CN110551163A - 一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法及其应用 - Google Patents

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赵晨
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Abstract

本发明涉及从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法及其应用，可有效解决从小叶莲中提取黄酮苷类化合物，实现在制备抗氧化剂和抗宫颈癌药物中的应用问题，所述的黄酮苷类化合物为从小叶莲中提取的桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidgs A)和桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidgs B)，具有抗氧化作用，对人宫颈癌细胞HeLa具有细胞毒活性，有效用于制备抗氧化剂和抗人宫颈癌细胞HeLa的药物。本发明原料丰富，制备方法易操作，有效用于从小叶莲中提取黄酮苷类化合物桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidgs A)、桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidgs B)，开拓了小叶莲的药用价值和商业价值，并为制备抗氧化药物和抗人宫颈癌细胞HeLa药物提供了技术支持，有显著的经济和社会效益。

Description

一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法及其应用。
背景技术
氧化应激是指机体组织或细胞内产生的活性氧自由基超过了原有的氧自由基使用能力或是清除能力，氧化还原平衡被破坏，从而导致体内产生过量堆积的活性氧自由基及其相关的代谢产物对机体造成一定的损害作用，因而呈现一定的病理状态。氧化应激被认为是导致许多退行性疾病的原因，如癌症、慢性炎症、心血管疾病、神经性疾病、糖尿病、阿尔兹海默症和帕金森病等。因此，通过抑制氧化应激类损伤成为治疗与氧化应激相关的疾病的重要途径之一。
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病。现今，癌症已成为全世界首要的致死病因。宫颈癌是一种发生于女性生殖系统的恶性肿瘤，是妇科最常见的恶性肿瘤，常见于50-55岁年龄妇女。据统计，在亚洲范围内，宫颈癌的发病率、死亡率约占全球的50％左右，而中国的宫颈癌发病率和死亡率却占全球1/3以上。近年来，宫颈癌发病的年龄逐渐趋于年轻化，全球宫颈癌发病的平均年龄已从60岁降至51.7岁。目前市场上还没有非常理想的治疗宫颈癌的药物，均存在着疗效差、副作用大等方面的缺点。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，杀伤肿瘤细胞的同时，还能提高机体免疫力，副作用较小。因此，从中草药中寻找高效低毒的抗宫颈癌活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗宫颈癌药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。
小叶莲是小檗科桃儿七属植物桃儿七Sinopodophyllum hexandrum的干燥成熟果实。桃儿七是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见。不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。桃儿七分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。小叶莲作为传统藏药始载于《月王药诊》，具有悠久的药用历史。化学成分研究表明主要含有木脂素和黄酮类化合物，黄酮类化合物具有重要而广泛的生物活性，如抗氧化性、抗病毒、抗肿瘤、清除自由基等。本发明所涉及的B环糖苷化的黄酮糖苷类化合物在桃儿七属植物中首次被发现，其生物活性迄今为止未见有专利或文献报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法及其应用，可有效解决从小叶莲中提取黄酮苷类化合物，实现在制备抗氧化剂和抗宫颈癌药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，所述的黄酮苷类化合物为桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidgs A Ⅰ)和桃儿七酮苷B(SinoflavonoidgsB Ⅱ)，其提取方法是：
以小叶莲药材6-9kg为原料，以2–5倍原料重量、体积比为75％–95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，每次提取时间为1.5–2小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2–3.2L，时间为1.5–2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用9.1–13L洗脱液，流速为10–15mLmin-1，每350–500ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254 薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15 经SephadexLH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为30–50mL/h，每6–12mL为一流份、收集24个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack ODS-A(250×20mm,5μm)，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidg A Ⅰ)，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidg B Ⅱ)。
从小叶莲中提取的化合物桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidgs A Ⅰ)、桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidgs B Ⅱ)具有抗氧化作用，对人宫颈癌细胞HeLa具有细胞毒活性，有效用于制备抗氧化剂和抗人宫颈癌细胞HeLa的药物。
本发明原料丰富，制备方法易操作，有效用于从小叶莲中提取黄酮苷类化合物桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidgs A Ⅰ)、桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidgs B Ⅱ)，开拓了小叶莲的药用价值和商业价值，并为制备抗氧化药物和抗人宫颈癌细胞HeLa药物提供了技术支持，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明化合物I的核磁共振氢谱图。
图2为本发明化合物I的核磁共振碳谱图。
图3为本发明化合物I的HMBC谱图。
图4为本发明化合物I的HSQC谱图。
图5为本发明化合物II的核磁共振氢谱图。
图6为本发明化合物II的核磁共振碳谱图。
图7为本发明化合物II的HMBC谱图。
图8为本发明化合物II的HSQC谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，将小叶莲药材9kg为原料，以18L、体积比为95％乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次3.2L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、 0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为15mLmin-1，每500ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比 10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份 145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15 经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为50mL/h，每12mL为一流份、收集 24个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷 -甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack ODS-A(250×20mm,5μm)，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidg A Ⅰ)，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidg B Ⅱ)。
