CN105920064A - 以西洋参茎叶为原料提取分离出的天然活性成分及其应用 - Google Patents
以西洋参茎叶为原料提取分离出的天然活性成分及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了以西洋参茎叶为原料提取分离出的天然活性成分及其应用，通过如下步骤制备：步骤S1，收割新鲜西洋参茎叶，阴干；步骤S2，阴干的西洋参茎叶烘干，粉碎过20～30目筛，得茎叶细粉；步骤S3，将茎叶细粉用70～90％乙醇热回流提取2～3次，每次1～2小时，收集滤液；步骤S4，滤液减压浓缩至无醇味，用AB‑8型大孔树脂富集，先用10～20％乙醇洗脱6～10个柱体积，再用70～80％乙醇洗脱12～16个柱体积，收集70～80％乙醇洗脱液；步骤S5，70～80％乙醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得西洋参茎叶提取物。本发明提取物具有较好活性，可用于制备药品、功能食品或保健品；本发明提取物的制备原料为被遗弃的西洋参茎叶，是对植物加工废弃物的充分利用，产业价值高，具有突出的实质性特点和显著的进步。
Description
技术领域
本发明属于植物提取物领域，涉及天然活性成分的提取分离与应用，具体涉及以西洋参茎叶为原料提取分离出的天然活性成分及其应用。
背景技术
西洋参茎叶是一种公认的珍贵药材，有其根部所不具备的药用价值，但以往由于提取设备与方法的局限一直没有得到有效开发。
以山东省文登市的西洋参种植产业为例，药农在种植西洋参的过程中，只研究如何增加西洋参的产量，却忽视了对西洋参茎叶的开发利用。据测定，西洋参叶子中的皂甙和多糖等有效成分的含量高达10％以上，是西洋参根中含量的2倍。如果在西洋参生长的3～5年的周期里，把茎叶中的有效成分全部提炼出来，就相当于这一株西洋参根中药效成分的含量。也就是说，在种植西洋参的过程中，因为没有开发利用西洋参茎叶，而把生产出来的药效成分丢掉了一半。这是一种极大的资源浪费。
因此，西洋参茎叶的提取分离方法研究以及提取分离出的天然产物的用途研究迫在眉睫。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物，该提取物中含有多种天然活性成分；
本发明的第二目的在于提供上述提取物在制备药品、功能食品或保健品方面的应用。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物，通过如下步骤制备而成：
步骤S1，收割新鲜的西洋参茎叶，阴干；
步骤S2，将已收割回来阴干的西洋参茎叶烘干，粉碎过20～30目筛，得茎叶细粉；
步骤S3，将茎叶细粉用70～90％乙醇热回流提取2～3次，每次1～2小时，过滤收集滤液；
步骤S4，滤液减压浓缩至无醇味，用AB-8型大孔吸附树脂纯化富集，先用10～20％的乙醇洗脱6～10个柱体积，再用70～80％乙醇洗脱12～16个柱体积，收集70～80％乙醇洗脱液；
步骤S5，70～80％乙醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得干粉状的西洋参茎叶提取物。
进一步地，步骤S2中烘干的温度为40～60℃。
进一步地，步骤S3中茎叶细粉用80％乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤收集滤液。
进一步地，步骤S4先用15％的乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱14个柱体积，收集75％乙醇洗脱液。
为了充分利用西洋参茎叶提取物，本发明提供了上述以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备增强机体免疫力的药品、功能食品或保健品方面的应用。
为了充分利用西洋参茎叶提取物，本发明提供了上述以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备增强机体抗疲劳缺氧的药品、功能食品或保健品方面的应用。
为了充分利用西洋参茎叶提取物，本发明提供了上述以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备降血糖的药品、功能食品或保健品方面的应用。
为了充分利用西洋参茎叶提取物，本发明提供了上述以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备降血压的药品、功能食品或保健品方面的应用。
