CN106554340A - 一种紫藤瘤中单体化合物的用途及其分离纯化方法 - Google Patents
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- A01N43/04—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom
- A01N43/14—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings
- A01N43/16—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with one or more oxygen or sulfur atoms as the only ring hetero atoms with one hetero atom six-membered rings with oxygen as the ring hetero atom
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Abstract
本发明公开了一种紫藤瘤中单体化合物的用途及其分离纯化方法，其中紫藤瘤中单体化合物为3′,5′‑二羟基‑2′,4′,7‑三甲氧基异黄烷、2′,4′,4‑三羟基查尔酮或12‑齐墩果烯‑3,22,24‑三醇。本发明单体化合物是从紫藤瘤中提取分离而得，可以用于抑制农作物病原性真菌。
Description
技术领域
本发明涉及一种紫藤瘤中单体化合物的用途及其分离纯化方法，属于天然植物源农药领域。
背景技术
植物源农药，是指利用具有生物活性植物或其特定部位，经粗加工或提取其有效成分做成制剂，用于防治有害生物的农药。植物源农药作为生物农药的重要组成部分，因其具有高效、低毒或无毒、低残留、选择性高、有害物质一般难以对其产生抗性、又易和其他农药相混配等优点，受全世界农药研究及应用部门的广泛重视，高效低毒、易降解的新型生物源农药的研发，是当今世界农药发展的大趋势。到目前为止，世界各国已对2000多种植物的杀虫活性进行了研究，其中不乏传统的中草药。随着植物源农药的发展，中草药源农药逐渐成为植物源农药研究的重点。所谓中草药源农药，是指用于防治病虫害的中草药提取物或从中分离纯化的单体物质。我国中医药几千年的发展取得了丰硕成果，中草药丰富的资源和研究基础是开发新型植物源农药的一个突出优势，引起广大农药研究人员的广泛关注。目前文献报道的具有杀虫、抑菌生物活性的中草药大约有60多种，主要分布于菊科、大戟科、豆科、樟科等10余科，主要应用在杀虫、杀菌、杀线虫方面[2]。
植物源杀菌剂是利用植物里含有的某些抗菌物质，杀死或有效抑制病原菌的生长发育。当前国内有关利用植物提取物抑制植物病原菌的研究已有一定的基础，如赵纯森等从厚朴树的自然落叶中提取总酚化合物，对禾赤色镰孢霉(Fusariumg raminearum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等10种真菌都有很强的抑制作用，盆栽和大田试验均显示出较好的防治效果；张国珍等报道了麻黄油、细辛油两种挥发油对Alternaria panax，Phytophthora,Rhizoctonia solani等几种供试病原真菌有较强的抑制作用；南昌中德联合研究所佘世望等对60味食药两用中药进行抗19种常见食品腐败菌的快速筛选，发现乌梅对所测普通变形杆菌、荧光假单胞菌属、蜡状芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌有强烈抑制作用；郑永权等研究发现苦参提取物对大肠杆菌、金黄色链球菌及表皮葡萄球菌均有明显抑制作用；冯俊涛等对56种植物的60种丙酮提取物进行了抑菌活性筛选，结果发现莴苣、苍耳等8种植物有进一步研究开发的价值。
赤霉病遍及全国，一直是淮河以南及长江中下游麦区发生最严重的病害之一，在大流行年份，产量损失可达10％～40％。所以急切需要开发新型、有效、无毒的生物农药。
生物农药快速发展的良好势头全球生物农药市场今后3年将以每年60％的速度增长，从2005年销售额6.7亿美元发展到2010年的10.8亿美元。我国近3年生物农药增长了80％。现在，中国各类生物农药的年总需求量达到14.5万吨，总销售量额约为10亿元。占农药总产值的10％左右，使用面积约4亿多亩次。我国规划到2015年生物农药占所有农药的份额将由现在的10％增加到30％。我国植物源农药现在市场规模只占生物农药的1.5％左右，市场需求量及发展潜力巨大。化学农药比例减少FAO已经做出了近年内减少使用化学农药50％的规划。根据美国Business Communications Company(BCC)预测，全球化学农药市场将以每年7.2％的速度下降，为生物源农药的发展留下了广阔的空间。在过去的十多年里，欧洲各国先后不同程度地减少了常规农药的用量。瑞典较上世纪末减少了50％的化学农药使用量，荷兰和丹麦制定了减少化学农药用量50％的“行动计划”和“长期作物保护计划”，美国颁布了减少农药使用的政令，早在20世纪末，美国就已减少了35％的化学农药用量。韩国农林部在2004年前减少了30％的化肥和化学农药的使用量，在2010年前将减少至2000年的50％。我国2007年开始禁用5种大吨位高毒农药品种，为生物源农药腾出了巨大的市场空间。
