CN112321664B - 提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从桦褐孔菌中提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法。本发明方法以异丙醇进行提取，提取液减压蒸馏后用石油醚萃取，再用C18制备色谱柱吸附，50‑100％乙醇(或甲醇)梯度洗脱后得桦褐孔菌醇。采用本发明方法得到的桦褐孔菌醇呈白色蓬松片晶状，纯度可达90％以上，具有耗时短、低毒性等优势，适于推广使用。

Description

提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法

技术领域

本发明涉及生物提取技术领域，具体涉及一种提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法。

背景技术

桦褐孔菌(Inonotus obliquus)属于真菌门、担子菌亚门、多孔菌科，主要分布在北半球气温较低的地区。在我国也主要分布在黑龙江、吉林(主要分布于长白山)等地。很早以前，人们就发现桦褐孔菌有着特殊的活性。人们用桦褐孔菌泡茶、煎煮慢慢地发现该真菌能够防治胃癌、肝癌、肠癌等多种癌症。桦褐孔菌醇(inotodiol)是桦褐孔菌特有的甾醇，体外实验发现桦褐孔菌醇不仅能抑制癌细胞的生长还能有效杀伤癌细胞。动物实验表明桦褐孔菌醇在体内有显著的促进抗肿瘤机制的发生的作用。有研究发现从桦褐孔菌中分离得到的四环三萜类物质桦褐孔菌醇可以通过细胞凋亡信号通路诱导小鼠体内白血病细胞的凋亡蛋白酶来发挥抗恶性细胞增值的作用。桦褐孔菌醇结构中22位碳上的-OH是桦褐孔菌醇发挥抗肿瘤活性的非常重要的活性基团。

目前，桦褐孔菌中甾醇化合物的提取方法主要为索氏提取法、有机溶剂浸提法、超声或微波辅助提取法等。桦褐孔菌醇的分离方法主要有硅胶柱层析反复分离法，高速逆流色谱分离法，高效液相色谱法。普通硅胶柱层析法，产品纯度高，但存在洗脱溶剂毒性强，过程繁琐，用时较长以及产量低等特点。高速逆流色谱法作为一种高效、方便方法被用于科研实验室分离药用植物、药用真菌的有效成分，但该法消耗有机溶剂多，难以放大规模进行工业化分离，使用有局限性。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了一种高提取率、高纯度的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法。本发明采用柱层析法提取，石油醚萃取，C18修饰硅胶柱层析分离桦褐孔菌醇，具有用时短，低毒性，高提取率，高纯度的特点。

本发明的通过如下技术方案实现：

本发明提供一种提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，所述方法包括以下步骤：

S1、将桦褐孔菌子实体粉碎后按一定料液比加入异丙醇溶液预浸泡，随后加入层析柱中，采用异丙醇溶液洗脱得到提取液；

S2、将提取液减压浓缩，采用石油醚萃取，得干粉；

S3、将干粉上样层析柱，采用甲醇或乙醇溶液梯度洗脱，收集主要洗脱峰；

S4、洗脱峰减压回收后，浓缩液冷冻干燥得桦褐孔菌醇冻干粉。

在一些实施方式中，所述S1中的异丙醇溶液均为100％的异丙醇溶液。

在一些实施方式中，所述S1中所述料液比为1kg:1～5L，优选为1kg:1L。

在一些实施方式中，所述S1中所述预浸泡时间为0.5～1h，优选为0.5h。

在一些实施方式中，所述S1中洗脱流速为1BV/h，总洗脱时间为2h。

在一些实施方式中，所述S1中所述层析柱为普通硅胶层析柱，优选的，所述层析柱的柱直径：柱床高度＝1:5。

在一些实施方式中，所述S2为将提取液50～55℃(优选50℃)减压回收异丙醇后浓缩，用纯水洗涤悬浮浓缩物后加入等体积的石油醚萃取3次，每次30min，合并上层石油醚相，55～60℃(优选60℃)减压回收石油醚得干粉。

