CN114605422A - 一对对映体生物碱二聚体类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一对对映体生物碱二聚体类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物提取技术领域，提供一对对映体生物碱二聚体类化合物及其制备方法和应用。所述化合物为下式(I)所示化合物。制备方法为：获得岩黄连提取物；岩黄连提取物溶于酒石酸溶液，过滤将滤液用乙酸乙酯萃取；将乙酸乙酯萃取后留下的酸水液调pH成碱性，用二氯甲烷萃取，浓缩得二氯甲烷部位；将二氯甲烷部位上硅胶柱层析，以洗脱剂进行梯度洗脱，收集含式(I)化合物的目标馏分，目标馏分依次用反相色谱柱、葡聚糖凝胶柱、制备液相进行分离，得目标化合物；通过手性柱对目标化合物进行拆分，得对映体生物碱二聚体类化合物。本发明所得化合物具有体外抗肿瘤活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。

Description

一对对映体生物碱二聚体类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及药物提取分离技术领域，具体涉及一对对映体生物碱二聚体类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
肿瘤是仅次于心血管疾病严重威胁人类生命健康的疾病。肿瘤能感染几乎每一个人体组织，给医学技术带来很大的挑战。肿瘤最基本特征是细胞失控性生长，缺乏细胞变异调控抑制从而使得肿瘤细胞能入侵自身组织和器官。一系列的证据表明化学治疗仍然是目前治疗肿瘤最为有效的方式之一。然而，天然产物是药物先导化合物的重要源泉，其结构的多样性、新颖性和生物活性一直以来都是人们关注的焦点。迄今为止，以天然产物为基础开发成药物的比例较高，这促使科学家寻找具有更高选择性、更强疗效和安全性的新型天然产物抗肿瘤药物。
岩黄连Corydalis saxicola Bunting，属于紫堇属罂粟科，为多年生草本植物，别名石生黄堇。本品性凉、味苦，有清热解毒、利湿止之功效。岩黄连是黔桂高寒山区珍贵的草药，其主要分布于甘肃、湖北、广西、四川、贵州、云南等地，为我国传统民间草药。全草皆可入药，长期以来直在黔桂地区被广泛应用于治疗热毒痈疮、急性腹痛、急性黄疸型肝炎。此外，临床上将岩黄连及其制剂(注射液)用于肝炎、肝硬化、肝癌等，疗效显著。
随着岩黄连应用的日益广泛，国内学者陆续开展了对该植物进行基础性研究。现代药理学研究表明岩黄连总生物碱具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫、保肝等多种生理活性。自从对岩黄连进行研究以来，已从岩黄连中分离鉴定出多种化学成分，包括生物碱、酰胺、黄酮类、甾体等等。其中生物碱类为主要化学成分，其药理作用最为显著，具有较强的抗肿瘤活性，可抑制肿瘤细胞株的增值，诱导肿瘤细胞的凋亡和抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。
生物碱二聚体类化合物是从岩黄连中首次分离得到。虽然有大量研究报道生物碱从岩黄连中分离得到，但目前还未见有从岩黄连中分离得到生物碱二聚体类化合物的相关报道。
发明内容
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一对对映体生物碱二聚体类化合物及其制备方法和应用，本发明所得化合物具有体外抗肿瘤活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一对对映体生物碱二聚体类化合物，所述化合物为下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0003349866070000021
本发明还提供上述对映体生物碱二聚体类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)以岩黄连为原料，提取获得岩黄连提取物；
(2)将岩黄连提取物溶于质量分数为3％的酒石酸溶液，滤去不溶物A后将滤液用乙酸乙酯萃取，分离得乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃取后留下的酸水液；
(3)将乙酸乙酯萃取后留下的酸水液调pH成碱性，用二氯甲烷萃取，浓缩得到纯化后的二氯甲烷部位；
(4)将纯化后的二氯甲烷部位上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂或者是以石油醚和丙酮组成的洗脱剂作为溶剂体系进行梯度洗脱，对馏分进行分析检测，收集含式(I)所示化合物的目标馏分，所得含目标化合物的目标馏分依次用反相色谱柱、葡聚糖凝胶柱、制备液相进行分离，即得到目标化合物；
