，用无血清的Leibovitz's L-15培养基孵育2h使细胞同步化，按照0μM、0.1μM、0.3μM、1μM、3μM、10μM、30μM、100μM分组处理细胞72h后，小心吸去上清，加入90μl含有青霉素(终浓度为100U/mL)、链霉素(终浓度为100μg/mL)、10％FBS的Leibovitz's L-15培养基，再加入10μl MTT溶液，37℃，5％CO₂条件下培养4h，孵育结束后，吸掉上清，每孔加入110μl Formazan溶解液，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值。结果见图4。图4为MTT实验结果图，由图4可以看出，对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA没有细胞毒活性。

4、Tanswell小室法检测对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA对MBA-MD-231细胞转移能力的影响，评价对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA对MBA-MD-231转移的抑制活性：

(1)将MBA-MD-231细胞铺于6孔板，置于37，5％CO₂的孵箱内培养24h使其贴壁，然后加入不同浓度(1μM、5μM、25μM)的DKA样品(含DMSO的DKA水溶液)，置37℃ 5％CO₂孵箱内孵育24h。

(2)孵育后每孔细胞先用1mL 0.25％的胰酶消化，再用含1ml 10％FBS的培养液终止消化，然后1300r/min离心5min，倒出上清，加1ml 0.1％的BM将细胞混匀后，再1300r/min离心5min，计数，将200-300μL细胞密度调成终浓度为5×10⁵细胞悬液，放置在孵箱内备用。

(3)在冰上配制趋化因子EGF，加入趋化小室的下室，每孔30μL；将包被好的聚碳酸酯膜左上角剪角后，光面朝下铺于下室上，放好胶垫，固定上室。

(4)将上述细胞悬液加入上室，每孔50μL，每个样品浓度3个复孔，然后置于CO₂孵箱内培养3.5h后，取出下室，刮去未趋化的细胞，用三步染色试剂进行固定和染色，染色后将膜用石蜡油固定，显微镜下计数。本实验选择2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮(LY294002)作为阳性对照药。对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA对MBA-MD-231转移的抑制活性实验结果如表1和图5所示。

表1不同浓度DKA对MBA-MD-231转移的抑制作用

实验结果显示，对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA在IC₅₀值为1.96(μM)时，对乳腺癌肿瘤细胞转移有50％的抑制作用，其抑制作用稍弱与阳性对照LY294002(2-(4-吗啉基)-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-4-酮盐酸盐)。

5、划痕实验：

(1)划痕实验：按照1μM、5μM、25μM的DKA分组，各组MBA-MD-231细胞培养72h后，弃净培养基，加入1μg/ml丝裂霉素溶液1ml，37℃常规培养箱静置1h；吸净孔内液体，加入1mlPBS溶液(1X，PH 7.4)，以钢尺为标准，10μl枪头垂直于板面以及背侧横线划竖线，弃净孔内液体，用PBS溶液轻轻冲洗3次。加入600μl分别含1％FBS的Leibovitz's L-15培养基，置于37℃培养箱中常规培养。

(2)摄片：划痕后0h、72h后于显微镜下摄片并记录摄片坐标，通过标记背侧面平行线位置，保证每次拍摄部位一致。

(3)分析：以ImageJ软件分析每组细胞划痕面积，计算划痕愈合百分比，重复三次实验。结果见图6-7。图6为0-72小时划痕恢复情况图，由图6可以看出，1μM、5μM、25μM的DKA可以抑制划痕的恢复。图7为划痕愈合率图，由图7可以看出，1μM、5μM、25μM的DKA可以明显抑制划痕愈合，与对照组比具有显著性差异。

6、MBA-MD-231小鼠肺转移抑制实验：

取对数生长期MBA-MD-231细胞，制备细胞悬液浓度为2×10^6cell/ml，裸鼠经尾静脉接种0.2ml/只，建立MBA-MD-231小鼠肺转移模型。

Control组：接种MBA-MD-231细胞，每2天尾静脉注射100μl DMSO，连续4周。

对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA低浓度组(2.5mg/kg)：接种MBA-MD-231细胞，每2天尾静脉注射100μl对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA(终浓度2.5mg/kg)，连续4周。

