CN102229598A

CN102229598A - 一种对映-贝壳杉型二萜类化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN102229598A
Application number: CN2011101005687A
Authority: CN
Inventors: 白素平; 海广范; 孙彭利; 尚校军; 张崇; 房立真; 梁会娟
Original assignee: Xinxiang Medical University
Current assignee: Xinxiang Medical University
Priority date: 2011-04-21
Filing date: 2011-04-21
Publication date: 2011-11-02
Anticipated expiration: 2031-04-21
Also published as: CN102229598B

Abstract

本发明提供一种结构新颖的对映-贝壳杉型二萜类化合物，特别是蓝萼香茶菜庚素(GLG)。本发明还提供所述化合物的制备方法，采用溶剂室温浸泡，浸提液减压蒸馏，将所得浸膏进行重复硅胶柱层析得到目标化合物。本发明的对映-贝壳杉型二萜类化合物药理作用明显，能够抑制人食管癌细胞(EC-1)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87MG)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人宫颈癌细胞(Hela)、人慢性髓原白血病细胞(K562)、人肝癌细胞(HepG₂)的活性，能够显著减小H₂₂和S₁₈₀荷瘤小鼠瘤体，并对免疫系统无明显抑制作用。本发明进一步提供所述化合物在制备治疗癌症，特别是治疗肝癌、肺癌、脑胶质瘤、乳腺癌、官颈癌、骨髓性白血病、食管癌的药物中的应用。

Description

一种对映-贝壳杉型二萜类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体涉及一种结构新颖的抗癌化合物——对映-贝壳杉型二萜类化合物、特别涉及蓝萼香茶菜庚素(glaucocalyxin G，GLG)，及其制备方法以及在治疗癌症中的应用。

背景技术

唇形科香茶菜属植物，在亚洲东部和非洲西部广为分布，全世界约有150种，我国约有90种25个变种，其中约有30种民间作为药用，具有清热解毒之功效，用于抗癌、消炎、健脾、活血、抗菌。该属植物的化学成分已经做了大量研究，从中提取了四百多种化学成分。经药理筛选发现，该属植物中的许多二萜化合物具有细胞毒、抗癌、抗炎活性。研究还发现，该属植物除富含二萜类成分外，还含有三萜，脂肪酸以及少量的黄酮、倍半萜、链烃等。

香茶菜属植物广泛分布于我国，河南、湖北、四川、贵州、山西、陕西、河北等省均有分布。全草具有抗菌消炎等作用，民间用于治疗急性黄疸型肝炎、急性胆囊炎、跌打损伤、毒蛇咬伤等。对蓝萼香茶菜粗制剂进行了药理作用研究，结果表明其对体内和体外的艾氏腹水癌肿瘤细胞有明显的抑制作用。

蓝萼香茶菜(Isodon japonica var.glaucocalyx)是唇形科香茶菜属植物中的一种，分布于我国的东北、华北地区。河南省山区资源丰富。蓝萼香茶菜具有健脾、清热解毒、活血、抗菌消炎和抗癌活性，用于胃炎、肝炎初期、感冒发热、乳腺炎、关节痛等疾病的治疗。现代研究发现其全草对心血管有一定的作用，而其中的有效成分对血小板聚集及癌症有一定的影响。从上世纪80年代至今，各国学者对其药理及化学等各方面进行了研究，以我国学者研究较多。

1981年许云龙等人从蓝萼香茶菜中提取出蓝萼甲素(glaucocalyxin A)和蓝萼乙素(glaucocalyxin B)，波谱分析推断蓝萼甲素具有香茶菜属二萜典型的15-氧-16-贝壳杉烯(ent-15-oxo-16-kaurene)骨架，而蓝萼乙素是蓝萼甲素的14-乙酰化物。

1988年刘晨江等从北京地区产蓝萼香茶菜中除了分得蓝萼甲素和蓝萼乙素外，还分得蓝萼丙素(glaucocalyxin C)，结构为对映-7β，14α，15α-三羟基-16-贝壳杉-3-酮。Dongsa kimls，除了从中分出蓝萼甲素、蓝萼乙素和蓝萼丙素外，还分出了两种新二萜glaucocalyxin D和glaucocalyxin E，并列出了这五种化合物结构的红外、紫外吸收以及质谱数据，对¹H和¹³C核磁共振化学位移值也做了归属。

