CN104277090B - 金花茶皂苷a标准品及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明以金花茶叶、枝、花为原料，乙醇‑水为浸提剂，通过超声波浸提、大孔吸附树脂柱吸附、柱层析分离、液相色谱分离等步骤制成金花茶皂苷A标准品。本发明制得的标准品性能稳定，检测精度高，可作为化学对照品，用于金花茶系列产品品质鉴别指标性成分，为质量监督、产品的真伪鉴别提供技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于天然产物分离纯化领域，具体涉及一种从金花茶叶中提取金花茶皂苷A标准品及其制备方法。
背景技术
金花茶(Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)是山茶科，山茶属，金花茶组，金花茶系植物。为常绿灌木或小乔木。主产于中国广西防城港市境内，金花茶是防城港市特色资源之一,素有“茶皇后”、“植物界大熊猫”的美誉，2009年防城港市防城区被命名为“中国金花茶之乡”，2010年被国家质量监督检验检疫局授权为国家地理标志保护产品，防城港市立足本地金花茶资源优势，扎实推进金花茶产业经济发展，促进农民增收。近年来金花茶产业发展取得了明显成效，人工种植金花茶面积达到3万亩，育苗300万株，有十几家企业利用金花茶花和叶研制有金花茶袋包茶、饮料、口服液等近30多个系列产品，产值达6个多亿。
在金花茶皂苷技术领域，申请人检索到如下两篇相关的技术文献：
文献1：题名：《金花茶叶皂苷类成分研究》，作者：苏琳,莫建光,韦英亮等；刊物：《中草药》，2012,43(5)，877-879。
该文献研究了金花茶Camellia ；euphlebia叶皂苷类成分。方法利用超声提取、大孔树脂富集以及制备色谱对金花茶叶水溶性部分进行分离纯化,运用NMR、MS、IR等光谱手段进行结构鉴定。结果分离得到3个单体化合物,分别为人参皂苷Rg1(1)、人参皂苷F1(2)和人参皂苷F5(3)。结论化合物1～3均为首次从该植物中分离得到的人参皂苷,其中人参皂苷Rg1、F5为首次从山茶属中分离得到。金花茶为国家一级保护的珍稀药用植物,这些成分的分离鉴定对其进一步的活性研究、开发利用和推广种植具有重要意义。但该文献分离得到的人参皂苷Rg1(1)、人参皂苷F1(2)和人参皂苷F5(3)三种化合物均是前人研究已经定性的化合物，其药理活性和用途已有很多报道。
文献2：题名：《金花茶皂甙的分离纯化及化学结构研究》；作者：曾秋文；刊物：广东海洋大学硕士论文，2010年。
该文献研究以金花茶叶为实验材料提取其中的皂甙成分,然后筛选分离纯化树脂,对皂甙进行分离纯化。通过抗氧化指标比较皂甙组分的抗氧化活性,并对抗氧化活性最高的皂甙组分进行进一步的分离纯化,分析其理化性质,为金花茶皂甙的构效关系研究提供理论依据。
研究的主要内容及结果如下:
1、以新鲜金花茶叶为原料,经过微波灭酶后进行组织破碎,采用超声波浸提及纳米超滤等方法进行提取和浓缩,得到金花茶浓缩液。金花茶浓缩液经过乙醇沉淀去杂、乙醚脱色得到粗皂甙提取液。试验结果显示金花茶粗皂甙提取液中主要含有皂甙并含有少量的茶多酚,皂甙含量约为茶多酚的10倍。
2、通过静态吸附率和解吸率等指标比较了聚酰胺树脂、XAD16、DM130和XAD1600等4种树脂对金花茶粗皂甙分离的效果,并选择XAD16作为分离树脂对金花茶粗皂甙进行分离纯化。分离纯化结果:在水以及10％、20％和30％异丙醇洗脱液处分别得到了WS、IS1、IS2、IS3等4个皂甙组分。各皂甙组分的得率分别为34.8％、9.1％、20.3％、31.8％,皂甙总得率达96.0％。高效液相色谱分析结果显示,相对于粗皂甙,各皂甙组分的吸收峰数量明显减少,表明XAD16大孔吸附树脂层析柱可以有效将金花茶粗皂甙分离出极性不同的皂甙组分。
3、以维生素C为参照物,通过羟基自由基清除试验、超氧阴离子清除试验、DPPH·自由基清除试验、磷钼络合物法等4种不同的抗氧化试验,比较了粗皂甙、WS、IS1、IS2、IS3等皂甙组分的抗氧化活性。结果显示,各皂甙组分均有明显的抗氧化活性,在清除羟基自由基实验中,IS1的清除率为66.5％,比维生素C及其他三个皂甙组分高；在DPPH·自由基清除试验中,IS1的清除率为96.3％,接近同浓度维生素C的清除率100％；在清除超氧阴离子的实验中,IS1的清除率达到64.7％,比皂甙组分IS2、IS3高；在磷钼络合物法实验中,IS1的抗氧化活性比皂甙组分IS2、IS3高37.1％、39.8％,可以看出IS1的抗氧化活性较为显著。
4、通过XAD1600柱层析和聚酰胺柱层析对抗氧化活性最高的皂甙组分IS1进行进一步的分离纯化,得到IS1A皂甙组分。高效液相色谱分析结果显示,IS1A出现唯一一个尖锐的峰,表明IS1A为单一化合物。抗氧化活性分析结果显示,IS1A的抗氧化活性较IS1高出10％左右,表明IS1A是主要的功效因子。颜色反应及构成糖薄层层析分析结果显示,IS1A是含有葡萄糖和半乳糖的三萜类皂甙。对于具体的化学结构有待进一步分析。
但是该文献的研究因其工艺比较粗糙，虽然得到了WS、IS1、IS2、IS3等4个皂甙组分，但因其组分比较复杂，纯度不够，无法确定其组分的具体成分和结构。
但金花茶系列产品的质量标准仍然参照茶叶的技术参数来监控，没有建立起特征的指标性成分来鉴别金花茶产品的技术标准。针对目前没有金花茶产品质量技术标准缺指标性成分的现状，我们对金花茶的化学成分进行了深入研究，首次从金花茶叶分离出了30多个化学成分，从中筛选出一个具有生物活性的新化合物-金花茶皂苷A，该新化合物可作为化学对照品，用于金花茶系列产品品质鉴别指标性成分，为质量监督、产品的真伪鉴别提供技术支撑。
