CN109879920B - 一种香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用，可有效解决制备新型香豆素糖苷类化合物，实现制备抗菌药物的问题，该化合物是从小驳骨药材中分离得到的小驳骨酚苷C(genglycoside C，I)、小驳骨酚苷E(genglycoside E，II)、小驳骨酚苷F(genglycosideF，III)，本发明制备的具有抗菌活性的新型香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷C（Ⅰ）、小驳骨酚苷E（Ⅱ）、小驳骨酚苷F（Ⅲ），作为唯一活性成分有效用于制备抗根癌农杆菌农药，开拓了抗菌农药的新途径和小驳骨的药用价值及商业价值，具有很好的实际应用价值，经济和社会效益显著。

Description

一种香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及农药，特别是一种香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用。
背景技术
化学合成农药的广泛使用，不仅污染环境，而且加速了耐药菌的出现，甚至出现了多药耐药菌。植物源农药具有不同的结构特征，由于结构的复杂性和多样性，具有已应用于农药领域具有不能比拟的优势，如生物降解快，毒性低，不易产生抗性，对环境无污染等优点，越来越受到研究者的广泛关注。因此，从中草药中寻找高效低毒的具有抗菌活性新型农药，研制选择性强、毒副作用低的抗菌农药是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
我国丰富的中药资源为药学工作者开发新型抗菌农药提供了物质基础。小驳骨为爵床科植物小驳骨(Gendarussa vulgaris Nees)的干燥地上部分。广泛分布于我国广西、广东、海南等省。具有祛瘀镇痛、续筋接骨之功效，主要用于跌打损伤、筋伤骨折、风湿骨痛、血瘀经闭及产后腹痛。在我国已有较长的应用历史，在《本草纲目拾遗》、《生草药性备要》、《岭南采药录》、《陆川本草》等医药古籍中均有记载。2010年作为新增药材，收载于《中华人民共和国药典》。近年来关于小驳骨化学成分及生物活性的研究受到国内外学者的广泛关注，化学成分主要包括生物碱、黄酮、香豆素、三萜等类型。生物活性研究表明，具有抗炎、止痛、保肝、抗氧化、免疫抑制、抗血管生成、抗人获得性免疫缺陷病毒、驱虫、抗焦虑、抗氧化作用、抗炎等作用。本发明所涉及的香豆素糖苷类化合物及其生物活性，迄今为止未见有专利或文献公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用，可有效解决制备新型香豆素糖苷类化合物，实现制备抗菌药物的问题。
本发明解决的技术方案是，一种香豆素糖苷类化合物，该化合物是从小驳骨药材中分离得到的小驳骨酚苷C(genglycoside C，I)、小驳骨酚苷E(genglycoside E，II)、小驳骨酚苷F (genglycosideF，III)，分子结构式分别为：
Figure BDA0002025148730000011
其制备方法是，以小驳骨15–20kg为原料，以2–5倍原料重量、体积浓度为75％–95％的乙醇加热90–95℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.6–4.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次3.6–4.8L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、 30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用3.8–5.0L洗脱液，流速为5–10mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100 ︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标小驳骨酚苷C(Ⅰ)、小驳骨酚苷E(Ⅱ)、小驳骨酚苷F(Ⅲ)的流份，得亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积浓度为40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E(Ⅱ)；收集18min 的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F(Ⅲ)；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)。
本发明制备的具有抗菌活性的新型香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)、小驳骨酚苷 E(Ⅱ)、小驳骨酚苷F(Ⅲ)，作为唯一活性成分有效用于制备抗根癌农杆菌农药，开拓了抗菌农药的新途径和小驳骨的药用价值及商业价值，具有很好的实际应用价值，经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中，一种香豆素糖苷类化合物，该化合物以小驳骨20kg为原料，以2–5 倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热90℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于4.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次4.8L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用5.0L洗脱液，流速为10mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组份Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)、小驳骨酚苷E(Ⅱ)、小驳骨酚苷F(Ⅲ)的流份，即为亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积浓度为40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E(Ⅱ)；收集18min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F(Ⅲ)；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)。