2008年陈海生等从辽宁鞍山产蓝萼香茶菜中分离得到两个结构新颖的对映-贝壳杉烷型二萜，蓝萼香茶菜己素(glaucocalyxin F)和蓝萼香茶菜X素(glaucocalyxin X)，并报道了两个化合物的波谱数据。

刘兰娣等研究了蓝萼香茶菜对大鼠全心缺血-再灌注时心肌C-FOS基因表达的影响。采用dortl离体全心缺血-再灌注损伤模型，免疫组化法，用相应C-fos抗体检测心肌细胞中C-fos基因表达情况，蓝萼香茶菜生药用乙醇回流提取3次，提取液回收乙醇，浓缩后加到0.5％淀粉糊中，挥去乙醇，浓度为1Kg/L，分为高中低三种不同浓度的香茶菜对缺血-再灌注全心进行预灌注，结果发现其能明显减少凋亡相关基因C-fos基因的表达，表明心肌缺血-再灌注损伤轻，心肌受到一定的保护，同时发现高浓度蓝萼香茶菜具有一定的心肌细胞毒性作用。其具有与剂量相关的心肌保护作用，但并非浓度越大越有效。

综上所述，蓝萼香茶菜在我国资源丰富。化学研究表明其含有二萜和三萜成分，二萜成分因其母核为对映贝壳杉烯型，类似于冬凌草甲素(oridonin)，故可能具有一定的抗癌作用。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种结构新颖的对映-贝壳杉型二萜类化合物。

本发明的目的之二在于提供所述对映-贝壳杉型二萜类化合物的制备方法。

本发明的目的还在于提供所述对映-贝壳杉型二萜类化合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明所公开的结构新颖的对映-贝壳杉型二萜类化合物分离自唇形科香茶菜属植物蓝萼香茶菜(Isodon japonica var.glaucocalyx)，是一种二萜化合物，具有贝壳杉烷型二萜结构骨架、α-β不饱和环戊酮结构单元和原儿茶缩醛结构单元，其分子结构通式如下：

其中R₁为-OH、OCH₃或OAc；R₂为-OH、OCH₃或OAc。

当R₁、R₂均为-OH时，将化合物命名为蓝萼香茶菜庚素(glaucocalyxin G，GLG)，化学名称为7α，14β-缩原儿茶醛-对映-贝壳杉-16-烯-3，15-二酮。

本发明还公开了所述对映-贝壳杉型二萜类化合物的制备方法，包括如下步骤：

取唇形科香茶菜属植物的叶，干燥粉碎后，加入2-5倍量的提取溶剂浸提，浸提液减压浓缩后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩得30℃时相对密度为1.05-1.25的浸膏；取浸膏溶解后，以D101大孔吸附树脂层析，用80％甲醇-水洗脱，洗脱液减压浓缩得淡黄色粉末，然后以200-300目硅胶柱层析，用氯仿/甲醇以50∶1、30∶1、20∶1、10∶1进行梯度洗脱，对氯仿/甲醇30∶1的洗脱部位进行纯化得到目标化合物。

优选地，所述香茶菜属植物为蓝萼香茶菜。

优选地，所述提取溶剂为甲醇或70％丙酮-水溶液。

优选地，所述浸提为在室温下浸泡2-3次，每次3-5天。

优选地，所述萃取为采用1-2倍量的乙酸乙酯萃取2-3次。

优选地，所述纯化为对氯仿/甲醇30∶1的洗脱部位进行硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯以5∶1、1∶1进行梯度洗脱，取石油醚/乙酸乙酯5∶1洗脱部位，在甲醇中重结晶，得到目标化合物。

所得目标化合物可以与药学上可接受的载体制成片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、注射剂、颗粒剂、滴丸剂或糖浆剂。