发明内容
申请人同日申请的另一个发明专利《金花茶皂苷A及其制备方法和抗肿瘤用途》公开了从金花茶(Camellia chrysanth(Hu)Tuyama)中分离出的新的金花茶皂苷A化合物及其制备方法，但该方法获得的金花茶皂苷A纯度不够高，无法将其用作标准品来鉴别金花茶系列产品的品质和进行质量监控，本发明的目的是针对前述问题，提供了一种金花茶皂苷A标准品及其制备方法。
本发明是这样实现的：
金花茶皂苷A标准品，其化学名称为：(3β,6α,12β)-3,6,12-三羟基达玛烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，其化学结构式为：
该金花茶皂苷A标准品为白色针状晶体；其纯度≥98％；溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；灰分：≤0.1％；重金属(以pb计)：≤5.0mg/Kg；水分：≤0.4％；熔点范围：192.3℃～195.6℃；有关物质：≤2.0％；其分子式为：C48H82O18；分子量为：946。
以上所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，将新鲜金花茶原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:4～6：0.0005进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；然后将金花茶超声波提取液浓缩得到金花茶浸膏，湿法上担体进行层析柱分离，收集130～150流分自然挥去溶剂，结晶后得到金花茶皂苷A粗品；最后将金花茶皂苷A粗品用液相色谱进行程序分离纯化得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到纯度≥98％的白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。
本发明金花茶皂苷A标准品制备过程中选取的柱层析分离的130～150流分，其处于本申请人同日申请的另一个发明专利《金花茶皂苷A及其制备方法和抗肿瘤用途》公开的123～162流份的范围更窄，其波谱数据和结构与该同日申请专利的一致，其纯度和理化性能均优于该同日申请的专利。
进一步的，以上所述的层析柱分离选用的层析柱为14㎝×100㎝,担体为200～300目，用体积比为15～25:2～4氯仿-甲醇洗脱。
进一步的，以上所述的制备液相色谱进行程序分离纯化为将金花茶皂苷A粗品溶解于有机溶剂中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0～5min，A:B体积比为25:75；5～28min，A:B体积比为40:60；28～37min，A:B体积比为40:60；37～42min，A:B体积比为50:50；42～60min，A:B体积比为50:50；60～65min，A:B体积比为25:75；65～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟。
进一步的，以上所述柱层析分离所用的担体为硅胶。
进一步的，以上所述的浓缩为真空浓缩，其条件为：真空度为620～660mmHg，蒸汽压为0.05～0.1Mpa。
进一步的，以上所述的超声波提取条件为：温度为65℃～75℃，频率为20KHZ～30KHZ，时间50分钟～70分钟。
进一步的，以上所述的金花茶浸膏为固形物含量浓度35％～45％的金花茶浸膏。
进一步的，以上所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、甲醇-水或乙醇-水。优选为甲醇-水或乙醇-水，甲醇或乙醇与水的体积比为：50～95:50～5。通过甲醇或乙醇与水的体积比的选择，能有效提高原料的超声波提取率，分别较甲醇、乙醇或水单一溶液的提取率分别提高了10％，10％，5％。
以上所述的金花茶皂苷A标准品在鉴别金花茶产品中的应用，所述的金花茶皂苷A标准品作为化学对照品，用于鉴别金花茶系列产品金花茶花茶、叶茶、袋泡茶、金花茶口服液、金花茶胶囊、花茶浓缩饮液品质。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明在柱层析分离中通过流份选取的优化选择得到金花茶皂苷A粗品，再用液相色谱法精制得到金花茶皂苷A产品，其纯度≥98.5％，质量稳定，均优于本发明人同日申请的另一个发明专利《金花茶皂苷A及其制备方法和抗肿瘤用途》公开的内容。
2.本发明的金花茶皂苷A标准品由于其纯度高，杂质含量少，其理化性能在纯度、干燥失重、熔点范围、重金属含量方面均优于本发明人同日申请的另一个发明专利《金花茶皂苷A及其制备方法和抗肿瘤用途》公开的内容。
3.用本发明的金花茶皂苷A标准品鉴别金花茶系列产品金花茶花茶、叶茶、袋泡茶、金花茶口服液、金花茶胶囊、花茶浓缩饮液品质，与传统的茶叶品质检验方法相比，具有如下有点：在定性方面：采用的金花茶皂苷A作为指标性成分，是金花茶中特有的成分，具有专属性，可以鉴别金花茶系列产品的真伪，在定量方面：采用的金花茶皂苷A作为指标性成分进行定量分析，可以确认产品中金花茶的质量分数。
4.在分离提取工艺上，通过甲醇或乙醇与水的体积比的选择，能有效提高原料的超声波提取率，分别较甲醇、乙醇或水单一溶液的提取率分别提高了10％，10％，5％。
附图说明
图1金花茶皂苷A的结构式
图2金花茶皂苷A的IR图谱
图3金花茶皂苷A的ESI-MS图谱
图4金花茶皂苷A的1HNMR图谱
图5金花茶皂苷A的13C NMR图谱
图6金花茶皂苷A的DEPT135图谱
图7金花茶皂苷A的HHCOSY图谱
