CN103565781B

CN103565781B - 一种组合物及其制备和在制备抗抑郁症药物中的应用

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Publication number: CN103565781B
Application number: CN201310546136.8A
Authority: CN
Inventors: 高晓霞; 周玉枝; 秦雪梅; 刘佳丽; 李震宇; 张丽增; 田俊生
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2013-11-06
Filing date: 2013-11-06
Publication date: 2015-04-15
Anticipated expiration: 2033-11-06
Also published as: CN103565781A

Abstract

一种组合物，由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇按1:1～4的比例组成，或由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇按1:1～4的比例组成。所述组合物是从中药柴胡中提取分离得到。采用体外单胺类神经递质再摄取抑制实验，结果显示上述组合物对5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NA）和多巴胺（DA）的再摄取具有三重抑制作用，抑制率均高于逍遥散石油醚有效部位和柴胡石油醚部位，且抑制效果高于阳性对照药物氟西汀、地昔帕明和6-羟多巴。两种组合物可在制备预防和治疗抑郁症药物中应用。

Description

一种组合物及其制备和在制备抗抑郁症药物中的应用

技术领域

本发明涉及多炔类化合物的组合物，具体属于一种组合物及其制备方法，以及在制备抗抑郁症药物中的应用。

背景技术

抑郁症是一种常见的精神疾病，具有发病率高、复发率高和高致残的特点。据WHO预测到2020年，单项抑郁症将成为第二大致残性疾病，其危害已越来越引起医药卫生界的重视。

现代医学研究表明，抑郁症发病机理复杂，诱发原因较多，临床症候多样。对于发病机制经近半个世纪的研究，最为人们所认同的是，抑郁症的单胺假说即抑郁症是由于人脑单胺类神经递质，5-HT、NA和/或DA缺损所致。现在临床上所用的主要的抗抑郁药物是通过抑制突触间隙5-HT和NA的再摄取增加突触间隙中单胺递质浓度。但合成抗抑郁药物存在抗抑郁谱窄，起效时间慢，以及毒副作用大等缺点。因此，国内外开始注意从传统药物和天然药物中研制与开发具有抗抑郁活性的药物。

逍遥散为经典名方，至今已有近千年的应用历史。现代临床与药理研究已证实其具有明显的抗抑郁作用，且未发现毒副作用。本课题组前期对逍遥散各部位进行了体外和体内药理活性研究，筛选出了石油醚活性部位，发现其抗抑郁疗效方面明显优于原复方，甚至超过了西药的活性，已申请专利（ZL201010110283.7），但其仍存在物质基础不明确等问题。本研究基于对药效物质基础的研究，以血清药物化学为指导，对君药柴胡的化学成分进行研究，发现其中多炔类化合物的含量较高，且能够入血，可能为抗抑郁的有效成分，因此对其进行深入的研究。

目前，从其他属植物中分离得到的多炔类成分曾被研究者报道具有显著的活性作用。例如人参炔三醇具有的抗肿瘤细胞的作用；从苍术中已经分离得到20余种聚乙炔类化合物，具有防止胃损伤、抗炎、利胆及黄嘌呤氧化酶阻碍等作用。近年来报道，已从柴胡属的植物中提取分离得到17种多炔类的化合物，其中柴胡毒素和乙酰柴胡毒素具有显著的神经毒性和细胞毒性作用，其它化合物未见活性或毒性的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种组合物及其制备方法，以及该组合物在制备抗抑郁症药物中的应用。

本发明发明人在长期从事逍遥散研究和开发的基础上，采用传统的提取分离方法，同时采用血清药物化学与高效液相色谱跟踪法，从君药柴胡药材中提取分离得到4种多炔类化合物（命名为RB-1、RB-2、RB-3、RB-4）。这四个化合物的在自然条件下浓缩、放置均不稳定，12h内会发生互变现象，最终只能得到分别含RB-1和RB-2的组合物1、RB-3和RB-4的组合物2。这两个组合物具有抗抑郁活性。

