CN109897079B - 一种香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用 - Google Patents
一种香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用,可有效解决制备具有肝保护活性的新型香豆素糖苷类化合物的制备,并实现在制备肝保护药物中的应用问题,具有肝保护活性的新型香豆素糖苷类化合物是从小驳骨药材中分离得到的小驳骨酚苷A(genglycoside A,I)、小驳骨酚苷B(genglycoside B,Ⅱ)、小驳骨酚苷D(genglycoside D,Ⅲ),本发明制备方法简单、重现性良好,所得化合物纯度高,有利于对其进行进一步的药理和临床研究,制备的具有肝保护活性的新型香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷A、小驳骨酚苷B、小驳骨酚苷D,有效用于制备肝保护药物,开拓了保肝药物的新途径和小驳骨的药用价值及商业价值,经济和社会效益显著。
Description
技术领域
本发明涉及医药,特别是具有抗保护活性的新型香豆素糖苷类化合物的一种香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用。
背景技术
肝脏将人体内多种内源性或者外源性毒性物质通过氧化、还原、水解等多种途径将其转化成无毒或者低毒的物质,是重要的代谢器官。肝脏易受病毒、药物、毒物及免疫病理因素的影响,如长期生活在有毒的环境中或过量饮酒都会诱发各类肝脏疾病,进而导致肝损伤的发生。肝损伤是形成肝炎、肝硬化和肝癌疾病的直接原因,临床发病率逐年升高,它已经成为严重危害全球人类健康的主要疾病之一。目前发病的重要原因普遍被认为是机体免疫应答和氧化应激反应,但对肝脏损伤的确切发病机制尚不明确,对于肝损伤尚无有效的治疗措施。
传统中药在我国已有几千年的应用历史,是研究保肝药物的重要资源。小驳骨为爵床科植物小驳骨(Gendarussa vulgaris Nees)的干燥地上部分。广泛分布于我国广西、广东、海南等省。具有祛瘀镇痛、续筋接骨之功效,主要用于跌打损伤、筋伤骨折、风湿骨痛、血瘀经闭及产后腹痛。在我国已有较长的应用历史,在《本草纲目拾遗》、《生草药性备要》、《岭南采药录》、《陆川本草》等医药古籍中均有记载。2010年作为新增药材,收载于《中华人民共和国药典》。近年来关于小驳骨化学成分及生物活性的研究受到国内外学者的广泛关注,化学成分主要包括生物碱、黄酮、香豆素、三萜等类型。生物活性研究表明,具有抗炎、止痛、保肝、抗氧化、免疫抑制、抗血管生成、抗人获得性免疫缺陷病毒、驱虫、抗焦虑、抗氧化作用、抗炎等作用。本发明所涉及的香豆素糖苷类化合物及其生物活性,迄今未见有公开报道。
发明内容
针对上述情况,为克服现有技术之缺陷,本发明之目的就是提供一种香豆素糖苷类化合物的制备方法及其应用,可有效解决制备具有肝保护活性的新型香豆素糖苷类化合物的制备,并实现在制备肝保护药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是,具有肝保护活性的新型香豆素糖苷类化合物是从小驳骨药材中分离得到的小驳骨酚苷A(genglycoside A,I)、小驳骨酚苷B(genglycoside B,Ⅱ)、小驳骨酚苷D(genglycoside D,Ⅲ),分子结构式分别为:
其制备方法是,以小驳骨15–20kg为原料,以2–5倍原料重量、体积浓度为75%–95%的乙醇在90–95℃下加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于3.6–4.8L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次3.6–4.8L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用3.8–5.0L洗脱液,流速为5–10mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩分别得组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,分别收集含有目标化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经SephadexLH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物Ⅱ的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有目标化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