实施例2
本发明一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，将小叶莲药材6kg为原料，以30L、体积比为75％乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、 0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用9.1L洗脱液，流速为10 mLmin-1，每350ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用 GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15 经SephadexLH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为30mL/h，每6mL为一流份、收集24 个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷- 甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack ODS-A(250×20mm,5μm)，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidg A Ⅰ)，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidg B Ⅱ)。
实施例3
本发明一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，将小叶莲药材8kg为原料，以24L、体积比为85％乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2.8L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、 0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用11.7L洗脱液，流速为13 mLmin-1，每450ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15 经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为45mL/h，每10mL为一流份、收集 24个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷 -甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack ODS-A(250×20mm,5μm)，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidg A Ⅰ)，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidg B Ⅱ)。
实施例4
本发明一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，将小叶莲药材7kg为原料，以28L、体积比为75％乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.4L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2.4L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用10.4L洗脱液，流速为12mLmin-1，每400ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15 经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为37mL/h，每8mL为一流份、收集24 个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷- 甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack ODS-A(250×20mm,5μm)，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidg A Ⅰ)，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidg B Ⅱ)。
本发明方法稳定可靠，其提取分离得到的黄酮苷类化合物经过UV、IR、核磁共振光谱 (1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定，其分别为桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidgs A Ⅰ)、桃儿七酮苷B(Sinoflavonoidgs B Ⅱ)。经试验，这两个黄酮苷类化合物对DPPH自由基具有清除能力，且对人宫颈癌细胞株HeLa 具有细胞毒活性，有关资料如下：
一、化合物的结构鉴定
对实施例1-4提取的黄酮苷类化合物经过UV、IR、核磁共振光谱(1H-NMR、13C-NMR、HSQC、HMBC)及高分辨率质谱(HR-ESI-MS)等光谱学技术进行鉴定，均证明实施例1-4所得到的化合物Ⅰ均是相同的，化合物Ⅱ也均是相同的，其中：
化合物Ⅰ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 543.1111[M﹢Na]+(calcd for C24H24O13Na,543.1115)，确定分子式为 C24H24O13。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3355cm-1)，羰基(1732、1652cm-1)，苯环(1611cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(269，352nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示与4位羰基缔合的5位酚羟基质子信号δ12.64(1H,s)；一个甲氧基氢信号δ3.77 (3H,s)，一个葡萄糖醛酸端基氢信号δ5.01(1H,d,J＝7.3Hz)；一组与氧相连的乙基氢信号δ 1.17(3H,t,J＝7.2Hz)，4.03(2H,q,J＝7.2Hz)；一组1,3,4-三取代苯信号δ7.81(1H,d,J＝2.1 Hz)、6.98(1H,d,J＝8.6Hz)、7.67(1H,dd,J＝8.6,2.1Hz)；一组1,2,3,5-四取代苯信号δ6.19(1H, d,J＝2.1Hz)、6.42(1H,d,J＝2.1Hz)。13C NMR(125MHz,DMSO-d6)显示含有24个碳原子，除了一个甲氧基的碳信号δ59.5，一组葡萄糖醛酸基碳信号δ101.8、71.3、74.9、73.0、75.4、 168.7，一组乙氧基碳信号δ60.7、13.8之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ177.8，两个与氧相连的烯碳信号δ154.8、137.7，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅰ为糖苷化的黄酮醇衍生物。通过δ3.77(3H,s)与δ137.7(C-3)的远程相关，表明苷元为3-甲氧基槲皮素。由亚甲二氧基δ4.03(2H,q,J＝7.2Hz,OCH 2CH3)]与葡萄糖醛酸基上羰基碳δ168.7(C-6″)的 HMBC相关，提示葡萄糖醛酸6位羧基与乙醇成酯。由葡萄糖醛酸基端基氢信号δ5.01(1H,d, J＝7.3Hz,H-1″)与δ144.8(C-3′)的HMBC相关，提示黄酮母核的3位被酯化的葡萄糖醛酸基糖苷化。葡萄糖醛酸基端基碳的化学位移δ101.8和端基氢的偶合常数7.3Hz，提示葡萄糖醛酸基的端基氢的相对构型为β型。将化合物I酸水解并进行高效液相色谱分析，葡萄糖醛酸基的绝对构型确定为D型。化合物I的1H NMR和13C NMR数据根据HSQC谱和HMBC谱进行归属，具体见Table 1。因此，化合物Ⅰ被确定为5,7,4′-三羟基-3-甲氧基黄酮-3′-O-β-D- 葡萄糖醛酸苷-6″-乙酯，命名为桃儿七酮苷A(sinoflavonoidg A)，分子结构式为：
Table 1.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments for I.