紫藤瘤(Wisteria sinensis Sweet Caulis)为豆科紫藤属植物紫藤的茎瘤体，紫藤为一种常见的绿化植物。在我国分布广泛，产河北以南黄河长江流域及陕西、河南、广西、贵州、云南，紫藤对气候和土壤的适应性强，较耐寒，能耐水湿及瘠薄土壤，喜光，较耐阴。紫藤瘤在日本民间一直用作抗胃癌的药物使用(林博夫，杨世忠.中药WTTC治疗胃癌获显效[J].广西中医药，1983，6(4):48.)。其化学成分也有一定的研究(刘劲松,陈爱民,许应生,等.紫藤瘤酚性成分研究[J].中药材,2013,36(09):1437-1440.刘劲松,陈爱民,许应生,等.紫藤瘤三萜类化学成分研究[J].中药材,2012,35(8):1246-1250.陈爱民,吴培云,刘劲松,等.紫藤瘤化学成分研究[J].安徽医药,2012,16(1):21-23.)。
本发明的研究表明，紫藤瘤中的主要化学成分为异黄酮、查尔酮及三萜等类型化合物。目前尚没有对紫藤瘤中单体化合物3ˊ,5ˊ-二羟基-2ˊ,4ˊ,7-三甲氧基异黄烷、2ˊ,4ˊ,4-三羟基查尔酮、12-齐墩果烯-3,22,24-三醇对农作物病院真菌抑制活性的相关研究报道。
发明内容
本发明旨在提供一种紫藤瘤中单体化合物的用途及其分离纯化方法，本发明紫藤瘤中单体化合物能够起到抑制农作物病原性真菌的作用。
本发明紫藤瘤中单体化合物为3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷、2′,4′,4-三羟基查尔酮或12-齐墩果烯-3,22,24-三醇，结构式如下：
3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷2′,4′,4-三羟基查尔酮12-齐墩果烯-3,22,24-三醇
本发明紫藤瘤中单体化合物的用途，是在抑制农作物病原性真菌中的应用。所述农作物病原性真菌包括天南星炭疽、花生褐斑、茄子茎枯、烟草赤星等。
本发明紫藤瘤中单体化合物的分离纯化方法，包括如下步骤：
1、取干燥的紫藤瘤药材，粉碎，以70～95vt％乙醇(优选为80vt％乙醇)为溶剂在80℃下回流提取三次，每次2小时，合并提取液，回收提取溶剂，浓缩后得到相对密度为1.1的浸膏；
2、将所得浸膏用硅胶柱梯度洗脱，洗脱剂由二氯甲烷和甲醇构成，洗脱剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为100:0～0:1，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离，TLC检识，合并相同组分后得到8个组分，极性由小到大依次称为Z1-Z8；
3、组分Z4经硅胶柱梯度洗脱，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯构成，洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为50:1～0:1，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离，TLC检识，合并相同组分后得到8个组分，极性由小到大依次称为A-H；
4、组分E先经MCI柱梯度洗脱，洗脱剂由甲醇和水构成，洗脱剂中甲醇和水的体积比为0:1～100:0，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离，再经pre-HPLC(乙腈-水，25:75～43:57，v/v)纯化得单体化合物3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷；
5、组分H经反相Rp18中压柱色谱梯度洗脱，洗脱剂由甲醇和水构成，洗脱剂中甲醇和水的体积比为10:90～100:0，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离，得到五个组分，极性由小到大依次称为H1～H5；
6、组分H1依次经硅胶柱洗脱(洗脱剂为石油醚和丙酮按体积比8:1构成)、经凝胶柱(洗脱剂为氯仿和甲醇按体积比1:1构成)分离，再经pre-HPLC(乙腈-水，30:70-40:60，v/v)分离纯化得到单体化合物12-齐墩果烯-3,22,24-三醇；
7、组分H2经凝胶柱(洗脱剂为氯仿和甲醇按体积比1:1构成)分离并经pre-HPLC(乙腈-水，30:70-32:68，v/v)分离纯化得到单体化合物2′,4′,4-三羟基查尔酮。