本发明制备方法简单、重现性良好,所得化合物纯度高,有利于对其进行进一步的药理和临床研究,制备的具有肝保护活性的新型香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷A、小驳骨酚苷B、小驳骨酚苷D,有效用于制备肝保护药物,开拓了保肝药物的新途径和小驳骨的药用价值及商业价值,经济和社会效益显著。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明在具体实施中,一种香豆素糖苷类化合物的制备方法,由小驳骨20kg为原料,以2–5倍原料重量、体积比浓度95%的乙醇90℃加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于4.8L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次4.8L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用5.0L洗脱液,流速为10mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩后,分别为组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,,分别收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为化合物小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
实施例2
本发明在具体实施中,一种香豆素糖苷类化合物的制备方法,由小驳骨15kg为原料,以3倍原料重量、体积浓度为75%的乙醇95℃加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于3.6L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次3.6L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用3.8L洗脱液,流速为5mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩后,分别为组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,分别收集含有目标化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为化合物小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有目标化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
实施例3
本发明在具体实施中,一种香豆素糖苷类化合物的制备方法,由小驳骨18kg为原料,以4倍原料重量、体积浓度为85%的乙醇92℃加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于4.5L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次4.5L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用4.5L洗脱液,流速为8mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩后,分别为组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,分别收集含有目标化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为化合物小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有目标化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
实施例4
本发明在具体实施中,一种香豆素糖苷类化合物的制备方法,由小驳骨16kg为原料,以3倍原料重量、体积浓度为80%的乙醇93℃加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于3.8L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次3.8L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用4.0L洗脱液,流速为7mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩后,分别为组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,分别收集含有目标化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为化合物小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有目标化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
本发明方法稳定可靠,易操作,所得产物经鉴定为具有肝保护活性的新型香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷A(I)、小驳骨酚苷B(Ⅱ)、小驳骨酚苷D(Ⅲ)作为唯一活性成分在制备保肝药物中的应用,并经实验取得了非常好的有益技术效果,有关资料如下:
一、化合物的鉴定
经核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)及高分辨质谱(HR-ESI-MS)光谱技术鉴定,其中:
化合物I
