WO2022173078A1 - 복합버섯균사체를 함유하는 인지기능 또는 기억력 개선용 조성물 - Google Patents

복합버섯균사체를 함유하는 인지기능 또는 기억력 개선용 조성물 Download PDF

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WO2022173078A1
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mycelium
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culture
complex
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박종례
김현민
김야엘
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주식회사 기운찬
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for improving cognitive function or memory, comprising the compound mushroom mycelium of three types of chaga mushroom, reishi mushroom, and shiitake mushroom.
  • Phellinus ( Phellinus ) linteus ) is also called a woody mud mushroom, and in Dongui Bogam, it is recorded in the name of Sangmoki ( ⁇ ) in the section of the soup. It grows wild on the trunks of mulberry trees and is all yellow except for the cape surface. At first, it looks like a lump of mud, but when it is grown, it looks like it sticks its tongue out of a tree stump, so it is also called Suseol ( ⁇ ). Since ancient times, Sanghwang mushroom has been used for uterine bleeding and menstrual irregularities, and recently it has been reported to have excellent effects in tumor suppression, immunity enhancement and whitening.
  • Reishi mushroom ( Ganoderma lucidum ) occurs on hardwood roots in summer. It is also known as the Buddha of Qin Shi Huang, and in Boncho Gangmok, along with ginseng, this mushroom is placed in the ranks of medicine. Reishi mushroom has tonic, antitussive, and small swelling effects, so it is effective for respiratory diseases, nervous breakdown, heart disease, high blood pressure, etc. It is also known to lower cholesterol and have anticancer effects.
  • Chaga ( Inonotus ) obliquus ) is a parasitic sclerotia that grows on birch and alder trees in cold regions such as Russia, Canada, and Hokkaido, Japan.
  • chaga mushroom In the United States, chaga mushroom is classified as a special natural substance and is being developed as a future pharmaceutical and health food.
  • Korea as a result of using chaga mushrooms for patients with gastric cancer and diabetes in the private sector, it has been reported that the effect was superior to that of other mushrooms.
  • chaga is effective in increasing body resistance, inhibiting tumor growth, and whitening.
  • mushrooms which are fruiting bodies, must be collected and used.
  • the demand for mass production cannot be met due to the difficulty that a large amount of production facilities and expenses are required.
  • the mushrooms are effective as anticancer agents or immune enhancers, their supply is limited, and mass production and rapid production are not easy, so they are not widely used. Therefore, with respect to the mushrooms, research on a mass culture method capable of producing a mycelium exhibiting an effect equivalent to that of a fruiting body of a mushroom fungus has been actively conducted recently.
  • Republic of Korea Patent No. 10-922311 discloses a method for complex culture of chaga mushroom, shanghai mushroom, reishi mushroom, oyster mushroom and cordyceps mycelium
  • Republic of Korea Patent No. 10-1358648 discloses chaga mushroom, shanghai mushroom and reishi mushroom
  • the complex culture method of, Republic of Korea Patent Registration No. 10-1652035 discloses a method for culturing a complex mushroom mycelium of chaga mushroom, shanghai mushroom and oyster mushroom.
  • the compound mushroom mycelium differs in its own enzyme activity or beta-glucan content depending on the culture conditions, and even when food is processed using this, different tastes and flavors can be produced.
  • the brain is made up of tens of billions of nerve cells, accounting for about 2% of the body's body weight, but consumes 20% of the body's oxygen and 25% of its glucose. Since nerve cells are already differentiated cells at a high level, their regenerative capacity following damage is very limited, whereas they are very vulnerable to damage caused by oxidative stress. This is due to the fact that the content of glutathione having an antioxidant function is low, and there are many unsaturated fatty acids such as DHA or arachidonic acid in the cell membrane of nerve cells, which is an organ that is easily damaged through oxidative stress caused by peroxidation.
  • Dementia is a disease that causes difficulties in daily life and social life due to deterioration of cognitive functions such as memory, orientation, language ability, and judgment due to damage to brain functions caused by various causes. It is caused by different causes.