本发明所选的紫藤瘤药材来源于豆科紫藤属植物紫藤(Wisteria sinensis)的茎瘤体。
本发明分离纯化得到单体化合物的化学结构通过质谱与核磁等技术手段确定。
本发明采用十字交叉法对分离纯化得到的单体化合物进行对农作物病原性真菌活性的抑制活性研究。
抗菌测试实验如下：
选取分离得到的单体化合物3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷、2′,4′,4-三羟基查尔酮、12-齐墩果烯-3,22,24-三醇分别加适量无菌水溶解(必要时加少量的DMSO助溶)，分别配置0.5mg·ml-1，0.25mg·ml-1、0.125mg·ml-1浓度的药物储备液。取1mL各浓度供试药液经0.22μm滤膜滤过，与9mL已灭菌的PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)于无菌试管中混匀，倒入已灭菌的培养皿中制成含药的培养基平板，以无菌水和DMSO作为空白对照。
将天南星炭疽、花生褐斑、茄子茎枯、烟草赤星四种作物病原真菌提前接种在PDA平板培养基上活化3～5d后，用无菌打孔器在活化后的农作物病原性真菌菌落边缘切下直径6mm生长一致的菌饼。将打好的菌饼菌丝面接种于含药培养基平板的中心，使病原真菌菌丝与培养基充分接触，再用封口膜将培养皿封口，防止其它杂菌的感染，然后置于26℃恒温培养箱中培养3～5d。每个抗菌试验平行试验三份。抑制率结果测量采用十字交叉法测定，待空白对照组试验菌落长至培养基平板边缘时，测量各培养皿中的菌落生长直径，以重复测量3次的试验菌落直径平均值计算测试供试样品溶液对菌丝生长相对抑制率。
注：直径单位为mm。
抗菌试验结果表明试验结果显示供试化合物样品对天南星炭疽、花生褐斑、四种农作物病原性真菌都具有较明显的抑菌效果，化合物样品对茄子茎枯、烟草赤星的抑菌效果最为显著。单体化合物3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷和2′,4′,4-三羟基查尔酮在0.5mg·mL-1浓度下对茄子茎枯抑制率分别达到42.9％和47.1％，单体化合物12-齐墩果烯-3,22,24-三醇在0.5mg·mL-1浓度下对天南星炭疽抑制率达到64.5％。
本发明的有益效果体现在：
1、本发明紫藤瘤中单体化合物3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷、2′,4′,4-三羟基查尔酮、12-齐墩果烯-3,22,24-三醇通过抗菌实验表明其对农作物病源性真菌具有较好的抗菌活性，具有很好的用药安全性；该类化合物对天南星炭疽、花生褐斑、茄子茎枯、烟草赤星四种作物病原真菌有明显的抑制作用，其作用为本发明首次发现。
2、本发明紫藤瘤中单体化合物的分离纯化条件所得化合物均通过NMR，MS等确定其化学结构该方法简单易行可控。
3、本发明紫藤瘤中单体化合物均通过高效液相色谱方法通过面积归一化法测定其含量，其纯度均大于98％。
4、本发明紫藤瘤中单体化合物的分离纯化方法简单、快捷、重现性好。
正因为以上优点，充分说明了该类化合物具有较强的农业方面实用性。
为了更好的理解本发明，下面结合附图，通过对本发明较佳的实施方式的描述，详细说明单不限制本发明。
附图说明
图1为单体化合物3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷的液相色谱图。从图1中可以看出纯度均大于98％。
图2为单体化合物2′,4′,4-三羟基查尔酮的液相色谱图。从图2中可以看出纯度均大于98％。
图3为单体化合物12-齐墩果烯-3,22,24-三醇的液相色谱图。从图3中可以看出纯度均大于98％。
图4为单体化合物3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷的抗菌效果图。从图4中可以看出在不同浓度下对天南星炭疽、花生褐斑、茄子茎枯、烟草赤星四种作物病原真菌有抑菌作用。
图5为单体化合物2′,4′,4-三羟基查尔酮的抗菌效果图。从图5中可以看出在不同浓度下对天南星炭疽、花生褐斑、茄子茎枯、烟草赤星四种作物病原真菌有抑菌作用。
图6为单体化合物12-齐墩果烯-3,22,24-三醇的抗菌效果图。从图6中可以看出在不同浓度下对天南星炭疽、花生褐斑、茄子茎枯、烟草赤星四种作物病原真菌有抑菌作用。
具体实施方式
本发明所用的紫藤瘤采自于四川省，经鉴定为豆科紫藤属植物紫藤茎瘤体。
三种单体化合物的制备
实施例1：
1、取干燥的紫藤瘤药材15kg，粉碎，以80vt％乙醇为溶剂在80℃下回流提取三次，每次2小时，合并提取液，回收提取溶剂，浓缩后得到相对密度为1.1的浸膏2kg；