实施例2
本发明在具体实施中，一种香豆素糖苷类化合物，以小驳骨15kg为原料，以3倍原料重量、体积浓度为75％的乙醇加热95℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.6L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次3.6L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用3.8L洗脱液，流速为5mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组份Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)、小驳骨酚苷E(Ⅱ)、小驳骨酚苷F(Ⅲ)的流份，即为亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积浓度为40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E(Ⅱ)；收集18min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F(Ⅲ)；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)。
实施例3
本发明在具体实施中，一种香豆素糖苷类化合物，以小驳骨18kg为原料，以4倍原料重量、体积浓度为85％的乙醇加热92℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于4.5L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次4.5L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4.5L洗脱液，流速为8mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组份Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)、小驳骨酚苷E(Ⅱ)、小驳骨酚苷F(Ⅲ)的流份，即为亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积比浓度40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E(Ⅱ)；收集18min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F(Ⅲ)；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)。
实施例4
本发明在具体实施中，一种香豆素糖苷类化合物，以小驳骨16kg为原料，以3倍原料重量、体积干燥为80％的乙醇加热93℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次3.8L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4.0L洗脱液，流速为7mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组份Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)、小驳骨酚苷E(Ⅱ)、小驳骨酚苷F(Ⅲ)的流份，即为亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积浓度为40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E(Ⅱ)；收集18min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F(Ⅲ)；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)。
本发明方法稳定可靠，易操作，所得产物经鉴定为具有抗菌活性的新型香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷C(Ⅰ)、小驳骨酚苷E(Ⅱ)、小驳骨酚苷F(Ⅲ)，作为唯一活性成分，具有对根癌农杆菌明显的抑制作用，可有效用于制备抑制根癌农杆菌的农药，并经试验取得了很好的有益技术效果，有关资料如下：
一、化合物的鉴定
经核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定，其中：
化合物I