图8金花茶皂苷A的TOCSY图谱
图9金花茶皂苷A的HSQC图谱
图10金花茶皂苷A的HMBC图谱
具体实施方式
一、金花茶皂苷A标准品制备
1.仪器与试剂
仪器：智能超声波提取器(上海之信仪器有限公司)。
旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)
Waters2695高效液相色谱仪(美国沃特斯公司)
Nicolet 4700傅里叶变换红外光谱仪(KBr压片，Nicolet公司)
紫外分光光度计(Thermo公司)
AV600核磁共振波谱仪(瑞士Bruker公司)
高分辨飞行时间质谱仪(瑞士Bruker公司)
试剂：柱层析及薄层色谱用硅胶(大连海洋化工厂)
HPLC分析用甲醇、乙腈为色谱纯(默克股份两合公司)；
水为纯净水；
其余试剂未特别说明的均为分析纯。
实例1：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:4：0.0005投入超声波提取罐提取，在65℃，频率为20KHZ，条件下浸提50分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为620mmHg，蒸汽压为0.05Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度35％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体进行层析柱分离，用体积比为15:2氯仿-甲醇洗脱，收集130～135流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于甲醇中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为620mmHg，蒸汽压为0.05Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为98.7％
实例2：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:4.5：0.0005投入超声波提取罐提取，在66℃，频率为25KHZ，条件下浸提52分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为624mmHg，蒸汽压为0.06Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度36％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体进行层析柱分离，用体积比为16:3氯仿-甲醇洗脱，收集135～140流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于乙醇中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为624mmHg，蒸汽压为0.06Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为98.8％
实例3：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:5：0.0005投入超声波提取罐提取，在67℃，频率为25KHZ，条件下浸提54分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为628mmHg，蒸汽压为0.07Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度37％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体进行层析柱分离，用体积比为17:4氯仿-甲醇洗脱，收集140～145流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于体积比为50:50的甲醇-水溶液中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟，得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为628mmHg，蒸汽压为0.07Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为99.0％
实例4：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:5.5：0.0005投入超声波提取罐提取，在68℃，频率为24KHZ，条件下浸提56分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为632mmHg，蒸汽压为0.08Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度38％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体进行层析柱分离，用体积比为18:2.5氯仿-甲醇洗脱，收集145～150流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于体积比为60:40的乙醇-水溶液中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟，得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为632mmHg，蒸汽压为0.08Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为99.30％