2、将所得浸膏用硅胶柱梯度洗脱，洗脱剂由二氯甲烷和甲醇构成，洗脱剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为100:0～0:1，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离，TLC检识，合并相同组分后得到8个组分，极性由小到大依次称为Z1-Z8；
3、组分Z4(82.3g)经硅胶柱梯度洗脱，洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯构成，洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为50:1～0:1，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离，TLC检识，合并相同组分后得到8个组分，极性由小到大依次称为A-H。
4、组分E(5.1g)先经MCI柱梯度洗脱，洗脱剂由甲醇和水构成，洗脱剂中甲醇和水的体积比为0:1～100:0，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离，再经pre-HPLC(乙腈-水，25:75～43:57，v/v)纯化得单体化合物3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷；
5、组分H(21.3g)经反相Rp18中压柱色谱梯度洗脱，洗脱剂由甲醇和水构成，洗脱剂中甲醇和水的体积比为10:90～100:0，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离，得到五个组分，极性由小到大依次称为H1～H5；
6、组分H1依次经硅胶柱洗脱(洗脱剂为石油醚和丙酮按体积比8:1构成)、经凝胶柱(洗脱剂为氯仿和甲醇按体积比1:1构成)分离，再经pre-HPLC(乙腈-水，30:70-40:60，v/v)分离纯化得到单体化合物12-齐墩果烯-3,22,24-三醇；
7、组分H2经凝胶柱(洗脱剂为氯仿和甲醇按体积比1:1构成)分离并经pre-HPLC(乙腈-水，30:70-32:68，v/v)分离纯化得到单体化合物2′,4′,4-三羟基查尔酮。
所得化合物均通过NMR，MS等确定其化学结构。
其中3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷，分子式为C18H20O6，为黄色粉末化合物，其氢谱和碳谱数据为：1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ:6.94(1H,d,J＝8.5Hz,H-5),6.42(1H,dd,J＝8.5,2.5Hz,H-6),6.38(1H,d,J＝2.5Hz,H-8),6.37(1H,s,H-6'),4.32(1H,ddd,J＝10.0,3.5,2.0Hz,H-2),4.09(1H,t,J＝10.0Hz,H-2),3.92(3H,OCH3-4'),3.85(3H,OCH3-2'),3.75(3H,OCH3-7),3.53(1H,m,H-3),3.02(1H,dd,J＝15.5,11.0Hz,H-4),2.91(1H,ddd,J＝15.5,5.0,1.5Hz,H-4).13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ:155.2(C-7),154.8(C-9),146.6(C-5'),142.3(C-3'),140.4(C-2'),133.1(C-4'),130.4(C-5),129.2(C-1'),114.6(C-10),107.9(C-6),103.8(C-6'),103.2(C-8),69.7(C-2),61.0(OCH3-4'),60.9(OCH3-2'),55.8(OCH3-7),32.1(C-3),30.1(C-4)。
其中2′,4′,4-三羟基查尔酮，分子式为C15H12O4，为黄色粉末化合物，其氢谱和碳谱数据为：1H-NMR(CD3OD,400MHz)δ:7.95(1H,d,J＝8.9Hz,H-6′),7.78(1H,d,J＝15.4Hz,H-α),7.61(2H,d,J＝8.7Hz,H-2,6),7.59(1H,d,J＝15.4Hz,H-β),6.84(2H,d,J＝8.7Hz,H-3,5),6.40(1H,dd,J＝8.9,2.4Hz,H-5′),6.27(1H,d,J＝2.4Hz,H-3′)；13C-NMR(CD3OD,150MHz)δ:193.4(C＝O),167.7(C-4′,2′),167.4(C-4′,2′),161.7(C-4),145.5(C-β),133.4(C-6′),131.8(C-2,6),128.0(C-1),118.5(C-α),117.0(C-3,5),114.5(C-1′),109.6(C-5′),104.1(C-3′).