白色粉末(甲醇),三氯化铁-铁氰化钾反应阳性,提示化合物含有酚羟基。异羟肟酸铁反应阳性,提示可能为香豆素类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 721.1381[M﹢K]+(calcd for C30H34O18K,721.1382),确定化合物I的分子式为C30H34O18,不饱和度为14。IR光谱给出羟基(3384cm-1)、羰基(1712cm-1)、苯环(1610,1509cm-1)。UV光谱给出香豆素类化合物的特征吸收207、291、335nm。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)中δ6.13(1H,d,J=9.5Hz)和δ7.80(1H,d,J=9.5Hz)为香豆素吡喃酮环上H-3和H-4的特征信号,结合芳香区信号δ6.93(1H,s),提示存在6,7,8三取代香豆素母核;芳香氢信号δ7.28(1H,d,J=1.9Hz),7.18(1H,dd,J=1.9,8.5Hz)和7.05(1H,d,J=8.5Hz),构成ABX偶合系统,提示含有1个1,3,4-三取代苯环;此外,δ3.15~5.34之间为两个葡萄糖基氢信号,其中δ5.06(1H,d,J=5.3Hz)和δ5.12(1H,d,J=5.3Hz)是两个葡萄糖端基氢信号。高场区δ3.73(3H,s),3.70(3H,s)提示结构中含有2个甲氧基。根据偶合常数并结合端基碳的化学位移δ103.2,99.6,证明两个葡萄糖的苷键为β-构型。将该化合物水解后,糖衍生化后经HPLC分析,并与糖标准品对照,确定葡萄糖的绝对构型为D型。该化合物的1H-NMR和13C-NMR光谱数据根据HSQC谱和HMBC谱进行归属,具体见表Table 1。13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)中共给出30个碳信号,其中包括一个香豆素母核(一个酯羰基碳信号δ160.1,两个烯碳信号δ111.9、144.6,一个苯环110.0、104.8、145.3、148.4、131.0、142.8),一个甲氧基δ56.1,一个香草酰基δ122.8、112.4、148.4、150.5、114.0、123.6、165.0、55.5,两组葡萄糖基信号δ103.2,73.7,76.2,70.4,74.2,64.0,99.6,73.1,76.8,69.7,77.3,60.8。以上1H-NMR和13C-NMR数据提示该化合物为香豆素糖苷衍生物。通过与文献数据比较,确定苷元为fraxetin。在HMBC谱中,由δ7.28(1H,d,J=1.9Hz)与二连氧取代芳香碳信号δ148.4、150.5和δ165.0的远程相关,再结合甲氧基氢信号3.74(3H,s)与芳香碳信号δ148.4(C-3″)的远程相关,提示香草酰基结构片段的存在。由两个葡萄糖端基质子信号δ5.06(1H,d,J=5.3Hz)和δ5.12(1H,d,J=5.3Hz)分别与碳信号δ150.5(C-4′′)和δ131.3(C-8)远程相关,提示在香草酰基上的羟基和香豆素母核8位羟基分别被糖苷化。由羟甲基氢信号δ4.19(1H,dd,J=11.8,7.5Hz)与酯羰基碳信号δ165.0的HMBC相关,提示内侧糖的6位羟基被香草酸酯化。甲氧基氢信号3.74(3H,s)与芳香碳信号δ145.3(C-6)的HMBC远程相关,结合甲氧基氢信号3.74(3H,s)与芳香氢δ6.93(1H,s)的NOE相关,提示香豆素母核6位羟基被甲醚化。综合上述分析,确定该化合物的结构为8-[6-(4-O-β-D-glucopyranosyloxy-3-methoxybenzoyl)]-O-β-D-glucopyranosyloxy-6-methoxy-7-hydroxycoumarin,为一未见文献报道的新化合物,命名为小驳骨酚苷A(genglycosideA)。
Table.1 1H-NMR(500 MHZ)and 13C-NMR(125 MHz)Data for compound I in DMSO-d6
化合物Ⅱ
白色粉末(甲醇)。紫外灯254nm下显深蓝色荧光,10%茴香醛-稀硫酸显淡绿色(105℃)。三氯化铁-铁氰化钾反应阳性,提示化合物含有酚羟基。异羟肟酸铁反应阳性,提示可能为香豆素类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 543.1097[M﹢Na]+(calcd forC24H24O13Na,543.1115),确定化合物Ⅱ的分子式为C24H24O13,不饱和度为13。IR光谱给出羟基(3359cm-1)、羰基(1710cm-1)、苯环(1602,1505cm-1)。UV光谱给出香豆素类化合物的特征吸收205、295、345nm。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)中δ6.08(1H,d,J=9.5Hz)和δ7.79(1H,d,J=9.5Hz)为香豆素吡喃酮环上H-3和H-4的特征信号,结合芳香区的一个单峰氢信号δ6.92(1H,s),提示存在6,7,8三取代香豆素母核;芳香氢信号δ7.29(1H,d,J=1.9Hz),7.22(1H,dd,J=8.2,1.9Hz)和6.79(1H,d,J=8.2Hz),构成一个ABX系统,说明存在1个1,3,4-三取代苯环。高场区δ4.94(1H,d,J=7.7Hz)为葡萄糖的端基氢信号,偶合常数提示苷键为β-构型;δ3.76(3H,s),3.75(3H,s)为2个甲氧基的氢质子信号。将该化合物水解后,糖衍生化后经HPLC分析,并与糖标准品对照,确定葡萄糖的绝对构型为D型。该化合物的1H-NMR和13C-NMR光谱数据根据HSQC谱和HMBC谱进行归属,具体见下表Table 2。