CN105330588A - 马齿苋中新生物碱Oleracone及其提取分离方法 - Google Patents

马齿苋中新生物碱Oleracone及其提取分离方法 Download PDF

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Abstract

马齿苋中新生物碱Oleracone及其提取分离方法，从马齿苋干燥药材中，用水煎煮提取，过滤，合并滤液，加热浓缩；经大孔吸附树脂除杂，分别以水与乙醇梯度洗脱，对乙醇洗液进行减压浓缩；对浓缩液再用乙酸乙酯萃取，减压回收乙酸乙酯；所得提取物经硅胶柱层析分离，依次用石油醚-丙酮梯度洗脱得到130个部位，将90-130部位洗脱物减压浓缩；再经ODS中压柱以甲醇-水等度洗脱得到10个部位，将部位3减压浓缩，经Sephadex？LH-20以甲醇-水等度洗脱，即得新骨架生物碱化合物，经波谱解析、化学方法和X射线单晶衍射实验确定结构式，并命名为Oleracone。采用本发明提取分离方法制备的马齿苋新生物碱Oleracone，可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料。

Description

马齿苋中新生物碱Oleracone及其提取分离方法
技术领域
本发明涉及中药提取、分离领域，尤其涉及一种从马齿苋药材中提取、分离和鉴别出的新骨架生物碱及其提取分离方法。
背景技术
马齿苋（PortulacaoleraceaL.）为马齿苋科植物，2015版《中华人民共和国药典》中收载马齿苋的干燥地上部分入药，具有清热解毒、凉血止血、止痢等功效，用于热毒血痢、痈肿疔疮、湿疹、丹毒、蛇虫咬伤、便血、痔血、崩漏下血等。现代药理学研究表明，马齿苋具有抗菌抗病毒、降血压、降血脂、抗氧化、抗癌、松弛骨骼肌和平滑肌、消炎止痛、调节免疫功能等作用；这些药理作用与其主要化学成分包括黄酮类、香豆素、萜类、甾类、生物碱、氨基酸、各种色素类和矿物质类等有很大关系。其中生物碱是马齿苋中一类主要的化学成分，马齿苋中含有去甲肾上腺素、多巴胺、少量多巴、腺苷、尿嘧啶、腺嘌呤、N，N-二环己基脲、尿囊素、N-反式-阿魏酰基酪胺；还有环二肽生物碱和酰胺类生物碱：马齿苋酰胺A、B、C、D、E、F、G、H（OleraceinA-H）等。但是，对本发明中马齿苋新骨架化合物的分离和药理活性研究未见报道。
目前，从马齿苋中分离出的化学成分大多数是已知的，并且是药理活性比较弱的，因此对马齿苋中新化合物的开发和分离是亟待需要的。
发明内容
针对上述问题，本发明提供一种简便、环保、快速，纯度高的马齿苋中新生物碱Oleracone及其提取分离方法。
为实现本发明的上述目的，本发明提供一种马齿苋中新生物碱，分子式为C14H17NO2，命名为Oleracone，化学结构式如下。
本发明还提供一种马齿苋中新生物碱Oleracone的提取分离方法，包括以下步骤。
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液过滤，合并滤液直接浓缩，得药液备用。
步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的大孔吸附树脂吸附除杂，分别以水和乙醇洗脱，对乙醇洗脱液进行减压浓缩，得到浓缩液备用。
步骤3、将步骤2中浓缩液用乙酸乙酯反复多次萃取，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。
步骤4、将步骤3中乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析分离，依次用石油醚-丙酮梯度洗脱得到130个洗脱部位，按顺序记为洗脱部位1-130，经薄层色谱进行检测，显色，合并90-130洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用。
步骤5、将步骤4中所得物再经ODS柱层析分离，用甲醇-水（30/70，v/v）等度洗脱，得到10个洗脱部位，按顺序记为部位1-10，经薄层色谱进行检测，显色，将洗脱部位3减压浓缩至干，得浓缩物备用。
步骤6、将步骤5中所得浓缩物经SephadexLH-20（羟丙基葡聚糖凝胶），以甲醇-水（50/50，v/v）等度洗脱得到新骨架生物碱化合物。
本发明马齿苋中新生物碱Oleracone在制备抗炎药物中的应用。
与现有技术相比本发明的有益效果。
本发明提供的马齿苋中新生物碱Oleracone及其提取分离方法，依次用水煎煮提取、大孔吸附树脂、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、ODS中压柱和SephadexLH-20，成功的分离出马齿苋新骨架生物碱，这种化合物可以作为其他化合物合成先导物，以及新药开发和药理活性研究的原料，也可用于制备抗炎药物。
附图说明
图1为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的结构式。
图2为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的IR谱图。
图3为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的质谱谱图。
图4为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的13C谱图。
图5为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的1H谱图。
图6为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的DEPT谱图。
图7为本发明X射线单晶衍射谱图。
图8为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的H-HCOSY谱图。
图9为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的HSQC谱图。
图10为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的NOESY谱图。