白色粉末(甲醇)。紫外灯254nm下显蓝色荧光。异羟肟酸铁反应阳性，提示可能为香豆素类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 539.1396[M﹢Na]+(calcd forC22H28O14Na, 539.1377)，确定化合物I的分子式为C22H28O14，不饱和度为9。IR光谱给出羟基(3333cm-1)、羰基(1700cm-1)、苯环(1612,1512cm-1)。UV光谱给出香豆素类化合物的特征吸收2 04、290、340nm。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)中δ6.33(1H,d,J＝9.6Hz)和δ 7.96(1H,d,J＝9.6Hz)为香豆素吡喃酮环上H-3和H-4的特征信号，结合芳香区信号δ 7.30(1H,s)、7.17(1H,s)，提示存在6,7二取代香豆素母核；此外，δ3.02～5.21之间为两个葡萄糖基氢信号，其中δ5.21(1H,d,J＝7.4Hz)和δ4.35(1H,d,J＝7.8Hz)是两个葡萄糖端基氢信号。高场区δ3.81(3H,s)提示结构中含有1个甲氧基。根据偶合常数可知两个葡萄糖的苷键为β-构型。将该化合物水解后，糖衍生化后经HPLC分析，并与糖标准品对照，确定葡萄糖的绝对构型为D型。该化合物的1H-NMR和13C-NMR光谱数据根据HSQC谱和 HMBC谱进行归属，具体见表Table1。13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)中共给出22个碳信号，其中包括一个香豆素母核(一个酯羰基碳信号δ160.4，两个烯碳信号δ113.4、144.1，一个苯环δ112.4、110.0、146.0、148.9、103.1、148.9)，一个甲氧基δ56.1，两组葡萄糖基信号δ99.0,71.8,87.4,67.9,76.5,61.1,103.9,73.8,75.9,70.1,76.9,60.4。以上1H-NMR 和13C-NMR数据提示该化合物为香豆素糖苷衍生物。由两个葡萄糖端基质子信号δ5.21(1 H,d,J＝7.4Hz)和δ4.35(1H,d,J＝7.8Hz)分别与碳信号δ148.9(C-7)和δ87.4(C-3 ′)远程相关，提示香豆素母核7位羟基被糖苷化，且内侧糖的3位羟基被葡萄糖糖苷化。甲氧基氢信号δ3.81(3H,s)与芳香碳信号δ146.0(C-6)的HMBC远程相关，提示香豆素母核6 位羟基被甲醚化。综合上述分析，确定该化合物的结构为7-[(3-O-β-D-glucopyranosyl-β-D-glucopyr anosyl)oxy]-6-methoxycoumarin，为一未见文献报道的新化合物，命名为小驳骨酚苷C(genglycos ide C)，分子结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
Table.1 1H-NMR(500MHZ)and 13C-NMR(125MHz)Data for compound I in DMSO-d6
Figure BDA0002025148730000052
Figure BDA0002025148730000061
化合物II
白色粉末(甲醇)。紫外灯254nm下显蓝色荧光。三氯化铁-铁氰化钾反应阳性，提示化合物含有酚羟基。异羟肟酸铁反应阳性，提示可能为香豆素类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 555.1320[M﹢Na]+(calcd for C22H28O15Na,555.1326)，确定化合物II的分子式为C22H28O15，不饱和度为9。IR光谱给出羟基(3378cm-1)、羰基(1706cm-1)、苯环(1 607,1509cm-1)。UV光谱给出香豆素类化合物的特征吸收206、292、339nm。1H-NMR(5 00MHz,DMSO-d6)中δ6.22(1H,d,J＝9.5Hz)和δ7.88(1H,d,J＝9.5Hz)为香豆素吡喃酮环上H-3和H-4的特征信号，结合芳香区的一个单峰氢信号δ7.02(1H,s)，提示存在6,7,8三取代香豆素母核；高场区δ4.97(1H,d,J＝7.8Hz)、4.06(1H,d,J＝7.8Hz) 为两个葡萄糖的端基氢信号，偶合常数提示苷键为β-构型；δ3.81(3H,s)为1个甲氧基的氢质子信号。将该化合物水解后，糖衍生化后经HPLC分析，并与糖标准品对照，确定葡萄糖的绝对构型为D型。该化合物的1H-NMR和13C-NMR光谱数据根据HSQC谱和HMBC谱进行归属，具体见下表Table 2。13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)中共给出22个碳信号，其中包括一个香豆素母核(一个酯羰基碳信号δ160.2，两个烯碳信号δ111.2、144.8，一个苯环δ105.0、145.3、143.7、131.3、142.7、110.1)，一个甲氧基δ56.1，两组葡萄糖基碳信号δ 103.6、73.8、76.4、69.5、76.5、67.7、103.0、73.5、76.2、69.8、76.6、60.8,其中δ103.6、103.0为糖基的端基碳信号。以上1H-NMR和13C-NMR数据提示该化合物为香豆素糖苷衍生物。通过与文献数据比较，确定苷元为fraxetin。在HMBC谱中，由两个葡萄糖端基质子信号δ4.97(1H,d,J＝7.8Hz)和δ4.06(1H,d,J＝7.8Hz)分别与碳信号δ131.3(C-8)和δ 67.7(C-6′)远程相关，提示香豆素母核8位羟基被糖苷化，且内侧糖的6位羟基被葡萄糖糖苷化。甲氧基氢信号δ3.81(3H,s)与芳香碳信号δ145.3(C-6)的HMBC远程相关，提示香豆素母核6位被甲醚化。综合上述分析，确定该化合物的结构为8-[6-(β-D-glucopyranosylo xy)]-O-β-D-glucopyranosyloxy-6-methoxy-7-hydroxycoumarin，为一未见文献报道的新化合物，命名为小驳骨酚苷E(genglycoside E)，分子结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
Table.2 1H-NMR(500MHZ)and 13C-NMR(125MHz)Data for compound II in DMSO-d6