13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)中共给出24个碳信号,其中包括一个香豆素母核(一个酯羰基碳信号δ160.2,两个烯碳信号δ115.0、144.5,一个苯环103.8、145.8、147.2、131.5、143.2、112.4),一个甲氧基δ56.0,一个香草酰基δ123.4、112.4、147.2、151.4、115.0、120.5、165.3、55.5,一组葡萄糖基信号δ104.8、73.8、76.3、70.2、74.3、63.7,其中δ104.8为糖基的端基碳信号。以上1H-NMR和13C-NMR数据提示该化合物为香豆素糖苷衍生物。通过与文献数据比较,确定苷元为fraxetin。在HMBC谱中,由氢信号δ7.29(1H,d,J=1.9Hz)和葡萄糖基6位氢信号δ4.13(1H,dd,J=11.8,7.5Hz)同时与酯羰基碳信号δ165.3远程相关,说明葡萄糖6位被香草酸酯化。甲氧基氢信号δ3.76(3H,s)、3.75(3H,s)与芳香碳信号δ145.8(C-6),147.2(C-3”)的HMBC远程相关,提示香豆素母核6位和3”被甲醚化。由葡萄糖端基质子信号δ4.94(1H,d,J=7.7Hz)与碳信号δ131.5(C-8)远程相关,提示在香豆素母核8位羟基分别被糖苷化。综合上述分析,确定该化合物的结构为8-[6-(3-hydroxy-4-methoxybenzoyl)]-β-D-glucopyranosyloxy-6-methoxy-7-hydroxycoumari n,为一未见文献报道的新化合物,命名为小驳骨酚苷B(genglycosideB)。
Table.2 1H-NMR(500MHZ)and 13C-NMR(125MHz)Data for compoundⅡin DMSO-d6
化合物Ⅲ
白色粉末(甲醇)。紫外灯254nm下显蓝色荧光,在空气中放置显橙黄色,10%硫酸-乙醇显亮黄色(105℃)。三氯化铁-铁氰化钾反应阳性,提示化合物含有酚羟基。异羟肟酸铁反应阳性,提示可能为香豆素类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z719.1794[M﹢Na]+(calcd for C31H36O18Na,719.1800),确定化合物Ⅲ的分子式为C31H36O18,不饱和度为14。IR光谱给出羟基(3377cm-1)、羰基(1709cm-1)、苯环(1603,1501cm-1)。UV光谱给出香豆素类化合物的特征吸收208、292、343nm。1H-NMR(500MHz,CD3OD)中δ7.56(1H,d,J=9.3Hz)和δ5.97(1H,d,J=9.3Hz)为香豆素吡喃酮环上H-4和H-3的特征信号,结合芳香区的一个单峰氢信号δ6.65(1H,s),提示存在6,7,8三取代香豆素母核;芳香氢信号δ7.03(2H,s),推测存在一个1,3,4,5-四取代苯环;高场区δ3.80(3H,s),3.79(6H,s)提示结构中含有3个甲氧基,此外还给出两个糖端基质子信号,δ5.11(1H,d,J=7.8Hz)是葡萄糖的端基氢信号,偶合常数提示苷键为β-构型;5.38(1H,s)是鼠李糖端基氢信号;δ1.25(3H,d,J=6.2Hz)为鼠李糖6位特征信号峰。将该化合物水解后,糖衍生化后经HPLC分析,并与糖标准品对照,确定葡萄糖和鼠李糖的绝对构型分别为D型和L型。该化合物的1H-NMR和13C-NMR光谱数据根据HSQC谱和HMBC谱进行归属,具体见下表Table 3。13C-NMR(125MHz,CD3OD)中共给出31个碳信号,其中包括一个香豆素母核(一个酯羰基碳信号δ163.4,两个烯碳信号δ112.4、146.0,一个苯环110.2、105.3、147.2、146.0、132.2、144.6),一个甲氧基δ56.8,一个紫丁香酰基δ126.9、107.6、154.3、139.7、154.3、107.6、167.0、56.5,一组葡萄糖基和一组鼠李糖基碳信号δ104.4,75.3,77.9,71.4,75.7,65.2,103.4,72.3,73.6,72.2,72.0,18.0。以上1H-NMR和13C-NMR数据提示该化合物为香豆素糖苷衍生物。通过与文献数据比较,确定苷元为fraxetin。HMBC谱显示,葡萄糖的端基氢δ5.11(1H,d,J=7.8Hz)和香豆素母核上8位的碳信号δ132.2远程相关,提示香豆素8位被葡萄糖糖苷化;由氢信号δ7.03(2H,s,H-2”,6”)和葡萄糖基6位氢信号δ4.41(1H,m)、4.60(1H,m)同时与酯羰基碳信号δ167.0远程相关,说明葡萄糖6位被紫丁香酸酯化;甲氧基氢信号δ3.80(3H,s)与δ147.2(C-6)远程相关,δ3.79(6H,s)与δ154.3(C-3”,5”)远程相关,提示香豆素6位,3”,5”位被甲醚化。综合上述分析,确定该化合物的结构为8-[6-(4-O-α-L-rhamnopyranosyloxy-3,5-dimethoxybenzoyl)]-O-β-D-glucopyranosyloxy-6-methoxy-7-hydroxyc oumarin,为一未见文献报道的新化合物,命名为小驳骨酚苷D(genglycosideD)。
Table.3 1H-NMR(500MHZ)and 13C-NMR(125MHz)Data for compoundⅢin CD3OD
二、肝保护作用有关实验资料如下:
1.实验材料