(5)通过手性柱对目标化合物进行拆分，即得到所述对映体生物碱二聚体类化合物。
上述制备方法中，步骤(1)中所述的岩黄连为紫堇属罂粟科植物Corydalissaxicola Bunting，优选地上部分为原料。
上述制备方法中，获得岩黄连提取物的方法与现有技术相同，具体可以是以岩黄连为原料，提取所用的溶媒为氯仿、丙酮、体积浓度为70-100％甲醇或体积浓度为75-95％乙醇。提取的方式具体可以是现有常规的常温浸提、加热提取、超声波提取或回流提取等。
上述制备方法中，步骤(2)中当浸膏溶于3％的酒石酸溶液后，调节浸膏溶液的pH＝2～3；滤去不溶物A后滤液用乙酸乙酯萃取的次数为2-4次。
上述制备方法中，步骤(3)中所述调pH成碱性是将pH值调为8～12，优选为PH＝8～11，更优选为pH＝9～10，所述二氯甲烷萃取的次数为2-4次。
上述制备方法中，步骤(4)中，硅胶柱层析时，当所用的洗脱剂由二氯甲烷和甲醇组成时，按照二氯甲烷和甲醇按体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1进行梯度洗脱；当洗脱剂由石油醚和丙酮组成时，二氯甲烷和甲醇按体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1的梯度洗脱；每500ml馏分进行收集，对馏分进行分析检测。每个梯度浓度的洗脱剂体积为柱体积的3倍，优选为4倍。
上述制备方法中，步骤(5)所得含目标化合物的目标馏分依次用反相色谱柱、葡聚糖凝胶柱、制备液相进行分离时，它们所用的洗脱剂优选为：
在用反相色谱柱分离时，洗脱剂由甲醇和水按不同的体积比组成的，按甲醇含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的梯度洗脱，每200ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；或者洗脱剂是由乙腈和水按按不同的体积比组成的，按乙腈含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％进行梯度洗脱，每200ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份。
在用葡聚糖凝胶柱分离时，洗脱剂为甲醇，每30ml馏分进行收集，对馏分进行检测；
在用制备液相分离时，流速为8mL/min，检测波长为210nm，流动相为甲醇：水：二乙胺的体积比为6：4：0.01，收集保留时间为28.3min的色谱峰；或者流动相为甲醇：水：二乙胺的体积比为5：5：0.01，收集保留时间为24.3min的色谱峰。
上述制备方法中，步骤(4)对馏分进行分析检测时，检测手段可以是TLC,优选为HPLC,更优选为HPLC-MS。
上述制备方法中，步骤(5)中，进行所述手性拆分时，手性拆分的流动相为体积比是62：38的正己烷和异丙醇，采用等度洗脱方式；或者流动相为体积比是10：90～40：60的正己烷和异丙醇；或者流动相为体积比是10：90～40：60的正己烷：乙醇；流动相流速为0.7mL/min，色谱柱温度为30℃，检测波长为210nm。
本发明还保护上述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还保护上述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分制备的抗肿瘤药物。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明提供了一对结构新颖的对映体生物碱二聚体类化合物，以及它的制备方法和应用，该化合物的制备方法简单易操作。通过考察该化合物对多种肿瘤的抑制作用，结果表明该化合物具有体外抗肿瘤活性，具有较好的潜在药用价值，有望用于各种抗肿瘤药物的制备。
具体实施方式
为了更清楚地表达本发明，以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
对映体生物碱二聚体类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取岩黄连干燥全株部分10kg，粉碎，用体积浓度为70％甲醇为溶媒，回流提取3次，合并提取液，减压回收溶剂，得到岩黄连提取物浸膏0.9kg；
(2)将岩黄连提取物浸膏溶于质量分数为3％的酒石酸溶液，调节浸膏溶液的pH＝2；滤去不溶物A后将滤液用乙酸乙酯萃取2次，减压浓缩回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物；
(3)将步骤(2)乙酸乙酯萃取后留下的酸水液用饱和的碳酸钠溶液调pH为8，用二氯甲烷萃取2次，浓缩回收溶剂，得到纯化后的二氯甲烷部位；
