WO2019225783A1 - 이노토디올 화합물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents

이노토디올 화합물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDF

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WO2019225783A1
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inotodiol
compound
chaga
allergy
prevention
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황인규
김영호
민 뉴엣 뉴엔티
강종성
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충남대학교산학협력단
(주)카보엑스퍼트
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    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of allergic diseases comprising chaga mushroom extract or inotodiol compound containing an Inotodiol compound as an active ingredient.
  • allergens that cause allergic reactions are called allergens.
  • allergens include pollen, drugs, vegetable fibers, bacteria, food, dyes, and chemicals.
  • Type I hypersensitivity reactions are allergic hypersensitivity reactions, which are mediated by specific IgE antibodies, in which specific IgE antibodies bind to the surface receptors of mast cells or basophils, resulting in various mediators in the cell. They are secreted out of the cell, causing immediate hypersensitivity reactions such as asthma, allergic rhinitis and anaphylaxis.
  • Type II hypersensitivity reactions are mediated by specific IgG antibodies and are initiated by antibodies that react with antigenic components on the cell surface.
  • Type III hypersensitivity is a reaction in which the antigen and the antibody form a complex in the state of high antigen, activating complement, resulting in cytotoxicity.
  • type IV hypersensitivity is a cell mediated hypersensitivity mediated by T cells.
  • mast cells are the main cells that cause allergic reactions, which are activated through the combination of IgE (immunoglobulin E) and allergens, and secrete various mediators to cause mucosal edema, bronchial smooth muscle contraction, and increased mucus secretion. Contribute to the reaction.
  • IgE immunoglobulin E
  • mast cells are known to play an important role in maintaining and defending the immune system in the human body by being located in the tissues surrounding the respiratory, digestive, genitourinary, dermis, and blood vessels (Rivera, J., et al., 2008; Moon, TC, et al., 2010; Blank, U., et al., 2013; Boyce, JA, 2004).
  • Mast cells produce and secrete mediators that cause allergic inflammatory reactions by external stimuli. These mediators are preformed mediators that have been produced and stored in granules before stimulation and newly synthesized mediators after stimulation (Schwartz, LB, et al., 1998). .
  • mast cells Within the granules of mast cells, histamine, proteoglycan, serine-proteases, carboxypeptidase A, sulfatases, exoglycosidase, etc. It is already created and exists, and when stimulated, these substances are released out of the cell.
  • Mast cells is the most important substance secreted by a newly-created after the stimulation Araki donik acid as a metabolite derived from (arachidonic acid), prostaglandin D 2 (prostagliadin D 2, PGD 2) and leukotriene C 4 (leukotriene C 4, LTC 4 ), LTD 4 , and LTE 4 .
  • PAF platelet activating factor
  • mast cells have been found to be not only limited to early allergic reactions but also deeply involved in late and chronic allergic reactions. That is, TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ ) produced and secreted from mast cells increases the expression of adhesion molecules of vascular endothelial cells to target organs of eosinophils and T lymphocytes. Promotes the influx of In addition, IL (interleukin) -4, IL-13, IL-6 produced in mast cells increases the response of T2 (T helper type 2, Th2) cells, which in turn increases the production of IgE, which leads to chronic allergic reactions. Contribute. As such, mast cells play a central role in inducing and sustaining allergic inflammatory responses (Ahn, 2004).
  • TNF- ⁇ tumor necrosis factor- ⁇
  • mast cell stabilizers that inhibit degranulation of mast cells as a treatment for allergic diseases.
  • Mast cell stabilizers have the advantage of being able to obtain the effects of antihistamine and anti-leukotriene at the same time by inhibiting degranulation of mast cells.
  • chromone-based substances such as chromoglycate and nedocromil have been developed as stabilizers for mast cells, they are used due to the inconvenience of use and the ambiguity of mechanism due to low bioavailability during oral administration. This is limited (Finn, DF, et al., 2013). Therefore, the development of a new concept of mast cell stabilizer, which is mast cell selective, excellent efficacy and safe.
  • Chaga ( Inototus) obliquus and Chaga mushrooms belong to Basidiomycota's Aphyllophorales, Hypnenochaetaceae, Russia's Siberia, Finland, Norway, Ukraine, Japan's Hokkaido and Korea's Odaesan Mountain. It is a mushroom native to the trunks and stumps of birch, alder and rowan in the cold and humid northern hemisphere. Chaga is a white rot fungus that breaks down lignin, cellulose, hemicellulose, etc. Known (Guk MH, et al., 2013).
  • the present inventors improve and treat the symptoms caused by allergy in a mouse model in which an inotodiol compound isolated from chaga mushroom extract or a chaga mushroom extract containing the same as an active ingredient induces food allergy and improves immune activity of mast cells.
  • the present invention was completed by confirming that there was an inhibitory effect.
  • Japanese Patent Laid-Open Publication No. 2006-347991 discloses that a mycelium-derived mushroom mycelium-derived material inhibits the release of histamine, which is a substance related to allergy, and is similar to the constitution of the present invention. Inotodiol compounds of are not described.
  • Korean Patent No. 1351054 describes that the atopic dermatitis therapeutic effect and chaga mushroom of the herbal composition comprising chaga mushroom helps to fundamentally treat atopic dermatitis by strengthening the overall immunity, but ino of the present invention Todiol compounds are not described.
  • Korean Patent Publication No. 2018-0003002 discloses that the inotodiol compound isolated from chaga extract has the effect of preventing or treating inflammation, but the allergy prevention or treatment of the present invention and the effect of inhibiting mast cell immune activity are not described at all. Not implied.
  • the present invention chaga mushroom containing an inotodiol (inotodiol) compound of the formula (1) as an active ingredient ( Inototus Obliquus ) relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergic diseases comprising an extract.
  • the chaga extract may be at least one selected from the group consisting of dichloromethane fraction or chloroform fraction obtained by adding dichloromethane or chloroform to the extract extracted with chaga mushroom as 70% ethanol as a solvent.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergic diseases comprising the inotodiol compound of Formula 1 as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition may inhibit degranulation of mast cells.
  • the allergy may be induced by at least one allergen selected from the group consisting of pollen, drugs, vegetable fibers, bacteria, foods, dyes and chemicals, preferably food-induced allergy.
  • the allergic disease may be at least one selected from the group consisting of urticaria, anaphylaxis, allergic rhinitis, bronchial asthma and atopic dermatitis.
  • the present invention is a chaga mushroom containing an inotodiol compound of Formula 1 as an active ingredient ( Inototus Obliquus ) relates to a dietary supplement for the prevention or improvement of allergic diseases comprising the extract.
  • the present invention also relates to a dietary supplement for the prevention or improvement of allergic diseases comprising the inotodiol compound of Formula 1 as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of allergic diseases, including chaga ( Inototus obliquus ) extract containing an inotodiol compound of Formula 1 as an active ingredient.
  • chaga Inototus obliquus
  • the chaga extract may be a fraction obtained by adding an organic solvent to the chaga extract extracted with 70% ethanol as a solvent.
  • the organic solvent is C1 to C4 lower alcohol, dichloromethane, chloroform, chloroform, ethyl acetate, ethyl acetate, diethylacetate, diethyl ether, acetone, hexane (hexane) may be one or more selected from the group consisting of. However, it is not limited thereto.
  • the lower alcohol of C1 to C4 may be methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol and the like.
  • the chaga extract is preferably at least one selected from the group consisting of dichloromethane fractions or chloroform fractions obtained by adding dichloromethane or chloroform to the extract extracted chaga mushroom with 70% ethanol as a solvent.
  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of allergic diseases comprising an inotodiol compound as an active ingredient.
  • the inotodiol compound may be synthesized according to a conventional method, may be prepared as a pharmaceutically acceptable salt, or may be separated and purified from chaga extract.
  • Inotodiol compounds isolated from the chaga can be purified using column chromatography.
  • the chromatography may include silica gel column chromatography, HP-20 column chromatography, RP-18 column chromatography, and LH-20 column chromatography. LH-20 column chromatography, and high-performance liquid chromatography can be used.
  • the allergy refers to a phenomenon in which a rapid reaction occurs in vivo by an antigen-antibody reaction through contact with an allergen, which is an allergen, and the allergen is pollen, drugs, vegetable fibers, bacteria, food, dyes, and chemicals. It may be at least one selected from the group consisting of, preferably food. However, it is not limited thereto.
  • the allergic disease is a disease caused by allergies
  • the main diseases are bronchial asthma, allergic rhinitis, atopic dermatitis, urticaria, food allergies, weakness, drug allergies, serum diseases, etc. to tissues causing allergens or allergic reactions According to different types of disease.
  • the allergic disease may be at least one selected from the group consisting of urticaria, anaphylaxis, allergic rhinitis, bronchial asthma and atopic dermatitis. However, it is not limited thereto.
  • the chaga mushroom extract containing the inotodiol compound or an active ingredient thereof may inhibit degranulation of mast cells.
  • allergen-inducing substances such as histamine, serine protase, proteoglycan, prostaglandin D 2 , and leukotriene are released to the outside of the cell, and this reaction is called degranulation of mast cells. do. Therefore, the degranulation inhibition of mast cells of the inotodiol compound or chaga mushroom extract containing the same as an active ingredient can prevent or treat allergy by inhibiting the secretion of allergen-stimulated substances causing allergic inflammatory response, which is called 'mast cell Stabilizer (mast cell stabilizer).