本发明进一步公开所述对映-贝壳杉型二萜类化合物在制备抗癌药物中的应用。

本发明所述化合物可以用于食管癌、肺癌、肝癌、脑胶质瘤、乳腺癌、官颈癌、骨髓性白血病等癌症的治疗。

本发明提供的对映-贝壳杉型二萜类化合物为一种结构新颖的二萜化合物，特别是蓝萼香茶菜庚素(GLG)。本发明提供的所述化合物的制备方法，采用溶剂室温浸泡，浸提液减压蒸馏，将所得浸膏进行重复硅胶柱层析即可得到目标化合物，产品纯度高。本发明的对映-贝壳杉型二萜类化合物，特别是GLG，其药理作用明显，能够抑制人食管癌细胞(EC-1)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87MG)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人官颈癌细胞(Hela)、人慢性髓原白血病细胞(K562)、人肝癌细胞(Hep G₂)的活性，能够显著减小H₂₂和S₁₈₀荷瘤小鼠瘤体，并对免疫系统无明显抑制作用。因此，本发明的对映-贝壳杉型二萜类化合物，特别是GLG可以用于制备治疗癌症的药物，特别是制备治疗肝癌、肺癌、脑胶质瘤、乳腺癌、官颈癌、骨髓性白血病、食管癌的药物。

附图说明

图1示出不同剂量GLG对H₂₂荷瘤小鼠肿瘤大小的影响；

图2示出不同剂量GLG对S₁₈₀荷瘤小鼠肿瘤大小的影响；

其中，1：模型组；2：低剂量组；3：中剂量组；4：高剂量组；5：阳性对照组。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

以下实施例中所采用的各种化学试剂如无特别标注，则为分析纯。

实施例1蓝萼香茶菜庚素(GLG)的制备方法

1：粉碎

取蓝萼香茶菜(Isodon japonica var.glaucocalyx)药材的叶子，粉碎至20目；

2：提取

将粉碎物用3倍量70％的丙酮-水混合溶剂在室温下浸泡3天，浸提3次，过滤，合并滤液，浓缩至无丙酮味，得到提取液；将提取液静置过夜，弃去下层固体以除去大量叶绿素，得到上清液；

将上清液与1.5倍量乙酸乙酯混合，搅拌并静置，萃取2次，取上层液合并，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到30℃时相对密度为1.05-1.15的浸膏。

3：D101大孔吸附树脂柱层析

将步骤2所得浸膏用80％甲醇-水加热至完全溶解，得到溶液，缓慢加到D101树脂柱中，观察溶液在树脂中的吸附情况，待溶液被吸附完全后，即采用80％甲醇-水洗脱该树脂柱(除去叶绿素等色素)，收集流出液，减压浓缩，得淡黄色粉末状固体。

4：硅胶柱层析

4.1拌样

步骤3所得淡黄色粉末状固体用甲醇全部溶解并拌入1.5倍量硅胶(200-300目)，溶剂室温挥发至干，得到拌硅胶样品；

4.2上柱

将步骤4.1所得样品缓慢加入到硅胶柱上端；

4.3梯度洗脱

用氯仿/甲醇以50∶1、30∶1、20∶1、10∶1的比例对步骤4.2装好的硅胶柱进行梯度洗脱，分别收集不同梯度的洗脱液。

5：分离纯化

将步骤4.3中氯仿/甲醇30∶1的洗脱部位重新进行硅胶柱层析(200-300目)，用石油醚(60-90℃)/乙酸乙酯以5∶1、1∶1的比例进行梯度洗脱，分别收集不同梯度的洗脱液。对石油醚(60-90℃)/乙酸乙酯5∶1的洗脱部位在甲醇中重结晶，得到针状晶体蓝萼香茶菜庚素(glaucocalyxin G，GLG)。

蓝萼香茶菜庚素光谱数据如下：

白色针状结晶，分子式C₂₇H₃₂O₆；

(c 0.50，吡啶)；IR v_max/cm^-1：3431，1729，1701，1625，1523，1456。

¹H NMR(400MHz，C₅D₅N)：7.65(1H，br s，7′-H)，7.23(2H，brs，3′-H，6′-H)，6.27(1H，s，1′-H)，6.24(1H，s，17a-H)，5.33(1H，s，17b-H)，4.79(1H，br s，14-H)，4.68(1H，dd，J＝12.4，4.8Hz，7-H)，3.19(1H，br s，13-H)，1.10(3H，s，18-H)，1.08(3H，s，20-H)，1.03(3H，s，19-H).