(4)将纯化后的二氯甲烷部位上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂进行梯度洗脱，按照二氯甲烷和甲醇按体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1进行梯度洗脱，每500ml馏分进行收集，分段收集样品，以TLC进行划段合瓶得到12段馏分，之后用HPLC-UV和HPLC-MS分析检测，发现第8段为含目标化合物的馏分；收集含式(I)所示化合物的目标馏分，所得含目标化合物的目标馏分用反相色谱柱分离，洗脱剂由甲醇和水按不同的体积比组成的，按甲醇含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的梯度洗脱，每200ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；再用葡聚糖凝胶柱分离，洗脱剂为甲醇，每30ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；然后再用制备液相进行分离，流速为8mL/min，检测波长为210nm，流动相为甲醇：水：二乙胺的体积比为6：4：0.01，收集保留时间为28.3min的色谱峰；即得到目标化合物；
(5)通过手性柱对目标化合物进行拆分，手性拆分的流动相为体积比是62：38的正己烷和异丙醇，采用等度洗脱方式；流动相流速为0.7mL/min，色谱柱温度为30℃，检测波长为210nm，即得到所述对映体生物碱二聚体类化合物。
对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物(±)-Corysaxicolaine A。
实施例2
对映体生物碱二聚体类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取岩黄连干燥全株部分10kg，粉碎，用体积浓度为100％的甲醇常温浸提3次，每次3h，合并提取液，减压回收溶剂，得到岩黄连提取物浸膏；
(2)将岩黄连提取物浸膏溶于质量分数为3％的酒石酸溶液，调节浸膏溶液的pH＝2.5；滤去不溶物A后将滤液用乙酸乙酯萃取3次，减压浓缩回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物；
(3)将步骤(2)乙酸乙酯萃取后留下的酸水液用饱和的碳酸钠溶液调pH为9，用二氯甲烷萃取3次，浓缩回收溶剂，得到纯化后的二氯甲烷部位；
(4)将纯化后的二氯甲烷部位上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂进行梯度洗脱，按照二氯甲烷和甲醇按体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1进行梯度洗脱，每500ml馏分进行收集，用HPLC-UV和HPLC-MS分析检测，收集含式(I)所示化合物的目标馏分，所得含目标化合物的目标馏分用反相色谱柱分离，洗脱剂是由乙腈和水按不同的体积比组成的，按乙腈含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％进行梯度洗脱，每200ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；再用葡聚糖凝胶柱分离，洗脱剂为甲醇，每30ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；然后再用制备液相进行分离，流速为8mL/min，检测波长为210nm，流动相为甲醇：水：二乙胺的体积比为5：5：0.01，收集保留时间为24.3min的色谱峰，即得到目标化合物；
(5)通过手性柱对目标化合物进行拆分，手性拆分的流动相为体积比是10：90～40：60的正己烷和异丙醇；流动相流速为0.7mL/min，色谱柱温度为30℃，检测波长为210nm，即得到所述对映体生物碱二聚体类化合物。
对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物(±)-Corysaxicolaine A。
实施例3
对映体生物碱二聚体类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)取岩黄连干燥全株部分10kg，粉碎，用氯仿为溶媒超声波提取，减压回收溶剂，得到岩黄连提取物浸膏；
(2)将岩黄连提取物浸膏溶于质量分数为3％的酒石酸溶液，调节浸膏溶液的pH＝3；滤去不溶物A后将滤液用乙酸乙酯萃取4次，减压浓缩回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物；
(3)将步骤(2)乙酸乙酯萃取后留下的酸水液用饱和的碳酸钠溶液调pH为12，用二氯甲烷萃取4次，浓缩回收溶剂，得到纯化后的二氯甲烷部位；