人肝癌细胞株(HepG2)由中国医学科学院药物研究所提供,胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养及实验分组
HepG2细胞培养于含有10%经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中,将培养瓶置于37℃,5%CO2饱和湿度培养箱培养,每1~2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时,用0.25%胰蛋白酶消化,传代。取对数生长期的HepG2细胞随机分成:空白对照组、模型组、正常对照组、给药组。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内,每孔100μL(含4000个),置37℃、5%CO2温箱中培养24小时。每组均设6个平行孔。空白组只加培养基,无细胞;给药组加入50μM的测试化合物的稀释液;模型组加入异烟肼/利福平(0.1+0.2)mg/mL的溶液。置37℃、5%CO2温箱中继续培养24小时,弃培养液,每孔加50μL(1mg/mL)MTT溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时,弃去上清液,每孔加入DMSO 200μL溶解甲簪颗粒,轻度振荡溶解。用酶标仪,在检测波长490nm条件下测定光密度值(OD),计算细胞存活率。重复测试3次,取平均值为最终结果。
4.实验结果
与正常对照组比较,模型组的细胞存活率明显降低,具有显著性差异(P<0.01);与模型组相比,经小驳骨酚苷A、B、D的保护后细胞存活率由55.3%分别增加到58.4%、60.1%、57.0%,各组均差异显著(P<0.01)。
表1.MTT法测定各组细胞存活率情况
组别 | n | 细胞存活率 |
模型组 | 6 | 55.3% |
小驳骨酚苷A | 6 | 58.4% |
小驳骨酚苷B | 6 | 60.1% |
小驳骨酚苷D | 6 | 57.0% |
通过多次反复实验,香豆素类化合物由于母核所连羟基、甲氧基、糖基的位置、数目、及糖种类的不同,其对利福平/异烟肼所致肝细胞损伤的保护作用存在很大的差异,由上述实验表明,本发明制备出的新型香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷A、B、D对利福平/异烟肼所致肝细胞损伤具有保护作用,具有制备临床上肝保护药物的应用潜能,实现在制备肝保护药物中的应用,是肝保护药物上的一大创新,开拓了保肝药物的新途径和小驳骨的药用价值及商业价值,经济和社会效益显著。
Claims (6)
1.一种香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷A(genglycoside A,I)、小驳骨酚苷B(genglycoside B,Ⅱ)、小驳骨酚苷D(genglycoside D,Ⅲ)的制备方法,其特征在于,所述的小驳骨酚苷A(genglycoside A,I)、小驳骨酚苷B(genglycoside B,Ⅱ)、小驳骨酚苷D(genglycoside D,Ⅲ)分子结构式分别为:
其制备方法是,以小驳骨15–20kg为原料,以2–5倍原料重量、体积浓度为75%–95%的乙醇在90–95℃下加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于3.6–4.8L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次3.6–4.8L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用3.8–5.0L洗脱液,流速为5–10mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩分别得组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,分别收集含有目标化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物Ⅱ的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有目标化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
2.根据权利要求1所述的香豆素糖苷类化合物的制备方法,其特征在于,由小驳骨20kg为原料,以2–5倍原料重量、体积比浓度95%的乙醇90℃加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于4.8L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次4.8L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用5.0L洗脱液,流速为10mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩后,分别为组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,分别收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为化合物小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