化合物Ⅱ，黄色粉末，盐酸-镁粉反应呈阳性，提示可能为黄酮类化合物。HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z 529.0956[M﹢Na]+(calcd for C23H22O13Na,529.0958)，确定分子式为 C23H22O13。IR(KBr,cm-1)显示该化合物具有游离羟基(3354cm-1)，羰基(1743、1659cm-1)，苯环(1613cm-1)。UV(λmax)显示该化合物具有黄酮醇骨架(269，354nm)。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)显示与4位羰基缔合的5位酚羟基质子信号δ12.64(1H,s)；两个甲氧基氢信号δ3.77 (3H,s)，3.67(3H,s)；一个葡萄糖醛酸端基氢信号δ5.03(1H,d,J＝7.3Hz)；一组1,3,4-三取代苯信号δ7.81(1H,d,J＝2.1Hz)、7.00(1H,d,J＝8.6Hz)、7.68(1H,dd,J＝8.6,2.1Hz)；一组1,2,3,5-四取代苯信号δ6.20(1H,d,J＝2.0Hz)、6.42(1H,d,J＝2.0Hz)。13CNMR(125MHz, DMSO-d6)显示含有23个碳原子，除了两个甲氧基的碳信号δ59.5、52.0，一组葡萄糖醛酸基碳信号δ101.7、71.5、74.9、73.0、75.3、169.2之外，还给出12个芳香碳信号，1个羰基碳信号δ177.9，两个与氧相连的烯碳信号δ154.8、137.8，以上碳谱数据进一步表明化合物Ⅱ为糖苷化的黄酮醇衍生物。通过δ3.77(3H,s)与δ137.8(C-3)的远程相关，表明苷元为3-甲氧基槲皮素。由甲氧基δ3.67(3H,s)与葡萄糖醛酸基上羰基碳δ169.2(C-6″)的HMBC相关，提示葡萄糖醛酸6位羧基与甲醇成酯。由葡萄糖醛酸基端基氢信号δ5.03(1H,d,J＝7.3Hz,H-1″) 与δ144.8(C-3′)的HMBC相关，提示黄酮母核的3位被酯化的葡萄糖醛酸基糖苷化。葡萄糖醛酸基端基碳的化学位移δ101.7和端基氢的偶合常数7.3Hz，提示葡萄糖醛酸基的端基氢的相对构型为β型。将化合物Ⅱ酸水解并进行高效液相色谱分析，葡萄糖醛酸基的绝对构型确定为D型。化合物Ⅱ的1H NMR和13C NMR数据根据HSQC谱和HMBC谱进行归属，具体见Table 2。因此，化合物Ⅱ被确定为5,7,4′-三羟基-3-甲氧基黄酮-3′-O-β-D-葡萄糖醛酸苷-6″- 甲酯，命名为桃儿七酮苷B(sinoflavonoidg B)，分子结构式为：
Table 2.NMR(500MHz,DMSO-d6)assignments forⅡ.
二、抗氧化活性
用无水乙醇配置0.1mmol/L的DPPH溶液，避光保存。将50μL的DPPH溶液与等体积不同浓度的待测样品溶液充分混匀，室温下暗处静置30min，在517nm处测定其吸光度。DPPH自由基清除能力用IC50值表示。结果见Table 3。
Table 3.化合物Ⅰ和Ⅱ对DPPH自由基清除能力
三、细胞毒活性
1.实验材料
人宫颈癌细胞株HeLa由中国医学科学院药物研究所提供，胎牛血清购自Gibco公司。
2.细胞培养
HeLa细胞培养于含有10％经加热灭活的胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中，将培养瓶置于37℃，5％CO2饱和湿度培养箱培养，每1～2天换培养液一次。当细胞生长到足以覆盖瓶底壁的大部分表面时，用0.25％胰蛋白酶消化，传代。
3.MTT法
对数生长期细胞培养于96孔培养板内，每孔100μL(含4000个肿瘤细胞)，置37℃、5％ CO2温箱中培养。次日，给药组加入含有不同浓度的测试化合物的稀释液，设4-5个剂量组，每组至少设五个平行孔。对照组加入与给药组等体积的溶剂。置37℃、5％CO2温箱中培养。 2天后弃培养液，每孔加50μL(1mg/ml)MTT溶液(培养基配置)。37℃孵育4小时，弃去上清液，每孔加入DMSO 200μL溶解甲簪颗粒，轻度振荡溶解。用酶标仪，在检测波长490nm 条件下测定光密度值(OD)，以溶剂对照处理的细胞为对照组，用下面公式计算药物对细胞的抑制率，根据计算得到的各浓度的抑制率通过SPSS 13.0软件处理得到半数抑制浓度(IC50)，重复测试3次，取平均值为最终结果。
4.实验结果
通过MTT法采用人宫颈癌细胞株HeLa对桃儿七酮苷A和B(sinoflavonoidgs A和B)进行细胞毒活性测试，结果见Table 4。
Table 4.化合物Ⅰ和Ⅱ对HeLa细胞的细胞毒活性
由上述实验表明，本发明制备出的桃儿七酮苷A(Sinoflavonoidgs A)和桃儿七酮苷B (Sinoflavonoidgs B)对DPPH自由基具有清除能力，可作为抗氧化剂，对人宫颈癌细胞HeLa 具有细胞毒活性，具有制备临床上抗宫颈癌药物的前景，可用于制备抗宫颈癌药物，开拓了小叶莲的药用价值和商业价值，为制备抗氧化剂和治疗宫颈癌提供了新的药物，经济和社会效益显著。

Claims (7)

1.一种从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，所述的该黄酮苷类化合物为桃儿七酮苷A和桃儿七酮苷B，其分子结构式为：
其提取方法是：
以小叶莲药材6-9kg为原料，以2–5倍原料重量、体积比为75％–95％的乙醇加热回流提取3次，提取温度为90–95℃，每次提取时间为1.5–2小时，减压回收乙醇得浸膏状乙醇提取物，混悬于2–3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2–3.2L，时间为1.5–2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用9.1–13L洗脱液，流速为10–15mLmin-1，每350–500ml体积为一流份，收集260个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为30–50mL/h，每6–12mL为一流份、收集24个流份，各个流份分别经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B。