图11为本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的HMBC谱图。
图12为oleracone对LPS刺激RAW264.7细胞产生NO的抑制作用示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步详细说明本发明。
本实施例提供一种马齿苋中新生物碱Oleracone，分子式为C14H17NO2，命名为Oleracone，结构式请参阅图1。
请参阅图2-11，本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的结构鉴定与推导。
黄色粉末，易溶于氯仿和甲醇，不溶于水。喷稀碘化铋钾试液呈阳性反应，[α]20 D+5.2(c0.6,MeOH)，UV(MeOH)λmax:360,255nm，IRνN-H3425.8，ν=C-H3193.8，νC-H2949.8，νC=O1700.2，νC=C1590.1，β NH1548.4，δ NH1506.8，ESI-MS给出M/Z：232.1326[M+H]+的准分子离子峰，分子量为231.1255。结合13CNMR，1HNMR以及DEPT数据，推测该化合物分子式为C14H17N02，不饱和度为7。根据13CNMR谱和DEPT谱显示14个碳信号，分别为4个伯碳（23.25，29.28，29.28，30.52），一个仲碳（48.35）和两个叔碳（127.1,137.2），7个季碳（171.3，205.5，149.0，158.4，126.5，126.7，59.78）。根据分子式计算，新生物碱的不饱和度为7。新生物碱的1H-NMR低场区有2个烯氢信号：7.09（1H,s），6.86（1H,s），结合13C-NMR谱、DEPT谱，提示具有2个-CH=C-结构片段。1H-NMR高场区δ1.40（6H,s）显示磁等同的两个甲基信号。13C-NMR中δ205.5及171.3为两个羰基信号。对化合物进行X单晶衍射分析，确定其上述结构。其1H-NMR及13C-NMR归属如表1所示，经文献检索，未见报道，是一种新骨架生物碱化合物，命名为Oleracone。
表1：马齿苋中新生物碱化合物的核磁数据。
序号 δC 类型 δH（J in Hz）
1 - NH 1.86（1H,bs）
2 59.78 C -
3 48.35 CH2 3.17（2H,s）
4 137.2 CH 7.09（1H,s）
5 158.4 C -
6 149.0 C -
7 127.1 CH 6.86（1H,s）
8 171.3 C -
9 126.5 C -
10 126.7 C -
11 29.28 CH3 1.40（3H,s）
12 29.28 CH3 1.40（3H,s）
13 23.25 CH3 2.22 （3H,s）
14 205.5 C -
15 30.52 CH3 2.48（3H,s）
本实施例还提供一种马齿苋中新生物碱Oleracone的提取分离方法，包括以下步骤。
步骤1、称取马齿苋干燥药材50kg，采用水煎煮提取，水的用量为药材用量的8-16倍，煎煮提取两次，每次2h，水提液过滤，合并滤液直接浓缩，得药液备用。
步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的AB-8或D101大孔吸附树脂吸附除杂，分别以水和50%乙醇洗脱，对50%乙醇洗脱液进行减压浓缩，得到浓缩液备用。所述水的洗脱除杂用量为2-3个柱体积，所述50%乙醇的洗脱用量为冲至颜色变浅为止。所述大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过24小时，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。
步骤3、将步骤2中浓缩液用乙酸乙酯反复3次萃取，40℃以下减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物。所述乙酸乙酯与浓缩液的用量比为1:1（v:v）。
步骤4、将步骤3中乙酸乙酯萃取物干法上样，经硅胶柱层析分离，所述硅胶为200-400目，依次用石油醚-丙酮（1:1，1:2，1:3，1:5，v:v）梯度洗脱得到130个洗脱部位，按顺序记为洗脱部位1-130，经薄层色谱进行检测，显色，合并90-130洗脱部位，将合并后的洗脱部位经40℃以下减压浓缩至干，备用。
步骤5、将步骤4中所得物再经ODS中压柱（Octadecylsilyl，十八烷基硅烷键合硅胶填料，所述填料粒度为20-40μm）层析分离，用甲醇-水（30/70，v/v）等度洗脱，得到10个洗脱部位，按顺序记为部位1-10，经薄层色谱进行检测，显色，将洗脱部位3在50℃以下减压浓缩至干，得浓缩物备用。
步骤6、将步骤5中所得浓缩物经SephadexLH-20（羟丙基葡聚糖凝胶），以甲醇-水（50/50，v/v）等度洗脱，根据颜色黄色带接，得到本发明马齿苋新骨架生物碱化合物。经超高效液相色谱，归一法测定纯度均为90-99%。
本发明马齿苋中新生物碱Oleracone的抗炎作用。
1、实验原料及相关试剂、分组。
DMEM高糖培养基、胎牛血清购于美国Hyclone公司；LPS购于美国Sigma公司；Griess试剂购于碧云天生物技术有限公司。
分组：共分为三组，即对照组、LPS组和实验组。
2、利用格里斯（Griess）法测定NO的含量，考察本发明马齿苋中新生物碱oleracone对LPS诱导的小鼠巨噬细胞RAW264.7的NO产生量的抑制作用。小鼠巨噬细胞RAW264.7传代后在含10%胎牛血清的高糖细胞培养基DMEM中培养，实验组加入不同浓度的oleracone（1-50μM），在37℃，5%CO2条件下孵育1h后用LPS（终浓度为1μg/mL）诱导炎症反应，24h后收集上清液。Griess法测定细胞上清液中NO的含量，根据不同浓度马齿苋来源生物碱对LPS诱导的RAW264.7细胞释放NO的影响，用以反映NO水平，如图12所示，其中“+”表示有LPS，“-”表示没有LPS或生物碱。由图12可知，马齿苋新骨架生物碱oleracone能够抑制LPS诱导的RAW264.7细胞产生过量炎症介质NO。

