CN107556325B

CN107556325B - 一种血散薯中微量生物碱单体的分离方法

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Publication number: CN107556325B
Application number: CN201710972717.6A
Authority: CN
Inventors: 杨瑞云; 周德雄; 梁艳; 李俊
Original assignee: Guangxi Normal University
Current assignee: Guangxi Normal University
Priority date: 2017-10-18
Filing date: 2017-10-18
Publication date: 2019-06-11
Anticipated expiration: 2037-10-18
Also published as: CN107556325A

Abstract

本发明提供一种血散薯中微量生物碱单体的分离方法，属于中草药提取技术领域。本发明的方法所提取的生物碱单体为佐氏千金藤碱和vireakine，包括的步骤为：乙醇回流提取血散薯粉；用石油醚脱脂，用体积比为90:10‑20:80的石油醚‑乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，再经硅胶柱层析分离、经硅胶柱层析纯化、凝胶色谱柱纯化、TLC检测得到目标物。本发明为首次从血散薯中分离得到佐氏千金藤碱和vireakine，由于生物碱成分是血散薯的主要活性成分，这些生物碱单体的获得对于血散薯药材质量标准的把控和药物研究具有积极意义。

Description

一种血散薯中微量生物碱单体的分离方法

【技术领域】

本发明涉及中草药提取技术领域，具体涉及一种血散薯中微量生物碱单体的分离方法。

【背景技术】

血散薯(Stephania dielsiana Y.C.Wu)，为防己科(Menispermaceae)千金藤属(Stephania)植物，主要分布于广东、广西、湖南南部和贵州南部等地区。血散薯药性苦、寒，具有清热解毒、散瘀止痛的功效，主治上呼吸道感染、咽炎、疮痈、胃痛、胃肠炎、牙痛、神经痛、跌打损伤等症，是广西民间常用中草药。

生物碱是血散薯具有抗菌、消炎、镇痛的主要成分，已知的生物碱单体包括克列班宁，青风藤碱，千金藤碱，去氢千金藤碱，番荔枝宁，左旋一四氢掌叶防己碱，异粉防己碱，头花千金藤碱和高阿罗莫灵。Zhang Yi等(Zhang Yi等，Chemical Constituents fromStephania dielsiana[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2009,7(3):199-202)从血散薯中分离得到12个生物碱成分，包括青风藤碱，千金藤碱，ayuthianine，去氢千金藤碱，cephamorphinanine，aknadinine，鹅掌楸碱，汉防己碱，左旋四氢巴马汀，紫堇单酚碱，氧代克班宁和norcanelilline。Yecheng Deng等(Yecheng Deng等，Antimicrobialactivity of extract and two alkaloids from traditional Chinese medicinalplant Stephania dielsiana[J].Food Chemistry,2011,124:1556–1560)从血散薯中分离得到两个主要的生物碱化合物：千金藤碱和克班宁。

随着血散薯在医药领域的广泛应用，进一步明确其中生物碱的成分，获得血散薯生物碱质量标准的定位对照品，对于血散薯药材质量标准的把控和药物研究具有积极意义。

【发明内容】

本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种血散薯中微量生物碱单体的分离方法，首次从血散薯获得佐氏千金藤碱和vireakine两种生物碱。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种血散薯中微量生物碱单体的分离方法，所指生物碱单体为佐氏千金藤碱和vireakine两种，所述方法包括以下步骤：

(1)将干燥的血散薯粉碎，利用乙醇回流提取，提取液经减压浓缩、低温冷冻干燥或喷雾干燥得到血散薯乙醇提取物；

(2)将血散薯乙醇提取物分散在蒸馏水或去离子水中，用石油醚脱脂后弃油相得水相A，水相A使用乙酸乙酯萃取，浓缩萃取液得到EA部分；

(3)将所述EA部分经硅胶柱层析分离，用体积比为90:10-20:80的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，得石油醚-乙酸乙酯体积比40:60洗脱液；

(4)将所述石油醚-乙酸乙酯体积比40:60洗脱液浓缩至干得固体，固体再经硅胶柱层析分离，用体积比为45:55和50:50的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比50:50洗脱的部分，浓缩后，再使用硅胶柱纯化，用体积比为40:60的氯仿-丙酮洗脱并收集洗脱部分，得到化合物佐氏千金藤碱和vireakine的混合物，洗脱部分通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20纯化，洗脱剂为体积比50:50的二氯甲烷-甲醇溶液，用TLC检测，收集目标流出液，即得到化合物佐氏千金藤碱和vireakine。

本发明中，为了提高乙醇提取物的得率，在乙醇回流提取中，优选所使用的乙醇的体积浓度为70-95％，优选乙醇与所述血散薯的液固比为2-10：1，并进一步优选乙醇回流提取的次数为2-6次，每次1-3小时。