在一些实施方式中，所述S3中干粉装入上样柱的上样量为柱填充质量的5～10％，优选为5％。

在一些实施方式中，所述S3中层析柱填料为C18修饰硅胶，优选的硅胶为球形，粒径为20～45μm；

在一些实施方式中，所述S3中层析柱的柱直径与柱床高度比为1:10～1:30，优选为1:10。

在一些实施方式中，所述S3中梯度洗脱采用以下梯度甲醇或乙醇溶液洗脱，具体见表1：

表1:

时间(min)	水的比例(％)	甲醇或乙醇的比例(％)
			0	50	50
12	50	50
			72	0	100
108	0	100
			120	50	50

。

在一些实施方式中，所述S3中梯度洗脱以5BV/h的流速洗脱2h，收集100％甲醇或乙醇洗脱时的主要洗脱峰。

在一些实施方式中，所述S4中洗脱峰在60℃减压回收甲醇或乙醇，浓缩液-80℃冷冻干燥得桦褐孔菌醇冻干粉。

本发明提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法相对于现有技术具有以下有益效果：

1)本发明通过条件参数的选择和优化，获得一种提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，该方法以100％异丙醇为提取溶剂，将桦褐孔菌粉碎后加入异丙醇进行预浸泡，随后装入层析柱中进行提取得到提取液，经浓缩后通过石油醚萃取得到桦褐孔菌醇粗体物，粗提物通过C18修饰的硅胶柱层析分离可得高纯度桦褐孔菌醇。相比传统的有机溶剂提取-硅胶柱层析分离，本发明的方法实现桦褐孔菌醇的提取纯度达90％以上。

2)通过本发明的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，提取得到的桦褐孔菌醇质量高，呈蓬松晶状。

3)本发明的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，通过柱层析提取，相比常规提取法有效减少了提取溶剂的消耗，节约成本。

4)本发明采用C18修饰的硅胶柱层析分离桦褐孔菌醇，相比传统硅胶柱层析分离，有效缩短了分离时间，仅需2h内即可完成分离，显著提高了桦褐孔菌的纯度，可应用于大规模生产。

5)区别于现有技术中广泛采用的氯仿或乙酸乙酯等的层析洗脱方式，本发明洗脱溶剂为无毒性的乙醇，也可用低毒性的甲醇，有效避免了氯仿等高毒性、高挥发性有机试剂的使用，更符合产业化应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1不同提取溶剂对桦褐孔菌醇及多酚提取率的影响；

图2不同萃取溶剂中桦褐孔菌醇的HPLC检测：A为粗提物；B为石油醚萃取物；C为乙酸乙酯萃取物；D为正丁醇萃取物；

图3不同萃取物中桦褐孔菌醇的纯度；

图4普通硅胶柱层析与C18修饰硅胶柱层析分离桦褐孔菌醇：A普通硅胶柱层析；BC18修饰硅胶柱层析；

图5为提取分离纯化桦褐孔菌醇的流程图；

图6为柱层析提取桦褐孔菌醇检测图；

图7为桦褐孔菌异丙醇提取物HPLC图；

图8为石油醚萃取相的HPLC检测图；

图9为C18修饰硅胶柱层析纯化的桦褐孔菌醇的HPLC检测图；

图10为桦褐孔菌醇MS检测图；

图11为桦褐孔菌醇NMR检测图；

图12为桦褐孔菌醇冻干粉。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明而提供。这些定义不应被理解为具有小于本领域技术人员所理解的范围。

除非在下文中另有定义，本发明具体实施方式中所用的所有技术术语和科学术语的含义意图与本领域技术人员通常所理解的相同。虽然相信以下术语对于本领域技术人员很好理解，但仍然阐述以下定义以更好地解释本发明。

如本发明中所使用，术语“包括”、“包含”、“具有”、“含有”或“涉及”为包含性的(inclusive)或开放式的，且不排除其它未列举的元素或方法步骤。术语“由…组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中某一组被定义为包含至少一定数目的实施方案，这也应被理解为揭示了一个优选地仅由这些实施方案组成的组。