实例5：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:6：0.0005投入超声波提取罐提取，在70℃，频率为25KHZ，条件下浸提60分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为636mmHg，蒸汽压为0.09Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度40％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体进行层析柱分离，用体积比为20:3.5氯仿-甲醇洗脱，收集130～140流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于体积比为70:30的甲醇-水溶液中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟，得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为640mmHg，蒸汽压为0.1Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为98.5％
实例6：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:4.2：0.0005投入超声波提取罐提取，在71℃，频率为26KHZ，条件下浸提62分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为640mmHg，蒸汽压为0.05Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度41％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体担体进行层析柱分离，用体积比为21:2.2氯仿-甲醇洗脱，收集140～150流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于体积比为80:20的乙醇-水溶液中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟，得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为640mmHg，蒸汽压为0.05Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为99.0％
实例7：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:4.8：0.0005投入超声波提取罐提取，在72℃，频率为25KHZ，条件下浸提64分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为645mmHg，蒸汽压为0.06Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度42％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体进行层析柱分离，用体积比为22:2.8氯仿-甲醇洗脱，收集135～145流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于体积比为90:10的甲醇-水溶液中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟，得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为645mmHg，蒸汽压为0.06Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为99.2％
实例8：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:5.2：0.0005投入超声波提取罐提取，在73℃，频率为28KHZ，条件下浸提66分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为650mmHg，蒸汽压为0.07Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度43％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体进行层析柱分离，用体积比为23:3.3氯仿-甲醇洗脱，收集130～150流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于体积比为95:5的甲醇-水溶液中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟，得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为650mmHg，蒸汽压为0.07Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为98.6％。