¹³C NMR(100MHz，C₅D₅N)：37.8(C-1)，34.2(C-2)，214.9(C-3)，47.2(C-4)，51.0(C-5)，23.5(C-6)，72.8(C-7)，55.6(C-8)，51.8(C-9)，38.3(C-10)，18.2(C-11)，31.0(C-12)，43.7(C-13)，77.6(C-14)，205.8(C-15)，147.8(C-16)，116.4(C-17)，26.2(C-18)，21.3(C-19)，18.2(C-20)，94.2(C-1′)，131.3(C-2′)，118.5(C-3′)，147.0(C-4′)，148.1(C-5′)，115.9(C-6′)，115.1(C-7′)。

实施例2蓝萼香茶菜庚素(GLG)的制备方法

1：粉碎

2：提取

将粉碎物用4倍量甲醇在室温下浸泡4天，浸提2次，过滤，合并滤液，减压蒸馏除去溶剂甲醇；所得浸膏溶于6倍量热水中，室温下静置过夜，弃去下层固体以除去大量叶绿素，得到上清液；

将上清液与1.5倍量乙酸乙酯混合，搅拌并静置，萃取3次，取上层液合并，减压浓缩，回收乙酸乙酯，得到30℃时相对密度为1.15-1.25的浸膏。

3：D101大孔吸附树脂柱层析

将步骤2所得浸膏用80％甲醇-水加热至完全溶解，得到溶液，缓慢加到树脂柱中，观察溶液在树脂中的吸附情况，待溶液被吸附完全后，即采用80％甲醇-水冲洗该树脂柱(除去叶绿素等色素)，收集流出液，减压浓缩，得淡黄色粉末状固体。

4：硅胶柱层析

4.1拌样

步骤3所得淡黄色固体粉末用甲醇全部溶解并拌入1.5倍量硅胶(200-300目)，溶剂室温挥发至干，得到拌硅胶样品；

4.2上柱

将步骤4.1得到样品缓慢加入到硅胶柱上端；

4.3梯度洗脱

5：分离纯化

将步骤4.3中氯仿/甲醇30∶1的洗脱部位重新进行硅胶柱层析(200-300目)，用石油醚(60-90℃)/乙酸乙酯以5∶1、1∶1的比例进行梯度洗脱，分别收集不同梯度的洗脱液。对石油醚(60-90℃)/乙酸乙酯5∶1的洗脱部位在甲醇中重结晶，得到针状晶体蓝萼香茶菜庚素(glaucocalyxin G，GLG)。化合物光谱数据同实施例1。

实施例3GLG注射剂的制备

包合物的制备：取蓝萼庚素原料适量，加少许无水乙醇溶解备用。另取γ-CD适量，置茄形瓶中，加少量水使溶解，置于磁力搅拌器上，水浴60℃恒温搅拌，同时缓慢滴加上述GLG的乙醇溶液，滴加完成后继续保温搅拌4h。将溶液用旋转蒸发仪70℃减压蒸出溶剂，然后置于真空干燥箱中50℃干燥，得GLG的γ-CD包合物。

注射剂配制：称取GLG-γ-CD包合物适量，按比例溶于一定体积注射用生理盐水，用微孔滤膜过滤，分装入安剖，灭菌，抽取样品测定含量，贴签标出含量。

实施例4GLG片剂的制备

配方：GLG 350mg、乳糖120mg、MCC 50mg、硬脂酸镁5mg。

制备方法：将GLG、乳糖及MCC混合均匀，用水润湿，然后过筛，干燥，再次过筛，然后加入硬脂酸镁，混合均匀，压片。

实施例5GLG硬胶囊剂的制备

配方：GLG 350mg、乳糖80mg、硬脂酸镁5mg。

制备方法：将GLG、乳糖混合均匀，用水润湿，然后过筛，干燥，再次过筛，然后加入硬脂酸镁，混合均匀，装入硬胶囊。

实施例6GLG软胶囊剂的制备

配方：GLG 350mg、聚乙二醇400 700mg。

制备方法：将处方量的GLG、聚乙二醇400研磨均匀，通过机械压制成适宜的软胶囊。

实施例7GLG滴丸剂的制备

配方：GLG 350mg、聚乙二醇60001050mg、无水乙醇适量。

制备方法：将GLG用适量无水乙醇微热溶解，加入聚乙二醇6000熔融液中(80℃水浴保温)，搅拌混合均匀，蒸除乙醇，继续保温静置，除去气泡，然后通过滴丸设备制备成滴丸。

