CN105687215B - 具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位及其制备方法和应用。该制备方法包括如下步骤：将番石榴叶用醇溶液进行提取，过滤，减压浓缩得到总浸膏；将总浸膏加水分散，依次用石油醚和氯仿萃取，收集氯仿萃取部位；将氯仿萃取部位进行硅胶柱层析，依次用氯仿洗脱、氯仿:甲醇＝0.9‑1.1:0.9‑1.1洗脱、甲醇洗脱；收集氯仿:甲醇＝0.9‑1.1:0.9‑1.1洗脱部位，得到具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位，可在制备抗肿瘤药物中应用。本发明能够明确番石榴叶提取物中起到抗肿瘤活性的有效部位及其包含的主要成分，为后续的质量控制、成药、进入国际市场提供基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位及其制备方法和应用，属于抗肿瘤药物技术领域。
背景技术
番石榴(Psidium guajava L.)俗称拔子、鸡矢果、芭乐、红心果、喇叭果等，为桃金娘科番石榴属植物，是常绿小乔木或灌木，原产热带美洲和东南亚，现广泛分布和种植于热带、亚热带地区。
现有技术中，番石榴叶提取物通过调控肝脏糖代谢AKT信号通路的机制对脂肪组织肿瘤坏死因子(TNF-α)、过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)基因的表达产生作用，并发现番石榴叶挥发油成分对表皮癌细胞抗增活性最高，是长春碱的4.37倍，另有研究认为番石榴叶提取物抗肿瘤细胞的机制在于抑制了T调节细胞，并增强了Th1细胞的作用。
但是，现有技术中，虽然有报道番石榴叶提取物可以起到抗肿瘤的作用，但是，现有研究并没有完全明确番石榴叶提取物中起到抗肿瘤作用的究竟是哪些主要成分，即使现有技术中提出番石榴叶中提取出某一个单体具有抗肿瘤作用，但因其是单体成分，无法表明具体的有效部位，以及有效部位的组分间协同作用，也导致无法对该番石榴提取物有效部位进行有效的质量控制，以使得提取物有效部位得以成为制剂；更甚者，因成分的不明确导致番石榴提取物无法成药、无法进入国际市场。
发明内容
鉴于上述现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位的制备方法，所得到的番石榴叶提取物能够明确其中起到抗肿瘤性的有效部位及其包含的主要成分，为后续的质量控制、成药、进入国际市场提供基础。
本发明的另一个目是提供由上述制备方法所得到的番石榴叶有效部位。
本发明还有一个目的是提供上述番石榴叶有效部位在制备抗肿瘤药物的应用。
本发明的目的通过以下技术方案得以实现：
一种具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将番石榴叶用醇溶液进行提取，过滤，减压浓缩得到总浸膏；
(2)将总浸膏加水分散，依次用石油醚和氯仿萃取，收集氯仿萃取部位；
(3)将氯仿萃取部位进行硅胶柱层析，依次用氯仿洗脱、氯仿:甲醇＝0.9-1.1:0.9-1.1洗脱、甲醇洗脱，收集氯仿:甲醇＝0.9-1.1:0.9-1.1的洗脱部位，得到具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位。
所述的步骤(1)中，醇溶液为乙醇、乙醇水溶液、甲醇或甲醇水溶液；乙醇水溶液中，乙醇的体积百分比浓度为大于等于70％；甲醇水溶液中，甲醇的体积百分比浓度为大于等于70％。
所述的步骤(1)中，提取的方式为渗漉、超声或加热回流；番石榴叶用醇溶液进行提取时，以重量计，醇溶液的用量为番石榴叶用量的5-10倍；提取次数为不低于2次。
所述的步骤(2)中，将总浸膏加水分散时，以体积计，水的用量与总浸膏的用量比为2-1∶1-2。
所述的步骤(2)中，依次用石油醚和氯仿萃取时，以体积计，石油醚或氯仿的用量为被萃取相的1-2倍；萃取次数为2-7次。
所述的步骤(3)中，洗脱时，洗脱液的用量为4-6倍柱体积。
上述制备方法制备得到的具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位。
所述有效部位为三萜酸和三萜皂苷成分，占氯仿:甲醇＝0.9-1.1:0.9-1.1的洗脱部位中总三萜酸和总三萜皂苷成分总质量的60％-90％，所述总三萜酸和总三萜皂苷成分占番石榴叶总浸膏质量的20％-80％；所述有效部位包括：6β-羟基积雪草酸、积雪草酸、2α-羟基齐墩果酸、2α-羟基乌苏酸、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸、齐墩果酸、乌苏酸。
所述的有效部位还包括积雪草苷、羟基积雪草苷、quadranosideⅣ和arjunglucoside Ⅱ。
本发明还提供上述的具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明提供的具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位及其制备方法和应用，综合现代提取技术、药物分析方法和细胞活性评价手段寻找番石榴叶中质量稳定可靠具有最佳抗肿瘤活性的有效成分(有效部位)，能够明确番石榴叶提取物中起到抗肿瘤性的有效部位及其包含的主要成分为含有三萜酸类化合物和三萜皂苷类化合物，为后续的质量控制、成药、进入国际市场提供基础。
附图说明
图1是实施例2的标准对照品的HPLC图；
图2是实施例2的番石榴叶提取物有效部位的HPLC图；
图3a是实施例2的番石榴叶提取物有效部位与对照品抑制结肠癌细胞(HCT116和SW480)24h增殖对比图；
图3b是实施例2的番石榴叶提取物有效部位与对照品抑制结肠癌细胞(HCT116和SW480)48h增殖对比图；
图4a是实施例2的番石榴叶提取物有效部位与对照品抑制鼻咽癌细胞(SUNE-1和HONE-1)24h增殖对比图；