  • Alzheimer's dementia is the most common dementia (accounting for about 70%) and is a disease in which degenerative changes in the brain gradually occur, leading to a decline in the overall cognitive function of the brain, including memory. Although it is still difficult to cure the disease, drugs that improve symptoms and slow the progression have been developed. While numerous studies have been conducted, proteins involved in Alzheimer's have been discovered, but the cause of the disease is still unknown. However, as a result of analyzing the postmortem brain tissue of the patients, amyloid plaques formed by the accumulation of beta-amyloid peptide between nerve cells and neurofibrillary tangles formed by hyperphosphorylated tau protein filaments in nerve cells has been reported to exist.
  • Beta-amyloid is composed of 36-43 amino acids of peptides, and the accumulation of beta-amyloid peptides is an early etiology that precedes brain damage and the development of neurofibrillary tangles. Methods for inhibiting or eliminating amyloid production are being studied as treatments for Alzheimer's disease.
  • Vascular dementia is dementia caused by damage to brain tissue due to cerebrovascular disease. If risk factors are well managed, prevention is possible, and early treatment can prevent further deterioration. Other types of dementia include drug addiction, brain tumors, and other types of dementia that are not classified elsewhere.
  • mild cognitive dysfunction symptoms of cognitive decline that do not interfere with daily life are called mild cognitive dysfunction. show various aspects. In particular, it is known that 25% of the population over the age of 65 in Korea suffer from mild cognitive impairment. In this case, early detection and treatment can be of the greatest help in suppressing cognitive decline.
  • the present inventors confirmed that the mycelium of three types of mushrooms obtained through the complex culture method and a composition using the same have cognitive improvement functions such as memory enhancement and dementia symptom improvement, and provide a composition for treatment or improvement of these symptoms. was completed.
  • Patent Document 1 Republic of Korea Patent Registration No. 10-1923408 (Title of the invention: complex culture method of chaga, reishi mushroom, and mycelium of Sanghwang mushroom, Applicant: Kyeongchan Co., Ltd., registration date: November 23, 2018)
  • Patent Document 2 Republic of Korea Patent Registration No. 10-1652035 (Title of the invention: production method of compound mushroom mycelium of chaga mushroom, shanghai mushroom and cypress mushroom, Applicant: Kiunchan Co., Ltd., registration date: August 23, 2016)
  • Patent Document 3 Republic of Korea Patent Registration No. 10-1358648 (Title of the invention: Complex culture method of chaga, Sanghwang mushroom and Reishi mushroom using mushroom extract, Applicant: Taebong Lee, Registration date: January 28, 2014)
  • Patent Document 4 Republic of Korea Patent Registration No. 10-1269410 (Title of the invention: Chaga mushroom, Sanghwang mushroom, Reishi mushroom, Chrysanthemum mushroom and Cordyceps complex culture method using mushroom medium, Applicant: Lee Tae-bong, Registration date: May, 2013 24 days)
  • Patent Document 5 Republic of Korea Patent Registration No. 10-0922311 (Title of the Invention: Method for double culturing of chaga, Sangha, reishi, oyster mushroom and cordyceps, which produces substances containing activated sugar-related compounds, Applicant: Lee Tae-bong, registration date: October 12, 2009)
  • the present invention relates to a composition for improving cognitive function or memory, comprising a complex mushroom mycelium of three types of chaga mushroom, reishi mushroom, and shanghai mushroom or an extract thereof.
  • the composition is available as a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia. Accordingly, the composition may be provided as a health functional food for preventing or improving dementia.
  • the compound mushroom mycelium is obtained by inoculating the fruiting body tissues of chaga, reishi mushroom, and situation mushroom into PDA (Potato Dextrose Agar), respectively, (step 1), and culturing each mushroom separately to become a mycelium;
  • Step 3 Obtaining a complex cultured mycelium by liquid-culturing three types of mycelium inoculated in PDB (Potato Dextrose Broth) medium for 4 to 6 weeks; and,
  • Step 4 Inoculating and culturing the complex cultured mycelium obtained through the third step culture in the rice barley medium;
  • the mycelium liquid culture of the third step is preferably performed at 10-30% relative humidity, 25-30 °C. Also, stationary culture for the initial 1 to 2 weeks, but preferably stirring for 1 to 5 minutes for 1 to 2 times per day, and then shaking culture with stirring at 50 to 150 rpm is good for culturing the mycelium.