一种组合物，即组合物1，由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇组成。

一种组合物，即组合物2，由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇组成。

组合物的制备方法，步骤包括：

（1）柴胡石油醚部位制备：将柴胡用95%乙醇浸泡，回流提取，提取液浓缩得浸膏，浸膏用石油醚萃取，得到柴胡石油醚部位；

（2）柴胡石油醚部位的粗分离：将柴胡石油醚部位，加入到硅胶层析柱，依次用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统洗脱,收集石油醚和乙酸乙酯比例为100:8至100:20的部分，得到含目标化合物的粗品；

（3）纯化：将粗品再经硅胶层析柱和Sephadex LH-20凝胶柱除杂，溶解于9:1的甲醇-氯仿溶剂中，滤膜过滤，备用；

（4）制备：色谱条件：色谱柱Agela（Venusil MP C18，10×100mm，i.d.10μm），流动相：甲醇：水=85:15，检测波长：315nm，柱温：25℃，流速：4.0ml/min，进样量：200μl；得到4个化合物的色谱峰，保留时间分别是8.0-12.0、12.1-16.5、17.0-21.0、22.0-30.0分钟，收集保留时间为8.0-16.5分钟的色谱峰浓缩至干得到组合物1，收集保留时间为17.0-30.0分钟的色谱峰浓缩至干得到组合物2。

本发明所述的化合物及其组合物是从中药柴胡中提取分离得到。实验中发现：当RB1和RB2、RB3和RB4分别以1:1～4的比例组成组合物的状态存在时较稳定。

采用NMR（¹H-NMR、¹³C-NMR、¹H-¹H COSY）、UV和MS等方法，对组合物1和组合物2中化合物的结构进行鉴定，组合物1由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇组成；组合物2由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇组成。

经体外试验证明，组合物1和组合物2能有效抑制5-HT、NA和DA的再摄取行为，其抑制率高于逍遥散和柴胡的石油醚部位，甚至高于阳性对照药物氟西汀、地昔帕明和6-羟多巴。组合物1和组合物2均可以在制备预防和治疗抑郁症的药物中应用。

说明书附图

图1组合物1的¹H-¹HCOSY谱图

图2组合物2的¹H-¹HCOSY谱图

具体实施方式

实施例1：组合物的制备

（1）柴胡石油醚部位制备

柴胡药材5kg，用95%乙醇浸泡12h，回流提取三次，提取液浓缩得浸膏，浸膏按照逍遥散复方石油醚部位的制备方法，使用石油醚萃取，得到柴胡石油醚部位。

（2）柴胡石油醚部位的粗分离

称取上述柴胡石油醚部位样品220g，加入层析柱，用石油醚：乙酸乙酯作为洗脱系统。将上述硅胶柱依次用石油醚：乙酸乙酯比例为100:0～100进行梯度洗脱。以硅胶GF₂₅₄薄层层析板、石油醚-乙酸乙酯为展开系统检测流份，薄层色谱监测组份有明显变化时，更换下一浓度洗脱梯度。结合高效液相色谱跟踪结果，收集石油醚和乙酸乙酯比例为100:8至100:20的部分，得到粗品C-H共17.7g。

（3）纯化：

取上述粗品（C-H）17.7g拌样，采用干法上样，置于干燥硅胶粉（200-300目）170g层析柱（层析柱规格：直径3cm，高45cm），依次用石油醚：乙酸乙酯比例为100:0～100进行梯度洗脱，结合高效液相色谱跟踪结果，收集石油醚和乙酸乙酯比例为100:4至100:6的部分，得到C-H-X8.9g。

取150mg样品C-H-X分别经过氯仿：甲醇（1:1）Sephadex LH-20凝胶柱，氯仿SephadexLH-20凝胶柱进行分离，共得到63.9mg样品C-H-X-LJ。然后将样品C-H-X-LJ溶解于甲醇：氯仿（9:1）的1ml溶剂中，0.45μm滤膜过滤，备用。

（4）组合物的制备

色谱条件：色谱柱（Venusil C₁₈10×100mm，i.d.10μm），流动相：甲醇：水=85:15，检测波长：315nm，柱温：25℃，流速：4.0ml/min，进样量：200μl。