图4b是实施例2的番石榴叶提取物有效部位与对照品抑制鼻咽癌细胞(SUNE-1和HONE-1)48h增殖对比图；
图5a是实施例2的番石榴叶提取物有效部位对HCT116结肠癌细胞作用所产生的细胞形态学改变图；
图5b是实施例2的番石榴叶提取物有效部位对SW480结肠癌细胞作用所产生的细胞形态学改变图；
图6a是实施例2的番石榴叶提取物有效部位与对照品使结肠癌细胞HCT116发生凋亡的对比图；
图6b是实施例2的番石榴叶提取物有效部位与对照品使结肠癌细胞SW480发生凋亡的对比图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和有益效果有更加清楚的理解，现对本发明的技术方案进行以下详细说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
本发明是一种具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位的制备方法，包括如下步骤：
(1)将番石榴叶用醇溶液进行提取，过滤，减压浓缩得到总浸膏。减压浓缩是按照常规方法进行的，浓缩至总浸膏无醇味为止；一般情况是浓缩至原提取液重量的1/10，这种条件下易于后面的水分散。所述醇溶液优选为乙醇、乙醇水溶液、甲醇或甲醇水溶液；乙醇水溶液中，乙醇的体积百分比浓度最好大于等于70％；甲醇水溶液中，甲醇的体积百分比浓度最好大于等于70％。提取的方式优选为渗漉、超声或加热回流。番石榴叶用醇溶液进行提取时，优选的，以重量计，醇溶液的用量为番石榴叶用量的5-10倍；提取次数为不低于2次。
(2)将总浸膏加水分散，依次用石油醚和氯仿萃取，收集氯仿萃取部位。将总浸膏加水分散时，优选的，以体积计，水的用量与总浸膏的用量比为2-1∶1-2。依次用石油醚和氯仿萃取时，优选的，以体积计，石油醚或氯仿的用量为被萃取相的1-2倍；萃取次数为2-7次，更优选5-7次。
(3)将氯仿萃取部位进行硅胶柱层析，依次用氯仿洗脱、氯仿:甲醇＝0.9-1.1:0.9-1.1洗脱、甲醇洗脱，收集氯仿:甲醇＝0.9-1.1:0.9-1.1的洗脱部位，得到具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位。洗脱时，优选的每种洗脱液的用量为4-6倍柱体积。最优选的，洗脱液是指氯仿、氯仿:甲醇＝1:1、甲醇这三种洗脱液，每种洗脱液的用量均是5倍柱体积。将氯仿萃取部位进行硅胶柱层析时，可以选用多种常规上样方式，优选的，这里使用拌样上样法，氯仿萃取部位用3-5倍体积量的硅胶拌样后上柱进行柱层析。
通过上述制备方法制备得到的具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位。所述有效部位为三萜酸和三萜皂苷成分，占氯仿:甲醇＝0.9-1.1:0.9-1.1的洗脱部位中总三萜酸和总三萜皂苷成分总质量的60％-90％，所述总三萜酸和总三萜皂苷成分占番石榴叶总浸膏质量的20％-80％。
所述有效部位包括有：6β-羟基积雪草酸、积雪草酸、2α-羟基齐墩果酸、2α-羟基乌苏酸、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸、齐墩果酸、乌苏酸。有效部位还可包括积雪草苷、羟基积雪草苷、quadranoside Ⅳ和arjunglucosideⅡ。
实施例1
本实施例提供一种具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位的制备方法，包括如下步骤：
将番石榴叶用10倍重量醇溶液(78wt％的乙醇溶液)进行热回流提取5次，过滤，减压浓缩得到总浸膏；
将总浸膏加水1:1分散，依次用2倍体积的石油醚和氯仿萃取，各萃取5次，收集氯仿萃取部位；
将氯仿萃取部位进行硅胶柱层析，3倍硅胶拌样上柱，依次用5倍柱体积的氯仿洗脱、5倍柱体积的氯仿:甲醇＝1:1洗脱、5倍柱体积的甲醇洗脱；
收集氯仿:甲醇＝1:1洗脱部位，得到具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位。
对得到的番石榴叶有效部位进行测定，采用制备HPLC分离出其中的主要成分并进行质谱和核磁共振验证，制备液相采用C18反相分析柱，DAD紫外检测器，以甲醇-(0.05％冰醋酸水溶液)为流动相进行梯度洗脱，流速为1mL/min，检测波长210nm，柱温30℃，洗脱程序为：0–6.0min，80％–86％(v/v)甲醇；6.0–8.0min，86％-87％甲醇；8.0–28.0min，87％甲醇。
其主要成分为：
化合物1：白色粉末，mp285～288℃，ESI-MSm/z505[M+H]+，分子式为C30H48O5。
1HNMR(pyridine-d5,400MHz)δ:4.43(1H,m,H-2),4.26(1H,d,J＝9.5Hz,H-3),5.12(1H,br s,H-6),5.58(1H,s,H-12),2.67(1H,d,J＝11.0Hz,H-18),4.43(1H,d,J＝10.5Hz,H-23a),4.07(1H,d,J＝10.5Hz,H-23b),1.01(3H,d,J＝6.0Hz,H3-29),0.94(3H,d,J＝6.0Hz,H3-30),1.19(3H,s,H3-24),1.66(3H,s,H3-25),1.76(3H,s,H3-26),1.80(3H,s,H3-27)；
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:49.7(C-1),68.4(C-2),77.5(C-3),42.7(C-4),47.9(C-5),66.8(C-6),38.8(C-7),40.5(C-8),47.9(C-9),37.4(C-10),23.3(C-11),125.3(C-12),138.0(C-13),43.8(C-14),27.9(C-15),24.2(C-16),47.4(C-17),52.9(C-18),38.8(C-19),38.7(C-20),30.4(C-21),36.8(C-22),65.4(C-23),15.4(C-24),18.4(C-25),18.2(C-26),23.2(C-27),179.2(C-28),16.8(C-29),20.7(C-30)。化合物1鉴定为6β-羟基积雪草酸