实例9：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:5.8：0.0005投入超声波提取罐提取，在74℃，频率为30KHZ，条件下浸提68分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为655mmHg，蒸汽压为0.09Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度44％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体进行层析柱分离，用体积比为24:3.8氯仿-甲醇洗脱，收集130～145流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于体积比为75:25的乙醇-水溶液中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟，得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为655mmHg，蒸汽压为0.09Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为98.8％。
实例10：
将采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长进行原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:6：0.0005投入超声波提取罐提取，在75℃，频率为30KHZ，条件下浸提70分钟，进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；
然后将金花茶超声波提取液在真空度为660mmHg，蒸汽压为0.1Mpa条件下真空浓缩得到固形物含量浓度45％的金花茶浸膏浓缩，湿法上14㎝×100㎝，200目～300目的硅胶担体进行层析柱分离，用体积比为25:4氯仿-甲醇洗脱，收集130～150流分自然挥去溶剂，结晶后过滤得到金花茶皂苷A粗品；
最后将金花茶皂苷A粗品溶解于体积比为55:45的甲醇-水溶液中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用制备液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0min～5min，A:B体积比为25:75；5min～28min，A:B体积比为40:60；28min～37min，A:B体积比为40:60；37min～42min，A:B体积比为50:50；42min～60min，A:B体积比为50:50；60min～65min，A:B体积比为25:75；65min～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟，得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，在真空度为660mmHg，蒸汽压为0.1Mpa条件下真空浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品。经HPLC检测、归一化法定量，含量为98.9％
实施例金花茶皂苷A标准品的理化指标检测结果：
实例1：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.1℃～195.5℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.9mg/Kg；
(5)灰分：≤0.09％；
(6)水分：≤0.39％；
(7)有关物质：≤1.9％。
实例2：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.2℃～195.5℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.8mg/Kg；
(5)灰分：≤0.09％；
(6)水分：≤0.38％；
(7)有关物质：≤1.7％。
实例3：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.3℃～195.4℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.3mg/Kg；
(5)灰分：≤0.08％；
(6)水分：≤0.34％；
(7)有关物质：≤1.8％。
实例4：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.3℃～195.3℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.2mg/Kg；
(5)灰分：≤0.08％；
(6)水分：≤0.35％；
(7)有关物质：≤1.6％。
实例5：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.2℃～195.5℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.9mg/Kg；
(5)灰分：≤0.09％；
(6)水分：≤0.39％；
(7)有关物质：≤1.9％。
实例6：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.3℃～195.4℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.3mg/Kg；
(5)灰分：≤0.08％；
(6)水分：≤0.34％；
(7)有关物质：≤1.8％。