  • 'mast cell Stabilizer mast cell stabilizer
  • CD4 + T cells, CD8 + cells, B cells, macrophages and mast cells CD4 + T cells and CD8 + cells, B cells, macrophages While it has no effect on activity regulation, it selectively inhibits only degranulation of mast cells.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergic diseases, including chaga mushroom extract containing the inotodiol compound or an active ingredient thereof.
  • the pharmaceutical composition may include 0.001% by weight to 100% by weight of chaga mushroom extract containing an inotodiol compound or an inotodiol compound as an active ingredient.
  • compositions may be used in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, oral formulations, external preparations, suppositories, and sterile injectable solutions, respectively, according to a conventional method.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , Methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one chaga mushroom extract containing an inotodiol compound or an inotodiol compound of the present invention as an active ingredient.
  • excipients for example, starch, calcium carbonate, sucrose or lactose, gelatin and the like are mixed and prepared.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Oral liquid preparations include suspensions, solvents, emulsions, and syrups, and may include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations, suppositories.
  • the non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate and the like can be used.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the age, sex, weight of the subject to be treated, the specific disease or pathology to be treated, the severity of the disease or pathology, the route of administration and the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of skill in the art and generally dosages range from 0.01 mg / kg / day to approximately 2000 mg / kg / day. More preferred dosage is 1 mg / kg / day to 500 mg / kg / day. Administration may be administered once a day or may be divided several times. The dosage does not limit the scope of the invention in any aspect.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to mammals such as rats, livestock, humans, etc. by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or cerebrovascular injections. Since the compound of the present invention has little toxicity and side effects, it is a drug that can be used safely even when taken for a long time for the purpose of prevention.
  • the present invention provides a health functional food composition for the prevention or improvement of allergic diseases, including a chaga mushroom extract containing an inotodiol compound or an inotodiol compound as an active ingredient and a food supplement acceptable food supplement.
  • Chaga mushroom extract containing the inotodiol compound or inotodiol compound as an active ingredient may be added as 0.001 to 100% by weight to the health functional food composition of the present invention.
  • the health functional food of the present invention includes the form of tablets, capsules, pills or liquids, and the food to which the extract of the present invention can be added, for example, various foods, beverages, gums, teas, vitamin complexes Etc.
  • the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of allergic diseases comprising an inotodiol compound or chaga mushroom extract containing the same as an active ingredient, the innodiol compound or inotodiol compound in a mouse model induced food allergy Chaga mushroom extract containing as an active ingredient was confirmed that allergy symptoms are alleviated and treated, inhibiting the immune activity of mast cells.
  • chaga mushroom extract containing the inotodiol compound and the inotodiol compound of the present invention as an active ingredient is expected to have high utility as a preventive or therapeutic composition for allergic diseases.
  • Figure 1 shows the effect of allergy symptom improvement according to the food allergy induction and ino todiol compound and chaga mushroom fraction containing the same.
  • A shows changes in rectal temperature
  • B shows the degree of relief or treatment of anaphylaxis symptoms
  • C shows the score for diarrhea symptoms.
  • Figure 2 shows the change in the number of eosinophils infiltrated the small intestine (A) and mast cell number (B) in the small intestine according to food allergy induction and inotodiol compound and chaga mushroom fraction containing the same.
  • Figure 3 shows the change in serum concentrations of allergy-related IgE (A) and MCPT-1 (B) according to food allergy induction and inodidiol compound and chaga mushroom fraction containing the same.
  • Figure 4 shows the results of confirming the CD4 + T cell immune activity of food allergy induction and inotodiol compounds and chaga mushroom fraction containing the same
  • (A) is a cytokine IL produced by Th2 CD4 + T cells -13, changes in the expression levels of IL-5 and IFN- ⁇
  • (B) is the egg white albumin activation of CD4 + T cells expressing DO11.00 TCR, a T cell receptor specific for egg white albumin-derived peptides and It shows the result of confirming the degree of cell division accordingly.
  • Figure 5 shows the results of confirming the immune activity of the allergic induction and mast cells of the inotodiol compound and chaga mushroom fraction containing the same, the mouse induced the degranulation of mast cells through the passive systemic anaphylaxis method
  • the results show the changes in rectal temperature (A) and MCPT-1 in blood.
  • Inotodiol compounds of the present invention were isolated from Chaga ( Inonotus obliquus ) extract.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • the column was HECTOR-M C 18 (4.6 ⁇ 250mm, 5 ⁇ m particle size, RStech, Korea), the flow rate was 1mL / min, UV detection (210nm) to confirm the content of the inotodiol compound, 70% ethanol extract (EtOH Ext.) About 1%, dichloromethane fraction (CH 2 Cl 2 Frac.) 7.8%, ethyl acetate fraction (EtOAc Frac.) 0.9%, water fraction (H 2 O Frac.) It was confirmed that the content of the inotodiol compound was the lowest at 0.05%.
  • chloroform fraction fractionated using chloroform instead of dichloromethane in the fractionation solvent contained an inotodiol compound in an amount similar to the dichloromethane fraction.
  • the inotodiol compound was separated from the dichloromethane fraction of chaga obtained in Example 1-1.
  • the molecular formula was identified as C 30 H 50 O 2 by ESI-MS analysis and 13 C NMR data.
  • a food allergy model was prepared using chicken egg white albumin (ovalbumin) as an allergen (allergen).
  • mice 20 ⁇ g of egg white albumin was mixed with 2 mg of alum and injected twice per two weeks into the abdominal cavity of rats. Induction of food allergy caused an allergic reaction to occur by oral administration of 50 mg egg white albumin five times at three-day intervals two weeks after the second immunization injection.
  • the extracts, fractions, and inotodiol compounds of chaga obtained in Example 1 were orally administered to mice daily during egg white albumin administration.
  • the group of mice administered dexamethasone (dexamethasone) daily as a positive control group was used.
  • 50 mg egg white albumin alone or chaga extract, fraction or ethanodiol compound was administered, and allergic symptoms were observed after 1 hour.
  • Six mice were used per experimental group, and each experimental group is shown in Table 2 below.
  • Rectal temperature was measured by using the mice in each group to determine the change in rectal temperature following food allergy and drug treatment. Rectal temperature was measured by inserting the sensor tip of the rectal thermometer into the rectum, the results are shown in Figure 1 (A).
  • the allergy induction group (Allergy) was confirmed that the rectal temperature is lower than the normal group (Normal).
  • the rectal temperature was higher than the food allergy inducing group (Allergy).
  • the group treated with the dichloromethane fraction of the inotodiol compound and chaga was similar to the rectal temperature. It confirmed that it represents.
  • the rectal temperature of the Chaga mushroom water fraction (H 2 O Frac.) was similar to that of the food allergy inducing group.
  • the food allergy induction group (Allergy) had a higher anaphylaxis score compared to the normal group (Normal), while dexamethasone (Dexa.), Chaga ethanol extract (EtOH Ext.), And dichloro It was confirmed that the anaphylaxis score of the group treated with the methane fraction (CH 2 Cl 2 Frac.) And the Inotodiol compound was lower than the food allergy induction group. In particular, it was confirmed that the anaphylaxis score of the group treated with the dichloromethane fraction of chaga and the inotodiol compound was lower. Meanwhile, the water fraction of chaga (H 2 O Frac.) Showed an anaphylaxis score similar to that of the food allergy induction group.
  • the food allergy induction group (Allergy) was confirmed that the score for diarrhea symptoms is higher than the normal group (Normal).
  • the score for diarrhea symptoms in the group treated with dexamethasone (Dexa.) Or inotodiol compounds isolated from chaga (Inotodiol) and chaga dichloromethane fraction (CH 2 Cl 2 Frac.) Containing them was evaluated for food allergy. It was confirmed that the lower than the induction group.
  • the group treated with Chaga ethanol extract (EtOH Ext.) And water fraction (H 2 O Frac.) The diarrhea symptoms were lower than the Chaga dichloromethane fraction. It was confirmed that the level is similar.
  • the inotodiol compound isolated from chaga was one of the main active ingredients to alleviate allergic symptoms, and further, the inotodiol compound as part of the active ingredient Dichloromethane fractions and chloroform fractions of chaga were found to be effective in relieving allergic symptoms.
  • Eosinophils are known to play an important role in food allergies. That is, eosinophils cause allergic inflammation in the small intestine. By observing the eosinophil changes in the small intestine, it was confirmed the allergic prevention and treatment effect of the dichloromethane fraction of the inotodiol compound of the present invention and chaga mushroom containing the same.
  • Allergic reactions are due to the expression of IgE in response to allergens and by the binding of allergens to IgE, mast cells secrete granules associated with allergic inflammation, such as histamine, serine protease, and proteoglycan. Done. Therefore, in order to confirm the allergic prevention and treatment effect of the dichloromethane fraction of chaga mushroom containing inotodiol compound of the present invention and the same, MCPT-1 (mast cell protease-), which is a mouse specific serine protease in serum of IgE The concentration of 1) was measured.
  • MCPT-1 mass cell protease-
  • Serum was secured by collecting blood from mice one day after the last administration of 50 mg egg white albumin alone or Chaga mushroom extract, fraction or ethanodiol compound in Experimental Example 1. The obtained serum was diluted 100-fold and used.