化合物2：白色粉末，mp>300℃，ESI-MSm/z487[M-H]-，分子式为C30H48O5。
1HNMR(pyridine-d5,400MHz)δ:4.25(1H,m,H-3),5.45(1H,s,H-12),4.24(1H,d,J＝10.5H z,H-23a),3.72(1H,d,J＝10.5Hz,H-23b),1.20(3H,s,H3-24),1.04(9H,s,H3-25,26,27),0.96(3H,d,J＝6.2Hz,H3-29),0.92(3H,d,J＝6.2Hz,H3-30)；
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:48.0(C-1),66.6(C-2),78.0(C-3),43.6(C-4),48.1(C-5),18.5(C-6),33.2(C-7),40.1(C-8),48.1(C-9),38.3(C-10),23.8(C-11),124.5(C-12),139.5(C-13),42.6(C-14),28.7(C-15),23.9(C-16),48.0(C-17),53.6(C-18),39.5(C-19),39.4(C-20),31.1(C-21),37.5(C-22),68.8(C-23),14.3(C-24),17.6(C-25),17.5(C-26),23.9(C-27),179.6(C-28),17.4(C-29),21.4(C-30)。化合物2鉴定为积雪草酸
化合物3：白色粉末，mp290～292℃，ESI-MSm/z473[M+H]+，分子式为C30H48O4。
1HNMR(pyridine-d5,400MHz)δ:4.08(1H,td,J＝10.0,4.5Hz,H-2),3.38(1H,d,J＝9.5Hz,H-3),5.46(1H,d,J＝3.5Hz,H-12),3.29(1H,dd,J＝13.5,4.5Hz,H-18),1.20(1H,s,H3-23),0.93,0.98,0.99,1.01,1.06,1.25,1.26(3H×7,s)；
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:47.8(C-1),68.6(C-2),83.8(C-3),39.9(C-4),59.5(C-5),18.8(C-6),33.2(C-7),39.9(C-8),48.1(C-9),38.6(C-10),23.8(C-11),122.5(C-12),144.9(C-13),42.2(C-14),28.3(C-15),23.9(C-16),46.7(C-17),42.0(C-18),46.4(C-19),31.0(C-20),34.2(C-21),33.2(C-22),29.3(C-23),17.7(C-24),16.9(C-25),17.5(C-26),26.2(C-27),180.2(C-28),33.2(C-29),21.33.8(C-30)。化合物3鉴定为2α-羟基齐墩果酸
化合物4：白色粉末，mp270～272℃，ESI-MSm/z471[M-H]-，分子式为C30H48O4。
1HNMR(pyridine-d5,400MHz)δ:4.09(1H,d,J＝2.0Hz,H-2),3.39(1H,d,J＝10.6Hz,H-3),5.46(1H,d,J＝3.2Hz,H-12),2.62(1H,d,J＝11.2Hz,H-18),1.20(1H,s,H3-23),0.96(6H,s,H3-24,26),1.07(3H,s,H3-25),1.26(3H,s,H3-27),0.93(3H,d,J＝6.5Hz,H3-29),0.99(3H,d,J＝6.5Hz,H3-30)；
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:47.9(C-1),68.5(C-2),83.8(C-3),39.4(C-4),55.8(C-5),18.8(C-6),33.4(C-7),40.0(C-8),47.9(C-9),37.4(C-10),24.7(C-11),125.5(C-12),139.2(C-13),42.5(C-14),28.6(C-15),23.8(C-16),47.9(C-17),53.5(C-18),38.4(C-19),39.3(C-20),31.0(C-21),39.3(C-22),28.6(C-23),17.6(C-24),17.4(C-25),18.8(C-26),23.7(C-27),180.0(C-28),16.9(C-29),21.3(C-30)。化合物4鉴定为2α-羟基乌苏酸
化合物5：白色粉末，ESI-MSm/z641[M+Na]+，分子式为C39H54O6。
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:3.83(1H,m,H-2),4.60(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),1.18(3H,s,H3-27),1.02(3H,s,H3-25),0.94(3H,s,H3-30),0.90(3H,s,H3-29),0.87(3H,s,H3-23),0.82(6H,s,H3-24,H3-26),7.63(2H,d,J＝8.8Hz,H-2′,6′),6.73(2H,d,J＝8.8Hz,H-3′,5′),6.86(1H,d,J＝6.8Hz,H-7′),5.84(1H,d,J＝6.8Hz,H-8′)；