其中12-齐墩果烯-3,22,24-三醇，分子式为C30H50O3，为白色针状结晶化合物，其氢谱和碳谱数据为：1H-NMR(CDCl3,400MHz)δ:5.19(1H,t,J＝3.5Hz,H-12),4.14(1H,d,J＝10.5Hz,H-24),3.38(1H,d,J＝10.5Hz,H-24),3.32(1H,m,H-22),3.29(1H,m,H-3),1.17(3H,s,CH3),1.05(3H,s,CH3),0.97(3H,s,CH3),0.96(3H,s,CH3),0.95(3H,s,CH3),0.92(3H,s,CH3),0.81(3H,s,CH3)；13C-NMR(CDCl3,100MHz)δ:143.4(C-13),122.0(C-12),80.0(C-3),75.7(C-22),64.5(C-24),56.4(C-5),48.0(C-9),46.6(C-19),44.7(C-18),43.3(C-4),42.0(C-14),41.8(C-21),39.6(C-8),39.3(C-1),36.7(C-10),36.6(C-17),33.2(C-7),32.0(C-29),30.5(C-20),28.5(C-2),28.3(C-28),27.4(C-16),25.5(C-27),25.3(C-15),24.1(C-11),23.6(C-23),20.6(C-30),19.6(C-6),16.4(C-26),15.8(C-25).
三种单体化合物的含量分析
实施例2：
2.1仪器与试药
2.1.1仪器
Shimadzu LC-15C型高效液相色谱仪(SPD-15C紫外检测器、LC-15C泵、LC-Solution色谱工作站、天津东康DT-230A型柱温箱)，KQ2200型超声清洗仪(江苏昆山超声仪器有限公司)，UV759CRT紫外可见分光光度计(上海佑科仪器仪表有限公司)，德国赛多利斯CP225D十万分之一电子天平。
2.1.2试药
乙腈、甲醇均为色谱纯(天津大茂化学试剂厂)，水为娃哈哈纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)，磷酸为分析纯(上海苏懿化学试剂有限公司)。
2.2色谱分析条件
试验色谱柱为Phenomenex-C18(250mm×4.6mm,5μm)，流动相为乙腈(A)-0.1％磷酸水溶液(B)，洗脱条件(0～25min,80～70％B；25～60min,70～55％B；60～70min,55～45％B；70～80min,45～35％B；80～90min,35～33％B；90～110min,33～25％B)，分析时间：110min，流速：1.0ml/min，柱温：35℃，检测波长：240nm，进样量：20μL。
2.3化合物溶液的制备
称取干燥至恒重的3ˊ,5ˊ-二羟基-2ˊ,4ˊ,7-三甲氧基异黄烷、2ˊ,4ˊ,4-三羟基查尔酮、12-齐墩果烯-3,22,24-三醇对照品8.26mg，5.93mg，3.08mg加色谱甲醇溶解定容至10mL，得到化合物1、2、3浓度分别0.826mg·mL-1，0.593mg·mL-1，0.308mg·mL-1的对照品溶液。
2.4化合物含量测定
取化合物样品溶液注入高效液相色谱仪分析，在240nm波长下检测其含量，结果发现其纯度大于98％(HPLC归一化法测定)。
单体化合物抗菌试验
实施例3：
3.1供试样品溶液的制备
选取分离得到的化合物3ˊ,5ˊ-二羟基-2ˊ,4ˊ,7-三甲氧基异黄烷、2ˊ,4ˊ,4-三羟基查尔酮、12-齐墩果烯-3,22,24-三醇适量加无菌水溶解(必要时加少量的DMSO助溶)，分别配置0.5mg·ml-1，0.25mg·ml-1、0.125mg·ml-1浓度的药物储备液。
3.2含药培养基的制备
量取1mL各浓度供试药液经0.22μm滤膜滤过，与9mL已灭菌的PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)于无菌试管中混匀，倒入已灭菌的培养皿中制成含药的培养基平板，以无菌水和DMSO作为空白对照。
3.3供试病原真菌菌饼的制备