  • Serum IgE concentration was measured using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit. 100 ⁇ l of carbonate coating buffer (pH9.5) containing 2 ⁇ g / ml of egg white albumin was added to a 96 well plate and coated by reacting at 4 ° C. overnight. After the reaction, the product was washed three times with washing buffer (0.05% tween 20 in PBS), and then 200 ⁇ l of PBS (phosphate buffered saline) containing 1% BSA (bovine serum albumin) was added per well to 1 at room temperature. Treated for hours and blocked and washed three times with wash buffer.
  • PBS phosphate buffered saline
  • BSA bovine serum albumin
  • the concentration of the serine protease MCPT-1 was used by using the mMCP-1 ELISA kit (eBioscience), and the measurement was carried out according to the method provided by the manufacturer, and the results were measured in FIG. 3 ( Shown in B).
  • the food allergy induction group (Allergy) compared to the normal group (Normal) increased the concentrations of IgE (3 (A)) and MCPT-1 (3 (B)) and egg protein-specific in serum, In the group treated with ethanol extract (EtOH Ext.) And dichloromethane fraction (CH 2 Cl 2 Frac.) Of chaga, both the concentrations of IgE and MCPT-1 were significantly decreased.
  • the concentrations of IgE and MCPT-1 were almost unchanged.
  • dexamethasone (Dexa.) And Inotodiol treatment the concentration of IgE was almost unchanged, but the concentration of MCPT-1 was found to decrease significantly.
  • Cytokines produced by Th2 T helper 2, Th2 CD4 + T cells are known to enhance the production of IgE and to promote differentiation of mast cells and eosinophils to aggravate allergic symptoms. In addition, it has anti-allergy effect that the case of the plant extracts that have been reported have the effect of inhibiting cytokine production in CD4 + T cell activation and Th2 CD4 + T cells at the same time the number of reports.
  • the expression level assay of cytokines produced by Th2 CD4 + T cells and Adoptive transfer experiments were performed using CD4 + TCR transgenic T cells expressing DO11.00 TCR, a T cell receptor (TCR) specific for egg white albumin-derived peptides.
  • cytokines In order to analyze the expression of cytokines, samples were treated in the same manner as in Experimental Example 1, and cells were separated from the mesenteric lymph nodes (mLN) of mice of each group one day later. At this time, dexamethasone was treated with 10 mg / kg, 20 mg / kg of imatinib (globec) used as a therapeutic agent for mast cell hyperplasia and 20 mg / kg of cholesterol similar in structure to the inotodiol compound Added. The separated cells were dispensed in a 96 well plate at 1 ⁇ 10 6 per well, followed by RPMI complete medium (10% fetal bovine serum (FBS), penicillin, streptomycin and glutamine containing egg white albumin).
  • FBS fetal bovine serum
  • RPMI medium or RPMI complete medium containing 100 ⁇ g / ml egg white albumin were added thereto, and then cultured in a cell incubator at 37 ° C. and 5% CO 2 for 3 days. After 3 days, the cell cultures were collected, and the amounts of IL-5, IL-13, and IFN- ⁇ secreted into the cell cultures were analyzed using an ELISA kit corresponding to each cytokine and an experimental method provided by the manufacturer. The results are shown in FIG. 4 (A).
  • the cells cultured in RPMI complete medium without egg white albumin had no or similar expression of IL-5, IL-13 and IFN- ⁇ in all groups. appear.
  • the cells cultured in RPMI complete medium containing egg white albumin (OVA), IL-5, IL-13 and IFN- ⁇ all increased significantly in the allergy induction group (Allergy).
  • OVA egg white albumin
  • IL-5, IL-13 and IFN- ⁇ all increased significantly in the allergy induction group (Allergy).
  • Chaga ethanol extract treated group EtOH Ext. It was confirmed that the amount of cytokines similar to the normal group (Normal).
  • DO11.00 TCR-expressing CD4 + T cells which are specific to egg white albumin-derived peptide of FIG. 4 (B)
  • DO11.00 TCR in the group (Allergy) to which egg white albumin was administered The CFSE fluorescence intensity of the expressing CD4 + T cells was significantly reduced compared to the cells in the egg white albumin non-immune group (Normal) and the number of CD4 + T cells was significantly increased, but Chaga ethanol extract (EtOH Ext.) And When treated with imatinib (Imat.), The fluorescence intensity of CFSE was not different compared to the non-immune group, and the number of cells did not increase.
  • the inotodiol compounds can treat more selective and safe allergic diseases by selectively inhibiting degranulation of mast cells.
  • the inotodiol compound of the present invention was added to the cooking seasoning at 1% by weight to prepare a cooking seasoning for health promotion.
  • inotodiol compound of the present invention 0.1% by weight of the inotodiol compound of the present invention was added to flour, and bread, cake, cookies, crackers and noodles were prepared using the mixture to prepare foods for health promotion.
  • Inotodiol compound of the present invention was added to the milk at 0.1% by weight, and the milk was used to prepare various dairy products such as butter and ice cream.
  • inotodiol compound of the present invention was added to 1,000 ml of apple juice or wine to prepare fruit juice for health promotion.

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Abstract

본 발명은 이노토디올 화합물 및 이노토디올 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯(Inototus obliquus) 추출물을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 식품 알레르기가 유도된 마우스 모델에 이노토디올 화합물 또는 이노토디올 화합물을 유효성분 중 하나로 함유하는 차가버섯 추출물을 투여하여 알레르기에 의한 증상들이 완화 및 치료되는 것을 확인함으로써, 본 발명의 이노토디올 화합물 및 이노토디올 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물이 알레르기 질환의 예방 또는 치료 조성물로써 활용 가치가 높을 것으로 기대된다.

Description

이노토디올 화합물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물
본 발명은 이노토디올(Inotodiol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물 또는 이노토디올 화합물을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
알레르기(allergy)는 과민반응(hypersensitivity)이란 뜻으로, 생물체가 어떤 외래성 물질과 접하면 항원-항체반응에 의하여 생체 내에서 급격한 반응이 일어나는 현상을 의미한다. 알레르기 반응을 유발하는 항원을 알레르겐(allergen)이라고 하며, 전형적인 알레르겐은 꽃가루, 약물, 식물성 섬유, 세균, 음식물, 염색약, 화학물질 등이 있다.
현대 문명의 발달과 더불어 각종 알레르겐에 노출될 기회가 많아지면서 알레르기 증상을 호소하는 환자가 급증하고 있다. 알레르기 환자는 선진화된 국가일수록 그 정도가 심한 것으로 파악되고 있으며, 우리나라의 경우에도 정확한 통계자료는 없으나 매년 그 환자수가 증가하고 특히, 소아환자의 수가 급증하고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 이유로 인해 국내외 유수의 제약회사나 연구기관 등에서 알레르기 질환에 의한 경제적, 생리적, 심리적 부담을 경감시킬 수 있는 원인적 치료제 개발에 많은 재원을 투자하고 있으나 아직까지 근원적 치료제 개발에는 미치지 못하고 있다.
지금까지 알려진 면역과민반응은, 크게 4가지 형태로 분류된다. I형 과민반응은 알레르기성 과민반응으로, 특이 IgE 항체에 의해 매개되는 과민반응으로, 특이 IgE 항체가 비만세포(mast cell) 또는 호염기성 세포(basophil)의 표면 수용체와 결합하여 세포 내의 다양한 매개물질들이 세포 밖으로 분비되어 천식, 알레르기성 비염, 아나필락시스 등의 즉시형 과민반응이 발생한다. II형 과민반응은 특이 IgG 항체에 의한 매개성 반응으로, 세포 표면에 있는 항원 성분과 반응하는 항체에 의해 시작되는 반응이다. III형 과민반응은 항원이 많은 상태에서 항원과 항체가 복합체를 형성하여 보체를 활성화시켜 세포 독성이 나타나는 반응이며, 마지막 IV형 과민반응은 T 세포에 의해 매개되는 세포 매개성 과민반응이다.
비만세포(mast cell)는 알레르기 반응을 일으키는 주요 세포로, IgE(immunoglobulin E)와 알레르겐의 결합을 통해 활성화 되고, 다양한 매개물질을 분비하여 점막부종, 기관지 평활근 수축, 점액 분비 증가 등을 일으킴으로서 알레르기 반응에 기여한다. 이러한 비만세포는 호흡기, 소화기, 비뇨생식기, 진피, 혈관을 둘러싸고 있는 조직에 위치하면서 인체에서 면역 계통 유지 및 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다(Rivera, J., et al., 2008; Moon, T.C., et al., 2010; Blank, U., et al., 2013; Boyce, J.A., 2004).
비만세포는 외부 자극에 의해 알레르기 염증 반응을 일으키는 매개물질을 생산, 분비하게 된다. 이러한 매개물질은 자극을 받기 전에 이미 생성되어 과립 내에 저장되어 있는 물질(preformed mediators)과 자극을 받은 후에 새롭게 생성, 유리되는 물질(newly synthesized mediators)이 있다(Schwartz, L.B., et al., 1998).
비만세포의 과립 내에는 히스타민(histamine), 프로테오글리칸(proteoglycan), 세린 프로타아제(serine-proteases), 카르복시펩티다아제 A(carboxypeptidase A), 설파타아제(sulfatases), 엑소글리코시다아제(exoglycosidase) 등이 이미 생성되어 존재하고 있으며, 자극을 받으면 이러한 물질들이 세포 외부로 유리된다. 비만세포가 자극을 받은 후 새롭게 생성하여 분비하는 가장 중요한 물질은 아라키도닉산(arachidonic acid)으로부터 유래된 대사산물로, 프로스타글란딘 D2(prostagliadin D2, PGD2) 및 류코트리엔 C4(leukotriene C4, LTC4), LTD4, LTE4 등이 있다. 그 외에 혈소판 활성 인자(platelet activating factor, PAF)가 있다(안강모, 2004).