13CNMR(CD3OD,100MHz)δ:47.3(C-1),67.6(C-2),85.3(C-3),39.3(C-4),56.5(C-5),19.5(C-6),33.8(C-7),40.6(C-8),49.0(C-9),37.9(C-10),24.1(C-11),123.3(C-12),145.5(C-13),43.0(C-14),28.8(C-15),24.6(C-16),46.8(C-17),42.8(C-18),47.7(C-19),31.6(C-20),34.9(C-21),31.7(C-22),29.2(C-23),17.8(C-24),17.1(C-25),18.2(C-26),26.4(C-27),179.2(C-28),33.6(C-29),24.0(C-30),168.6(C-1′),116.8(C-2′),144.7(C-3′),145.5(C-4′),133.6(C-5′),115.8(C-6′),159.9(C-7′),115.8(C-8′),133.6(C-9′)。化合物5鉴定为3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸(3β-O-cis-p-coumaroyloxy-2α-hydroxy-olean-28-oicacid)
化合物6：白色粉末，ESI-MSm/z641[M+Na]+，分子式为C39H54O6。
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:3.83(1H,m,H-2),4.60(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),1.14(3H,s,H3-27),0.97(3H,s,H3-26),0.88(3H,s,H3-23),0.82(3H,s,H3-24),0.79(3H,s,H3-25),1.04(3H,d,J＝6.4Hz,H3-29),0.97(3H,d,J＝6.4Hz,H3-30),7.64(2H,d,J＝8.4Hz,H-2′,6′),6.71(2H,d,J＝8.4Hz,H-3′,5′),6.86(1H,d,J＝6.8Hz,H-7′),5.84(1H,d,J＝6.8Hz,H-8′)；
13CNMR(CD3OD,100MHz)δ:47.3(C-1),67.6(C-2),85.3(C-3),39.3(C-4),56.5(C-5),19.5(C-6),33.8(C-7),40.6(C-8),49.0(C-9),37.9(C-10),24.1(C-11),126.5(C-12),139.9(C-13),43.0(C-14),28.8(C-15),24.6(C-16),46.8(C-17),42.8(C-18),47.7(C-19),31.6(C-20),34.9(C-21),31.7(C-22),29.3(C-23),18.2(C-24),17.6(C-25),17.8(C-26),24.1(C-27),181.0(C-28),21.6(C-29),17.2(C-30),127.8(C-1′),116.8(C-2′),144.7(C-3′),159.9(C-4′),133.6(C-5′),115.8(C-6′),144.7(C-7′),115.7(C-8′),168.6(C-9′)。化合物6鉴定为3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸(3β-O-cis-p-coumaroyloxy-2α-hydroxy-urs-28-oicacid)
化合物7：白色粉末，ESI-MSm/z641[M+Na]+，分子式为C39H54O6。
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:3.83(1H,m,H-2),4.62(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),1.19(3H,s,H3-27),1.05(3H,s,H3-25),0.91(3H,s,H3-29),0.94(6H,s,H3-30,H3-26),0.87(3H,s,H3-23),0.78(3H,s,H3-24),7.45(2H,d,J＝8.6Hz,H-2′,6′),6.80(2H,d,J＝8.6Hz,H-3′,5′),7.63(1H,d,J＝16.0Hz,H-7′),6.37(1H,d,J＝16.0Hz,H-8′)；
13CNMR(CD3OD,100MHz)δ:47.5(C-1),67.6(C-2),85.6(C-3),39.3(C-4),56.5(C-5),19.5(C-6),33.9(C-7),40.6(C-8),48.9(C-9),38.0(C-10),24.1(C-11),123.1(C-12),145.8(C-13),43.0(C-14),28.9(C-15),24.6(C-16),46.7(C-17),43.0(C-18),47.5(C-19),31.7(C-20),34.9(C-21),31.7(C-22),29.2(C-23),17.9(C-24),17.1(C-25),18.3(C-26),26.4(C-27),179.2(C-28),33.6(C-29),24.0(C-30),169.6(C-1′),115.9(C-2′),146.2(C-3′),127.4(C-4′),131.1(C-5′),116.8(C-6′),161.2(C-7′),116.8(C-8′),131.1(C-9′)。化合物:7鉴定为3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸(3β-O-trans-p-coumaroyloxy-2α-hydroxy-olean-28-oicacid)
化合物8：白色粉末，ESI-MSm/z641[M+Na]+，分子式为C39H54O6。