  • the rice barley medium of the fourth step is dehydrated after soaking the rice barley in water for 4 to 8 hours, and after adding 0.5 to 2 parts by weight of calcium carbonate based on 100 parts by weight of the dehydrated barley, sterilized at 120 to 125° C. for 30 minutes to 2 hours. may have been obtained by The fourth stage of culturing is carried out for 4 to 7 weeks.
  • the mycelium liquid culture of the third step is preferably carried out at a relative humidity of 40 to 60% and 25 to 30° C.
  • the PDA (Potato Dextrose Agar) used for culturing the mushroom mycelium in the present invention is prepared by sterilizing a product containing 3 to 5 g of potato starch, 10 to 30 g of dextrose, and 10 to 30 g of agarose based on a total volume of 1 liter. can At this time, water may be added so as to have a total volume of 1 liter as a residual amount.
  • the sterilization is preferably performed for 15-20 minutes at 120-125° C. at at least 1.3-1.7 atmospheres, which can be equally applied to the sterilization conditions of all media.
  • the most preferred manufacturing conditions for PDA may be sterilization by adding 4 g of potato starch, 20 g of dextrose and 15 g of agarose to a total volume of 1 liter.
  • PDB Potato Dextrose Broth
  • PDA Potato Dextrose Agar
  • the most preferable manufacturing conditions for PDB (Potato Dextrose Broth) may be sterilization by adding 4 g of potato starch and 20 g of dextrose to a total volume of 1 liter.
  • each mushroom fruiting body piece in PDA (Potato Dextrose Agar), respectively, and then incubate at 25 ⁇ 30°C for 1 ⁇ 3 weeks.
  • the incubation period can be appropriately adjusted within 1 to 3 weeks depending on the growth ability of the mushroom fruiting body.
  • the relative humidity during culture in this condition is 10 to 60%. Even when humidity is less than 10% or exceeds 60%, mycelium growth can be slow.
  • the mycelium may not grow well enough to activate the subsequent liquid culture, and even if it exceeds 3 weeks, the mycelium culture may not work well during the subsequent liquid culture.
  • the culture temperature is less than 25 ° C. or exceeds 30 ° C., it is also undesirable because it affects the mycelium culture during liquid culture.
  • the second step when the three types of mycelium are complex inoculated into PDB (Potato Dextrose Broth), it is only necessary to inoculate a certain amount of the mycelium of each mushroom cultured in the first step to a similar degree, but more preferably each culture
  • the mycelium is cut into 0.5 ⁇ 2mm square, and 3 ⁇ 7 sections for each mushroom mycelium can be inoculated with 3 types of mycelium in PDB (Potato Dextrose Broth).
  • the mycelium culture of the third step is performed at 25-30 ° C.
  • the culture temperature is less than 25 ° C, the mycelium may not grow well, and even if it exceeds 30 ° C, the culture of the mycelium may be slow.
  • stationary culture for the initial 1 to 2 weeks, but preferably stirring for 1 to 5 minutes for 1 to 2 times per day, and then shaking culture with stirring at 50 to 150 rpm is good for culturing the mycelium.
  • the relative humidity during culture in this condition is not particularly limited, but it is preferable that the relative humidity is 10% to 30%.
  • the mycelium obtained through the third step culture may be inoculated by 1 to 10 ml each as a culture solution.
  • the mycelium culture medium is inoculated with less than 1 ml, the amount of mycelium may be small and the additional culture may not be good, and even if the culture medium is inoculated with more than 10 ml, the culture is not more activated, which is not preferable.
  • the rice barley medium of the fourth step is dehydrated after soaking the rice barley in water for 4 to 8 hours, and after adding 0.5 to 2 parts by weight of calcium carbonate based on 100 parts by weight of the dehydrated barley, sterilized at 120 to 125° C. for 30 minutes to 2 hours. may have been obtained by At this time, if rice barley is not fully soaked in water and immersed for less than 4 hours is used, the moisture during mycelium cultivation may be insufficient, and thus the rice barley may not be used well as a nutrient source. Since it is not absorbed into rice barley, it has the effect of delaying only the manufacturing time, which is undesirable.