实施例8GLG糖浆剂的制备

配方：GLGγ-CD包合物(含纯药)3.5g、纯净水适量(约30ml)、单糖浆加至100ml。

制备方法：将处方量的GLGγ-CD包合物用适量的纯净水研磨均匀，搅拌下加入到适量单糖浆中，添加单糖浆至足量搅匀即可。

实施例9GLG颗粒剂的制备

配方：GLGγ-CD包合物(含纯药)3.5g、蔗糖20g、糊精26.5g、纯净水适量。

制备方法：将处方量的GLGγ-CD包合物、蔗糖、糊精混合均匀，加入适量纯净水制成软材，过16目筛制颗粒，干燥，按照每袋5g分装成10袋。

实验例1蓝萼香茶菜庚素(GLG)药效学实验

一、体外实验

1、实验材料

1.1药品与试剂：新生小牛血清(杭州四季青公司)、MEM培养液(Gibco公司)、RPMI1640培养液(Gibco公司)、胰酶(Gibco公司)、MTT(郑州博兴生物科技有限公司)；GLG(白色粉末，纯度＞98％，按照实施例1的方法制备得到)；5-氟尿嘧啶(上海旭东药业有限公司，批号：091102)。

1.2供试细胞：人食管癌细胞(EC-1)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87MG)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人官颈癌细胞(Hela)、人慢性髓原白血病细胞(K562)、Hep G₂细胞均由上海中科院细胞库提供。

以上细胞在含有10％(体积百分数)新生小牛血清，100U/mL青霉素，100U/mL链霉素的MEM或RPMI1640培养液中生长，在37℃的温度下，5％(体积分数)CO₂的培养箱中培养，2天更换一次培养液，培养瓶铺满时用2.5g/L胰酶消化传代，细胞培养至对数期。

1.3仪器：CO₂培养箱(MCO-15AC，SANYO)、自动酶标仪(Mk3，美国Thermro生产)、倒置显微镜(XDS-200D，上海蔡康光学仪器有限公司)。

1.4统计方法：采用SPSS-12.0进行统计学处理，计量资料均用

表示。

2、方法与结果

2.1配制GLG药物原液：定量称取4.51mg(0.01mmol)GLG粉末，加入0.5mL DMSO溶解后用0.5mL培养液稀释，配制成1×10⁴μmol/L的GLG药物原液，备用。

2.2MTT法测定GLG对人食管癌细胞(EC-1)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87MG)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人官颈癌细胞(Hela)、人慢性髓原白血病细胞(K562)、Hep G₂细胞的抑制作用：取培养至对数生长期的上述细胞，细胞计数约3-5×10⁴个/mL(K562细胞为2.5×10⁵个/mL)，接种于96孔板中，每孔液体100μL，细胞贴壁后(除K562细胞)倾去原液；然后加入含有0.3％体积分数的胎牛血清的培养液，饥饿培养；24h后更换培养液，并加入GLG药物原液，分别配制成0.16μmol/L、0.32μmol/L、0.63μmol/L、1.25μmol/L、2.5μmol/L、5μmol/L和10μmol/L七个不同浓度作为测定组，同时设置正常细胞和等浓度的5-氟尿嘧啶作为对照组(每组设置6个复孔)，继续培养24h；然后每孔加入20μL MTT，4h后倾去所有液体，加入150μL DMSO，使固体溶解，在37℃温度下静置0.5h；用自动酶标仪在570nm的波长下检测，630nm波长下参考；计算GLG对上述细胞半数抑制浓度(IC₅₀)。抑制率＝(1-测定组OD值/正常对照组OD值)×100％。结果如表1所示。

表1GLG对各种肿瘤细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)

注：与阳性对照组相比^△P＜0.05，^△△P＜0.01

结果表明，GLG对EC-1细胞、U87MG细胞、Hela细胞、K562细胞、MCF-7细胞、Hep G₂细胞均具有较强的细胞毒性，与阳性对照组相比，GLG对EC-1细胞作用与5-氟尿嘧啶作用相当，对A549细胞作用不及5-氟尿嘧啶强，对U87MG细胞、Hela细胞、K562细胞、MCF-7细胞、Hep G₂细胞杀伤作用均较5-氟尿嘧啶强。

二、体内实验——GLG对H₂₂荷瘤小鼠移植性肿瘤生长的抑制作用

1.材料与方法

1.1实验动物及瘤株昆明种小鼠，由新乡医学院动物实验中心提供，雄性，体重20±2g。H₂₂小鼠肝癌细胞，购自南京凯基生物有限公司，瘤株按常规方法传代接种。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂

GLG注射液(按照实施例3的方法制备得到)；注射用环磷酰胺白色粉末，产品批号09123121，江苏恒瑞医药股份有限公司；

1.2.2仪器

血细胞计数板，浙字26270107号，浙江玉环县五金光学仪器厂；电子称量计数天平，浙制00000589，余姚市金诺天平仪器有限公司；LDZX-50KBS立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；101-2型电热鼓风恒温干燥箱，江苏金坛市佳美仪器有限公司；80-2型离心沉淀机，江苏金坛市中大仪器厂；

1.3实验方法

1.3.1H₂₂细胞悬液的制备

无菌条件下操作，取接种8d的H₂₂荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，见其腹部明显膨隆，手轻触有明显波动性，脱臼断颈处死，置于一洁净玻璃烧杯中，75％乙醇消毒，保持数分钟后取出，移入超净台，用5ml无菌注射器吸出该腹腔积液，观察无明显血性。缓缓注入15ml离心管中，补充适量生理盐水至10ml左右，轻轻吹打混匀，800rmin离心10min，弃上清。重复上述洗涤过程一次，适量生理盐水均匀悬浮细胞。常规细胞计数，以生理盐水调整细胞终浓度至1×10⁷个/ml，接种备用。

1.3.2模型制作

于无菌条件下，左手固定小鼠，将小鼠左侧腋部皮肤常规酒精消毒后右手持1ml无菌注射器于小鼠右腋部皮下注射0.15ml(瘤细胞数1×10⁷个/ml)H₂₂瘤细胞悬液制成局灶性肿瘤模型。

1.3.3实验动物分组及给药

实验动物50只左腋下接种H₂₂瘤细胞悬液24小时后称重，随机分为模型组、环磷酰胺阳性对照组(10mg/kg)、GLG高剂量(80mg/kg)、中剂量(40mg/kg)、低剂量组(20mg/kg)。各组给药途径均为腹腔注射，模型组给予等量生理盐水，共给药12d。

1.3.4.检测指标及方法

末次给药后24h称体重，再以颈椎脱臼法处死小鼠，进行如下指标的检测：

(1)对小鼠瘤重的影响

实验结束颈椎脱臼处死小鼠，消毒、剪开左腋部皮肤，剥离包膜取出瘤块，于电子称量计数天平上称湿瘤重，比较各组小鼠的瘤重，计算抑瘤率。抑瘤率是评价药物对实体瘤生长抑制作用的常用指标，计算公式如下：

抑瘤率＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％

(2)对机体免疫功能的影响

取出小鼠胸腺和脾脏，于电子称量计数天平上称湿重，按下公式计算胸腺指数和脾指数。

胸腺指数＝胸腺重量(mg)/体重(g)

脾指数＝脾脏重量(mg)/体重(g)

(3)大体形态观察观察所取小鼠H₂₂肿瘤瘤块，观察瘤组织弥散程度、坏死情况，与肌肉、血管、皮肤等组织的粘连情况。

(4)统计学处理

实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS11.0统计软件中的单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行统计学处理，P＜0.05为差异有统计学意义。

2、实验结果

2.1GLG对小鼠瘤重的影响

GLG高、中、低剂量组均能抑制小鼠H₂₂肿瘤的生长，与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)，且高、中剂量组抑瘤率均大于30％；阳性药环磷酰胺也能明显抑制H₂₂的生长(P＜0.05)，抑瘤率为77.14％(见表2)。

表2蓝萼香茶菜庚素对H₂₂小鼠瘤重的影响

注：与模型组相比P＜0.05

2.2GLG对小鼠免疫系统的影响

胸腺和脾都是重要的免疫器官，胸腺指数和脾指数的大小往往反应机体免疫系统的机能状况。蓝萼香茶菜庚素对H₂₂小鼠免疫器官的影响见表3。

表3蓝萼香茶菜庚素对H₂₂小鼠免疫器官的影响

注：与模型组相比*P＜0.05

GLG高、中、低剂量组与模型组比较，动物的胸腺指数和脾指数均无明显变化(P＞0.05)。而阳性药CTX则引起荷瘤小鼠胸腺指数和脾指数明显减小(P＜0.01)(见表3)，GLG对小鼠免疫系统无明显影响。