1HNMR(CD3OD,400MHz)δ:3.84(1H,m,H-2),4.63(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),1.14(3H,s,H3-27),0.94(3H,s,H3-26),0.89(3H,s,H3-23),0.86(3H,s,H3-24),0.85(3H,s,H3-25),1.07(3H,d,J＝6.4Hz,H3-29),0.96(3H,d,J＝6.4Hz,H3-30),7.45(2H,d,J＝8.4Hz,H-2′,6′),6.80(2H,d,J＝8.4Hz,H-3′,5′),7.62(1H,d,J＝16.0Hz,H-7′),6.37(1H,d,J＝16.0Hz,H-8′)；
13CNMR(CD3OD,100MHz)δ:47.3(C-1),67.7(C-2),85.6(C-3),39.3(C-4),56.5(C-5),19.5(C-6),33.8(C-7),40.6(C-8),49.0(C-9),37.9(C-10),24.1(C-11),126.5(C-12),139.9(C-13),43.0(C-14),28.8(C-15),24.6(C-16),46.8(C-17),42.8(C-18),47.7(C-19),31.6(C-20),34.9(C-21),31.7(C-22),29.3(C-23),18.4(C-24),17.7(C-25),17.9(C-26),24.2(C-27),177.2(C-28),21.6(C-29),17.3(C-30),127.4(C-1′),116.9(C-2′),131.1(C-3′),161.2(C-4′),131.1(C-5′),116.9(C-6′),146.3(C-7′),115.8(C-8′),169.7(C-9′)。化合物8鉴定为3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸(3β-O-trans-p-coumaroyl-2α-hydroxy-urs-28-oicacid)
化合物9：白色粉末，mp>300℃，ESI-MSm/z455[M-H]-，分子式为C30H48O3。
1HNMR(pyridine-d5,400MHz)δ:3.40(1H,dd,J＝13.2,5.6Hz,H-3),5.48(1H,d,J＝3.6Hz,H-12),3.30(1H,d,J＝3.2Hz,H-18),1.01(1H,s,H3-23),0.88(6H,s,H3-24),1.22(3H,s,H3-25),1.00(3 H,s,H3-26),1.26(3H,s,H3-27),0.93(3H,s,H3-29),0.99(3H,s,H3-30)；
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:39.0(C-1),28.0(C-2),78.2(C-3),39.2(C-4),55.7(C-5),18.5(C-6),33.5(C-7),39.8(C-8),48.1(C-9),37.4(C-10),24.9(C-11),122.2(C-12),144.2(C-13),42.2(C-14),28.6(C-15),23.3(C-16),46.7(C-17),42.5(C-18),46.4(C-19),31.3(C-20),34.0(C-21),33.3(C-22),28.6(C-23),16.5(C-24),15.5(C-25),18.8(C-26),25.7(C-27),179.9(C-28),33.0(C-29),23.3(C-30)。化合物9鉴定为齐墩果酸
化合物10：白色粉末，mp>300℃，ESI-MSm/z455[M-H]-，分子式为C30H48O3。
1HNMR(pyridine-d5,400MHz)δ:3.46(1H,dd,J＝10.2,4.8Hz,H-3),5.35(1H,d,J＝2.0Hz,H-12),2.65(1H,d,J＝11.6Hz,H-18),1.07(1H,s,H3-23),0.90(6H,s,H3-24),1.24(3H,s,H3-25),1.03(3H,s,H3-26),1.26(3H,s,H3-27),0.97(3H,d,J＝6.4Hz,H3-29),1.01(3H,d,J＝6.4Hz,H3-30)；
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:39.4(C-1),28.4(C-2),78.4(C-3),39.6(C-4),55.1(C-5),19.1(C-6),33.9(C-7),40.3(C-8),48.3(C-9),37.7(C-10),23.9(C-11),125.9(C-12),139.6(C-13),42.8(C-14),29.0(C-15),24.2(C-16),48.3(C-17),53.8(C-18),39.8(C-19),39.7(C-20),31.4(C-21),37.6(C-22),29.1(C-23),16.8(C-24),15.9(C-25),17.8(C-26),21.7(C-27),179.9(C-28),17.7(C-29),19.1(C-30)。化合物10鉴定为乌苏酸
化合物11：白色针晶，mp230～233℃，ESI-MSm/z959[M+H]+，分子式为C48H78O19。
1HNMR(pyridine-d5,400MHz)δ:0.90(3H,d,J＝6.0Hz,H3-29),0.86(3H,d,J＝6.0Hz,H3-30),1.16(3H,s,H3-24),1.20(3H,s,H3-25),1.78(3H,s,H3-26),5.92(1H,brs,H-12)；