实例7：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.3℃～195.3℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.3mg/Kg；
(5)灰分：≤0.07％；
(6)水分：≤0.35％；
(7)有关物质：≤1.7％。
实例8：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.2℃～195.5℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.9mg/Kg；
(5)灰分：≤0.09％；
(6)水分：≤0.39％；
(7)有关物质：≤1.9％。
实例9：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.2℃～195.5℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.7mg/Kg；
(5)灰分：≤0.08％；
(6)水分：≤0.39％；
(7)有关物质：≤1.8％。
实例10：
(1)性状：白色针状晶体；
(2)溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；
(3)熔点范围：192.3℃～195.4℃；
(4)重金属(以pb计)：≤4.7mg/Kg；
(5)灰分：≤0.08％；
(6)水分：≤0.39％；
(7)有关物质：≤1.8％。
二、金花茶皂苷A的理化性质、波谱数据和结构确定
仪器设备：用Nicolet 4700(KBr压片)傅立叶变换红外光谱仪测定红外光谱；用BRUKER高分辨飞行时间质谱测定ESI-MS；核磁共振谱用BRUKER AV III600型超导核磁共振波谱仪测定(TMS为内标)。经对实施例1的产品化合物检测分析得到附图2-10的图谱。
制备得到的化合物理化性质：性状为白色针状晶体，溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；熔点范围：192.1℃～195.5℃。
由图2金花茶皂苷A的IR图谱分析得知：IR(cm-1):3384(-OH)；2935,2869(-CH3,-CH2)，1398(偕二甲基)；1632(双键)；1073(C-O-C)。
由图3金花茶皂苷A的ESI-MS图谱分析得知：ESI-MS(positive)m/z HR-TOF-MS(positive)947.5029[M+H]+,结合碳谱给出分子式为C48H82O18。不饱和度为8，由皂甙的4个环、1个双键和3个糖构成。
由图4金花茶皂苷A的1HNMR图谱分析得知：1H-NMR(C5D5N,600MHz)显示有9个甲基信号，δ(ppm):1.76(3H,s)为鼠李糖甲基峰，对应碳谱13C-NMR(C5D5N,150MHz)化学位移为δ(ppm):18.62。其余8个甲基为甙元特征甲基质子信号，δ(ppm):0.95(6H,s,CH3-29,CH3-30),1.16(3H,s,CH3-27),
1.35(3H,s,CH3-19),1.58(9H,s,CH3-18,CH3-21,CH3-26),2.10(3H,s,CH3-28)。HSQC对应的碳信号δ(ppm):17.1,17.20,17.60,17.40,17.51,22.17,25.84,32.07。
由图5金花茶皂苷A的13C NMR图谱分析得知：3个糖端基质子信号δ5.16(1H,d,J＝7.38Hz)，δ5.25(1H,d,J＝7.38Hz)，δ6.49(1H,s)，对应谱中对应的碳信号δ(ppm):98.13，101.78，101.72。烯氢信号δ5.24(1H，信号与糖端基质子重叠)，对应的碳信号δ(ppm):125.85。
由图6金花茶皂苷A的DEPT135图谱分析得知：DEPT135显示有10个仲碳(CH2)，由低场到高场依次为δ(ppm)：62.94、62.72、45.82、39.27、35.90、30.81、30.60、27.62、26.50、23.09；6个季碳(C)由由低场到高场依次为δ(ppm)：130.77、83.12、51.27、41.06、39.86、39.52；23个叔碳(CH)由由低场到高场依次为δ(ppm)：126.85、101.78、101.73、98.13、79.28、79.09、78.45、78.26、78.14、78.11、75.02、74.44、74.03、72.43、72.29、72.15、71.47、70.05、69.34、60.89、51.53、49.41、48.94。
由图7金花茶皂苷A的HHCOSY图谱、图8金花茶皂苷A TOSCY图谱和图9金花茶皂苷A的HSQC图谱分析得知：HHCOSY、TOSCY和HSQC三个糖的连接顺序分别是：98.13-75.02-71.47-78.19-74.44-62.93；101.78-72.43-78.12-79.28-74.44-62.72；101.72-78.25-74.03-79.09-69.34-18.62。
由图10金花茶皂苷A的HMBC图谱分析得知：HMBC谱中葡萄糖残基H-1’(δ5.16,d)与季碳(δ83.1,C-20)相关，δ5.25(H-1”)与C-2’位δ75.02相关，两组葡萄糖连接顺序为Glc(2→1)Glc；HMBCδ6.49(1H,s)，与δ72.43远程相关，葡萄糖和鼠李糖连接顺序为Glc(2→1)Rha，因此三个糖的连接顺序为Glc(2→1)Glc(2→1)Rha。
综合以上分析，可以得到实施例1制备得到的化合物的13C NMR和1H NMR数据如表1.