Figure BDA0002025148730000072
Figure BDA0002025148730000081
化合物III
白色粉末(甲醇)。紫外灯254nm下显微弱蓝色荧光。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/ z 555.1320[M﹢Na]+(calcd for C22H28O15Na,555.1326)，确定化合物III的分子式为C22H28O15，不饱和度为9。IR光谱给出羟基(3327cm-1)、羰基(1682cm-1)、苯环(1608,1506cm-1)。 UV光谱给出香豆素类化合物的特征吸收207、292、338nm。1H-NMR(500MHz,DMSO-d 6)中δ7.94(1H,d,J＝9.5Hz)和δ6.39(1H,d,J＝9.5Hz)为香豆素吡喃酮环上H-4 和H-3的特征信号，结合芳香区的一个单峰氢信号δ7.14(1H,s)，提示存在6,7,8三取代香豆素母核；；高场区δ3.81(3H,s)提示结构中含有1个甲氧基，此外还给出两个糖端基质子信号，δ5.26(1H,d,J＝7.8Hz)、5.18(1H,d,J＝7.8Hz)是两个葡萄糖的端基氢信号，偶合常数提示苷键为β-构型；将该化合物水解后，糖衍生化后经HPLC分析，并与糖标准品对照，确定葡萄糖的绝对构型为D型。该化合物的1H-NMR和13C-NMR光谱数据根据HSQ C谱和HMBC谱进行归属，具体见下表Table 3。13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)中共给出2 2个碳信号，其中包括一个香豆素母核(一个酯羰基碳信号δ159.9，两个烯碳信号δ114.9、 144.2，一个苯环114.4、105.9、149.6、141.3、136.1、142.4)，一个甲氧基δ56.6，两组葡萄糖基碳信号δ102.6,74.0,76.4,69.9,77.6,60.7,102.5,74.0,76.4,69.9,77.5,60.7。以上1 H-NMR和13C-NMR数据提示该化合物为香豆素糖苷衍生物。通过与文献数据比较，确定苷元为fraxetin。HMBC谱显示，葡萄糖的端基氢δ 5.26(1H,d,J＝7.8Hz)、5.18(1H,d,J ＝7.8Hz)和香豆素母核上7、8位的碳信号δ141.3、136.1远程相关，提示香豆素7、8位被葡萄糖糖苷化；甲氧基氢信号δ 3.81(3H,s)与δ149.6(C-6)远程相关，提示香豆素6位被甲醚化。综合上述分析，确定该化合物的结构为7,8-bis(β-D-glucopyranosyloxy)-6-methoxycou marin，为一未见文献报道的新化合物，命名为小驳骨酚苷F(genglycoside F)，分子结构式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
Table.3 1H-NMR(500MHZ)and 13C-NMR(125MHz)Data for compound III in CD3OD
Figure BDA0002025148730000091
二、抗菌作用有关实验资料如下：
1.滤纸片扩散法
供试菌划线接种在LB固体培养基上，在28℃培养，待单菌落长出，挑取单菌落加入2mL无菌去离子水使其分散均匀，继续加无菌去离子水稀释至2×104cfu/mL。LB固体培养基高压灭菌(121℃、0.1MPa)20min，置于超净工作台上冷却至45-55℃后，将其加入培养皿中待其凝固成平面后，用移液器吸取0.1mL制备好的液体菌悬浮液注入其中并涂布均匀。待菌液中的水分接近挥干时，将无菌圆滤纸片(5mm)轻放在制备好的细菌平板上，用移液器吸取待测化合物的样品液注入到滤纸片的正中央后，在30℃培养48h，用十字交叉法测定抑菌圈的直径。
2.实验结果
小驳骨酚苷C(Ⅰ)、小驳骨酚苷E(Ⅱ)、小驳骨酚苷F(Ⅲ)对根癌农杆菌均有不同程度的抑制作用，抑菌圈直径分别为6.7mm、8.5mm、7.2mm。
表1.小驳骨酚苷C，E，F抗菌活性结果
化合物 根癌农杆菌
小驳骨酚苷C(Ⅰ) 6.7±0.3
小驳骨酚苷E(Ⅱ) 8.5±0.7
小驳骨酚苷F(Ⅲ) 7.2±0.5
香豆素类化合物由于母核所连羟基、甲氧基、糖基的位置、数目、及糖种类的不同，其抗菌抑制作用存在很大的差异，由上述实验表明，本发明制备出的新型香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷C、E、F对根癌农杆菌具有抑制作用，具有制备抗菌农药的应用潜能，实现在制备抗菌农药中的应用，是抗菌农药上的一大创新，经济和社会效益显著。

Claims (5)

1.一种香豆素糖苷类化合物的制备方法，其特征在于，该化合物是从小驳骨药材中分离得到的小驳骨酚苷C(genglycoside C，I)、小驳骨酚苷E(genglycoside E，II)、小驳骨酚苷F(genglycosideF，III)，分子结构式分别为：
Figure FDA0003302956060000011
其制备方法是，以小驳骨15–20kg为原料，以2–5倍原料重量、体积浓度为75％–95％的乙醇加热90–95℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.6–4.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次3.6–4.8L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用3.8–5.0L洗脱液，流速为5–10mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标小驳骨酚苷C、小驳骨酚苷E、小驳骨酚苷F的流份，得亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积浓度为40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E；收集18min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C。