3.根据权利要求1所述的香豆素糖苷类化合物的制备方法,其特征在于,由小驳骨15kg为原料,以3倍原料重量、体积浓度为75%的乙醇95℃加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于3.6L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次3.6L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用3.8L洗脱液,流速为5mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩后,分别为组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,分别收集含有目标化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为化合物小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有目标化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
4.根据权利要求1所述的香豆素糖苷类化合物的制备方法,其特征在于,由小驳骨18kg为原料,以4倍原料重量、体积浓度为85%的乙醇92℃加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于4.5L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次4.5L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用4.5L洗脱液,流速为8mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩后,分别为组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,分别收集含有目标化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为化合物小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有目标化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
5.根据权利要求1所述的香豆素糖苷类化合物的制备方法,其特征在于,由小驳骨16kg为原料,以3倍原料重量、体积浓度为80%的乙醇93℃加热回流提取3次,每次提取时间为1小时,减压回收乙醇,得浸膏状乙醇提取物,混悬于3.8L的蒸馏水中,依次以石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次,每次3.8L,时间为1.5小时;将正丁醇萃取部位经AB-8大孔吸附树脂柱色谱分离,依次用体积比为0:100、30:70、95:5乙醇-水混合溶剂进行梯度洗脱,每一梯度用4.0L洗脱液,流速为7mLmin-1,将水洗脱液弃去,分别收集体积比为30:70、95:5乙醇-水的洗脱流份,减压浓缩后,分别为组分Fr.N1和组分Fr.N2;将组分Fr.N1经硅胶柱色谱分离,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰20、100︰30、100︰50二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,各个流份经硅胶薄层色谱检测分析,采用GF254薄层板,以体积比5︰2的二氯甲烷-甲醇作为展开剂,以三氯化铁-铁氰化钾试剂作为显色剂,分别收集含有目标化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)和小驳骨酚苷A(I)的流份,即为亚组分Fr.N1-1和亚组分Fr.N1-3;将亚组分Fr.N1-1经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每2mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ)的流份,用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷D(Ⅲ);将亚组分Fr.N1-3经制备高效液相色谱纯化,体积浓度为40%甲醇洗脱,收集12min的洗脱峰,即为化合物小驳骨酚苷A(I);将组份Fr.N2经Sephadex LH-20凝胶柱色谱纯化,甲醇洗脱,每10mL为一流份,收集含有化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,得到个亚组份Fr.N2-1,再经硅胶柱色谱纯化,用体积比100︰3、100︰5、100︰7、100︰10、100︰30的二氯甲烷-甲醇作洗脱液进行梯度洗脱,合并含有目标化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)的流份,减压浓缩后用甲醇重结晶即为化合物小驳骨酚苷B(Ⅱ)。
6.权利要求1-5所述方法制备的香豆素糖苷类化合物小驳骨酚苷A(I)、小驳骨酚苷B(Ⅱ)、小驳骨酚苷D(Ⅲ)作为唯一活性成分在制备保肝药物中的应用。
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