在提及单数形式名词时使用的不定冠词或定冠词例如“一个”或“一种”，“所述”，包括该名词的复数形式。

本发明中的术语“大约”、“大体”表示本领域技术人员能够理解的仍可保证论及特征的技术效果的准确度区间。该术语通常表示偏离指示数值的±10％，优选±5％。

此外，说明书和权利要求书中的术语第一、第二、第三、(a)、(b)、(c)以及诸如此类，是用于区分相似的元素，不是描述顺序或时间次序必须的。应理解，如此应用的术语在适当的环境下可互换，并且本发明描述的实施方案能以不同于本发明描述或举例说明的其它顺序实施。

本发明所述的一种提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，是基于100％异丙醇为提取溶剂，将桦褐孔菌粉碎后加入异丙醇进行预浸泡，随后装入层析柱中进行提取得到提取液，经浓缩后通过石油醚萃取得到桦褐孔菌醇粗体物，粗提物再通过C18修饰的硅胶柱层析分离可得高纯度桦褐孔菌醇。

可以理解，本发明的方法核心是基于特定浓度的异丙醇粗提取、石油醚萃取以及C18修饰硅胶柱梯度层析完成，过程中的某些参数或条件可以是常规或本领域经实验可优化的。不作限制，如下提供本一种本发明较优选的一种提取分离纯化桦褐孔菌醇方法，以用于更好的解释本发明。

S1、将桦褐孔菌子实体粉碎后加入异丙醇(料液比为1kg:1L)，浸泡0.5h后加入层析柱中(柱直径：柱床高度＝1:5)，采用异丙醇以1BV/h流速洗脱2BV，得到提取液(1BV为1个柱体积)；

S2、将提取液50℃减压回收异丙醇后浓缩，用纯水洗涤悬浮浓缩物后加入等体积的石油醚萃取3次，每次30min，合并上层石油醚相，30℃减压回收石油醚得浓缩液；

S3、干粉装入上样柱中(上样量为5％柱填料质量)，上样柱连接C18修饰硅胶(球形，粒径为20～45μm)填充的层析柱(柱直径：柱床高度＝1:10)。采用以下梯度甲醇(或乙醇)溶液以5BV/h的流速洗脱2h，收集100％甲醇(或乙醇)洗脱时的主要洗脱峰。

S4、100％乙醇(或甲醇)洗脱峰在60℃减压回收乙醇(或甲醇)后，浓缩液-80℃冷冻干燥得桦褐孔菌醇冻干粉。

此外，本发明实施例中所使用的实验材料、试剂等均是本领域可通过商购获得。

实验例提取方法优化设计

1.提取溶剂对桦褐孔菌醇提取率的影响

分别称取S1中粉碎后的桦褐孔菌粉4份，每份660g，分别加入660mL的甲醇、乙醇异丙醇和丙酮，浸泡0.5h后分别装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以1.08L/h的流速用对应溶剂洗脱1h，收集洗脱液1.08L，HPLC检测不同提取液中桦褐孔菌醇的浓度，利用福林酚比色法测量不同提取液中多酚的浓度。桦褐孔菌醇提取率(％)＝[桦褐孔菌醇浓度(mg/mL)×洗脱液体积(mL)×100]/桦褐孔菌粉质量(g)。多酚提取率(％)＝[多酚浓度(mg/mL)(以没食子酸计)×洗脱液体积(mL)×100]/桦褐孔菌粉质量(g)。

从图1中可见，采用异丙醇对桦褐孔菌粉提取后，桦褐孔菌醇的提取率显著高于采用乙醇、丙酮作为提取溶剂，与采用甲醇作为提取溶剂时的提取率接近为1.25mg/g，但采用异丙醇作为提取溶剂，副产物多酚的提取率仅为0.96mg/g显著低于采用甲醇作为提取溶剂时的2.44mg/g，减少了多酚对后续桦褐孔菌醇纯化的干扰。综上所述，异丙醇作为提取溶剂提取桦褐孔菌粉，具有较高的桦褐孔菌醇提取率和较低的杂质干扰。