为了充分利用西洋参茎叶提取物，本发明提供了上述以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备降血脂的药品、功能食品或保健品方面的应用。
为了充分利用西洋参茎叶提取物，本发明提供了上述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备抗肿瘤的药品、功能食品或保健品方面的应用。
本发明的优点：
(1)本发明提供的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物经过充分的工艺优化，具有较好的增强机体免疫力、增强机体抗疲劳缺氧能力、降血糖、降血压、降血脂和抗肿瘤功能，可以用于制备具有上述功能的药品、功能食品或保健品；
(2)本发明提取物的制备原料为被遗弃的西洋参茎叶，是对植物加工废弃物的充分利用，产业价值高，与现有技术相比，具有突出的实质性特点和显著的进步。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
实施例1：西洋参茎叶提取物的制备
本实施例提取物通过如下步骤制备而成：
步骤S1，收割新鲜的西洋参茎叶，阴干；
步骤S2，将已收割回来阴干的西洋参茎叶50℃烘干，粉碎过20目筛，得茎叶细粉；
步骤S3，将茎叶细粉用80％乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤收集滤液；
步骤S4，滤液减压浓缩至无醇味，用AB-8型大孔吸附树脂纯化富集，先用15％的乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱14个柱体积，收集75％乙醇洗脱液；
步骤S5，75％乙醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得干粉状的西洋参茎叶提取物。
实施例2：西洋参茎叶提取物的制备
本实施例提取物通过如下步骤制备而成：
步骤S1，收割新鲜的西洋参茎叶，阴干；
步骤S2，将已收割回来阴干的西洋参茎叶50℃烘干，粉碎过20目筛，得茎叶细粉；
步骤S3，将茎叶细粉用80％乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤收集滤液；
步骤S4，滤液减压浓缩至无醇味，用AB-8型大孔吸附树脂纯化富集，先用10％的乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱14个柱体积，收集75％乙醇洗脱液；
步骤S5，75％乙醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得干粉状的西洋参茎叶提取物。
实施例3：西洋参茎叶提取物的制备
本实施例提取物通过如下步骤制备而成：
步骤S1，收割新鲜的西洋参茎叶，阴干；
步骤S2，将已收割回来阴干的西洋参茎叶50℃烘干，粉碎过20目筛，得茎叶细粉；
步骤S3，将茎叶细粉用80％乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤收集滤液；
步骤S4，滤液减压浓缩至无醇味，用AB-8型大孔吸附树脂纯化富集，先用20％的乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱14个柱体积，收集75％乙醇洗脱液；
步骤S5，75％乙醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得干粉状的西洋参茎叶提取物。
实施例4：对比实施例，步骤S4先用8％的乙醇洗脱8个柱体积
本实施例提取物通过如下步骤制备而成：
步骤S1，收割新鲜的西洋参茎叶，阴干；
步骤S2，将已收割回来阴干的西洋参茎叶50℃烘干，粉碎过20目筛，得茎叶细粉；
步骤S3，将茎叶细粉用80％乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤收集滤液；
步骤S4，滤液减压浓缩至无醇味，用AB-8型大孔吸附树脂纯化富集，先用8％的乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱14个柱体积，收集75％乙醇洗脱液；
步骤S5，75％乙醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得干粉状的西洋参茎叶提取物。
实施例5：对比实施例，步骤S4先用22％的乙醇洗脱8个柱体积
本实施例提取物通过如下步骤制备而成：
步骤S1，收割新鲜的西洋参茎叶，阴干；
步骤S2，将已收割回来阴干的西洋参茎叶50℃烘干，粉碎过20目筛，得茎叶细粉；