共得到4个化合物的色谱峰，保留时间分别是11.56、12.81、19.34、22.89分钟，收集保留时间为11.56和12.81分钟的色谱峰浓缩至干得到组合物1，收集保留时间为19.34、22.89分钟的色谱峰浓缩至干得到组合物2。4个化合物命名标号分别为RB-1、RB-2、RB-3和RB-4。

（5）稳定性实验

将制备得到的4个化合物的色谱峰分别收集,在自然条件下浓缩、放置，结果显示这四个化合物不能单独稳定存在，浓缩过程中发生互变现象，RB-1会得到比例为1:1～1.5的组合物1，RB-2会得到比例为1:2～4的组合物1；RB-3会得到比例为1:1～1.5的组合物2，RB-4会得到比例为1:2～4的组合物2。故将RB-1和RB-2、RB-3和RB-4分别混合收集浓缩得到比例为1:1～4的组合物1和组合物2，并对其稳定性进行考察。

经实验室多次试验考察发现，顺反式比例为1:1～4时，2个月内于4℃且避光条件下保存稳定。长时间放置时会发生继续互变及降解现象。具体结果如表1所示。

表1稳定性考察结果表

（6）结构确认

由于本研究中得到的是组合物，采用相关谱进行归属，采用NMR（¹H-NMR、¹³C-NMR、¹H-¹H-COSY）、UV和MS等方法，并参照文献鉴定了四种化合物的结构。组合物1和2的¹H-¹H-COSY图见图1和图2。

四种化合物的结构鉴定结果如下：

①RB-1:

中文名：(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇

英文名：(2Z,8Z,10E)-Pentadecatriene-4,6-diyn-1-ol

结构式

分子式C₁₅H₁₈O

分子量214

UV252,267,298,316,338

MS HREIMS m/z214.1[M]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,/600MHz)δ_H:4.44(2H,dd,J=6.4,1.5HZ,H-1),6.23(1H,dt,J=10.8HZ,H-2),5.68(1H,d,J=10.8HZ,H-3),5.42(1H,d,J=10.5HZ,H-8),6.51(1H,d,J=10.8HZ,H-9),6.59(1H,dd,J=15.6,10.8HZ,H-10),6.01(1H,dt,J=15.6HZ,H-11),2.19(2H,q,J=7.2HZ,H-12),1.38(2H,m,H-13),1.32(2H,m,H-14),0.90(3H,t,J=7.2HZ,H-14)。

¹³C-NMR(CDCl₃,/600MHz)δc:61.3(C-1),145.9(C-2),109.6(C-3),78.6(C-4),79.8(C-5),78.3(C-6),80.8(C-7),105.0(C-8),144.7(C-9),127.7(C-10),140.5(C-11),32.9(C-12),31.6(C-13),22.5(C-14),13.8(C-15)。

②RB-2：

中文名(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇

英文名(2Z,8Z,10E)-Pentadecatriene-4,6-diyn-1-ol

结构式

分子式C₁₅H₁₈O

分子量214

UV252,267,298,316,338

MS HREIMS m/z214.1[M]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,/600MHz)δ_H:4.44(2H,dd,J=6.4,1.5HZ,H-1),6.23(1H,dt,J=10.8HZ,H-2),5.68(1H,d,J=10.8HZ,H-3),5.57(1H,d,J=15.6HZ,H-8),6.71(1H,dd,J=15.6,10.8HZ,H-9),6.12(1H,dd,J=15.6,10.8HZ,H-10),5.90(1H,dt,J=15.6HZ,H-11),2.14(2H,q,J=7.2HZ,H-12),1.38(2H,m,H-13),1.32(2H,m,H-14),0.90(3H,t,J=7.2HZ,H-14)。

¹³C-NMR(CDCl₃,/600MHz)δ_C:61.2(C-1),144.9(C-2),109.7(C-3),77.6(C-4),79.9(C-5),75.1(C-6),83.1(C-7),107.1(C-8),145.7(C-9),129.4(C-10),140.7(C-11),33.0(C-12),31.7(C-13),22.1(C-14),13.8(C-15)。