2.不同萃取溶剂对桦褐孔菌醇纯度的影响

称取S1中粉碎后的桦褐孔菌分660g，加入660mL的异丙醇，浸泡0.5h后装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以1.08L/h的流速用异丙醇洗脱1h，收集洗脱液1.08L，将提取液于50℃下减压浓缩为洗脱液体积的1/2，即540mL，分别取180mL浓缩液装入3只500mL分液漏斗中，向3只漏斗中分别加入等体积的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇，剧烈震荡混匀5分钟后，静置25分钟使溶剂分层，收集上层溶剂。重复萃取3次，合并萃取液，旋蒸回收萃取溶剂后，用少量甲醇溶解萃取物上HPLC检测。萃取物中桦褐孔菌醇纯度(％)＝[桦褐孔菌醇浓度(mg/mL)×萃取物甲醇溶液体积(mL)]×100/萃取物质量(mg)。

由图2可见，相比其它萃取溶剂，石油醚可有效富集粗提液中的桦褐孔菌醇组分。正丁醇萃取效果最差，经HPLC检测未发现明显的甾醇化合物色谱峰。

而且由图3可见，粗提物经石油醚萃取后，桦褐孔菌醇纯度由15.8％上升到19.1％。粗提物经石油醚萃取可显著提高桦褐孔菌醇纯度，为后续分离工作奠定基础。

3.不同分离柱对桦褐孔菌醇纯化的影响

取200mg石油醚萃取物干法上样装入普通硅胶(球形，粒径为45～75μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表2所示的梯度以石油醚：乙酸乙酯混合溶液1BV/h的流速洗脱4h，收集各主要洗脱峰上HPLC检测。

表2普通硅胶层析柱分离桦褐孔菌醇的石油醚：乙酸乙酯洗脱梯度

取200mg石油醚萃取物干法上样装入C18修饰硅胶(球形，粒径为20～45μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表1所示的梯度配制梯度乙醇溶液以1BV/h的流速洗脱层析柱2h，收集各主要洗脱峰上HPLC检测。

从图4可见，采用常规普通硅胶柱层析分离石油醚萃取物时，洗脱耗时达240分钟，色谱峰分离度较低，且峰型较杂。采用C18修饰硅胶柱层析分离石油醚萃取物时，耗时大为缩短，仅需120分钟，且色谱峰分离度较高，出现明显的桦褐孔菌醇洗脱峰。洗脱试剂为无毒性的乙醇。

通过综合优化，确立本发明的最优提取流程，具体参见图5。

实施例1桦褐孔菌醇分离纯化例

S1、将干燥至恒重的桦褐孔菌粉粉碎成粒度为40目的粗粉备用。称取S1中粉碎后的桦褐孔菌分660g，加入660mL的异丙醇，浸泡0.5h后装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以一个柱体积1.08L/h的流速用异丙醇洗脱2h，收集洗脱液2.16L，将提取液于50℃下减压浓缩得干粉10.89g，HPLC进行定性检测。

S2、用500mL纯水重悬干粉，然后悬浮液加入500mL的石油醚萃取30分钟，收集上层石油醚相。萃取三次，每次30分钟。合并三次石油醚相共计1.5L，60℃减压回收石油醚得干粉4.5g，HPLC进行定性检测。

S3、干粉装入上样柱中，上样柱连接C18修饰硅胶(球形，粒径为20～45μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表1所示的梯度以乙醇溶液5BV/h的流速洗脱2h，收集100％乙醇洗脱时的主要洗脱峰，体积为624mL，HPLC进行定性检测。

S4、100％乙醇洗脱峰在60℃减压回收乙醇后，浓缩液-80℃冷冻干燥得桦褐孔菌醇冻干粉623.6mg。

结果表明：

图6为实施例1提取桦褐孔菌醇的检测图，图中有两种检测结果，210nm波长下检测的洗脱峰和254nm波长下检测的洗脱峰。210nm和254nm均为萜类化合物常用的检测波长。从图6可见桦褐孔菌三萜类化合物在20～100min的范围内被有效洗脱。