  • the fourth step of culturing is preferably carried out at 25 ⁇ 30 °C. If the culture temperature is less than 25 °C, the mycelium may not grow well, and even if it exceeds 30 °C, the culture of the mycelium may also be slow. In addition, it is better that the relative humidity during culture under this condition is 40 to 60%. Humidity below 40% or above 60% can also slow the growth of mycelium.
  • the three kinds of compound mushroom mycelium extract can be extracted by using water, C1-C4 alcohol or a mixture solution thereof as a solvent, and the C1-C4 alcohol is methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol and It may be selected from the group consisting of isobutanol. More preferably, water may be used as a solvent, and hot water at 70-75° C. of 5 to 20 times the weight of the three kinds of compound mushroom mycelium is added, and the liquid phase after extraction for 8 to 15 hours may be freeze-dried.
  • Water, C1-C4 alcohol, or a mixed solution thereof used in the preparation of the extract of the three kinds of complex mushroom mycelium can be used in an amount of 1 to 40 times the volume (1 to 40 liters based on 1 kg) based on the weight of the three kinds of complex mushroom mycelium used, preferably In general, 5 to 40 times the volume can be used.
  • the extraction conditions of the three types of compound mushroom mycelium extract may be 1 minute to 48 hours at 20 to 100°C. The above process can be repeated 1 to 4 times.
  • the three kinds of complex mushroom mycelium is extracted and concentrated with water, C1-C4 alcohol, or a mixed solvent thereof, water is added to the three kinds of complex mushroom mycelium extract obtained, and then suspended, preferably three kinds of complex mushrooms 1 to 1000 times the weight of the mycelium extract, more preferably 1 to 500 times, and most preferably 1 to 50 times the weight of the mycelium extract is added and suspended, and then hexane, chloroform, ethyl acetate, and butanol in the suspension It can be prepared from three types of compound mushroom mycelium fraction obtained by adding a solvent selected from the group consisting of.
  • the three kinds of complex mushroom mycelium fraction is preferably obtained by extracting and concentrating three kinds of complex mushroom mycelium with water, C1-C4 alcohol or a mixed solvent thereof, suspending the three kinds of complex mushroom mycelium extract in water and mixing with hexane Concentrate of the obtained hexane layer, the concentrate of the chloroform layer obtained by mixing chloroform with the residue (water layer) remaining after removing the hexane layer, or ethyl obtained by mixing ethyl acetate with the residue (water layer) remaining after removing the chloroform layer It may be a concentrate of the acetate layer, a concentrate of the butanol layer obtained by mixing butanol with the residue (water layer) remaining after removing the ethyl acetate layer, or a concentrate of the residue (water layer) remaining after removing the butanol layer.
  • fractionation conditions are not limited, but after preparing a suspension by adding water 1 to 50 times the weight of the three kinds of complex mushroom mycelium extract to the three kinds of complex mushroom mycelium extract, hexane in the same amount as the water , chloroform, ethyl acetate, and can be fractionated by adding a solvent selected from the group consisting of butanol.
  • chloroform is added to the residue remaining after removing the hexane layer
  • ethyl acetate is added to the residue after removing the chloroform layer
  • butanol is added to the residue remaining after removing the ethyl acetate layer.
  • Each solvent chloroform, ethyl acetate, or butanol
  • the manufacturing temperature of the extract or a fraction thereof may be 20 to 100 °C, but is not limited thereto.
  • the extraction or fractionation time is not particularly limited, but extraction is preferably within 10 minutes to 2 days, and a conventional extraction device, an ultrasonic crushing extractor or a fractionator may be used as the extraction device.
  • the thus-prepared extract or fraction may be dried with hot air, dried under reduced pressure, or freeze-dried to remove the solvent.
  • the extract or fraction may be purified and used using column chromatography.
  • the extract is a known method used for separation and extraction of plant components, such as extraction with an organic solvent (alcohol, ether, acetone, etc.), distribution of hexane and water, and a method by column chromatography according to a conventional method. It can be used after fractionation or purification using a combined method.
  • organic solvent alcohol, ether, acetone, etc.