2.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，将小叶莲药材9kg为原料，以18L、体积比为95％乙醇加热回流提取3次，提取温度为95℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于3.2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次3.2L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用13L洗脱液，流速为15mLmin-1，每500ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为50mL/h，每12mL为一流份、收集24个流份，各个流份分别经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B。
3.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，将小叶莲药材6kg为原料，以30L、体积比为75％乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用9.1L洗脱液，流速为10mLmin-1，每350ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为30mL/h，每6mL为一流份、收集24个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B。
4.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，将小叶莲药材8kg为原料，以24L、体积比为85％乙醇加热回流提取3次，提取温度为92℃，每次提取时间为1.5小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.8L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2.8L，时间为1.5小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用11.7L洗脱液，流速为13mLmin-1，每450ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为45mL/h，每10mL为一流份、收集24个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B。
5.根据权利要求1所述的从小叶莲中提取黄酮苷类化合物的方法，其特征在于，将小叶莲药材7kg为原料，以28L、体积比为75％乙醇加热回流提取3次，提取温度为90℃，每次提取时间为2小时，减压回收乙醇，得浸膏状乙醇提取物，混悬于2.4L的蒸馏水中，依次以石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取3次，每次2.4L，时间为2小时；将乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱色谱初步分离，依次用体积比为100:0、100:5、100:7、100:10、100:30、100:50、100:70、100:100、100:200、0:100的石油醚-丙酮混合溶剂系统进行梯度洗脱，每一梯度用10.4L洗脱液，流速为12mLmin-1，每400ml体积为一流份，收集260个流份、各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，分别以体积比1:1的石油醚-丙酮和体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份1–35、流份36–85、流份86–104、流份105–115、流份116–132、流份133–144、流份145–157、流份158–163、流份164–170、流份171–182、流份183–188、流份189–195、流份196–204、流份205–208、流份209–234、流份235–260，得到组份Fr.1-Fr.16；将组分Fr.15经Sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，甲醇洗脱，流速为37mL/h，每8mL为一流份、收集24个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，用GF254薄层板，以体积比5:1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10:90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3–5min，根据薄层色谱检测结果，分别合并流份5–17、流份18–24，得到2个亚组分Fr.15-1，Fr.15-2；将亚组分Fr.15-2经制备高效液相色谱分离，色谱柱为YMC-Pack ODS-A，再以体积比为55:45的甲醇-水混合溶液洗脱，流速为7mL/min，收集保留时间为40min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷A，收集保留时间为48min的色谱峰，得到化合物桃儿七酮苷B。
6.权利要求1-5所述方法从小叶莲中提取的桃儿七酮苷A、桃儿七酮苷B在制备抗氧化剂中的应用。
7.权利要求1-5所述方法从小叶莲中提取的桃儿七酮苷A、桃儿七酮苷B在制备抗人宫颈癌细胞HeLa药物中的应用。
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