图7为实施例1的柱层析提取桦褐孔菌醇的HPLC检测图(HPLC条件为：LC-20AT高效液相色谱仪，InertSustain C18柱(3.0×100mm,3μm),检测温度为室温，流速为1ml/min；流动相A相为超纯水，B相为乙腈；洗脱梯度为0～5min,30％B；5～25min,50％B；25～35min,90％B；35～40min,90％B；40～45min,30％B；45-50min,30％B)，从图7可见HPLC图谱中有5个明显的洗脱峰，其中峰高最高的为桦褐孔菌醇。

图8为实施例1的提取方法得到的桦褐孔菌醇石油醚萃取物的HPLC的谱图(HPLC条件为：LC-20AT高效液相色谱仪，InertSustain C18柱(3.0×100mm,3μm),检测温度为室温，流速为1ml/min；流动相A相为超纯水，B相为乙腈；洗脱梯度为0～5min,30％B；5～25min,50％B；25～35min,90％B；35～40min,90％B；40～45min,30％B；45～50min,30％B)，从图8可见有5个明显的洗脱峰，其中峰高最高的为桦褐孔菌醇，对比图7发现经过石油醚萃取后实现了桦褐孔菌醇的有效富集。

图9为实施例1的提取方法得到的精制桦褐孔菌醇的HPLC的谱图(HPLC条件为：LC-20AT高效液相色谱仪，InertSustain C18柱(3.0×100mm,3μm),检测温度为室温，流速为1ml/min；流动相A相为超纯水，B相为乙腈；洗脱梯度为0～5min,30％B；5～25min,50％B；25～35min,90％B；35～40min,90％B；40～45min,30％B；45～50min,30％B)，图中只剩2个明显的洗脱峰，其中主要峰为桦褐孔菌醇，另一洗脱峰为残留的杂质，桦褐孔菌醇的纯度达到91％。

图10为桦褐孔菌醇的MS鉴定图。将C18修饰硅胶柱层析分离得到的桦褐孔菌醇洗脱峰旋干后取一部分溶于色谱甲醇后通过SHIMADZU LC-MS 8050液质联用仪进行检测。由图可以看出分子离子的最高峰为425.45。桦褐孔菌醇的分子量为442。质谱中的最高峰可能为桦褐孔菌醇加氢在脱掉一分子水的分子量，即(M+H-H2O)。该质谱图中的另外一个特征峰为407.45，该分子量可能为桦褐孔菌醇加氢后脱掉两分子水的分子量，即(M+H-2H2O)。

图11为桦褐孔菌醇的NMR鉴定图。将C18修饰硅胶柱层析分离得到的桦褐孔菌醇洗脱峰旋干后取一10mg溶于DMSO-D6后通过BRUKER AVANCE III核磁共振仪进行¹³C谱分析。由图可以看桦褐孔菌醇的碳原子的化学位移为13C NMR(DMSO-D6,600MHz):18.95(C-6),20.50(C-11),23.99(C-30),25.61(C-20),26.03(C-12),26.87(C-23),27.57(C-2),28.95(C-7),30.52(C-15,C-16),35.20(C-1),36.55(C-10),38.51(C-4),44.30(C-13),46.82(C-17),48.93(C-14),50.05(C-5),72.00(C-22),76.77(C-3),133.46(C-8),134.43(C-9)。

图12为最终获得的桦褐孔菌醇冻干粉，从图12中可知实施例1提取得到的桦褐孔菌醇样品呈白色蓬松针晶状，其纯度达90％以上。

实施例2桦褐孔菌醇分离纯化例

S1、将干燥至恒重的桦褐孔菌粉粉碎成粒度为40目的粗粉备用。称取S1中粉碎后的桦褐孔菌分660g，加入660mL的异丙醇，浸泡0.5h后装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以1.08L/h的流速用异丙醇洗脱1h，收集洗脱液1.08L，将提取液于50℃下减压浓缩得干粉10.89g，

S2、用500mL纯水重悬干粉，然后悬浮液加入500mL的石油醚萃取30分钟，收集上层石油醚相。萃取三次，每次30分钟。合并三次石油醚相共计1.5L，60℃减压回收石油醚得干粉4.5g。

S3、干粉装入上样柱中，上样柱连接C18修饰硅胶(球形，粒径为20-45μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表1所示的梯度以甲醇溶液5BV/h的流速洗脱2h，收集100％甲醇洗脱时的主要洗脱峰，体积为624mL。