2.4大体形态观察

模型组癌细胞广泛向肌肉组织内侵入，与胸壁肌肉和上肢肌肉粘连，部分瘤体中心出现大面积液化坏死，并有部分小鼠出现皮肤溃破现象；而GLG中、低剂量组瘤组织部分稍有侵袭浅肌层，瘤体中心有少量坏死；GLG高剂量组及阳性对照组瘤体较小，上述现象比较轻微。见图1。

鉴此，GLG对小鼠H₂₂实体瘤均有明显的抑制作用，对荷瘤小鼠的免疫功能无明显影响。

三、体内实验——GLG对S₁₈₀荷瘤小鼠移植性肿瘤生长的抑制作用

1.材料与方法

1.1实验动物及瘤株：昆明种小鼠，由新乡医学院动物实验中心提供，雄性，体重20±2g，常规饲料喂养，饮水量不限。瘤株：肉瘤S₁₈₀实体型，购自南京凯基生物有限公司，瘤株按常规方法传代接种。

1.2试剂与仪器

1.2.1试剂

1.2.2仪器

血细胞计数板，浙字26270107号，浙江玉环县五金光学仪器厂；电子称量计数天平，浙制00000589，余姚市金诺天平仪器有限公司；LDZX-50KBS立式电热压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；101-2型电热鼓风恒温干燥箱，江苏金坛市佳美仪器有限公司；80-2型离心沉淀机，江苏金坛市中大仪器厂。

1.3实验方法

1.3.1S₁₈₀细胞悬液的制备

无菌条件下操作，取接种10d左右的S₁₈₀荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，仰卧固定于小动物解剖台，先后用碘伏和酒精消毒动物腹部皮肤，用5ml无菌注射器依次穿过腹部皮肤、皮下组织、肌肉、腹膜进入腹腔，吸取肿瘤细胞生长良好的腹水(腹水为乳白色浓稠液体，若为黄色或有大量红细胞的血性腹水则弃之不用)，所抽腹水放入离心管内，放置于冰盒上。另将注射器中剩余的腹水加一滴于血球计数板上，于显微镜下观察，进行细胞计数，其中瘤细胞个数应为1×10⁷个/ml，腹水用无菌生理盐水稀释成于细胞计数板下瘤细胞数达1×10⁷个/ml的细胞悬液，整个操作在冰盒上进行。

1.3.2模型制作

于无菌条件下，左手固定小鼠，将小鼠左侧腋部皮肤常规酒精消毒后右手持1ml无菌注射器于小鼠左腋部皮下注射0.15ml(瘤细胞数1×10⁷个/ml)S₁₈₀瘤细胞悬液制成局灶性肿瘤模型。在操作过程中注意紧贴皮下进针，勿扎入过深，以免伤及胸膜腔或内脏。

1.3.3实验动物分组及给药

实验用雄性昆明纯种小鼠50只左腋下接种S₁₈₀瘤细胞悬液24小时后称重，随机分为模型组、环磷酰胺阳性对照组、GLG注射液高、中、低剂量组，每组10只进行编号标记。各组给药途径均为腹腔注射，剂量分别为环磷酰胺阳性对照组(10mg/kg)、GLG高剂量(80mg/kg)、中剂量(40mg/kg)、低剂量(20mg/kg)，模型组给予等量生理盐水，共给药12d。

1.3.4.检测指标及方法

末次给药后24小时称体重，再以颈椎脱臼法处死小鼠，进行如下指标的检测：

(1)对小鼠瘤重的影响

(2)对机体免疫功能的影响

胸腺指数＝胸腺重量(mg)/体重(g)

脾指数＝脾脏重量(mg)/体重(g)

(3)大体形态观察观察所取小鼠S₁₈₀肿瘤瘤块，观察瘤组织弥散程度、坏死情况，与肌肉、血管、皮肤等组织的粘连情况。

(4)统计学处理

采用SPSS 13.0统计软件分析实验结果，结果用

表示，组间比较用t检验。以P＜0.05(显著性)作为有差异的标志。

2.结果

2.1动物的一般体征模型组小鼠于一周后出现行动迟缓、体毛枯疏、呼吸深迟，有死亡发生；环磷酰胺阳性对照组、GLG大、中、小剂量组小鼠亦有行动迟缓、呼吸深迟等体征出现，也有死亡现象，但较模型组变化轻。各组小鼠在接种3d后用手可触摸到瘤块，但尚无法比较各组瘤体大小，7d后出现肉眼可见明显瘤块。