비만세포는 알레르기 조기 반응에만 국한되어 작용하는 것이 아니라 후기 반응이나 만성 알레르기 반응에도 깊이 연관되어 있음이 밝혀졌다. 즉, 비만세포에서 생성되어 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α)는 혈관내피세포의 부착분자(adhesion molecules)의 발현을 증가시켜 호산구(eosinophil) 및 T 림프구(T lymphocyte)의 표적기관으로의 유입을 촉진시킨다. 또한, 비만세포에서 생산되는 IL(interleukin)-4, IL-13, IL-6 등은 Th2(T helper type 2, Th2) 세포의 반응을 증가시키고, 결국 IgE의 생산을 증가시킴으로써 만성 알레르기 반응에 기여한다. 이와 같이, 비만세포는 알레르기 염증 반응을 일으키고 지속시키는 데에 중심축의 역할을 하고 있다(안강모, 2004).
전통적으로 알레르기 질환의 치료에는 알레르기 유발물질(알레르겐)에 대한 회피 용법, 약물 요법, 알레르겐 면역요법의 3가지 치료가 주된 치료법으로 알려져 있다. 실제적으로 알레르기 질환의 치료를 위해서 현재 임상에서 가장 흔하게 적용되고 있는 약물 요법의 경우, 알레르기 반응에 관여하는 화학매개물질(히스타민, 류코트리엔 등)들에 대한 억제 약물(항히스타민제, 항류코트리엔제 등) 혹은 알레르기 반응으로 인한 조직의 염증을 억제하는 항염증 약물들(스테로이드제, 면역 억제제 등)이 주로 사용되고 있다. 하지만 이러한 약물 요법은 지속적으로 약물을 투여할 경우에만 임상 증상을 호전된 상태로 유지시킬 수 있다는 단점이 있다(Nahm, D.H., 2015). 스테로이드제의 경우에는 장기간 사용할 경우 다양한 부작용을 유발시킨다는 것이 잘 알려져 있어 사용에 많은 주의가 요구된다.
최근 알레르기 질환 치료제로 비만세포의 탈과립(degranulation)을 억제하는 비만세포 안정제(mast cell stabilizer)에 대한 관심이 높아지고 있다. 비만세포 안정제는 비만세포의 탈과립을 억제하여 항히스타민제와 항류코트리엔제의 효과를 동시에 얻을 수 있다는 장점을 가지고 있으나 다른 의약품과 비교하면 개발이 미진한 상태이다. 크로모글리케이트(cromoglycate)와 네도크로밀(nedocromil)과 같은 크로모네(chromone)계 물질들이 비만세포의 안정제로 개발되었으나, 경구 투여시 낮은 생체이용률로 인한 사용의 불편함 및 기전의 모호성으로 인해 사용이 제한적이다(Finn, D.F., et al., 2013). 따라서 비만세포 선택적이면서 효능이 우수하고 안전한 새로운 개념의 비만세포 안정제의 개발이 요구되고 있다.
차가버섯(Inototus obliquus, Chaga mushroom)은 담자균류(Basidiomycota)의 민주름버섯목(Aphyllophorales), 소나무비늘버섯과(Hymenochaetaceae)에 속하는 버섯으로, 러시아의 시베리아, 핀란드, 노르웨이, 우크라이나, 일본의 홋카이도 및 우리나라의 오대산 등 한랭 다습한 북반구에서 자작나무, 오리나무, 마가목 등의 줄기 및 그루터기에 자생하는 버섯이다. 차가버섯은 리그닌(lignin), 셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose) 등을 분해하는 백색부후균(white rot fungus)으로, 야생에서 흑색의 균핵체를 자작나무 등 기주의 줄기에 형성하면서 기생하는 것으로 알려져 있다(Guk M.H., et al., 2013).
1950년대 말부터 러시아에서 연구가 시작되어 차가버섯의 자실체(fruit body)에서 추출한 β-글루칸(β-glucan), 폴리페놀(polyphenol) 및 스테롤(sterol) 등의 물질이 인체에 생리활성 효과를 나타내는 것으로 보고되었다. 지금까지 밝혀진 차가버섯의 효과로는 항암작용(Youn M.J., et al., 2008; Nomura M., et al., 2008)뿐 만 아니라 항산화 작용(Park Y.K., et al., 2004), 항고지혈증, 항당뇨(Kim M.A., et al., 2009), 항진균, 항바이러스, 항염증, 진통작용 등이 있다.
이러한 다양한 생리활성을 가진 차가버섯으로부터 유용한 화합물들을 분리하는 연구들이 진행되어 왔고, 이노토디올(inotodiol), 트라메테놀산(trametenolic acid), 라노스테롤(lanosterol), 이노노트술리드(inonotsulide) 등과 같은 다양한 화합물들이 분리되었다(Ma L., et al., 2013). 이 중, 이노토디올(inotodiol) 화합물의 경우에는, 항암, 항염증, 멜라닌 형성 억제 등과 같은 활성이 있음이 밝혀져 있다.
이에, 본 발명자들은 차가버섯 추출물로부터 분리한 이노토디올 화합물 또는 이를 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물이 식품 알레르기를 유도한 마우스 모델에서 알레르기에 의한 증상을 개선 및 치료하고, 비만세포의 면역 활성을 억제하는 효과가 있는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래 선행기술로서 일본공개특허 제2006-347991호에는 차가버섯을 포함하는 버섯 균사체 유래 물질이 알레르기 유발과 관련된 물질인 히스타민의 방출을 억제하는 것이 기재되어 있어, 본 발명의 구성과 유사하나, 본 발명의 이노토디올 화합물이 기재되어 있지 않다. 또한, 한국등록특허 제1351054호에는 차가버섯을 포함하는 생약 조성물의 아토피성 피부염 치료 효과 및 차가버섯이 전체적인 면역력을 강화시켜 아토피성 피부염을 근본적으로 치료하는데 도움을 준다고 기재되어 있으나, 본 발명의 이노토디올 화합물은 기재되어 있지 않다. 한국공개특허 제2018-0003002호에는 차가버섯 추출물로부터 분리한 이노토디올 화합물이 염증 예방 또는 치료 효과가 있음이 기재되어 있으나, 본 발명의 알레르기 예방 또는 치료 및 비만세포 면역활성 억제 효과는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다.
본 발명의 목적은 이노토디올(inotodiol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물 또는 이노토디올 화합물을 포함하는 효과적이면서 안전하고 경구투여가 가능한 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명은 하기 화학식 1의 이노토디올(inotodiol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯(Inototus obliquus ) 추출물을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
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상기 차가버섯 추출물은 차가버섯을 70% 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물에 디클로로메탄(dichloromethane) 또는 클로로포름(chloroform)을 가하여 분획한 디클로로메탄 분획물 또는 클로로포름 분획물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 이노토디올 화합물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
상기 약학 조성물은 비만세포의 탈과립(degranulation)을 억제할 수 있다.
상기 알레르기는 꽃가루, 약물, 식물성 섬유, 세균, 식품, 염색약 및 화학 물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 알레르겐 의해 유도되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 식품에 의해 유도되는 알레르기이다.
상기 알레르기 질환은 두드러기, 아나필락시스(anaphylaxis), 알레르기성 비염, 기관지천식 및 아토피성 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
또 다른 일면에 있어서, 본 발명은 상기 화학식 1의 이노토디올(inotodiol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯(Inototus obliquus) 추출물을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 이노토디올 화합물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 상기 화학식 1의 이노토디올(inotodiol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯(Inototus obliquus) 추출물을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 차가버섯 추출물은 차가버섯을 70% 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물에 유기용매를 가하여 분획한 분획물일 수 있다.
상기 유기용매는 C1 내지 C4의 저급 알코올, 디클로로메탄(dichloromethane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 디에틸아세테이트(diethylacetate), 디에틸에테르(diethyl ether), 아세톤(acetone), 헥산(hexane)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 그러나 이에 한정되지 않는다. 상기 C1 내지 C4의 저급 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등 일 수 있다.
상기 차가버섯 추출물은 바람직하게는 차가버섯을 70% 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물에 디클로로메탄 또는 클로로포름을 가하여 분획한 디클로로메탄 분획물 또는 클로로포름 분획물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상이다.
또한, 본 발명은 이노토디올 화합물을 유효성분으로 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
상기 이노토디올 화합물은 통상적인 방법에 따라 합성할 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수 있으며, 또는 차가버섯 추출물로부터 분리, 정제될 수 있다.
상기 차가버섯으로부터 분리된 이노토디올 화합물은 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), HP-20 컬럼 크로마토그래피(HP-20 column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(High-performance liquid chromatography) 등에서 선택하여 사용할 수 있다.
상기 알레르기는 알레르기 유발 물질인 알레르겐과의 접촉을 통해 항원-항체 반응에 의하여 생체 내에서 급격한 반응이 일어나는 현상을 의미하는 것으로, 상기 알레르겐은 꽃가루, 약물, 식물성 섬유, 세균, 식품, 염색약 및 화학 물질로 이루어진 군중에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 식품이다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 상기 알레르기 질환은 알레르기에 의해 생기는 질환으로, 주된 질환은 기관지천식, 알레르기성 비염, 아토피성 피부염, 두드러기, 식품알레르기, 약진, 약제 알레르기, 혈청병 등이고, 알레르겐의 종류나 알레르기 반응을 일으키는 조직에 따라 여러 가지 질환의 유형을 나타낸다.