③RB-3：

中文名：(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇

英文名：(2Z,8Z,10E)-heptadecatriene-4,6-diyn-1-ol

结构式

分子式C₁₇H₂₂O

分子量242

UV252,267,298,316,338

MS HREIMS m/z242[M]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,/600MHz)δ_H:4.44(2H,dd,J=6.8HZ,H-1),6.26(1H,dt,J=10.8,6.7HZ,H-2),5.70(1H,dt,J=10.8,11.2HZ,H-3),5.42(1H,d,J=10.5HZ,H-8),6.51(1H,d,J=10.8HZ,H-9),6.59(1H,dd,J=15.6,10.8HZ,H-10),6.02(1H,dt,J=15.6HZ,H-11),2.20(2H,m,H-12),1.38(2H,m,H-13),1.29(2H,m,H-14),1.29(2H,m,H-15),1.29(2H,m,H-16),0.90(3H,t,J=6.8HZ,H-17)。

¹³C-NMR(CDCl₃,/600MHz)δc:61.3(C-1),145.9(C-2),109.6(C-3),78.6(C-4),79.8(C-5),78.3(C-6),80.8(C-7),105.0(C-8),144.5(C-9),127.8(C-10),140.5(C-11),32.9(C-12),31.6(C-13),28.9(C-14),28.8(C-15),22.5(C-16),14.0(C-17)。

④RB-4

中文名：柴胡炔醇（(2Z,8E,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇）

英文名：Bupleurynol（(2Z,8E,10E)-heptadecatriene-4,6-diyn-1-ol）

结构式

分子式C₁₇H₂₂O

分子量242

UV252,267,298,316,338

MS HREIMS m/z242[M]⁺

¹H-NMR(CDCl₃,/600MHz)δ_H:4.44(2H,dd,J=6.8HZ,H-1),6.26(1H,dt,J=10.8,6.7HZ,H-2),5.70(1H,dt,J=10.8,11.2HZ,H-3),5.56(1H,d,J=15.5HZ,H-8),6.70(1H,dd,J=15.6,10.8HZ,H-9),6.11(1H,dd,J=14.8,10.9HZ,H-10),5.89(1H,dd,J=14.8,7.3HZ,H-11),2.15(2H,m,H-12),1.39(2H,m,H-13),1.29(2H,m,H-14),1.29(2H,m,H-15),1.29(2H,m,H-16),0.89(3H,t,J=6.8HZ,H-17)。

¹³C-NMR(CDCl₃,/600MHz)δc:61.2(C-1),144.9(C-2),109.7(C-3),77.6(C-4),79.9(C-5),75.1(C-6),83.1(C-7),107.1(C-8),145.7(C-9),129.4(C-10),140.7(C-11),33.0(C-12),31.7(C-13),29.0(C-14),28.9(C-15),22.6(C-16),14.0(C-17)。

实施例2：组合物体外活性测定

对上述提取、分离的各化合物及其柴胡石油醚部位、逍遥散石油醚部位进行了体外5-HT、NA和DA单胺递质再摄取抑制试验。

1、实验材料

①动物

品系：SD大鼠，性别：雄性，体重：200-220g，来源：上海斯莱克实验动物责任有限公司，动物合格证号：SCXK（沪）2007-0005，饲养：SPF级动物房常规饲养。

②供试样品的制备

I.组合物的制备

组合物1和组合物2分别溶于10%DMSO（二甲基亚砜，一种药理常用溶剂），配制成1mg/ml的溶液，然后再稀释10倍使浓度为100μg/ml。

II.柴胡石油醚部位的制备

柴胡饮片12kg粉碎，加无水乙醇10升加热回流提取2次（每次2h），合并提取液，过滤，滤液浓缩至浸膏，置真空干燥箱中（60℃）烘干，粉碎得醇提物；醇提物加石油醚（60-90℃），超声提取3次（每次30min），合并石油醚提取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，置真空干燥箱中（60℃）烘干，得柴胡石油醚部位；取适量溶于10%DMSO（二甲基亚砜，一种药理常用溶剂），配制成1mg/ml的溶液，然后再稀释10倍使浓度为100μg/ml。