2.根据权利要求1所述的香豆素糖苷类化合物的制备方法，其特征在于，该化合物以小驳骨20kg为原料，以2–5倍原料重量、体积浓度为95％的乙醇加热90℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于4.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次4.8L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用5.0L洗脱液，流速为10mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组份Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标化合物小驳骨酚苷C、小驳骨酚苷E、小驳骨酚苷F的流份，即为亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积浓度为40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E；收集18min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C。
3.根据权利要求1所述的香豆素糖苷类化合物的制备方法，其特征在于，以小驳骨15kg为原料，以3倍原料重量、体积浓度为75％的乙醇加热95℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.6L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次3.6L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用3.8L洗脱液，流速为5mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组份Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标化合物小驳骨酚苷C、小驳骨酚苷E、小驳骨酚苷F的流份，即为亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积浓度为40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E；收集18min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C。
4.根据权利要求1所述的香豆素糖苷类化合物的制备方法，其特征在于，以小驳骨18kg为原料，以4倍原料重量、体积浓度为85％的乙醇加热92℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于4.5L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次4.5L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4.5L洗脱液，流速为8mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组份Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标化合物小驳骨酚苷C、小驳骨酚苷E、小驳骨酚苷F的流份，即为亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积比浓度40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E；收集18min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C。
5.根据权利要求1所述的香豆素糖苷类化合物的制备方法，其特征在于，由小驳骨16kg为原料，以3倍原料重量、体积干燥为80％的乙醇加热93℃回流提取3次，每次提取时间为1小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次3.8L，时间为1.5小时；将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离，依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度用4.0L洗脱液，流速为7mLmin-1，将水洗脱液弃去，分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份，分别减压浓缩干燥，得组分Fr.N1和组分Fr.N2；将组份Fr.N1经硅胶柱色谱分离，用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，在365nm下观察显蓝色荧光的斑点，收集含有目标化合物小驳骨酚苷C、小驳骨酚苷E、小驳骨酚苷F的流份，即为亚组分Fr.N1-3；将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化，用体积浓度为40％甲醇洗脱，收集16min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷E；收集18min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷F；收集21min的洗脱峰，得化合物小驳骨酚苷C。
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