상기 알레르기 질환은 두드러기, 아나필락시스, 알레르기성 비염, 기관지천식 및 아토피성 피부염으로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 그러나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 이노토디올 화합물 또는 이를 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물은 비만세포의 탈과립을 억제할 수 있다.
상기 비만세포는 알레르겐에 의해 자극을 받으면 히스타민, 세린 프로타아제, 프로테오글리칸, 프로스타글란딘 D2, 류코트리엔 등의 알레르기 염증 반응 유발 물질을 세포 외부로 유리하며, 이러한 반응을 비만세포의 탈과립(degranulation) 반응이라고 한다. 따라서, 상기 이노토디올 화합물 또는 이를 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물의 비만세포의 탈과립 억제는 알레르겐 자극에 의한 알레르기 염증 반응 유발 물질의 분비를 억제하여 알레르기를 예방 또는 치료할 수 있으며, 이를 ‘비만세포 안정제(mast cell stabilizer)’라 한다.
특히나, 본 발명의 이노토디올 화합물은 알레르기 치료와 관련되어 있는 CD4+ T 세포, CD8+ 세포, B 세포, 대식세포 및 비만세포들 중에서, CD4+ T 세포 및 CD8+ 세포, B 세포, 대식세포 활성 조절에는 전혀 영향을 주지 않는 반면에, 비만세포의 탈과립만을 선택적으로 억제한다.
또한, 본 발명은 이노토디올 화합물 또는 이를 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 약학 조성물에는 이노토디올 화합물 또는 이노토디올 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물이 0.001중량% 내지 100중량%로 포함될 수 있다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 이노토디올 화합물 또는 이노토디올 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 이노토디올 화합물 또는 이노토디올 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 이노토디올 화합물 또는 이노토디올 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물은 본 발명의 건강기능식품 조성물에 0.001~100중량%로 하여 첨가될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명은 이노토디올 화합물 또는 이를 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물을 포함하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 식품 알레르기가 유도된 마우스 모델에 이노토디올 화합물 또는 이노토디올 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물을 투여하여 알레르기에 의한 증상들이 완화 및 치료되고, 비만세포의 면역 활성을 억제하는 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명의 이노토디올 화합물 및 이노토디올 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯 추출물이 알레르기 질환의 예방 또는 치료 조성물로써 활용 가치가 높을 것으로 기대된다.
도 1은 식품 알레르기 유도 및 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯 분획물 처리에 따른 알레르기 증상 개선 효과를 보여주고 있다. (A)는 직장 온도의 변화를, (B)는 아나필락시스 증상 완화 또는 치료 정도를, (C)는 설사 증상에 대한 점수를 보여주고 있다.
도 2는 식품 알레르기 유도 및 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯 분획물 처리에 따른 소장에 침윤된 호산구의 수(A) 및 소장에서의 비만세포 수(B)의 변화를 보여주고 있다.
도 3은 식품 알레르기 유도 및 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯 분획물 처리에 따른 알레르기 관련 IgE(A) 및 MCPT-1(B)의 혈청 내 농도 변화를 보여주고 있다.
도 4는 식품 알레르기 유도 및 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯 분획물의 CD4+ T 세포 면역 활성을 확인한 결과를 보여주는 것으로, (A)는 Th2 CD4+ T 세포에 의해 생성되는 사이토카인인 IL-13, IL-5 및 IFN-γ의 발현량의 변화를, (B)는 난백알부민 유래 펩타이드에 특이적인 T 세포 수용체인 DO11.00 TCR이 발현되는 CD4+ T 세포의 난백알부민에 의한 활성화 및 그에 따른 세포분열 정도를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 알레르기 유도 및 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯 분획물의 비만세포의 면역 활성을 확인한 결과를 보여주는 것으로, 수동전신과민증(passive systemic anaphylaxis) 방법을 통해 비만세포의 탈과립을 유도한 마우스에서의 직장 내 온도(A) 및 혈액 내 MCPT-1의 변화를 확인한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
<실시예 1. 이노토디올(inotodiol) 화합물의 분리>
실시예 1-1. 차가버섯 추출물의 제조 및 이노토디올 화합물의 함량 확인
본 발명의 이노토디올 화합물은 차가버섯(Inonotus obliquus) 추출물로부터 분리하였다.
차가버섯 630g을 미세입자로 분쇄하고, 70%[v/v] 에탄올 3,000㎖을 가하고, 40℃, 90Hz의 초음파 교반 하에 추출하는 것을 3회 반복하여 70% 에탄올 추출물(3×3.0ℓ)을 얻었고, 이를 진공회전농축기(rotary evaporator)를 이용하여 건조된 갈색의 70% 에탄올 추출물 58g을 얻었다.
차가버섯 70% 에탄올 추출물 58g을 물에 녹이고, 디클로로메탄(dichloromethane, CH2Cl2)을 가하여 디클로로메탄 분획물 6.0g을 확보하고, 디클로로메탄 분획물을 분리하고 남은 분획물에 다시 에틸아세테이트(ethyl acetate, EtOAc)를 가하여 에틸아세테이트 분획물 3.2g과 물 분획물 48.5g을 확보하였다.
상기에서 확보한 차가버섯 추출물 및 분획물에 포함되어 있는 이노토디올 화합물의 함량을 확인하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)를 수행하였다. HPLC는 아세토니트릴(acetonitrile) 농도 구배(0-30분; 60→95%[v/v], 30-60분; 95%[v/v] 유지) 조건으로 LC-10AD(Shimadzu Co. Kyoto, Japan)를 사용하여 진행하였고, 각각의 차가버섯 추출물 및 분획물의 농도가 2㎎/㎖이 되도록 메탄올로 용해하여 0.2㎛ 주사기 필터(syringe filter)로 필터링 한 후, 10㎕씩을 주입하였다. 컬럼은 HECTOR-M C18(4.6×250㎜, 5㎛ 입자크기, RStech, Korea)를 사용하였으며, 유속은 1㎖/분, UV 탐지(210㎚)로 이노토디올 화합물의 함유량을 확인한 결과, 70% 에탄올 추출물(EtOH Ext.)에는 약 1%, 디클로로메탄 분획물(CH2Cl2 Frac.)에는 7.8%, 에틸아세테이트 분획물(EtOAc Frac.)에는 0.9%, 물 분획물(H2O Frac.)에는 0.05%로 이노토디올 화합물의 함유량이 가장 낮은 것을 확인하였다.
상기 분획 용매 중 디클로로메탄 대신에 클로로포름을 이용하여 분획한 클로로포름 분획물의 경우에도 디클로로메탄 분획물과 유사한 양의 이노토디올 화합물이 함유되어 있는 것을 확인하였다.
실시예 1-2. 이노토디올 화합물의 분리
상기 실시예 1-1에서 확보한 차가버섯의 디클로로메탄 분획물로부터 이노토디올 화합물을 분리하였다.
디클로로메탄 분획물 2.5g을 n-헥산:에틸아세테이트가 20:1, 9:1, 4:1, 2:1 및 1:2[v/v] 비율로 혼합된 혼합용매를 각각 1ℓ씩 이용하여 농도구배 용출 조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)로 분획하여 13개의 소분획물을 얻었다(Frac. C1~C13). 상기 소분획물 중 Frac. C6 및 Frac. C7을 혼합한 후, n-헥산:에틸아세테이트가 20:1[v/v]로 혼합된 혼합용액의 등용매 조건에 따른 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 이노토디올 화합물 210㎎을 분리하였다.
<실시예 2. 이노토디올 화합물의 물리화학적 구조 확인>
Inotodiol;
백색 무정형 분말;
ESI-MS: [M+ Na]+ 465.37 m/z (C30H50O2: 442.27);
1H NMR 및 13C NMR 데이터는 하기 표 1 참조;
ESI-MS 분석 결과와 13C NMR 데이터를 통해 분자식이 C30H50O2로 확인되었다.
이노토디올에 대한 13C-NMR에서 탄소 30개의 피크(peak)를 확인 할 수 있었으며, δC 121.2, 134.0, 134.4, 134.8 피크에서 두 개의 이중 결합(double bond)이 있고, δC 73.2, 78.7 피크를 통해서 2개의 히드록실 그룹(hydroxyl group)이 있는 것을 추정할 수 있었다(표 2 참조). 또한 1H-NMR 스펙트럼(표 2 참조)에서, δH 0.67, 0.76, 0.82, 0.88, 0.93, 1.60, 1.69 (3H, s)에서 단일(singlet)의 메틸 피크(methyl peak)와 δH 0.88에서 이중(doublet)의 메틸 피크를 확인할 수 있었다. 또한 δH 5.16 (1H, t, J = 7.2 Hz)에서 H-24에 해당하는 올레핀(olefinic)의 피크와, δH 3.18 (1H, m, H-3)과 δH 3.65 (1H, H-22)에서 산소에 결합하고 있는 옥시메틴(oxymethine)의 피크가 나타남을 확인하였다.
이상의 결과를 논문에 보고된 데이터(Du. D., et al., 2011)와 비교하여 이노토디올 화합물의 구조를 확증할 수 있었다.
Figure PCTKR2018005906-appb-T000001
< 실험예 1. 알레르기 마우스 모델의 제조 및 추출물의 투여>
알레르기 마우스 모델을 제조하기 위해 5주령의 수컷 BALB/C 마우스를 이용하였다. 알레르기 유도물질(알레르겐, allergen)로 닭의 난백알부민(ovalbumin)을 이용하여 식품 알레르기 모델을 제조하였다.