本发明中，为了提高生物碱的得率，在石油醚脱脂时，优选所使用的石油醚与乙醇提取物的液固比为2-10：1；并进一步优选在对水相A进行乙酸乙酯萃取时，所用的乙酸乙酯与所述水相A等体积。

本发明中，还优选步骤(3)中所述的梯度洗脱是依次用体积比90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，从而可以得到目标物。

本发明提取所得佐氏千金藤碱和vireakine均具有抗菌活性，可以应用在制备抗菌药物中。

综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：

本发明通过对血散薯进行醇提后，在经过石油醚脱脂、乙酸乙酯萃取、石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱、硅胶柱分离、硅胶柱层析纯化、凝胶色谱柱纯化、TLC检测等步骤，从血散薯中成功分离纯化了2个结构相近、含量较少的生物碱单体，均为首次从该植物中分离得到。由于生物碱成分是血散薯的主要活性成分，这些生物碱单体的获得对于血散薯药材质量标准的把控和药物研究具有积极意义。

【附图说明】

图1为佐氏千金藤碱的¹³C NMR图谱。

图2为vireakine的¹³C NMR图谱。

【具体实施方式】

为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

取干燥血散薯20kg粉碎，粉末用体积浓度为70％-95％的乙醇回流提取2-6次，每次1-3h，每次所用乙醇与血散薯的液固比为2-10：1；合并提取液，减压浓缩干燥后得到血散薯乙醇提取物。将血散薯乙醇提取物分散捏溶于适量温热蒸馏水或去离子水中，混悬液用石油醚萃取脱脂，所使用的石油醚与乙醇提取物的液固比为2-10：1，脱脂后弃油相得水相A，水相A用等体积乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩得到血散薯EA部分。

将血散薯EA部位拌样过硅胶柱，依次用体积比90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比40:60部分，浓缩至干得固体B。

将固体B部分拌样过硅胶柱，使用体积比为45:55和50:50的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比50:50洗脱的部分，浓缩后，再使用硅胶柱纯化，用体积比为40:60的氯仿-丙酮洗脱并收集洗脱物，得到化合物佐氏千金藤碱和vireakine的混合物。混合物通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20纯化，洗脱剂为体积比50:50的二氯甲烷-甲醇溶液，TLC检测，收集目标流出液，分别得到化合物佐氏千金藤碱和vireakine。

实施例2

实施例1和2中所用的试剂浓度和提取次数稍有不同，最终均能得到佐氏千金藤碱和vireakine这两种生物碱，只是在得率方法有些许差异，将实施例1和2所得的化合物进行质谱分析，相关的光谱数据信息和结构式如下：

佐氏千金藤碱：淡黄色晶体。[α]²⁰ _D-62.2°(c 0.1,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ,ppm,J/Hz):7.76(1H,d,J＝8.5,H-11),6.92(1H,d,J＝8.5,H-10),6.52(1H,s,H-3),6.06(1H,d,J＝1.4,H-12),5.92(1H,d,J＝1.4,H-12),3.79(3H,s,OCH₃-8),3.53(1H,dd,J＝4.3,14.4,H-5),3.08(3H,m,H-4,5),2.63(1H,dd,J＝3.8,14.4,H-7),2.59(3H,s,N-CH₃),2.52(1H,t,J＝14.4,H-7),2.35(1H,t,J＝14.2,H-6a)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,δ):142.2(C-1),126.1(C-la),116.7(C-lb),146.8(C-2),106.9(C-3),126.6(C-3a),29.2(C-4),53.7(C-5),61.9(C-6a),27.5(C-7),128.8(C-7a),144.2(C-8),148.4(C-9),113.9(C-10),124.4(C-11),124.1(C-11a),100.8(C-12),61.5(OCH₃-8),44.1(N-CH₃)。其¹³C NMR图见图1。以上数据与文献(Noriaki Kashiwaba等，Aporphine Glycosides from Stephaniacepharantha Seeds[J].Journal of Natural Products,2000,63(4):477-479)中的佐氏千金藤碱(stesakine)基本一致，故确定为佐氏千金藤碱，结构如下：