S4、100％甲醇洗脱峰在60℃减压回收乙醇后，浓缩液-80℃冷冻干燥得桦褐孔菌醇冻干粉554.5mg。

实施例3桦褐孔菌醇分离纯化例

S1、将干燥至恒重的桦褐孔菌粉粉碎成粒度为40目的粗粉备用。称取S1中粉碎后的桦褐孔菌分660g，加入1320mL的异丙醇，浸泡1h后装入60.6mm×374mm(直径×高度)的层析柱中，以1.08L/h的流速用异丙醇洗脱2h，收集洗脱液1.08L，将提取液于55℃下减压浓缩得干粉10g。

S2、用500mL纯水重悬干粉，然后悬浮液加入500mL的石油醚萃取30分钟，收集上层石油醚相。萃取三次，每次30分钟。合并三次石油醚相共计1.5L，57℃减压回收石油醚得干粉4.0g。

S3、干粉装入上样柱中，上样柱连接C18修饰硅胶(球形，粒径为20-45μm)填充的层析柱(柱直径×柱床高度＝36.6mm×366mm)。按表1所示的梯度以乙醇溶液5BV/h的流速洗脱2h，收集100％乙醇洗脱时的主要洗脱峰，体积为624mL。

S4、100％乙醇洗脱峰在60℃减压回收乙醇后，浓缩液-80℃冷冻干燥得桦褐孔菌醇冻干粉500.1mg。

前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。

Claims (14)

1.一种提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将桦褐孔菌子实体粉碎后按一定料液比加入异丙醇溶液预浸泡，随后加入层析柱中，采用异丙醇溶液洗脱得到提取液；

S2、将提取液减压浓缩，石油醚萃取，得干粉；

S3、将干粉上样层析柱，采用甲醇或乙醇溶液梯度洗脱，收集主洗脱峰；

S4、洗脱峰减压回收，浓缩液冷冻干燥得桦褐孔菌醇冻干粉；

所述S1中的异丙醇溶液均为100％的异丙醇溶液；

所述S3中层析柱填料为C18修饰硅胶。

2.如权利要求1所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S1中所述料液比为1kg:1～5L；所述预浸泡时间为0.5～1h。

3.如权利要求2所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S1中所述料液比为1kg:1L；所述预浸泡时间为0.5h。

4.如权利要求3所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S1中，所述洗脱的流速为1BV/h，总洗脱时间为2h。

5.如权利要求1-2任一所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S1中，所述层析柱的柱直径：柱床高度＝1:5。

6.如权利要求1-2任一所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S2中提取液减压浓缩为提取液50～55℃减压回收异丙醇后浓缩，所述石油醚萃取为石油醚萃取3次。

7.如权利要求6所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述石油醚萃取为用纯水洗涤浓缩物后加入等体积的石油醚萃取3次，每次30min，合并上层石油醚相，55～60℃减压回收石油醚得干粉。

8.如权利要求1-2任一所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S3中干粉的上样量为柱填充质量的5-10％。

9.如权利要求8所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S3中干粉的上样量为柱填充质量的5％。

10.如权利要求1-2任一所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述硅胶为球形，粒径为20-45μm；所述层析柱的柱直径与柱床高度比为1:10～1:30。

11.如权利要求10所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述层析柱的柱直径与柱床高度比为1:10。

12.如权利要求1-2任一所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S3中梯度洗脱采用以下梯度甲醇或乙醇溶液洗脱:

时间(min) 水的比例(％) 甲醇或乙醇的比例(％) 0 50 50 12 50 50 72 0 100 108 0 100 120 50 50

。

13.如权利要求12所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S3中梯度洗脱以5BV/h的流速洗脱2h，收集100％甲醇或100％乙醇洗脱时的主洗脱峰。

14.如权利要求13所述的提取分离纯化桦褐孔菌醇的方法，其特征在于：所述S4中洗脱峰在60℃减压回收甲醇或乙醇，浓缩液-80℃冷冻干燥得桦褐孔菌醇冻干粉。

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