마우스의 면역을 유도(immunization)하기 위해 20㎍의 난백알부민을 2㎎의 명반(alum)과 혼합하여 2주 간격으로 2회, 쥐의 복강 내로 주사하였다. 식품 알레르기 유도는, 2번째 면역유도 주사 후 2주 뒤에 50㎎의 난백알부민을 3일 간격으로 5회 경구 투여함으로써 알레르기 반응이 일어나도록 하였다. 또한, 알레르기 치료 효과를 확인하기 위해 상기 실시예 1에서 확보한 차가버섯의 추출물, 분획물 및 이노토디올 화합물을 난백알부민을 투여하는 동안 매일 마우스에 경구 투여하였다. 이때, 양성대조군으로 덱사메타손(dexamethasone)을 매일 투여한 마우스 군을 이용하였다. 50㎎ 난백알부민 단독 또는 차가버섯 추출물, 분획물 또는 이토노디올 화합물을 마지막으로 투여 하고, 1시간 후에 알레르기에 의한 증상들을 관찰하였다. 실험 그룹 당 마우스를 6마리 이용하였고, 각각의 실험 그룹을 하기 표 2에 나타내었다.
Figure PCTKR2018005906-appb-T000002
< 실험예 2. 알레르기 증상의 개선 효과 확인>
실험예 2-1. 직장(rectal) 온도 변화 확인
식품 알레르기 유발 및 약물 처리에 따른 직장의 온도 변화를 확인하기 위해 각 그룹에 해당되는 마우스를 이용해 직장의 온도를 측정하였다. 직장 온도는 직장체온계의 센서 끝을 직장에 삽입하여 측정하였고, 그 결과를 도 1(A)에 나타내었다.
도 1(A)에서 보여주듯이, 알레르기 유도 그룹(Allergy)의 경우에는 정상 그룹(Normal)에 비해 직장 온도가 낮아지는 것을 확인하였다. 반면에, 덱사메타손(Dexa.) 또는 본 발명의 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물(Inotodiol)과 이를 포함하고 있는 차가버섯 에탄올 추출물(EtOH Ext.) 및 디클로로메탄 분획물(CH2Cl2 Frac.)을 처리한 그룹에서는 식품 알레르기 유도 그룹(Allergy)에 비해 직장 온도가 높은 것을 확인하였고, 특히나, 이노토디올 화합물 및 차가버섯의 디클로로메탄 분획물을 처리한 그룹의 경우에는 정상 그룹과 비슷한 수준의 직장 온도를 나타내는 것을 확인하였다. 반면에, 차가버섯의 물 분획물(H2O Frac.)을 처리한 경우의 직장 온도는 식품 알레르기 유도 그룹과 비슷한 수준의 직장 온도를 나타내었다.
이를 통해, 본 발명의 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯 디클로로메탄 분획물이 알레르기 유발에 의해 나타나는 증상 중의 하나인 직장 온도 저하를 개선한다는 것을 알 수 있었다.
실험예 2-2. 아나필락시스 (anaphylaxis) 관찰
본 발명의 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물 및 이를 포함하는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물의 식품 알레르기에 의한 아나필락시스 증상 개선 또는 치료 효과를 확인하기 위해, 실험 그룹별 마우스 반응을 관찰하였고, 하기 표 3에 따라 아나필락시스 증상을 점수화하였고, 그 결과를 도 1(B)에 나타내었다.
Figure PCTKR2018005906-appb-T000003
도 1(B)에서 보여주듯이, 식품 알레르기 유도 그룹(Allergy)의 경우에는 정상 그룹(Normal)에 비해 아나필락시스 점수가 높은 반면에, 덱사메타손(Dexa.), 차가버섯 에탄올 추출물(EtOH Ext.), 디클로로메탄 분획물(CH2Cl2 Frac.) 및 이노토디올 화합물(Inotodiol)을 처리한 그룹의 아나필락시스 점수는 식품 알레르기 유도 그룹에 비해 낮아지는 것을 확인하였다. 특히나, 차가버섯의 디클로로메탄 분획물 및 이노토디올 화합물을 처리한 그룹의 아나필락시스 점수가 더 낮아지는 것을 확인하였다. 한편, 차가버섯의 물 분획물(H2O Frac.)의 경우에는 식품 알레르기 유도 그룹과 비슷한 수준의 아나필락시스 점수를 나타내었다.
이를 통해, 본 발명의 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물이 알레르기 유발에 의한 아나필락시스 증상을 개선한다는 것을 알 수 있었다.
실험예 2-3. 대장에서의 대변(stool) 관찰
본 발명의 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물 및 이를 포함하는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물의 식품 알레르기에 의한 대변 형태 변화를 관찰하였다. 실험 그룹별 마우스의 대장 내의 대변의 형태를 육안으로 관찰하고, 하기 표 4에 따라 설사 증상을 점수화하여, 그 결과를 도 1(C)에 나타내었다.
Figure PCTKR2018005906-appb-T000004
도 1(C)에서 보여주듯이, 식품 알레르기 유도 그룹(Allergy)의 경우에는 정상 그룹(Normal)에 비해 설사 증상에 대한 점수가 높은 것을 확인하였다. 그러나 덱사메타손(Dexa.) 또는 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물(Inotodiol) 및 이를 포함하고 있는 차가버섯 디클로로메탄 분획물(CH2Cl2 Frac.)을 처리한 그룹의 설사 증상에 대한 점수는 식품 알레르기 유도 그룹에 비해 낮은 것을 확인하였다. 반면,차가버섯 에탄올 추출물(EtOH Ext.) 및 물 분획물(H2O Frac.)을 처리한 그룹에서 설사 증상 완화 효과가 차가버섯 디클로로메탄 분획물에 비해 낮으며, 물 분획물의 경우에는 알레르기 유도 그룹과 비슷한 수준임을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물이 알레르기 유발에 의한 설사 증상을 개선한다는 것을 알 수 있었다.
또한, 상기 도 1에서는 보여주지 않았으나, 차가버섯의 클로로포름 분획물을 처리한 경우에도 본 발명의 디클로로메탄 분획물을 처리한 경우와 비슷한 직장 온도, 아나필락시스 점수 및 대변 증상에 대한 점수를 나타내는 것을 확인하였다. 반면에, 이노토디올 화합물과 구조식이 유사한 콜레스테롤(cholestero) 20㎎/㎏을 처리한 경우에는 이노토디올 화합물과 달리 알레르기를 유도 그룹과 유사한 수준의 직장 온도, 아나필락시스 점수 및 대변 증상에 대한 점수를 나타내는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 직장 온도, 아나필락시스 증상 및 대변 관찰을 통해, 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물이 알레르기 증상을 완화하는 주요 유효성분 중 하나임을 알 수 있었으며, 또한, 이노토디올 화합물을 유효성분의 일부로 함유하고 있는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물 및 클로로포름 분획물의 경우에도 알레르기 증상을 완화하는 효과가 우수함을 알 수 있었다.
< 실험예 3. 식품 알레르기에 의한 소장의 세포 변화 관찰>
실험예 3-1. 소장의 호산구( eosinophils ) 관찰
호산구는 식품 알레르기에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 즉, 호산구는 소장에서 알레르기성 염증을 유발시킨다. 이에 소장에서의 호산구 변화를 관찰함으로써, 본 발명의 이노토디올 화합물 및 이를 포함하는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물의 알레르기 예방 및 치료 효과를 확인하였다.
상기 실험예 1의 각 실험 그룹의 마우스를 마취한 후 개복하여 소장을 꺼낸 후 포르말린(formalin)으로 고정시킨 후 파라핀(paraffin)으로 처리하여 조직에 파라핀을 침투시키고 포매한 후 마이크로톰으로 박절하여 조직 절편을 확보하였다. 확보한 소장의 절편을 이용해 H&E(hematoxylin and eosin) 염색을 한 후, 호산구 세포를 관찰하였고, 그 결과를 도 2(A)에 나타내었다.
도 2(A)의 조직 염색을 통해 염색된 호산구의 세포 수를 측정한 결과에서 보듯이, 식품 알레르기 유도 그룹(Allergy)이 정상 그룹(Normal)에 비해 소장 내의 호산구의 침윤이 증가하였고, 덱사메타손(Dexa.)과 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물(Inotodiol) 및 이를 포함하고 있는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물(CH2Cl2 Frac.)을 처리한 그룹의 경우에는 호산구의 침윤이 감소하였다. 반면, 차가버섯의 물 분획물(H2O Frac.)의 경우는 그 감소 효과가 거의 없음을 알 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물이 알레르기에 의한 염증을 완화시킴으로써 알레르기를 예방 또는 치료할 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 3-2. 소장의 비만세포 관찰
알레르기 반응을 유발한다고 알려진 비만세포(mast cell)를 관찰함으로써 본 발명의 이노토디올 화합물 및 이를 포함하는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물 분획물의 알레르기 예방 및 치료 효과를 확인하였다.
상기 실험예 3-1에서 확보한 소장의 조직 절편을 이용하여 비만세포를 관찰하기 위해 톨루이딘(toluidine)으로 염색하고, 현미경 상에서 비만세포를 관찰하고, 비만세포 수를 측정하여 그 결과를 도 2(B)에 나타내었다.