将天南星炭疽、花生褐斑、茄子茎枯、烟草赤星四种作物病原真菌提前接种在PDA平板培养基上活化3～5d后，用无菌打孔器在活化后的农作物病原性真菌菌落边缘切下直径6mm生长一致的菌饼。将打好的菌饼菌丝面接种于含药培养基平板的中心，使病原真菌菌丝与培养基充分接触，再用封口膜将培养皿封口，防止其它杂菌的感染，然后置于26℃恒温培养箱中培养3～5d。每个抗菌试验平行试验三份。
3.4抑菌活性结果测定
抑制率结果测量采用十字交叉法测定，待空白对照组试验菌落长至培养基平板边缘时，测量各培养皿中的菌落生长直径，以重复测量3次的试验菌落直径平均值计算测试供试样品溶液对菌丝生长相对抑制率。
注：直径单位为mm。
表1化合物3ˊ,5ˊ-二羟基-2ˊ,4ˊ,7-三甲氧基异黄烷对4种农作物病原性真菌体外抑制情况
注：-表示实验时染菌严重无法观察抑制情况。
表2化合物2ˊ,4ˊ,4-三羟基查尔酮对4种农作物病原性真菌体外抑制情况
注：-表示实验时染菌严重无法观察抑制情况。
表3化合物12-齐墩果烯-3,22,24-三醇对4种农作物病原性真菌体外抑制情况
Claims (8)
1.一种紫藤瘤中单体化合物的用途，其特征在于：在抑制农作物病原性真菌中的应用：
所述紫藤瘤中单体化合物为3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷、2′,4′,4-三羟基查尔酮或12-齐墩果烯-3,22,24-三醇。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述农作物病原性真菌包括天南星炭疽、花生褐斑、茄子茎枯、烟草赤星等。
3.一种权利要求1所述的紫藤瘤中单体化合物的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)取干燥的紫藤瘤药材，粉碎，以70～95vt％乙醇为溶剂在80℃下回流提取三次，每次2小时，合并提取液，回收提取溶剂，浓缩后得到相对密度为1.1的浸膏；
(2)将所得浸膏用硅胶柱梯度洗脱，TLC检识，合并相同组分后得到8个组分，极性由小到大依次称为Z1-Z8；
(3)组分Z4经硅胶柱梯度洗脱，TLC检识，合并相同组分后得到8个组分，极性由小到大依次称为A-H；
(4)组分E先经MCI柱梯度洗脱，再经pre-HPLC纯化得单体化合物3′,5′-二羟基-2′,4′,7-三甲氧基异黄烷；
(5)组分H经反相Rp18中压柱色谱梯度洗脱，得到五个组分，极性由小到大依次称为H1～H5；
(6)组分H1依次经硅胶柱洗脱、经凝胶柱分离，再经pre-HPLC分离纯化得到单体化合物12-齐墩果烯-3,22,24-三醇；
(7)组分H2经凝胶柱分离并经pre-HPLC分离纯化得到单体化合物2′,4′,4-三羟基查尔酮。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤(1)中乙醇的质量是紫藤瘤药材质量的10-20倍。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤(2)中洗脱剂由二氯甲烷和甲醇构成，洗脱剂中二氯甲烷和甲醇的体积比为100:0～0:1，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤(3)中洗脱剂由石油醚和乙酸乙酯构成，洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比为50:1～0:1，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤(4)中MCI柱梯度洗脱的洗脱剂由甲醇和水构成，洗脱剂中甲醇和水的体积比为0:1～100:0，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
步骤(5)中洗脱剂由甲醇和水构成，洗脱剂中甲醇和水的体积比为10:90～100:0，洗脱剂的极性由小到大进行梯度洗脱分离。
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