表1实施例1制备得到的化合物的13C NMR和1H NMR数据(溶剂：氚代吡啶)
| NO | 13C NMR | HSQCδH | HMBCδH |
| C-1 | 39.27 | 1.6702(1H,d,J＝12.24Hz)；0.9492(1H,d,J＝8.04Hz) | |
| C-2 | 27.62 | 1.5031(1H,m)；0.8462(1H,m) | |
| C-3 | 78.45 | 3.4570(1H,t,J＝5.82,5.82Hz) | H-28 |
| C-4 | 39.86 | C | H-28,H-29, |
| C-5 | 60.69 | 1.3838(1H,d,J＝10.74Hz) | H-28 |
| C-6 | 72.29 | 4.2175(1H,d,J＝7.32Hz) | |
| C-7 | 45.82 | 2,2349(1H,m)；1.9582(1H,m) | |
| C-8 | 41.06 | C | |
| C-9 | 49.44 | 1.4723(1H,m) | |
| C-10 | 39.52 | C | |
| C-11 | 30.80 | 2,0578(1H,m)；1.4732(1H,m) | |
| C-12 | 70.04 | 4.1516(1H,m) | |
| C-13 | 48.94 | 1.9488(1H,m) | |
| C-14 | 51.27 | C |
| C-15 | 30.60 | 2,0578(1H,m)；1.4732(1H,m) | |
| C-16 | 26.50 | 1.6702(1H,m)；1.2223(1H,m) | |
| C-17 | 51.53 | 2.4910(1H,t,J＝9.54,9.54Hz) | H-21 |
| C-18 | 17.51 | 1.58(3H,s) | |
| C-19 | 17.38 | 1.35(3H,s) | |
| C-20 | 83.12 | C | Glc-H1` |
| C-21 | 22.17 | 1.59(3H,s) | |
| C-22 | 35.89 | 2,3595(1H,m)；1.7639(1H,m) | |
| C-23 | 23.09 | 2,4910(1H,m)；2.2340(1H,m) | |
| C-24 | 125.85 | 5.2455(1H,s) | H-26,H-27 |
| C-25 | 130.80 | C | H-26,H-27 |
| C-26 | 25.64 | 1.58(3H,s) | |
| C-27 | 17.60 | 1.16(3H,s) | |
| C-28 | 32.07 | 2.10(3H,s) | |
| C-29 | 17.10 | 0.95(3H,s) | H-28 |
| C-30 | 17.20 | 0.95(3H,s) | |
| C-1’ | 98.13 | 5.1636(1H,d,J＝7.32Hz) | |
| C-2’ | 75.02 | 3.9710(1H,brs) | Glc-H1`` |
| C-3’ | 71.47 | 4.1664(1H,brs) | |
| C-4’ | 78.19 | 3.9017(1H,brs) | |
| C-5’ | 74.44 | 3.9710(1H,brs) | |
| C-6’ | 62.93 | 4,4916(1H,m)；4,3627(1H,m) | |
| C-1” | 101.78 | 5.2508(1H,d,J＝6.42Hz) | |
| C-2” | 72.43 | 4,2114(1H,m) | Rha-H1 |
| C-3” | 78.12 | 3.9710(1H,brs) | |
| C-4” | 79.28 | 4,3746(1H,m) | |
| C-5” | 74.44 | 3.9710(1H,brs) | |
| C-6” | 62.72 | 4,4916(1H,m)；4,3627(1H,m) | |
| C-1”’ | 101.72 | 6.4937(1H,s) | |
| C-2”’ | 78.25 | 4,3627(1H,m) | |
| C-3”’ | 74.03 | 4.3251(1H,brs) | |
| C-4”’ | 79.09 | 4,3627(1H,m) | Rha-H6 |
| C-5”’ | 69.34 | 4,9317(1H,m) | Rha-H6 |
| C-6”’ | 18.62 | 1.76(3H,s) |
通过以上分析确定实施例1制备得到的化合物为(3β,6α,12β)-3,6,12-三羟基达玛烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷。申请人进一步将其命名为：金花茶皂苷A。
进一步的，对实施例2-10所制备的化合物进行与实施例1所制备的化合物相同的检测，其结果与化合物1的结果高度吻合，重现性极好。