步骤S3，将茎叶细粉用80％乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤收集滤液；
步骤S4，滤液减压浓缩至无醇味，用AB-8型大孔吸附树脂纯化富集，先用22％的乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱14个柱体积，收集75％乙醇洗脱液；
步骤S5，75％乙醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得干粉状的西洋参茎叶提取物。
实施例6：效果实施例(增强机体免疫力的作用)
1、材料与方法
1.1动物
纯系BALB/C小鼠，由遵义医学院病生教研室传代繁殖。鼠龄2～3月，体重20～24g。
1.2试剂与样品
分别按实施例1～5方法制备提取物1～5。氢化可的松(扬州制药厂)。
1.3仪器
一次性使用无菌注射器(扬州市长城医疗器械厂)，荧光显微镜(X71，日本OLYPUS公司)，紫外分光光度计(美国Eppendorf公司)。
1.4小鼠分组及模型制备
取小鼠70只，雌雄不拘，随机分为7组，每组10只，随机将7组动物定为分别为正常对照组、模型对照组、提取物1～5组。模型对照组、提取物1～5组采用每天每只肌注氢化可的松(5mg/100ml)0.2ml的方法复制免疫力低下模型；同时，提取物1～5组每天灌胃给药提取物1～5，每只0.2g/kg，其余组则分别给同体积的生理盐水，每天1次，连续1wk，末次给药后2h，将小鼠称重处死，摘取肝、胸腺及脾脏称重，计算器官系数(mg/100g)。
1.5统计学方法
用SPSS18.0版统计软件进行单因素方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2、实验结果
2.1对免疫功能低下模型小鼠免疫器官系数(器官重量/体重)的影响
模型组动物的肝、胸腺系数、脾系数均明显低于正常对照组，说明模型复制成功(P＜0.05)；与模型对照组比较，提取物1～3组肝、脾和胸腺的重量明显增加(P＜0.01)；与模型对照组比较，提取物4、5组肝、脾和胸腺的重量无明显增加(P＞0.05)。结果见表1。
表1对免疫功能低下模型小鼠免疫器官系数(器官重量/体重)的影响
| 组别 | 肝系数×10-2 | 脾系数×10-3 | 胸腺系数×10-3 |
| 正常对照组 | 5.08 | 0.75 | 0.37 |
| 模型对照组 | 4.52 | 0.40 | 0.21 |
| 提取物1组 | 5.07 | 0.73 | 0.36 |
| 提取物2组 | 4.98 | 0.70 | 0.32 |
| 提取物3组 | 4.96 | 0.71 | 0.33 |
| 提取物4组 | 4.55 | 0.42 | 0.24 |
| 提取物5组 | 4.54 | 0.43 | 0.24 |
上述试验结果表明，本发明提供的提取物可以增强机体的免疫力，这与AB-8型大孔吸附树脂纯化富集方法有关。
实施例7：效果实施例(增强机体抗疲劳缺氧能力的作用)
本实施例使用游泳实验和常压耐缺氧实验制备疲劳缺氧小鼠模型，观察药物改善小鼠的无负重游泳时间和常压耐缺氧时间等方面的抗疲劳缺氧作用。
1、材料与方法
1.1动物
封闭群昆明种小鼠，♂，8周龄，体质量18～22g，购自沈阳医学院动物实验中心。动物饲养在温度(22±1)℃、相对湿度55％～65％、12h光照周期的通风干燥环境中，采用大小鼠维持料1022饲养。
1.2试剂与样品
分别按实施例1～5方法制备提取物1～5。
1.3仪器
选用规格为60cm×30cm×50cm恒温玻璃缸作游泳槽，用于测定无负重游泳时间，用250ml密闭容器测定常压耐缺氧时间。
1.4小鼠分组及疲劳模型制备
测定清洁级昆明种小鼠60只，按体重随机分为6组，即模型对照组、提取物1～5组，每组10只；提取物1～5组每天灌胃给药提取物1～5，每只0.2g/kg，其余组则分别给同体积的生理盐水，每天1次，连续灌胃3天，于实验的第4天行常温无负重力竭游泳。于实验的第4天早8时，将每组小鼠分别投入40cm水温为(25±2)℃的水槽中行无负重力竭游泳实验，游泳过程用专人不断轻轻搅动水面，使之不停运动。当小鼠沉没水中超过10s，捞出后不能完成反正翻射时预示体力已处于耗竭状态，故可记录小鼠从入水到疲劳时所需时间。
1.5常压耐缺氧时间的测定
提取物1～5组每天灌胃给药提取物1～5，每只0.2g/kg，其余组则分别给同体积的生理盐水，每天1次，连续灌胃3天，于实验的第4天，将每组小鼠分别置于预先加有10g钠石灰的250ml密闭容器中，瓶口用凡士林涂封，以死亡为指标，用秒表记录存活时间。