도 2(B)의 톨루이딘 염색을 통해 염색된 비만세포 수를 측정한 결과에서 보듯이, 식품 알레르기 유도 그룹(Allergy)이 정상 그룹(Normal)에 비해 소장 내의 비만세포 수가 증가하였고, 덱사메타손(Dexa.)과 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물(Inotodiol) 및 이를 포함하고 있는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물(CH2Cl2 Frac.)을 처리한 경우에는 비만세포의 수가 감소하였다. 반면, 물 분획물(H2O Frac.)의 경우는 그 감소 효과가 거의 없음을 알 수 있었다.
또한, 도 2에서는 보여주지 않았으나, 차가버섯의 클로로포름 분획물을 처리한 경우에도 본 발명의 차가버섯의 디클로로메탄 분획물을 처리한 경우와 마찬가지로 호산구 및 비만세포 감소 효과가 있음을 확인하였다. 반면에, 이노토디올 화합물과 구조식이 유사한 콜레스테롤 20㎎/㎏을 처리한 경우에는 이노토디올 화합물과 달리 호산구 및 비만세포의 감소 효과가 없는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 차가버섯으로부터 분리한 이노토디올 화합물 및 이를 포함하고 있는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물 및 클로로포름 분획물이 알레르기 예방 또는 치료 효과가 있음을 알 수 있었다.
<실험예 4. 알레르기에 의한 IgE 및 MCPT-1 발현량 확인>
알레르기 반응은 알레르겐에 반응하는 IgE의 발현에 기인하고 알레르겐과 IgE의 결합에 의해, 비만세포가 히스타민(histamine), 세린 프로테아제(serine protease), 프로테오글리칸(proteoglycan)과 같은 알레르기 염증과 관련된 과립물질들을 분비하게 된다. 따라서, 본 발명의 이노토디올 화합물 및 이를 포함하는 차가버섯의 디클로로메탄 분획물의 알레르기 예방 및 치료 효과를 확인하기 위해 마우스의 혈청 내 IgE 및 비만세포 특이적 세린 프로테아제인 MCPT-1(mast cell protease-1)의 농도를 측정하였다.
혈청은 상기 실험예 1에서 50㎎ 난백알부민 단독 또는 차가버섯 추출물, 분획물 또는 이토노디올 화합물을 마지막으로 투여하고 1일 후에 마우스의 혈액을 채취하여 확보하였다. 확보한 혈청을 100배 희석하여 이용하였다.
혈청 내 IgE 농도는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)키트를 이용하여 측정하였다. 96웰 플레이트에 2㎍/㎖의 난백알부민이 포함되어 있는 카보네이트 코팅 버퍼(carbonate coating buffer, pH9.5)를 웰 당 100㎕씩 넣고, 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켜 코팅하였다. 반응 후 세척 버퍼(washing buffer)(0.05% tween 20 in PBS)로 3회 세척한 후, 1% BSA(bovine serum albumin)이 포함된 PBS(phosphate buffered saline)를 웰 당 200㎕씩 넣고 상온에서 1시간 동안 처리하여 블로킹시킨 다음 세척 버퍼로 3회 세척하였다. 세척 후, 혈청을 웰 당 100㎕씩 첨가하고 상온에서 2시간 동안 반응 시키고 세척 버퍼로 세척하였다. 1㎍/㎖의 바이오틴으로 표지된 항-마우스 IgE(biotin conjugated anti-mouse IgE)를 웰 당 100㎕씩 넣고 1시간 동안 반응시킨 후 세척 버퍼로 세척하고, 다시 HRP(horseradish peroxidase)가 붙어있는 스트렙트아비딘(streptavidin-HRP)을 30분 동안 처리하였다. 플레이트를 세척 버퍼로 5회 세척한 후 테트라메틸렌벤지딘(tetramethylenbenzidine) 100㎕를 처리하여 발색을 유도하였다. 발색이 되면 2N 황산(H2SO4)를 100㎕씩 처리하여 발색반응을 정지시킨 후 450㎚에서 흡광도를 측정하여, 혈청 내 IgE의 농도를 분석하였고, 그 결과를 도 3(A)에 나타내었다.
또한, 세린 프로테아제인 MCPT-1(mast cell protease-1)의 농도는 mMCP-1 ELISA 키트(eBioscience사)를 이용하였고, 제조사에서 제공하는 방법대로 실험을 진행하여 측정하였고, 그 결과를 도 3(B)에 나타내었다.
도 3에서 보여주듯이, 식품 알레르기 유도 그룹(Allergy)이 정상 그룹(Normal)에 비해 혈청 내 난백단백질 특이적인 IgE(3(A)) 및 MCPT-1(3(B))의 농도가 증가하였고, 차가버섯의 에탄올 추출물(EtOH Ext.)과 디클로로메탄 분획물(CH2Cl2 Frac.)을 처리한 그룹의 경우에는 IgE 및 MCPT-1의 농도가 모두 현저히 감소하였다. 차가버섯의 물 분획물(H2O Frac.)을 처리한 경우에는 IgE 및 MCPT-1의 농도가 거의 변화가 없음을 알 수 있었다. 한편, 덱사메타손(Dexa.)과 이노토디올(Inotodiol)을 처리한 경우에는 IgE의 농도는 거의 변하지 않았지만 MCPT-1의 농도는 현저히 감소하는 것을 알 수 있었다.
또한, 도 3에서는 보여주지 않았으나, 차가버섯의 클로로포름 분획물을 처리한 경우에도 본 발명의 차가버섯의 디클로로메탄 분획물을 처리한 경우와 마찬가지로 혈청 내 IgE 및 MCPT-1의 농도를 감소시키는 것을 확인하였다.
이러한 결과는 알레르겐에 특이적인 IgE 발현의 저감 효과보다 비만세포의 활성 조절/억제 효과가 알레르기 증상의 예방 또는 치료와 더 직접적인 관계가 있음을 보여준다고 할 수 있다.
<실험예 5. 비만세포 특이적 억제 효과 확인>
실험예 5-1. CD4+ T 세포 활성 조절 효과 확인
Th2(T helper 2, Th2) CD4+ T 세포에 의해 생성되는 사이토카인이 IgE의 생성을 증진하고 비만세포와 호산구의 분화(differentiation)를 촉진하여 알레르기 증상을 심화시키는 것으로 알려져있다. 또한, 항알레르기 효과가 있다고 보고되어 있는 식물 추출물들의 경우 CD4+ T 세포의 활성화와 Th2 CD4+ T 세포의 사이토카인 생성을 억제하는 효과를 동시에 갖는다는 것이 다수 보고되어 있다.
이에, 본 발명의 이노토디올 화합물 또는 이노토디올 화합물을 함유하는 차가버섯 추출물의 CD4+ T 세포 활성 조절 효과를 확인하기 위해, Th2 CD4+ T 세포에 의해 생성되는 사이토카인의 발현량 분석실험 및 난백알부민 유래 펩타이드에 특이적인 T 세포 수용체(T cell receptor, TCR)인 DO11.00 TCR을 발현하는 CD4+ TCR 트랜스제닉 T 세포(transgenic T cell)를 이용한 입양전달(adoptive transfer) 실험을 수행하였다.
사이토카인의 발현 분석을 위해서 상기 실험예 1의 방법과 동일한 방법으로 시료를 처리하고 1일 후에 각 그룹의 마우스의 장관막 림프절(mesenteric lymph node, mLN)로부터 세포를 분리하였다. 이때, 덱사메타손은 10㎎/㎏을 처리하고, 비만세포 과다증 치료제로 이용되고 있는 이매티닙(imatinib, 글로벡) 20㎎/㎏과 이노토디올 화합물과 구조식이 유사한 콜레스테롤 20㎎/㎏을 처리한 그룹 추가하였다. 분리한 세포를 96웰 플레이트에 웰 당 1×106개씩 분주한 후, 난백알부민이 포함되어 있는 RPMI 완전배지(10% 소 태아 혈청(fetal bovine serum, FBS), 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민이 포함된 RPMI 배지) 또는 100㎍/㎖의 난백알부민이 포함되어 있는 RPMI 완전 배지를 넣고 37℃, 5% CO2 조건의 세포 배양기에서 3일 동안 배양하였다. 3일 경과 후에 세포 배양액을 모은 후, 세포 배양액으로 분비된 IL-5, IL-13 및 IFN-γ의 양을 각각의 사이토카인에 해당되는 ELISA 키트 및 제조사에서 제공한 실험 방법을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 4(A)에 나타내었다.
난백알부민 유래 펩타이드에 특이적인 T 세포 면역반응의 정도를 동물실험을 통해 측정하기 위한 실험을 다음과 같이 수행하였다. DO11.10 TCR을 발현하는 형질전환 마우스(transgenic mouse)의 림프절에서 세포를 분리하였다. 분리한 세포를 CFSE(carboxyfluorescein succinimidyl ester)라는 형광물질로 염색한 다음, 2×106개의 세포를 BALB/C 쥐에 정맥 주사하였다. 세포를 주사하고 하루 후에 난백알부민 50㎍을 명반과 함께 복강 주사하여 DO11.00 TCR 발현 CD4+ T 세포의 분열을 유도하였다. 난백알부민 주사 하루 후부터 4일 동안 1일 1회, 이노토디올 화합물 20㎎/㎏, 차가버섯 에탄올 추출물 320㎎/㎏, 덱사메타손 10㎎/㎏, 이매티닙 10㎎/㎏ 또는 콜레스테롤 20㎎/㎏을 경구 투여하였다. 난백알부민 주사 5일 후에 BALB/C의 림프절로부터 세포를 분리한 다음, 항-CD4 항체 및 항-DO11.10 항체를 이용하여 세포를 염색하고 유세포 분석기(flow cytometry)를 이용하여 DO11.00 TCR이 발현되는 CD4+ T 세포에서의 CFSF 형광 강도를 측정하여 세포 분열 정도를 결정하고, 세포 수를 측정하였고, 그 결과를 도 4(B)에 각각 나타내었다. 이때, 세포의 분열이 증가할수록 CFSF 형광 강도는 감소한다.