DKA中浓度组(5mg/kg)：接种MBA-MD-231细胞，每2天尾静脉注射100μl对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA(终浓度5mg/kg)，连续4周。

DKA高浓度组(10mg/kg)：接种MBA-MD-231细胞，每2天尾静脉注射100μl DKA(终浓度10mg/kg)，连续4周。

每周检查一次小鼠体重。接种4周后，二氧化碳法处死所有小鼠，摘除肺，仔细剔除无关组织，用D-Hanks液洗涤2～3次，洗去血液，沥干水分保存。结果见图8-9。图8为注射不同浓度对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA小鼠4周后的肺部照片，由图8可以看出，与Control组相比，DKA(2.5mg/kg,5mg/kg和10mg/kg)均可以显著减少全肺表面肉眼可见转移结节的数量。图9为注射不同浓度对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA小鼠4周后的体重图，由图9可以中看出，各组小鼠体重无显著差异。

7、HE实验：

(1)将固定好的肺组织切成4μm厚的切片，将切片放在烘箱中1h；

(2)将干燥的石蜡切片进行常规二甲苯脱蜡，下行梯度乙醇水化，蒸馏水洗；

(3)加入苏木精染色10min～30min，然后用流水洗去苏木精染液；

(4)1％盐酸乙醇褪色，见切片变红，颜色较浅即可，在放入自来水流水中使其恢复蓝色；

(5)伊红染色1min，流水冲洗；

(6)切片经梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封片；

(7)随机选择一个视野使用显微镜(400×)拍照；

(8)观察计算每只小鼠全肺转移灶数目；

(9)数据分析试验数据组间统计学差异采用one-way ANOVA和Tukey’s检验，P值小于0.05认为有显著性差异。结果见图10-11。

图10为肺组织HE染色图，图11为肺内转移性病变率图，由图10-11可以看出，与Control组相比，DKA(2.5mg/kg,5mg/kg和10mg/kg)均可以显著抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞肺转移。

Claims

1.对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA在制备抗乳腺肿瘤侵袭转移药物中的应用，所述对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的结构式如下：

。

2.对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA在制备抗乳腺肿瘤侵袭转移抑制剂中的应用，所述对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的结构式如下：

。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA的制备方法包括如下步骤：

（1）将豨莶草地上干燥部分用乙醇回流提取多次，过滤，收集滤液；

（2）将滤液减压浓缩，得到稠浸膏；

（3）将稠浸膏分散到水中，搅拌均匀，然后用乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯溶液，将乙酸乙酯溶液减压浓缩，得乙酸乙酯部位浸膏；

（4）将乙酸乙酯部位浸膏进行硅胶柱层析，氯仿-甲醇系统洗脱，收集氯仿甲醇洗脱部位，再进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯系统洗脱，洗脱15-20个柱体积至有白色粉末或结晶析出，收集该部分洗脱液，将洗脱液浓缩至有大量白色粉末析出，过滤，石油醚—乙酸乙酯冲洗，即得对映-贝壳杉烷型二萜化合物DKA纯化物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（1）中，所述的多次为3次以上，每次1.5h。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（2）中，将滤液减压浓缩至密度为1.15-1.20 g/ml，无明显乙醇气味。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（3）中，稠浸膏与水的质量比为1:20，用乙酸乙酯萃取时乙酸乙酯与水液的体积比为1.5-2:1，萃取三次以上。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，氯仿甲醇洗脱部位即氯仿与甲醇的体积比为30:1时收集得到的液体。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤（4）中，将氯仿甲醇洗脱部位进行硅胶柱层析时使用石油醚-乙酸乙酯系统洗脱，石油醚-乙酸乙酯体积比为6:1，冲洗白色粉末时用体积比为6:1~10:1石油醚-乙酸乙酯系统冲洗。