1.6统计学方法
实验数据用均数±标准差(x±s)表示，应用SPSS12.0版统计软件进行单因素方差分析和t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2、实验结果
2.1对疲劳模型小鼠抗疲劳能力的影响
与模型对照组比较，提取物1～3组小鼠实验后，游泳时间均延长，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，提取物4、5组游泳时间无显著变化，抗疲劳能力无明显增强。结果见表2。
2.2对缺氧模型小鼠耐缺氧能力的影响
与模型对照组比较，提取物1～3组小鼠实验后，缺氧时间均延长，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，提取物4、5组缺氧时间无显著变化，小鼠的耐缺氧能力无显著增强。结果见表2。
表2对疲劳模型小鼠游泳时间和缺氧模型小鼠缺氧时间的影响
| 组别 | 游泳时间(min) | 缺氧时间(min) |
| 模型对照组 | 114.2 | 31.5 |
| 提取物1组 | 437.5 | 64.5 |
| 提取物2组 | 418.5 | 60.5 |
| 提取物3组 | 420.0 | 61.5 |
| 提取物4组 | 119.5 | 36.5 |
| 提取物5组 | 118.0 | 36.0 |
上述试验结果表明，本发明提供的提取物具有抗疲劳抗缺氧作用，这与AB-8型大孔吸附树脂纯化富集方法有关。
实施例8：效果实施例(降血糖、降血压和降血脂作用)
1、材料与方法
1.1试验仪器
Thermo6500二氧化碳培养箱，EosBravoW全自动生化分析仪，金净JJ-CJ-2F洁净工作台，BioTekELX800酶标仪，ZEISSAxiovert40CFL倒置显微镜。
1.2材料与试剂
分别按实施例1～5方法制备提取物1～5。人肝癌胚胎瘤细胞HepG2购自中国典型培养物保藏中心。特级胎牛血清，RPMI1640培养基，Gibco公司。葡萄糖酶法测定试剂盒，购自南京建成生物工程研究所。胰蛋白酶，购自Sigma公司。人注射用胰岛素，购自万邦生化医药公司。清洁级昆明种小鼠，体质量18～22g，第三军医大学动物室提供。
1.3细胞降糖试验
将消化并稀释好的HepG2细胞加入到96孔板中，待细胞铺满率达80％，换掉原培养基，用PBS缓冲液清洗1次，将96孔板随机分组，分别为正常对照组和提取物1～5组(5mg·L-1)。每组每孔加入250μl含药或不含药的培养液。24h后利用葡萄糖酶法测定试剂盒于全自动生化分析仪中利用终点法，在505nm波长下检测培养液中葡萄糖剩余量。
1.4动物降血糖实验
清洁级昆明种小鼠，体质量18～22g，购自第三军医大学动物室。小鼠平衡饲养3d后，饥饿12h，然后尾部静脉注射四氧嘧啶(70mg·kg-1)。3d后，检测血糖。取血糖为10～25mmol/L的小鼠作为高血糖模型小鼠，按照血糖分为8组，每组10只。分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组(胃盐酸胍，100mg·kg-1)和提取物1～5组(100mg·kg-1)。高糖模型对照组灌胃蒸馏水，灌胃药物7d，饥饿12h，测定空腹血糖值。
1.5统计方法
用SPSS19.0做显著性检验。
2、实验结果
2.1对HepG2降糖实验的影响
与正常对照组比，提取物1～3组对葡萄糖消耗量明显增加(P＜0.01)；与正常对照组比，提取物4、5组对葡萄糖的消耗量无明显增加(P＞0.05)，无明显的降糖作用。结果见表3。
2.2对糖尿病模型小鼠血糖的影响
小鼠给予四氧嘧啶后，可以观察到小鼠血糖增加。与正常对照组比较，模型对照组小鼠血糖升高(P＜0.01)；与模型对照组比较，提取物1～3组和阳性药对照组血糖显著降低(P＜0.01)；与模型对照组比较，提取物4、5组血糖无明显降低(P＞0.05)。试验结果见表3。
表3对HepG2葡萄糖消耗量及糖尿病小鼠血糖的影响
上述结果表明，本发明提供的提取物具有明显的降血糖作用，降血糖效果与AB-8型大孔吸附树脂纯化富集方法有关。试验表明，本发明提供的提取物还具有降血压、降血脂作用，也与AB-8型大孔吸附树脂纯化富集方法有关。
因此，本发明提取物可以用于“三高”的治疗和预防。
实施例9：效果实施例(抗肿瘤作用)
1、材料与方法
人脐静脉血管内皮细胞系由湖北医药学院附属太和医院妇产科取得新鲜新生儿脐带，采用酶消化法分离人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)，传代培养，HUVECs 2～4代用于实验。
1.2试剂与样品