도 4(A)에서 보듯이, 난백알부민이 포함되지 않은 RPMI 완전 배지에서 배양한 세포(No OVA)의 경우에는 모든 그룹에서 IL-5, IL-13 및 IFN-γ의 발현이 없거나, 유사하게 나타났다. 반면에 난백알부민이 포함된 RPMI 완전 배지에서 배양한 세포(OVA)의 경우, IL-5, IL-13 및 IFN-γ 모두, 알레르기 유도 그룹(Allergy)에서 현저히 증가하였다. 그러나, 차가버섯 에탄올 추출물을 처리한 그룹(EtOH Ext.)의 경우에는 사이토카인의 양이 정상그룹(Normal)과 비슷한 수준임을 확인하였다. 그러나, 이노토디올 화합물을 처리한 그룹(Inotodiol)의 경우에는 IL-5, IL-13 및 IFN-γ 발현량 모두, 알레르기 유도 그룹의 발현량과 유의적 차이가 없음을 확인하였다.
또한, 도 4(B)의 난백알부민 유래 펩타이드에 특이적인 TCR인 DO11.00 TCR 발현 CD4+ T 세포를 분석한 결과에서 보듯이, 난백알부민을 투여한 그룹(Allergy)에서의 DO11.00 TCR을 발현하는 CD4+ T 세포의 CFSE 형광 강도가 난백알부민 비면역 그룹(Normal)에 있는 세포들과 비교하여 현격하게 줄어들고 아울러 CD4+ T 세포의 수가 현저히 증가하였으나, 차가버섯 에탄올 추출물(EtOH Ext.) 및 이매티닙(Imat.)을 처리한 경우에는 CFSE의 형광 강도가 비면역 군과 비교하여 차이가 없었을 뿐만 아니라 세포의 수도 증가하지 않았다. 반면에, 이노토디올 화합물을 처리한 그룹(Inotodiol)의 경우에는 DO11.00 TCR이 발현된 CD4+ T 세포의 CFSE 형광 강도가 난백알부민만을 주사한 그룹과 비슷한 수준으로 감소하였고 CD4+ T 세포 수도 현저히 증가함을 확인하였다.
또한, 도 4에서 보여주지 않았으나, 본 발명의 차가버섯 디클로로메탄 분획물 및 클로로포름 분획물을 처리한 경우에도 차가버섯 추출물과 같이 Th2 CD4+ T 세포에 의한 사이토카인 발현을 억제한다는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 결과들을 통해, 본 발명의 차가버섯 디클로로메탄 분획물 및 클로로포름 분획물은 알레르겐에 의해 유도되는 현격한 Th2 CD4+ T 세포 활성 조절능을 보유하고 있는 반면, 이노토디올은 그러한 효능이 없음을 알 수 있었다.
실험예 5-2. 비만세포 면역 활성 조절 효과 확인
상기 실험예 4의 이노토디올 화합물 또는 이를 함유하는 차가버섯 추출물의 MCPT-1 발현 감소는 이노토디올 화합물에 의한 비만세포의 면역 활성 저해와 관련되어 있음을 알 수 있다.
이에, 본 발명의 이노토디올 화합물 또는 이노토디올 화합물을 함유하는 차가버섯 추출물의 비만세포의 탈과립 저해 효과를 직접적으로 확인하기 위해 수동전신과민증(passive systemic anaphylaxis) 실험을 수행하였다.
상기 실험예 1의 5주령의 수컷 BALB/C 마우스에 이노토디올 화합물(20㎎/㎏), 차가버섯 에탄올 추출물(320㎎/㎏), 이노토디올 화합물의 대조군으로 구조식이 유사한 콜레스테롤 20㎎/㎏, 양성대조군으로 덱사메타손 10㎎/㎏ 및 이매티닙 20㎎/㎏을 1일 1회, 3일간 경구 투여하였다. 경구 투여 한지 3일째에 항-DNP(dinitrophenol)-IgE 3㎍을 정맥 주사하고, 24시간 후에 항원으로 DNP가 결합된 BSA(bovine serum albumin) 80㎍을 정맥 주사하여 비만세포의 탈과립을 유도하였다. 비만세포의 탈과립을 유도한 마우스의 직장 온도를 측정하였고, 혈액 내 MCPT-1의 양을 분석하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보듯이, 마우스의 직장 온도를 측정한 결과(5(A))에서 비만세포의 탈과립을 유도한 경우(DNP-BSA 처리)에 직장의 온도가 저하되는 반면에, 이노토디올 화합물(Inotodiol) 및 차가버섯 에탄올 추출물(EtOH Ext.)을 처리한 경우에는 직장의 온도가 저하되지 않는 것을 확인하였다.
또한, 비만세포의 탈과립 과정에서 배출되는 MCPT-1의 양을 분석한 결과(5(B))에서는 비만세포의 탈과립을 유도한 경우(DNP-BSA 처리)에 마우스 혈액 내 MCPT-1의 농도가 증가되고, 덱사메타손(Dexa.), 이매티닙(Imat.), 이노토디올 화합물(Inotodiol) 및 차가버섯 에탄올 추출물(EtOH Ext.)을 처리한 경우에는 MCPT-1의 농도 증가 정도가 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 반면에, 이노토디올 화합물과 구조식이 유사한 콜레스테롤(Chol.)을 처리한 경우에는 이노토디올 화합물과 달리 MCPT-1의 감소 효과가 나타나지 않음을 확인하였다.
도 5에서 그 결과를 보여주지 않았으나, 본 발명의 차가버섯 디클로로메탄 분획물 및 클로로포름 분획물의 경우에도 이노토디올 화합물과 동일하게 MCPT-1의 양을 감소시키는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 차가버섯 디클로로메탄 분획물, 클로로포름 분획물 및 이노토디올 화합물이 비만세포의 탈과립을 억제하는 것을 확인하였다.
따라서, 상기 결과들을 통해, 본 발명의 차가버섯 디클로로메탄 분획 및 클로로포름 분획물의 경우에는 CD4+ T 세포 활성을 조절하면서, 비만세포의 탈과립도 억제함으로써 복합적인 면역 저해 기능을 가지고 있는 반면에, 본 발명의 이노토디올 화합물은 복합적 면역 저해 기능을 가지고 있는 덱사메타손이나 디클로로메탄 분획물 및 클로로포름 분획물과 달리 비만세포의 탈과립만을 선택적으로 억제하는 효능을 통해 좀 더 선택적이고 안전한 알레르기 질환을 치료 할 수 있음을 알 수 있었다.
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명의 차가버섯의 디클로로메탄 분획물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
제제예 1-2. 주사액제의 제조
본 발명의 이노토디올 화합물 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명의 이노토디올 화합물을 조리용 양념에 1중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
본 발명의 이노토디올 화합물을 밀가루에 0.1중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명의 이노토디올 화합물을 스프 및 육즙에 0.1중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명의 이노토디올 화합물을 우유에 0.1중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
본 발명의 이노토디올 화합물 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
본 발명의 이노토디올 화합물 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1의 이노토디올(Inotodiol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯(Inototus obliquus) 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018005906-appb-I000002
  2. 제1항에 있어서,
    상기 차가버섯 추출물은 차가버섯을 70% 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물에 디클로로메탄(dichloromethane) 또는 클로로포름(chloroform)을 가하여 분획한 디클로로메탄 분획물 또는 클로로포름 분획물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 하기 화학식 1의 이노토디올(Inotodiol) 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018005906-appb-I000003
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 있어서,
    상기 약학 조성물은 비만세포의 탈과립을 억제하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 있어서,
    상기 알레르기는 꽃가루, 약물, 식물성 섬유, 세균, 식품, 염색약 및 화학 물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 알레르기는 식품에 의해 유도되는 알레르기인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에서 있어서,
    상기 알레르기 질환은 두드러기, 아나필락시스(anaphylaxis), 알레르기성 비염, 기관지천식 및 아토피성 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 하기 화학식 1의 이노토디올(Inotodiol) 화합물을 유효성분으로 함유하는 차가버섯(Inototus obliquus) 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018005906-appb-I000004
  9. 제8항에 있어서,
    상기 차가버섯 추출물은 차가버섯을 70% 에탄올을 용매로 하여 추출한 추출물에 디클로로메탄(dichloromethane) 또는 클로로포름(chloroform)을 가하여 분획한 디클로로메탄 분획물 또는 클로로포름 분획물로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  10. 하기 화학식 1의 이노토디올(Inotodiol) 화합물을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2018005906-appb-I000005
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 건강기능식품 조성물은 비만세포의 탈과립을 억제하는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  12. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알레르기는 꽃가루, 약물, 식물성 섬유, 세균, 식품, 염색약 및 화학 물질로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의해 유도되는 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 알레르기는 식품에 의해 유도되는 알레르기인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  14. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알레르기 질환은 두드러기, 아나필락시스, 알레르기성 비염, 기관지천식 및 아토피성 피부염으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 알레르기 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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