III.逍遥散石油醚部位的制备

逍遥散复方12kg粉碎，加无水乙醇10升加热回流提取2次（每次2h），合并提取液，过滤，滤液浓缩至浸膏，置真空干燥箱中（60℃）烘干，粉碎得醇提物；醇提物加石油醚（60-90℃），超声提取3次（每次30min），合并石油醚提取液，回收溶剂，浓缩至浸膏，置真空干燥箱中（60℃）烘干，得逍遥散石油醚部位；取适量溶于10%DMSO（二甲基亚砜，一种药理常用溶剂），配制成1mg/ml的溶液，然后再稀释10倍使浓度为100μg/ml。

③对照药物的制备：

I.盐酸氟西汀1.73mg→0.5ml双蒸水，终反应浓度：0.1mM（100%抑制了³H-5-HT的再摄取）

II.地西帕明1.51mg→0.5ml双蒸水，终反应浓度：0.1mM（100%抑制了³H-NA的再摄取）

III.6-羟基多巴胺1.03mg→0.5ml双蒸水，终反应浓度：0.1mM（100%抑制了³H-DA的再摄取）

④脑突触体的制备

5-HT和NA能脑突触体的制备

大鼠断头后迅速取出大脑，置于预冷（4℃）的生理盐水中，去除软脑膜及血管组织。取3g大脑皮层，放入到30ml0.32M的冷蔗糖溶液中。用超声波细胞粉碎器匀浆（保持低温），4℃平衡离心（1500g,10min），随后取上清液离心（20000g，30min）。弃取上清液，留用沉淀，即突触小体的粗提物。此沉淀部分再用0.32M的冷蔗糖溶液悬浮后小心铺在已由管底依次铺上1.2M和0.8M（各10ml）的冷蔗糖梯度溶液上,4℃平衡离心（38000g）60min。用穿刺针小心收集0.8–1.2M蔗糖界面处的悬浮带，置于10ml0.32M的冷蔗糖溶液中混匀，4℃平衡离心（20000g）30min），沉淀物即为精制的脑突触体。将沉淀物悬浮于少量Tris-Krebs缓冲液(Tris:15mM;NaCl:94.7mM;KCl:4.7mM;CaCl₂:0.5mM;MgSO₄:2.4mM;NaH₂PO₄:1.2mM;Glucose:10.6mM;Ascorbic:0.57mM;Pargyline:0.01mM)中，用总蛋白测定试剂盒测定悬液中的蛋白含量。

DA能脑突触体的制备

大鼠断头后迅速取出大脑，置于预冷（4℃）的生理盐水中，去除软脑膜及血管组织。取2g大脑去皮层后的剩余脑组织，放入到20ml0.32M的冷蔗糖溶液中。用超声波细胞粉碎器匀浆（保持低温），4℃平衡离心（1500g,10min），随后取上清液离心（20000g）30min。弃取上清液，留用沉淀，即突触小体的粗提物。将沉淀物悬浮于少量Tris-Krebs缓冲液中，用总蛋白测定试剂盒测定悬液中的蛋白含量。

2、单胺的再摄取抑制试验

试管中先加入1.0ml Tris-Krebs缓冲液（预先通氧15min），随后加入20μl突触小体悬液，然后加入对照样品或待测药物10μl（均于4℃环境中操作），混合均匀，37℃水浴中温浴5min。于4℃环境中加入10μl底物（³H-5HT、³H-NA或³H-DA；终反应浓度：300nM），混匀，37℃水浴中温浴5min。随后每管加入3ml予冷的Tris-Krebs缓冲液终止反应，并迅速用多头细胞收集器通过玻璃纤维滤膜抽滤，再用同体积的相同溶液冲洗试管和滤器2次。取下滤膜，60–70℃烘干，将滤膜放入闪烁瓶内，加入甲苯闪烁液，于β-液闪计数器计数。空白、37℃、及不同的药物浓度均为3复管。突触体的净摄取量：37℃的cpm值（主动再摄取）减去0℃的cpm值（非特异性聚集）。