分别按实施例1～5方法制备提取物1～5。酸性成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、MTT：Sigma公司；肝素、胸苷：Sigma公司；胎牛血清(FBS)、M199：Gibco公司；DMEM/F12培养基：Invitrogen生命技术有限公司；0.25％胰蛋白酶：Invitrogen生命技术有限公司；EDTA：美国AMRESCO公司；二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)：美国SIGMA公司；青链霉素混合液：美国AMRESCO公司；链霉素：上海先锋药业公司。
1.3仪器
10mm圆形细胞培养皿及T-25cm2细胞培养瓶：康宁生命科学有限公司；6孔、12孔、24孔及96孔细胞培养板：北京赛因坦科技有限公司；15ml、50ml离心管、枪头、细胞计数板、盖玻片：康宁生命科学有限公司；酶联免疫测定仪：芬兰Thermo Labsystems公司；倒置光学显微镜及拍照系统：日本Olympus Corporation Transwell小室、1.5ml EP管、2ml冻存管：Coster公司；37℃恒温5％CO2细胞培养箱：美国Thermo Fisher公司；超净工作台：上海博迅实业公司；常温台式离心机：Beckman Coulter商贸有限公司；-4℃、-20℃恒温冰箱：西门子股份公司；电热恒温水浴箱：北京中西远大公司纯水机：瑞士Millipore公司；电子天平：上海天平仪器技术有限公司；液氮存储罐：美国Thermo Scientific公司；蛋白电泳及转移设备：美国Bio-Rad公司；移液器：美国Thermo Electron公司。
1.4实验分组
①对照组(control组)：用无血清、无生长因子的M199基础培养液。
②VEGF组(模型组)：在M199培养基中加入VEGF(20ng/ml)。
③提取物1组：在VEGF组基础上加入提取物1(150μg/ml)。
④提取物2组：在VEGF组基础上加入提取物2(150μg/ml)。
⑤提取物3组：在VEGF组基础上加入提取物3(150μg/ml)。
⑥提取物4组：在VEGF组基础上加入提取物4(150μg/ml)
⑦提取物5组：在VEGF组基础上加入提取物5(150μg/ml)
1.5MTT法检测HUVECs增殖
1.5.1所需试剂及其配制
①PBS缓冲液：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4·12H2O 2.89g、KH2PO40.226g、双蒸水800ml，定容至1000ml。调整pH值至7.4，4℃冰箱保存备用。
②MTT溶液：电子天平称取100mg MTT，加入20mlPBS溶液中搅拌溶解，即达到目的浓度5mg/ml；待MTT完全溶解后，经0.22μm硝化纤维素滤膜过滤除菌，最后放置在锡箔纸包裹的避光环境中于4℃冰箱内保存(2周内有效)。
③无水二甲基亚砜(DMSO)。
1.5.2操作步骤
①取对数生长期HUVECs，调节细胞浓度为1×105个/ml后接种到96孔板上，每孔100μl，细胞贴壁后所有细胞换液为未添加aFGF的5％FBSM199基础培养液，放置于37℃，5％CO2培养箱中继续培养2天后按分组实验进行实验。
②除control组外，其余各实验组均加入VEGF(20ng/ml)，提取物1～5组在加入VEGF基础上再加入提取物1～5(150μg/ml)，同时设置凋零组(全为培养液不含细胞)，每组设5个复孔。
③37℃，5％CO2恒温箱培养24小时后，每孔加入5mg/mlMTT10μl，继续培养4h。
④弃上清，每孔加入DMSO 100μl，摇床混匀15min。
⑤在酶联免疫吸附试验检测仪上490nm处测定各孔光吸收值(OD值)，记录各组所得OD值结果。
1.6统计学处理
文中数据均采用均数±标准差差(x±s)表示。两组间数据的差异统计分析用student’s t检验或ANOVA进行比较分析，spss17.0软件计算P值，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2、实验结果
2.1对VEGF诱导的HUVECs增殖的影响
加入VEGF孵育24h后，VEGF明显促进HUVECs的增殖，VEGF组OD值较control组相比明显增高(P<0.01)。提取物1～3明显抑制HUVECs增殖，与VEGF组比均有显著差异(P<0.01)。提取物4、5无明显抑制作用，与VEGF组比无显著差异(P＞0.05)。
具体试验结果见表4。
表4提取物对VEGF诱导的HUVECs增殖的影响
| 组别 | OD值 |