(4)将纯化后的二氯甲烷部位上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂进行梯度洗脱，按照二氯甲烷和甲醇按体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1进行梯度洗脱，每500ml馏分进行收集，用HPLC-UV和HPLC-MS分析检测，收集含式(I)所示化合物的目标馏分，所得含目标化合物的目标馏分用反相色谱柱分离，洗脱剂由甲醇和水按不同的体积比组成的，按甲醇含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的梯度洗脱，每200ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；再用葡聚糖凝胶柱分离，洗脱剂为甲醇，每30ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；然后再用制备液相进行分离，流速为8mL/min，检测波长为210nm，流动相为甲醇：水：二乙胺的体积比为6：4：0.01，收集保留时间为28.3min的色谱峰，即得到目标化合物；
(5)通过手性柱对目标化合物进行拆分，手性拆分的流动相为体积比是10：90～40：60的正己烷：乙醇，采用梯度洗脱方式；流动相流速为0.7mL/min，色谱柱温度为30℃，检测波长为210nm，即得到所述对映体生物碱二聚体类化合物。
对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物(±)-Corysaxicolaine A。
实施例4
重复实施例1，不同的是：将步骤(1)中的提取溶媒由体积浓度为70％甲醇更改为体积浓度为75％的乙醇。
对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物(±)-Corysaxicolaine A。
实施例5
重复实施例1，不同的是：将步骤(1)中的提取溶媒由体积浓度为70％甲醇更改为体积浓度为95％的乙醇，提取方式采用加热提取，温度为60℃，提取时间为3h。
对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物(±)-Corysaxicolaine A。
实施例6
重复实施例1，不同的是：将步骤(1)中的提取溶媒由体积浓度为70％的甲醇更改为丙酮。
对所得产物用NMR及HRESIMS等进行结构分析，确定为目标化合物(±)-Corysaxicolaine A。
二、产品的确认
实施例1-6所得产物经NMR和HRESIMS等进行结构分析，波谱数据如下所示；并用HPLC分析检测，化合物的纯度>95％。
化合物1：
UV(DMSO)λmax(logε)283.2(3.63),326.3(3.38)nm；
1H NMR(400MHz,DMSO,25℃)δH 7.10(1H,d,J＝8.2Hz,H-9),7.59(1H,d,J＝8.2Hz,H-10),7.84(1H,d,J＝8.7Hz,H-11)and 7.48(1H,d,J＝8.7Hz,H-12),7.18(1H,s,H-1),7.23(1H,s,H-4),5.99(1H,s),5.94(1H,s),6.07(2H,s),2.88(3H,s),7.71(1H,s,H-1'),7.02(1H,s,H-4'),9.05(1H,s,H-8'),6.23(1H,s,H-11'),8.46(1H,s,H-13'),3.08(2H,t,J＝6.0Hz,H-5'),4.54(2H,m,H-6'),3.20(3H,s,OMe-2'),3.89(3H,s,OMe-10')；
13C NMR(100MHz,DMSO,25℃)δC 104.1(C-1),147.2(C-2),147.7(C-3),99.6(C-4),126.8(C-4a),140.3(C-4b),56.0(C-6),114.5(C-6a),144.9(C-7),147.7(C-8),107.9(C-9),116.5(C-10),126.6(C-10a),124.1(C-10b)，120.0(C-11),123.8(C-12),130.5(C-12a),101.0(-OCH2O-),101.5(-OCH2O-),42.5(-NMe)；111.3(C-1'),146.5(C-2'),149.5(C-3'),111.7(C-4'),126.1(C-4'a),27.0(C-5'),52.7(C-6'),145.9(C-8'),121.3(C-8'a),166.5(C-9'),147.2(C-10'),122.7(C-11'),109.3(C-12'),130.8(C-12'a),113.6(C-13'),113.9(C-13'a),120.5(C-13'b),55.8(OMe-3',10').