  • the chromatography is silica gel column chromatography (silica gel column chromatography), LH-20 column chromatography (LH-20 column chromatography), ion exchange resin chromatography (ion exchange resin chromatography), medium pressure liquid chromatography (medium pressure liquid chromatography) chromatography), thin layer chromatography (TLC), silica gel vacuum liquid chromatography, and high performance liquid chromatography may be selected.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for improving cognitive function or memory, comprising three kinds of compound mushroom mycelium, or an extract thereof, and a pharmaceutical excipient.
  • the pharmaceutical composition is available as a pharmaceutical composition for preventing or treating dementia.
  • the pharmaceutical composition may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., oral dosage forms, external preparations, suppositories, and sterile injection solutions according to conventional methods, respectively.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose or It is prepared by mixing lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid preparations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used as a base of the suppository.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention will vary depending on the age, sex, and weight of the subject to be treated, the specific disease or pathological condition to be treated, the severity of the disease or pathological condition, the route of administration, and the judgment of the prescriber. Dosage determination based on these factors is within the level of one of ordinary skill in the art, and dosages generally range from 0.01 mg/kg/day to approximately 2000 mg/kg/day. A more preferred dosage is 1 mg/kg/day to 500 mg/kg/day. Administration may be administered once a day, or may be administered in several divided doses. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to mammals such as mice, livestock, and humans by various routes. All modes of administration can be envisaged, for example, by oral, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine dural or intracerebrovascular injection. Since the complex cultured mycelium of the present invention has almost no toxicity and side effects, it is a drug that can be safely used even when taken for a long period for the purpose of prevention.
  • the present invention provides a health functional food for improving cognitive function or memory, comprising three kinds of compound mushroom mycelium, or an extract thereof, and various food excipients.
  • the health functional food can be used as a health functional food for preventing or improving dementia.
  • the mycelium may be added to the health functional food of the present invention in an amount of 0.001 to 100% by weight.
  • the health functional food of the present invention includes the form of tablets, capsules, pills or liquids, and the food to which the extract of the present invention can be added includes, for example, various drinks, meat, sausage, bread, candy, Snacks, noodles, ice cream, dairy products, soups, ionized beverages, beverages, alcoholic beverages, gum, tea, and vitamin complexes.
  • the present invention relates to a method for preparing a composition for improving cognitive function containing compound mushroom mycelium.
  • the compound mushroom mycelium is excellent in improving memory, improving spatial recognition ability, and inhibiting inflammatory responses in brain nerve cells, so it is excellent in the improvement of senile brain diseases including vascular dementia and Alzheimer's disease as a pharmaceutical composition or health functional food. of can be provided.
  • FIGS. 1A to 1D are graphs showing the effect of improving memory deterioration of three kinds of compound mushroom mycelium extracts in the Barnes maze test.
  • Fig. 1a movement distance
  • Fig. 1b movement speed
  • Fig. 1c time to reach the refuge
  • Fig. 1d analysis of movement
  • Figures 2a and 2b are graphs showing the effect of three kinds of compound mushroom mycelium extract on the escape search and retention time in rats with dementia.
  • Fig. 2a evacuation route
  • Fig. 2b evacuation congestion time
  • FIG. 3a and 3b are graphs showing the memory recovery effect of three kinds of compound mushroom mycelium extract in the Y maze test. (Fig. 3a: Spontaneous alternation, Fig. 3b: Total entries)
  • FIGS. 4A and 4B are graphs showing the memory recovery effect of three types of compound mushroom mycelium in the passive avoidance test. (Fig. 4a: Step-through latency, Fig. 4b: Escape latency)
  • FIGS. 5A and 5B are graphs showing the effect of inhibiting apoptosis of hippocampal CA1 region nerve cells by three types of compound mushroom mycelium.
  • Fig. 5a hippocampal CA1 region staining
  • Fig. 5b number of neurons
  • FIGS. 6A to 6D are graphs showing the inhibitory activity of three types of compound mushroom mycelium on the inflammatory response of BV2 microglia.
  • Fig. 6a Growth
  • Fig. 6b NO
  • Fig. 6c TNF- ⁇
  • Fig. 6d IL-6
  • the medium inoculated with gig mycelium was stationary cultured in a BOD incubator (Bio-Oxygen Demand incubator, low-temperature incubator) for 1 week at 27-28 ° C and 20% humidity, but stirred for about 1 minute every day during the culture. After one week, the flasks inoculated and cultured were transferred to a shaker incubator and cultured at 27° C. and 100 rpm for 4 weeks to prepare three kinds of complex mushroom mycelium cultures.