2.2GLG对小鼠瘤重的影响

蓝萼香茶菜庚素高、中、低剂量组与模型组相比瘤体小，重量轻；其中蓝萼香茶菜庚素高、中剂量组与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)，且高、中剂量组抑瘤率均大于30％(见表4)。

表4GLG对荷S₁₈₀肿瘤小鼠瘤重的影响

注：*与模型组相比P＜0.05

2.3蓝萼香茶菜庚素对小鼠免疫系统的影响

胸腺和脾都是重要的免疫器官，胸腺指数和脾指数的大小往往反应机体免疫系统的机能状况(见表5)。

表5GLG对荷S₁₈₀肿瘤小鼠免疫器官的影响

注：*与模型组相比P＜0.05

由上表5可以得出GLG高、中、低剂量组与模型组相比无显著性差异(P＞0.05)，环磷酰胺阳性对照组与模型组相比有显著性差异(P＜0.05)，GLG对荷S₁₈₀肿瘤小鼠免疫器官的影响并不明显。

2.4大体形态观察

模型组癌细胞广泛向肌肉组织内侵入，与胸壁肌肉和上肢肌肉粘连，部分瘤体中心出现大面积液化坏死，并有部分小鼠出现皮肤溃破现象；而GLG中、低剂量组瘤组织部分稍有侵袭浅肌层，瘤体中心有少量坏死；GLG高剂量组及阳性对照组瘤体较小，上述现象比较轻微。见图2。

鉴此，GLG有明显的抑瘤作用和抗癌作用，与模型组相比差异有显著性。高剂量组抑瘤率达到61.56％，与阳性对照组相比有相等的抗癌作用。通过胸腺指数和脾指数检测，GLG对动物免疫系统无明显的抑制作用。GLG可成为一种高效低毒的抗癌药物。

本发明的对映-贝壳杉型二萜化合物中，当R₁为OCH₃或OAc、R₂为OCH₃或OAc时，按照实验例1同法进行实验，结果表明，R₁为OCH₃或OAc、R₂为OCH₃或OAc时，本发明的化合物也具有对人食管癌细胞(EC-1)、人脑星形胶质母细胞瘤细胞(U87MG)、人肺癌细胞(A549)、人乳腺癌细胞(MCF-7)、人官颈癌细胞(Hela)、人慢性髓原白血病细胞(K562)、Hep G₂细胞增殖的抑制作用，并且也具有体内抑制H₂₂和S₁₈₀荷瘤小鼠肿瘤增长的效应。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一类对映-贝壳杉型二萜类化合物，其分子结构通式如下：

其中R₁为-OH、OCH₃或OAc；R₂为-OH、OCH₃或OAc。

2.根据权利要求1所述的对映-贝壳杉型二萜类化合物，其特征在于，所述化合物的分子结构通式中，R₁为-OH，R₂为-OH。

3.权利要求1或2所述的对映-贝壳杉型二萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：取唇形科香茶菜属植物的叶，干燥粉碎后，加入2-5倍量的提取溶剂浸提，浸提液减压浓缩后用乙酸乙酯萃取，萃取液减压浓缩得30℃时相对密度为1.05-1.25的浸膏；取浸膏溶解后，以D101大孔吸附树脂层析，用80％甲醇-水洗脱，洗脱液减压浓缩得淡黄色粉末，然后以200-300目硅胶柱层析，用氯仿/甲醇以50∶1、30∶1、20∶1、10∶1进行梯度洗脱，对氯仿/甲醇30∶1洗脱部位进行纯化得到目标化合物。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述香茶菜属植物为蓝萼香茶菜。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述提取溶剂为甲醇或70％丙酮-水溶液。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述浸提为在室温下浸泡2-3次，每次3-5天。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述萃取为采用1-2倍量的乙酸乙酯萃取2-3次。

8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述纯化为对氯仿/甲醇30∶1的洗脱部位进行硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯以5∶1、1∶1进行梯度洗脱，取石油醚/乙酸乙酯5∶1洗脱部位，在甲醇中重结晶，得到目标化合物。

9.权利要求1或2所述的对映-贝壳杉型二萜类化合物在制备抗癌药物中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用包括对映-贝壳杉型二萜类化合物在制备治疗肝癌、肺癌、脑胶质瘤、乳腺癌、官颈癌、骨髓性白血病和食管癌的药物中的应用。