| 正常对照组 | 0.170±0.03 |
| VEGF组 | 0.435±0.05 |
| 提取物1组 | 0.188±0.03 |
| 提取物2组 | 0.195±0.02 |
| 提取物3组 | 0.198±0.04 |
| 提取物4组 | 0.424±0.05 |
| 提取物5组 | 0.428±0.05 |
通过抑制血管内皮细胞的增殖可以抑制肿瘤血管生成，进而发挥抗肿瘤作用。提取物1～3均可以显著抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖，提取物4、5不能明显抑制VEGF诱导的血管内皮细胞增殖。上述试验表明，本发明提供的提取物可以抑制肿瘤血管生成进而发挥抗肿瘤作用，这种作用可能与AB-8型大孔吸附树脂纯化富集方法有关。
在对实施例1～3制备的提取物进行进一步分离纯化过程中，发现了一种结构新颖的三萜类化合物A。药理作用研究表明，该化合物A单体的药理活性(增强机体免疫力、增强机体抗疲劳缺氧能力、降血糖、降血压、降血脂和抗肿瘤)为提取物(提取物组所含化合物A与单体组化合物A的作用浓度和剂量相等)药理活性的80～90％。这表明，该三萜类化合物A是本发明提取物的主要药效物质。该三萜类化合物A的结构式如下：
分离纯化步骤：(a)实施例1～3任一方法制备的提取物用正相硅胶分离，依次用体积比为120:1、60:1、30:1和15:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；(b)步骤(a)中组分3用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为40:1、30:1和10:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(c)步骤(b)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为85％的甲醇水溶液等度洗脱，收集14～18个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到化合物A。
结构确证：HR-ESI-MS显示[M+H]+为m/z 453.3675，结合核磁特征可得分子式为C31H48O2，不饱和度为8。核磁共振氢谱数据δH(ppm，CDCl3，600MHz)：H-1(1.62，dd，J＝12.4，8.9Hz)，H-1(2.11，dd，J＝12.4，3.6Hz)，H-2(5.82，ddd，J＝10.9，8.9，3.6Hz)，H-3(5.68，d，J＝10.9Hz)，H-5(0.77，d，J＝11.2Hz)，H-6(1.48，m)，H-6(1.63，m)，H-7(1.68，m)，H-7(1.87，m)，H-9(1.89，d，J＝10.5Hz)，H-11(4.27，d，J＝10.5Hz)，H-15(5.43，d，J＝10.3Hz)，H-16(5.52，d，J＝10.3Hz)，H-18(2.46，d，J＝8.4Hz)，H-19(1.41，m)，H-20(1.10，m)，H-21(1.28，m)，H-21(1.48，m)，H-22(1.36，m)，H-22(1.51，m)，H-23(1.02，s)，H-24(0.82，s)，H-25(1.19，s)，H-26(1.22，s)，H-27(1.36，s)，H-28(0.87，s)，H-29(0.85，d，J＝6.3Hz)，H-30(0.93，d，J＝6.1Hz)，11-OMe(3.18，s)，12-OH(4.69，s)；核磁共振碳谱数据δC(ppm，CDCl3，125MHz)：40.2(CH2，1-C)，122.6(CH，2-C)，138.3(CH，3-C)，36.8(C，4-C)，55.2(CH，5-C)，19.7(CH2，6-C)，38.9(CH2，7-C)，50.7(C，8-C)，46.8(CH，9-C)，35.7(C，10-C)，76.2(CH，11-C)，143.3(C，12-C)，121.2(C，13-C)，37.4(C，14-C)，131.6(CH，15-C)，143.1(CH，16-C)，41.3(C，17-C)，48.0(CH，18-C)，39.9(CH，19-C)，40.5(CH，20-C)，30.8(CH2，21-C)，38.8(CH2，22-C)，26.6(CH3，23-C)，15.7(CH3，24-C)，13.7(CH3，25-C)，19.7(CH3，26-C)，14.3(CH3，27-C)，19.3(CH3，28-C)，17.2(CH3，29-C)，20.4(CH3，30-C)，51.7(CH3，11-OMe)。