进一步的可以确认该化合物的英文名称为：(3β,6α,12β)-3,6,12-trihydroxydammar-24-en-20-yl-2-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-β-D-glucopyranosyl-(2→1)-O-α-L-Rh amnopyranoside。
进一步对实施1-10制备的化合物进行其他理化性质检测和归纳，该化合物为白色针状晶体；其纯度≥98％；溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；灰分：≤0.1％；重金属(以pb计)：≤5.0mg/kg；水分：≤0.4％；熔点范围：192.1℃～195.5℃；(7)有关物质：≤2.0％；其分子式为：C48H82O18；分子量为：946。命名为金花茶皂苷A标准品。
经进一步研究分析，在定性方面：采用的金花茶皂苷A作为指标性成分，是金花茶中特有的成分，具有专属性，可以鉴别金花茶系列产品的真伪，在定量方面：采用的金花茶皂苷A作为指标性成分进行定量分析，可以确认产品中金花茶的质量分数，因此金花茶皂苷A标准品作为化学对照品，用于鉴别金花茶系列产品金花茶花茶、叶茶、袋泡茶、金花茶口服液、金花茶胶囊、花茶浓缩饮液品质。
Claims (7)
1.一种金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：将新鲜金花茶原料预处理后，按照金花茶原料：纯净水：复合果浆酶物料比为1:4～6：0.0005进行超声波提取得到金花茶超声波提取液；然后将金花茶超声波提取液浓缩得到金花茶浸膏，湿法上担体进行层析柱分离，收集130～150流分自然挥去溶剂，结晶后得到金花茶皂苷A粗品；最后将金花茶皂苷A粗品用液相色谱进行程序分离纯化得到富含金花茶皂苷A组分纯化液，浓缩、静止结晶、冷冻干燥处理后，即可得到纯度≥98.5%的白色针状的金花茶皂苷A晶体，即金花茶皂苷A标准品；
所述的金花茶皂苷A化学名称为：(3β,6α,12β)-3,6,12-三羟基达玛烷-24-烯-20-甲基-2-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-β-D-吡喃葡萄糖-(2→1)-O-α-L-吡喃鼠李糖苷，其化学结构式为：
该金花茶皂苷A标准品为白色针状晶体；其纯度≥98.5%；溶解性：溶于甲醇、乙醇，微溶于水，不溶于石油醚、氯仿；灰分：≤0.1%；重金属（以pb计）：≤5.0 mg/Kg；水分：≤0.4%；熔点范围：192.3℃～195.6℃；有关物质：≤2.0%；其分子式为：C48H82O18；分子量为：946；
所述的层析柱分离选用的层析柱为14㎝×100㎝,担体为200目～300目，用体积比为15～25:2～4氯仿-甲醇洗脱；
所述的液相色谱进行程序分离纯化为将金花茶皂苷A粗品溶解于有机溶剂中制备得到金花茶皂苷A供试液，然后将供试液用液相色谱进行程序分离纯化，所述的程序分离纯化条件为：紫外吸收波长203nm；流动相：A为乙腈，B为水；梯度洗脱条件：0～5 min，A:B体积比为25:75；5～28 min，A:B体积比为40:60；28～37 min，A:B体积比为40:60；37～42 min，A:B体积比为50:50；42～60 min，A:B体积比为50:50；60～65 min，A:B体积比为25:75；65～70min，A:B体积比为25:75；金花茶皂苷A色谱峰的保留时间为23分钟。
2.根据权利要求1所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述柱层析分离所用的担体为硅胶。
3.根据权利要求1所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的浓缩为真空浓缩，其条件为：真空度为620～660mmHg，蒸汽压为0.05～0.1Mpa。
4.根据权利要求2或3所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的超声波提取条件为：温度为65℃～75℃，频率为20KHZ～30KHZ，时间50分钟～70分钟。
5.根据权利要求4所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的金花茶浸膏为固形物含量浓度35％～45％的金花茶浸膏。
6.根据权利要1所述的金花茶皂苷A标准品的制备方法，其特征在于：所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、甲醇-水或乙醇-水；所述的金花茶原料预处理为将采采摘的新鲜金花茶的花、枝、叶原料去杂物，用自来水冲洗干净，沥干水分，切为0.5cm～3cm长。
7.如权利要求1金花茶皂苷A标准品在鉴别金花茶产品中的应用，其特征在于：如权利要求1所述的金花茶皂苷A标准品作为化学对照品，用于鉴别金花茶系列产品金花茶花茶、叶茶、袋泡茶、金花茶口服液、金花茶胶囊、花茶浓缩饮液品质。
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