阳性对照药（氟西汀、地西帕明、6-羟多巴）的终反应浓度均为0.1mM。在此浓度之下，阳性对照药可以100%的抑制大鼠脑突触体对5-HT、NA和DA的再摄取。因此，以0.1mM为阳性对照药的终反应作用浓度，待测样品的抑制作用和相应的阳性对照药进行比较进行抑制作用的筛选。

3、实验结果

研究中为了分别制备了两批样品，进行了两次实验，测得各组样品的CPM值，以阳性药的和待测药物的CPM值相比计算，得出样品的抑制百分率（阳性药以100%计）。计算公式为：

待测样品抑制单胺类神经递质的百分率=[1-（CPM_样-CPM_对照）/CPM_对照]×100%

第一次结果

第二次实验结果

注：-为样品不足，未进行试验。

4、初步结论：

体外单胺类神经递质的再摄取抑制实验显示，组合物1和组合物2能有效抑制5-HT、NA和DA的再摄取行为，其抑制率高于逍遥散和柴胡的石油醚部位，甚至高于阳性对照药物氟西汀、地昔帕明和6-羟多巴。

结论：

本发明从柴胡石油醚部位中分离得到含新化合物RB-1和其顺反异构体RB-2的组合物1，含新化合物RB-3和其顺反异构体RB-4的组合物2。经体外试验证明，组合物1和组合物2能有效抑制5-HT、NA和DA的再摄取行为，其抑制率高于逍遥散和柴胡的石油醚部位，甚至高于阳性对照药物氟西汀、地昔帕明和6-羟多巴。因这两化合物化学成分明确，在植物中含量较高，属低极性成分，组合物形式保存较稳定，适宜开发成抗抑郁新药。

Claims

1.一种组合物，特征在于，其由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十五烷三烯-4,6-二炔-1-醇按1:1～4的比例组成。

2.一种组合物，特征在于，其由(2Z,8Z,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇和(2Z,8E,10E)-2,8,10-十七烷三烯-4,6-二炔-1-醇按1:1～4的比例组成。

3.一种组合物的制备方法，其特征在于，步骤包括：

(1)柴胡石油醚部位制备：将柴胡用95％乙醇浸泡，回流提取，提取液浓缩得浸膏，浸膏用石油醚萃取，得到柴胡石油醚部位；

(2)柴胡石油醚部位的粗分离：将柴胡石油醚部位，加入到硅胶层析柱，依次用石油醚-乙酸乙酯洗脱系统洗脱,收集石油醚和乙酸乙酯比例为100:8至100:20的部分，得到含目标化合物的粗品；

(3)纯化：将粗品再经硅胶层析柱和Sephadex LH-20凝胶柱除杂，溶解于9:1的甲醇-氯仿溶剂中，滤膜过滤，备用；

(4)制备：色谱条件：色谱柱Agela(Venusil MP C18，10×100mm，i.d.10μm)，流动相：甲醇：水＝85:15，检测波长：315nm，柱温：25℃，流速：4.0ml/min，进样量：200μl；得到4个化合物的色谱峰，保留时间分别是8.0-12.0、12.1-16.5、17.0-21.0、22.0-30.0分钟，收集保留时间为8.0～16.5分钟的色谱峰浓缩至干，得到如权利要求1所述的组合物。

4.一种组合物的制备方法，其特征在于，步骤包括：

(4)制备：色谱条件：色谱柱Agela(Venusil MP C18，10×100mm，i.d.10μm)，流动相：甲醇：水＝85:15，检测波长：315nm，柱温：25℃，流速：4.0ml/min，进样量：200μl；得到4个化合物的色谱峰，保留时间分别是8.0-12.0、12.1-16.5、17.0-21.0、22.0-30.0分钟，收集保留时间为17.0～30.0分钟的色谱峰浓缩至干，得到如权利要求2所述的组合物。

5.如权利要求1或2所述的组合物在制备抗抑郁药物中的应用。

6.如权利要求1或2所述的组合物在制备功能食品中的应用。