Vireakine：棕色粉末。[α]²⁰ _D-48.5°(c 0.1,CHCl₃)；¹H NMR(400MHz,CDCl₃,δ,ppm,J/Hz):7.80(1H,d,J＝8.5,H-10),6.86(1H,d,J＝8.5,H-9),6.51(1H,s,H-3),6.05(1H,d,J＝1.4,H-12),5.90(1H,d,J＝1.4,H-12),3.90(3H,s,OCH₃-8),3.78(3H,s,OCH₃-11),3.52(1H,dd,J＝4.3,14.2,H-7),3.38(1H,m,H-6a),3.13(2H,m,H-4,5),2.59(2H,m,H-4,5),2.56(3H,s,N-CH₃),2.40(1H,t,J＝14.2,H-7)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃,δ):142.2(C-1),116.7(C-la),126.7(C-lb),146.7(C-2),106.9(C-3),126.6(C-3a),29.3(C-4),53.8(C-5),62.0(C-6a),27.1(C-7),124.8(C-7a),146.0(C-8),110.4(C-9),123.2(C-10),152.2(C-11),129.9(C-11a),100.7(C-12),60.8(OCH₃-8),55.9(OCH₃-11),44.1(N-CH₃)。其¹³CNMR图见图2。以上数据与文献(Beatrice Baghdikian等，New antiplasmodial alkaloidsfrom Stephania rotunda[J].Journal of Ethnopharmacology,2013,145(1):381-385)中的vireakine基本一致，故确定为vireakine，结构如下：

实施例3.抑菌效果试验

1、菌悬液的制备

在无菌操作台中，挑取金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、微球菌、伤寒杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌这6种标准菌株少许，接种于牛肉膏蛋白胨培养基中，放置于37℃恒温水浴摇床中震荡培养18h。取18h培养的各菌株培养物，用牛肉膏蛋白胨培养基稀释1000倍得菌悬液用于实验。

2、供试液的制备

将本发明所得佐氏千金藤碱和vireakine经冷冻干燥，各提取物分别用二甲亚砜溶解，制备成1mg·mL^-1的初始浓度，在超净工作台中用0.22μm(尼龙66)的微孔滤膜过滤备用。

3、二倍稀释法

对于每个受试样品分别取灭菌试管8支，第1管加入受试药液0.1mL，第2-8管中分别加入0.1mL培养基液，取供试液0.1mL加入第2管中，混匀后取0.1mL加入第3管中，依次稀释至第7管，第7管吸出0.1mL弃去，第8管不加药液作为对照。每管加入菌悬液0.9mL，使得1-8管的液体总量均为1mL，受试药液浓度分别为：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56μg·mL^-1。将试管放入恒温培养箱37℃培养24h后，取出试管观察细菌生长情况。如药液管混浊，表示细菌生长，供试药液无抑菌作用；如药液管清亮则表示细菌生长受抑制，其能抑制细菌生长的最大稀释度的药液，即为该样品的最小抑菌浓度(MIC)。

4、抑菌结果

佐氏千金藤碱和vireakine对6种常见细菌的抑菌活性测试结果见下表1。

表1佐氏千金藤碱和vireakine二倍稀释法抑菌结果

从上表可以看出，血散薯中的提取物佐氏千金藤碱和vireakine，对金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、微球菌、伤寒杆菌、巨大芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌具有一定的抑制效果，证明生物碱是血散薯中的主要抗菌成分，这两个化合物的抗菌活性为首次报道。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims

1.一种血散薯中微量生物碱单体的分离方法，其特征在于：生物碱单体为佐氏千金藤碱和vireakine，所述方法包括以下步骤：

(4)将所述石油醚-乙酸乙酯体积比40:60洗脱液浓缩至干得固体，固体再经硅胶柱层析分离，用体积比为45:55和50:50的石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，收集石油醚-乙酸乙酯体积比50:50洗脱的部分，浓缩后，再使用硅胶柱纯化，用体积比为40:60的氯仿-丙酮洗脱并收集洗脱部分，得到化合物佐氏千金藤碱和vireakine的混合物，洗脱部分通过凝胶色谱柱Sephadex LH-20纯化，洗脱剂为体积比50:50的二氯甲烷-甲醇溶液，TLC检测，收集目标流出液，即得到化合物佐氏千金藤碱和vireakine；其中，佐氏千金藤碱的结构式为：

Vireakine的结构式为：

2.根据权利要求1所述的血散薯中微量生物碱单体的分离方法，其特征在于：所述乙醇回流提取所使用的乙醇的体积浓度为70-95％，所述乙醇与所述血散薯的液固比为2-10：1。

3.根据权利要求1所述的血散薯中微量生物碱单体的分离方法，其特征在于：所述乙醇回流提取的次数为2-6次，每次1-3小时。

4.根据权利要求1所述的血散薯中微量生物碱单体的分离方法，其特征在于：步骤(2)所述石油醚脱脂所使用的石油醚与乙醇提取物的液固比为2-10：1。

5.根据权利要求1所述的血散薯中微量生物碱单体的分离方法，其特征在于：步骤(2)所述乙酸乙酯萃取中，所用的乙酸乙酯与所述水相A等体积。

6.根据权利要求1所述的血散薯中微量生物碱单体的分离方法，其特征在于：步骤(3)中所述的梯度洗脱是依次用体积比90:10、80:20、70:30、60:40、50:50、40:60、30:70、20:80的石油醚-乙酸乙酯混合溶液梯度洗脱。