HRESIMS m/z 655.2043[M+H]+(calcd.for C39H31N2O8 +,655.2075)。
因此，可确定上述化合物1(±)-Corysaxicolaine A其结构式如下述式(I)所示：
Figure BDA0003349866070000081
三、产品抗肿瘤作用研究
以临床使用的肿瘤治疗药物羟基喜树碱为阳性对照药,以空白培养基作阴性对照,以MGC-803(人胃癌细胞),HepG2(肝癌细胞),A549(肺癌细胞),T24(膀胱癌细胞)，SKOV3(卵巢癌细胞)为受试细胞株用法对化合物进行了体外抗肿瘤活性测试。
将受试药物和细胞共同培养48h，根据预实验细胞生长速率的结果，接种一定密度的细胞190μL于96孔培养板约(5×104～1×105个/孔)。
培养24h待细胞贴壁后，分别加入系列浓度的样品10μL，每个样品设5个复孔,其中乙醇终浓度＜1％，另设阴性对照孔4个，加入10μL空白基质。
细胞于饱和湿度、5％CO2，37℃条件下孵化48h，每孔加入10μL MTT(5mg/ml)，继续培养4h。
吸去上清液，加入DMSO 150μL/孔,充分溶解后用酶标仪在测定波长为570nm和参考630nm处测定OD值，计算每个给药孔细胞增殖抑制率，并计算其IC50值，结果如下述表1所示：
表1：
Figure BDA0003349866070000082
由表1可知，本发明所述化合物对多种肿瘤细胞均有良好的抑制作用，表明本发明所述化合物具有良好的抗肿瘤作用，有望用于抗肿瘤药物的制备。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (10)

1.一对对映体生物碱二聚体类化合物，其特征在于：所述化合物为下式(I)所示化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FDA0003349866060000011
2.权利要求1所述对映体生物碱二聚体类化合物的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)以岩黄连为原料，提取获得岩黄连提取物；
(2)将岩黄连提取物溶于质量分数为3％的酒石酸溶液，滤去不溶物A后将滤液用乙酸乙酯萃取，分离得乙酸乙酯萃取物和乙酸乙酯萃取后留下的酸水液；
(3)将乙酸乙酯萃取后留下的酸水液调pH成碱性，用二氯甲烷萃取，浓缩得到纯化后的二氯甲烷部位；
(4)将纯化后的二氯甲烷部位上硅胶柱层析，以二氯甲烷和甲醇组成的洗脱剂或者是以石油醚和丙酮组成的洗脱剂作为溶剂体系进行梯度洗脱，对馏分进行分析检测，收集含式(I)所示化合物的目标馏分，所得含目标化合物的目标馏分依次用反相色谱柱、葡聚糖凝胶柱、制备液相进行分离，即得到目标化合物；
(5)通过手性柱对目标化合物进行拆分，即得到所述对映体生物碱二聚体类化合物。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的提取所用的溶媒为氯仿、丙酮、体积浓度为70-100％的甲醇或体积浓度为75-95％的乙醇，提取采用的具体方式为常温浸提、加热提取、超声波提取或回流提取。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，当浸膏溶于3％的酒石酸溶液后，得浸膏溶液的pH＝2-3；滤去不溶物A后滤液用乙酸乙酯萃取的次数为2-4次。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中，所述调pH成碱性是用饱和碳酸钠溶液将pH值调为9～10，所述二氯甲烷萃取的次数为2-4次。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(4)中，硅胶柱层析时，当所用的洗脱剂由二氯甲烷和甲醇组成时，二氯甲烷和甲醇按体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1进行梯度洗脱；当洗脱剂由石油醚和丙酮组成时，二氯甲烷和甲醇按体积比为100：1，80：1，50：1，40：1，30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，5：1，2：1，1：1进行梯度洗脱；每500ml馏分进行收集，对馏分进行分析检测。
7.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于：步骤(4)中，在用反相色谱柱分离时，洗脱剂由甲醇和水按不同的体积比组成的，按甲醇含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％的梯度洗脱，每200ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；或者洗脱剂是由乙腈和水按按不同的体积比组成的，按乙腈含量为20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％进行梯度洗脱，每200ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；
在用葡聚糖凝胶柱分离时，洗脱剂为甲醇，每30ml馏分进行收集，对馏分进行检测，收集目标馏份；
在用制备液相分离时，流速为8mL/min，检测波长为210nm，流动相为甲醇：水：二乙胺的体积比为6：4：0.01，收集保留时间为28.3min的色谱峰；或者流动相为乙腈：水：二乙胺的体积比为5：5：0.01，收集保留时间为24.3min的色谱峰。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)中，进行所述手性拆分时，手性拆分的流动相为体积比是62：38的正己烷和异丙醇，采用等度洗脱方式；或者流动相为体积比是10：90～40：60的正己烷和异丙醇；或者流动相为体积比是10：90～40：60的正己烷：乙醇；流动相流速为0.7mL/min，色谱柱温度为30℃，检测波长为210nm。
9.权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.以权利要求1所述化合物或其药学上可接受的盐为活性成分制备的抗肿瘤药物。
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