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:47.5(C-1),68.3(C-2),78.1(C-3),41.9(C-4),47.5(C-5),17.9(C-6),32.5(C-7),40.0(C-8),47.2(C-9),37.7(C-10),23.9(C-11),125.3(C-12),137.8(C-13),43.0(C-14),28.0(C-15),23.9(C-16),47.7(C-17),52.5(C-18),38.4(C-19),38.6(C-20),30.1(C-21),36.2(C-22),65.7(C-23),13.8(C-24),17.0(C-25),16.7(C-26),23.2(C-27),179.6(C-28),23.2(C-29),20.6(C-30),95.0(Glc-1),73.1(Glc-2),77.3(Glc-3),68.7(Glc-4),75.8(Glc-5),69.6(Glc-6),104.3(Glc-1'),73.4(Glc-2'),76.5(Glc-3'),77.5(Glc-4'),74.7(Glc-5'),60.6(Glc-6'),102.0(Rha-1),71.9(Rha-2),70.3(Rha-3),72.1(Rha-4),68.3(Rha-5),17.9(Rha-6)。化合物11鉴定为积雪草苷
化合物12：白色针晶，ESI-MSm/z975[M+H]+，分子式为C48H78O20。
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:48.2(C-1),68.9(C-2),78.7(C-3),43.1(C-4),48.7(C-5),67.6(C-6),39.3(C-7),39.5(C-8),49.7(C-9),37.9(C-10),24.3(C-11),126.3(C-12),137.7(C-13),44.2(C-14),28.7(C-15),24.5(C-16),48.4(C-17),53.3(C-18),38.0(C-19),39.0(C-20),31.0(C-21),37.5(C-22),66.5(C-23),15.5(C-24),17.4(C-25),19.1(C-26),23.7(C-27),176.2(C-28),23.7(C-29),21.1(C-30),95.5(Glc-1),73.6(Glc-2),78.3(Glc-3),70.1(Glc-4),76.7(Glc-5),71.0(Glc-6),104.4(Glc-1'),75.0(Glc-2'),77.6(Glc-3'),78.3(Glc-4'),76.3(Glc-5'),61.4(Glc-6'),102.4(Rha-1),72.4(Rha-2),72.1(Rha-3),73.6(Rha-4),69.4(Rha-5),18.1(Rha-6)。化合物12鉴定为羟基积雪草苷
化合物13：白色粉末，ESI-MSm/z649[M-H]-，分子式为C36H58O10。
1HNMR(pyridine-d5,400MHz)δ:3.80(1H,m,H-2),3.60(1H,d,J＝9.6Hz,H-3),3.49(1H,d,J＝11.2Hz,H-23),3.25(1H,d,J＝11.2Hz,H-23),2.23(1H,d,J＝11.2Hz,H-18),1.12(3H,s,H3-27),1.04(3H,s,H3-25),0.83(3H,s,H3-26),0.68(3H,s,H3-24),0.90(3H,d,J＝6.3Hz,H3-29),0.92(3H,d,J＝6.3Hz,H3-30),5.25(1H,brs,H-12),5.37(1H,d,J＝8.1Hz,Glc-H-1)；
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:47.2(C-1),70.0(C-2),79.3(C-3),44.7(C-4),48.9(C-5),19.7(C-6),33.6(C-7),41.1(C-8),49.3(C-9),39.5(C-10),24.9(C-11),123.9(C-12),145.3(C-13),43.3(C-14),29.3(C-15),24.5(C-16),48.1(C-17),42.8(C-18),43.3(C-19),31.1(C-20),31.8(C-21),35.1(C-22),67.6(C-23),15.4(C-24),18.5(C-25),18.7(C-26),27.2(C-27),177.6(C-28),34.2(C-29),24.8(C-30),96.8(Glc-1),75.2(Glc-2),80.0(Glc-3),72.2(Glc-4),80.4(Glc-5),63.3(Glc-6)。化合物13鉴定为quadranosideⅣ
化合物14：白色粉末，ESI-MSm/z649[M-H]-，分子式为C36H58O10。
1HNMR(pyridine-d5,400MHz)δ:4.02(1H,m,H-2),3.70(1H,d,J＝10.0Hz,H-3),3.17(1H,d d,J＝13.8,4.3Hz,H-18),5.41(1H,t,J＝3.5Hz,H-12),1.06(3H,s,H3-27),1.14(3H,s,H3-25),1.09(3 H,s,H3-26),1.14(3H,s,H3-24),0.85(6H,s,H3-29,30),6.32(1H,d,J＝8.2Hz,Glc-H-1)；
13CNMR(pyridine-d5,100MHz)δ:49.1(C-1),70.0(C-2),79.3(C-3),44.7(C-4),49.2(C-5),19.7(C-6),33.9(C-7),41.1(C-8),49.0(C-9),39.4(C-10),25.1(C-11),127.2(C-12),139.6(C-13),43.7(C-14),29.7(C-15),25.7(C-16),49.5(C-17),54.4(C-18),40.4(C-19),40.2(C-20),31.9(C-21),37.9(C-22),67.6(C-23),15.5(C-24),18.7(C-25),18.9(C-26),24.9(C-27),177.4(C-28),18.4(C-29),22.3(C-30),96.8(Glc-1),75.2(Glc-2),80.0(Glc-3),72.3(Glc-4),80.3(Glc-5),63.4(Glc-6)。化合物14鉴定为arjunglucoside Ⅱ