  • BOD incubator Bio-Oxygen Demand incubator, low-temperature incubator
  • Rice barley was soaked in water for 6 hours and then dehydrated for 8 hours, 1 g of calcium carbonate based on 100 g of dehydrated barley was added, mixed evenly, and sterilized at 121° C. for 1 hour in an autoclave to prepare a rice barley medium. After completion of the sterilization, 5 ml of the compound mushroom mycelium culture medium cultured for 5 weeks per 1 kg of the rice barley medium cooled to 25 ° C was dispensed and inoculated. After inoculation, it was cultured for 30 days in a culture room maintained at a temperature of 26-28°C and a humidity of 45-50%.
  • the cultured compound mushroom mycelium was dried at 57-60° C. for 24 hours using a dryer with rice barley included, and pulverized using a pin mill grinder to prepare a powder.
  • Example 1 In the method of Example 1, instead of complex inoculation of the mycelium of three types of mushrooms, only the mycelium of chaga mushroom was single inoculated into the PDB, and the subsequent culture process was the same.
  • Example 1 In the method of Example 1, instead of the complex inoculation of the mycelium of three types of mushrooms, only the reishi mushroom mycelium was single inoculated into the PDB, and the subsequent culture process was the same.
  • Example 1 In the method of Example 1, the PDB culture step was omitted, and the mycelium of three kinds of mushrooms was directly inoculated into the rice barley medium, and the culture period was additionally performed as much as the PDB culture step instead.
  • Compound mushroom mycelium of chaga mushroom, shanghai mushroom and oyster mushroom was prepared by the method of Preparation Example 1 and Example 1 of Korean Patent Registration No. 10-1652035.
  • a compound mushroom mycelium was prepared by the method of Preparation Example 1 and Example 1 of Korean Patent Registration No. 10-1652035, but the compound mushroom mycelium was prepared using Reishi mushroom instead of oyster mushroom.
  • a compound mushroom mycelium of chaga mushroom, reishi mushroom, and Sanghwang mushroom mycelium was prepared by the method of Example 1 of Korean Patent Registration No. 10-1358648.
  • mice in each group dilute 5 mg/kg (Sample-L) or 15 mg/kg (Sample-H) of 3 types of compound mushroom mycelium with 1 mL of distilled water once a day , was orally administered for a total of 3 weeks.
  • Distilled water (vehicle) was used as a placebo (vehicle).
  • a rat model of vascular dementia was prepared through bilateral common carotid artery occlusion and hypovolemia (2VO/H) surgery, and the following experiments were performed and compared with the results of the control group (normal).
  • a barnes maze with 20 round holes was prepared, 1.2 m from the floor, and a platform was provided under one of the round holes.
  • An LED was installed on the maze to provide an aversive stimulus, and an interlocked video-tracking system was used to track the movement and analyze the arrival time and distance to the escape area.
  • the movement from the same point to the shelter was used for analysis once a day for up to 2 minutes for 4 days.
  • the escape was removed from the hole where the shelter was once immediately after the evaluation of the ability to reach the shelter for 4 days was finished, and then the contents of movement to find the shelter in the maze for 2 minutes were used for analysis.
  • sample-L administration group and the sample-H administration group which were administered with three types of compound mushroom mycelium extract, were found to have significantly shorter travel distance and time than the Vehicle group, and this tendency was found to depend on the concentration of administration.
  • each rat On the 4th day after the completion of the Barnes maze test, each rat was placed in a Y-shaped maze made of black plastic. The total number of movements with three arms labeled A, B, and C for 8 minutes for each rat (total entries; suggesting locomotion) and the number of alternating movements with three arms (spontaneous alternation; suggesting memory) ) were analyzed.
  • each rat was placed in a manual avoidance test box. After placing Rat in a light box, remove the middle septum to make it naturally move to a dark box, and repeat this 3 times to indicate the step-through latencies (step-through latencies; suggesting the degree of avoidance instinct) ) was measured. At the same time, electrical stimulation was given for 3 seconds in a dark box and the rats were taken out. After 24 hours, each rat was placed in a light box, and after removing the septum, the time (escape latencies; suggestive of memory) until moving to the dark box was analyzed.