Claims (6)

1.马齿苋中新生物碱Oleracone，其特征在于，分子式为C14H17NO2，命名为Oleracone，化学结构式为。
2.如权利要求1所述的马齿苋中新生物碱Oleracone的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、取马齿苋干燥药材，采用水煎煮提取，水提液过滤，合并滤液直接浓缩，得药液备用；
步骤2、将步骤1中所得药液直接经预处理过的大孔吸附树脂吸附除杂，分别以水和乙醇洗脱，对乙醇洗脱液进行减压浓缩，得到浓缩液备用；
步骤3、将步骤2中浓缩液用乙酸乙酯反复多次萃取，减压回收乙酸乙酯至浸膏，得到乙酸乙酯萃取物；
步骤4、将步骤3中乙酸乙酯萃取物经硅胶柱层析分离，依次用石油醚-丙酮梯度洗脱得到130个洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，合并90-130洗脱部位，将合并后的洗脱部位经减压浓缩至干，备用；
步骤5、将步骤4中所得物再经ODS柱层析分离，用甲醇-水（30/70，v/v）等度洗脱，得到10个洗脱部位，经薄层色谱进行检测，显色，将洗脱部位3减压浓缩至干，得浓缩物备用；
步骤6、将步骤5中所得浓缩物经SephadexLH-20（羟丙基葡聚糖凝胶），以甲醇-水（50/50，v/v）等度洗脱得到新骨架生物碱化合物。
3.如权利要求1所述的马齿苋中新生物碱Oleracone的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中水的洗脱除杂用量为2-3个柱体积，50%乙醇的洗脱用量为冲至颜色变浅为止。
4.如权利要求1所述的马齿苋中新生物碱Oleracone的提取分离方法，其特征在于，所述步骤2中大孔吸附树脂的预处理过程为乙醇浸泡过24h，上柱，用乙醇洗至滴入水中无混浊，再用水洗至无醇味。
5.如权利要求1所述的马齿苋中新生物碱Oleracone的提取分离方法，其特征在于，所述步骤3中乙酸乙酯与浓缩液的用量比为1:1。
6.如权利要求1所述的马齿苋中新生物碱Oleracone的提取分离方法，其特征在于，所述步骤4中石油醚-丙酮的用量为1:1、1:2、1:3、1:5。
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