可见，本实施例得到的番石榴叶有效部位包含乌苏酸、齐墩果酸、2α-羟基乌苏酸、2α-羟基齐墩果酸、积雪草酸、6β-羟基积雪草酸、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸、积雪草苷、羟基积雪草苷、quadranoside Ⅳ和14、arjunglucoside Ⅱ这14种主要三萜酸和三萜皂苷化合物。
实施例2
本实施例提供一种具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位的制备方法，包括如下步骤：
将番石榴叶用5倍重量醇溶液(90wt％的乙醇溶液)进行超声提取3次，过滤，减压浓缩得到总浸膏；
将总浸膏加水1:1分散，依次用1倍体积的石油醚和氯仿萃取，各萃取7次，收集氯仿萃取部位；
将氯仿萃取部位进行硅胶柱层析，3倍硅胶拌样上柱，依次用5倍柱体积的氯仿洗脱、5倍柱体积的氯仿:甲醇＝1:1洗脱、5倍柱体积的甲醇洗脱；
收集氯仿:甲醇＝1:1洗脱部位，得到具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位。
按照上述的制备方法，任意选取8个不同产地的番石榴叶进行提取，进行含量测定试验。
对得到的番石榴叶有效部位进行测定：
(1)采用HPLC对番石榴叶提取物进行定性定量测定：
色谱条件：C18反相分析柱(Eclipse XDB-C18，250mm×4.6mm，5μm)，DAD紫外检测器，紫外检测波长210nm，流速1mL/min，梯度系统为：A：0.5‰冰醋酸水溶液，B：甲醇；0–6.0min，80％–86％(v/v)的甲醇溶液；6.0–8.0min，86％–87％的甲醇溶液；8.0–28.0min，87％的甲醇溶液。
根据实施例1的结果，选取标准对照品进行对照，测定结果如图1和图2所示，图中的色谱峰为：1、6β-羟基积雪草酸，2、积雪草酸，3、2α-羟基齐墩果酸，4、2α-羟基乌苏酸，5、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸，6、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸，7、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸，8、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸，9、齐墩果酸，10、乌苏酸。
采用面积归一法进行统计，以质量百分比计，所述番石榴叶提取物中，上述10个化合物(有效部位)的总量为的总三萜酸和总三萜皂苷成分的68％左右，总三萜酸和总三萜皂苷成分含量为番石榴叶提取物总量的25％左右。
具体的，8个不同产地包含10种化合物的有效部位的含量测定的结果如表1所示，其计算以总三萜酸和总三萜皂苷成分的总量为100％计。
表1
对含量测定方法进行精度、重复性、稳定性和回收率试验等方法学研究。结果如表2所示。
表2
由表1和表2可见，本实施例中，含量测定方法是精确稳定的，而番石榴叶有效部位的主要成分及含量虽然受药材的不同有变化，但是其有效部位的含量是稳定的(即本发明实施例的方法是稳定的、得到的产品是稳定的)，且有效部位的主要成分是可测的，这就为药材的质量标准、药物的质量控制提供了基础。
对本实施例得到的番石榴叶提取物有效部位进行抗肿瘤活性评价，以任选批次的番石榴叶有效部位为例，其中BB代本实施例得到的任选批次的番石榴叶有效部位，AA表示积雪草酸对照品。方法如下：
1.材料
1.1试剂与药品
番石榴叶提取物有效部位(BB)、积雪草酸(AA)由本实验室制备、分离和纯化，用DMSO溶解备用。RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清和磷酸盐缓冲液购自美国Hyclone公司)，甲基耦氮唑蓝(MTT)、DMSO和胰蛋白酶购自美国Sigma公司。
1.2细胞株
结肠癌SW480、HCT116细胞株，鼻咽癌SUNE-1、HUNE-1均由广东省医学实验动物中心提供，本实验室保存。
1.3仪器
全自动CO2孵箱(美国杜邦公司Napoc6100)，450型酶标仪(美国BioRadgs公司)，YZ-1450型层流超净工作台(苏州净化设备公司)，倒置显微镜(日本Olympus公司)，高速冷冻离心机(德国Sigma公司)，流式细胞仪(美国Becton Dickinson公司)。
2.AA和BB对肿瘤细胞的生长抑制实验
取对数生长期的四种肿瘤细胞，接种于96孔板，每孔所含细胞约4000个。细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃，5％CO2下培养24h后，分别加入不同浓度AA和BB的DMSO溶液，设置6个复孔，加药后继续孵育。分别在加药后24和48h终止实验，每孔加入1mg/mL MTT溶液10μL，4h后，再每孔加入DMSO 50μL，充分混匀后于酶标仪490nm下测定吸光度OD值，计算生长抑制率。抑制率(％)＝(1-实验组OD平均值/对照组OD平均值)×100％。
结果如图3a、图3b、图4a、图4b所示。
3.Hoechst 33258荧光检测细胞形态学改变
取对数生长期的HCT116和SW480细胞制成细胞悬液，接种于24孔板,细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃，5％CO2下培养24h，加入浓度分别为40和80μg/mL的BB再分别作用于细胞12和24h。吸出孔内的培养液，PBS冲洗，加入多聚甲醛固定15min，吸出固定液，用PBS洗2次后加入1ml Hoechst33258工作液，避光染色5min，荧光显微镜下检测细胞形态学改变。
结果如图5a、5b所示。
4.流式细胞仪Annex in V-FIT C/PI双染法检测细胞死亡