红外波谱表明该化合物含有双键(1663cm-1)和偕二甲基(1380cm-1)基团。13C-NMR、DEPT和HSQC谱中显示有31个碳信号，包括九个甲基(一个甲氧基)，五个亚甲基，十个次甲基(一个连氧碳和四个烯烃碳)，以及七个季碳，以上功能结构再结合不饱和数表明该化合物为五环三萜结构。1H-NMR谱结合HSQC谱显示的六个单峰甲基质子信号δH 1.02(3H，s)，0.82(3H，s)，1.19(3H，s)，1.22(3H，s)，1.36(3H，s)和0.87(3H，s)和两个双峰甲基质子信号δH 0.85(3H，d，J＝6.3Hz)，0.93(3H，d，J＝6.1Hz)以及1H-NMR数据表明该化合物为乌苏烷型三萜类化合物。在该乌苏烷型化合物中，还存在一个甲氧基，并且C-2与C-3、C-12与C-13、C-15与C-16形成双键结构。HMBC谱中H-9和H-18与C-12，H-18和Me-27与C-13以及12-OH与C-12相关信号以及它们的碳化学位移表明该化合物存在烯醇式结构，羟基连接在C-12位与C-12和C-13形成的双键构成烯醇式结构。此外，HMBC谱中11-OMe与C-11的相关信号以及碳化学位移表明C-11位连有一个甲氧基。NOESY谱中H-11、Me-25和Me-26之间的交叉峰表明H-11为β构型。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如下所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致。
三萜类化合物A的碳原子编号如下式所示：
上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
Claims (10)
1.一种以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物，其特征在于，通过如下步骤制备而成：
步骤S1，收割新鲜的西洋参茎叶，阴干；
步骤S2，将已收割回来阴干的西洋参茎叶烘干，粉碎过20～30目筛，得茎叶细粉；
步骤S3，将茎叶细粉用70～90％乙醇热回流提取2～3次，每次1～2小时，过滤收集滤液；
步骤S4，滤液减压浓缩至无醇味，用AB-8型大孔吸附树脂纯化富集，先用10～20％的乙醇洗脱6～10个柱体积，再用70～80％乙醇洗脱12～16个柱体积，收集70～80％乙醇洗脱液；
步骤S5，70～80％乙醇洗脱液减压浓缩，喷雾干燥，得干粉状的西洋参茎叶提取物。
2.根据权利要求1所述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物，其特征在于：步骤S2中烘干的温度为40～60℃。
3.根据权利要求1所述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物，其特征在于：步骤S3中茎叶细粉用80％乙醇热回流提取3次，每次2小时，过滤收集滤液。
4.根据权利要求1所述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物，其特征在于：步骤S4先用15％的乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱14个柱体积，收集75％乙醇洗脱液。
5.权利要求1～4任一所述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备增强机体免疫力的药品、功能食品或保健品方面的应用。
6.权利要求1～4任一所述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备增强机体抗疲劳缺氧的药品、功能食品或保健品方面的应用。
7.权利要求1～4任一所述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备降血糖的药品、功能食品或保健品方面的应用。
8.权利要求1～4任一所述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备降血压的药品、功能食品或保健品方面的应用。
9.权利要求1～4任一所述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备降血脂的药品、功能食品或保健品方面的应用。
10.权利要求1～4任一所述的以西洋参茎叶为原料提取分离出的提取物在制备抗肿瘤的药品、功能食品或保健品方面的应用。
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