取对数生长期的HCT116和SW480细胞制成细胞悬液，接种于6孔板,细胞用含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基于37℃，5％CO2下培养24h，加入浓度分别为40和100μg/mL的BB以及AA40和100μM，再分别作用细胞12和24h后消化收集细胞，1000r/min离心10min，PBS洗涤1次，以100μlPBS悬浮细胞，每管加入10μl Annex in V-FIT C以及10μl PI试剂，避光染色10min，上机检测细胞死亡率。
结果如图6a和图6b所示。
由上实验结果可见，本发明实施例的番石榴叶提取物有效部位能够起到明显抗肿瘤作用，能够对结肠癌细胞(HCT116和SW480)和鼻咽癌细胞(SUNE-1和HONE-1)产生明显的抑制增殖作用。且BB对肿瘤细胞的生长抑制率强于AA。从流式细胞仪检测结果分析，BB使细胞大部分发生坏死而AA主要诱导细胞发生凋亡，对细胞而言，往往坏死对细胞造成的伤害相较于凋亡更为剧烈。显示出本发明实施例的番石榴叶提取物有效部位多种组分具有协同作用以及对抗肿瘤效果相比单体的明显增强。
本发明以番石榴叶为原料，经醇提、萃取、层析等一系列提取分离方法得到三萜酸和三萜皂苷部位，即抗肿瘤有效部位：1、6β-羟基积雪草酸，2、积雪草酸，3、2α-羟基齐墩果酸，4、2α-羟基乌苏酸，5、3β-O-cis-p-coumaroyloxy-2α-hydroxy-olean-28-oic acid(3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸)，6、3β-O-cis-p-coumaroyloxy-2α-hydroxy-urs-28-oic acid(3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸)，7、3β-O-trans-p-coumaroyloxy-2α-hydroxy-olean-28-oic acid(3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸)，8、3β-O-trans-p-coumaroyloxy-2α-hydroxy-urs-28-oic acid(3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸)，9、齐墩果酸，10、乌苏酸，11、积雪草苷，12、羟基积雪草苷，13、quadranoside Ⅳ和14、arjunglucoside Ⅱ。体外活性评价实验证实，这些有效部位具有显著抗细胞增殖、诱导细胞凋亡和坏死的作用，可用于开发天然植物来源的低成本抗肿瘤新药。
综上所述，本申请提供的具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位及其制备方法和应用，能够明确番石榴叶提取物中起到抗肿瘤活性的有效部位及其包含的主要成分，为后续的质量控制、成药、进入国际市场提供基础。
Claims (9)
1.一种具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)将番石榴叶用醇溶液进行提取，过滤，减压浓缩得到总浸膏，醇溶液为乙醇、乙醇水溶液、甲醇或甲醇水溶液；其中的乙醇水溶液中，乙醇的体积百分比浓度为大于等于70％，甲醇水溶液中，甲醇的体积百分比浓度为大于等于70％；
(2)将总浸膏加水分散，依次用石油醚和氯仿萃取，收集氯仿萃取部位；
(3)将氯仿萃取部位进行硅胶柱层析，依次用氯仿洗脱、氯仿:甲醇＝0.9-1.1:0.9-1.1洗脱、甲醇洗脱，收集氯仿:甲醇＝0.9-1.1:0.9-1.1的洗脱部位，得到具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中，提取的方式为渗漉、超声或加热回流；番石榴叶用醇溶液进行提取时，以重量计，醇溶液的用量为番石榴叶用量的5-10倍；提取次数为不低于2次。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，将总浸膏加水分散时，以体积计，水的用量与总浸膏的用量比为2-1∶1-2。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中，依次用石油醚和氯仿萃取时，以体积计，石油醚或氯仿的用量为被萃取相的1-2倍；萃取次数为2-7次。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述的步骤(3)中，洗脱时，洗脱液的用量为4-6倍柱体积。
6.根据权利要求1-5任一权利要求所述制备方法制备得到的具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位。
7.根据权利要求6所述的具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位，其特征在于：所述有效部位包括：6β-羟基积雪草酸、积雪草酸、2α-羟基齐墩果酸、2α-羟基乌苏酸、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸、3β-氧-顺式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-齐墩果酸、3β-氧-反式-香豆酰-2α-羟基-乌苏酸、齐墩果酸、乌苏酸。
8.根据权利要求7所述的具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位，其特征在于：所述的有效部位还包括积雪草苷、羟基积雪草苷、quadranosideⅣ和arjunglucosideⅡ。
9.权利要求6、7或8所述具有抗肿瘤作用的番石榴叶有效部位在制备抗肿瘤药物中的应用。
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