  • the rats were cardiac perfused with a fixative (4% paraformaldehyde), the brain was removed, and the part where the hippocampus was located was cut in a coronal plane to make a paraffin block. It was cut to a thickness of 5 ⁇ m and stained with cresyl violet reagent. While observing with an optical microscope, the number of surviving neurons per unit area of the hippocampal CA1 area (500 ⁇ m 2 ) was counted.
  • a fixative 4% paraformaldehyde
  • the inflammatory response of BV2 microglia cells was induced by placing the cells in a 96-well plate at a volume of 1x10 4 /well, and then treating them with LPS (Lipopolysaccharide) at 100 ng/ml for 24 hours.
  • LPS Lipopolysaccharide
  • the anti-inflammatory activity of the three types of compound mushroom mycelium extracts was measured by pre-treating the samples at various concentrations (0-500 ⁇ g/ml) for 12 hours before LPS treatment on the cells.
  • Anti-inflammatory activity was determined by quantifying the inflammatory mediators Nitric Oxide (NO), TNF- ⁇ (Tumor Necrosis Factor- ⁇ ), IL-6 (Interleukin 6), etc. secreted in the cell culture medium.
  • Microglia are cells that induce inflammation in the brain and cause brain lesions such as dementia, and inhibition of the inflammatory response of these cells is directly related to the improvement of dementia and cognitive function.
  • the three complex mushroom mycelium significantly inhibited the production of inflammatory mediators such as NO, TNF- ⁇ , and IL-6 ( FIGS. 6a to 6d ).
  • the cognitive function improvement effect of the three kinds of compound mushroom mycelium extract is related to the inhibition of the inflammatory response of microglia.
  • amyloid beta a substance that causes degenerative neurological diseases
  • the aggregation-reducing effect of amyloid beta, a substance that causes degenerative neurological diseases, of the compound mushroom mycelium of Example 1 was measured by fluorescence analysis (ThioflavinT assay).
  • Amyloid beta peptide (A ⁇ 1-42) was used at a concentration of 5 ⁇ M, and was stored at -80 °C before use. Each extract was diluted in distilled water for each test concentration.
  • 5 ⁇ l of each sample extract dilution was added to 92.5 ⁇ l of 0.01 M sodium phosphate buffer solution, 2.5 ⁇ l of 5 ⁇ M A ⁇ 1-42 was added, followed by reaction at 37° C. for 26 hours, followed by 5 ⁇ M Thioflavin T 2,000 ⁇ l was added and measured with a fluorescence spectrometer. At this time, each treated sample was made to have a final concentration of 1 ⁇ g/ml.
  • Example 1 of the present invention 200 g of the compound mushroom mycelium of Example 1 of the present invention was mixed with 175.9 g of lactose, 180 g of potato starch and 32 g of colloidal silicic acid. After adding a 10% gelatin solution to this mixture, it was ground and passed through a 14 mesh sieve. This was dried, and 160 g of potato starch, 50 g of talc and 5 g of magnesium stearate were added thereto, and the resulting mixture was made into tablets.
  • the compound mushroom mycelium of Example 1 of the present invention was added to the cooking seasoning in an amount of 1% by weight to prepare a cooking seasoning for health promotion.
  • the compound mushroom mycelium of Example 1 of the present invention was added to wheat flour in an amount of 0.1% by weight, and the mixture was used to prepare bread, cake, cookies, crackers and noodles to prepare health-promoting food.
  • the compound mushroom mycelium of Example 1 of the present invention was added to the soup and broth in an amount of 0.1% by weight to prepare a health-improving soup and broth.
  • the compound mushroom mycelium of Example 1 of the present invention was added to milk in an amount of 0.1% by weight, and various dairy products such as butter and ice cream were prepared using the milk.

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Abstract

본 발명은 복합버섯균사체를 함유하는 인지 기능 개선용 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 복합버섯균사체는 기억력 증진, 공간인지 능력 개선, 뇌신경세포에서의 염증반응을 억제하는 효능이 우수하여, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매를 비롯한 노인성 뇌질환의 개선 효과가 우수한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로의 제공이 가능하다.

Description

복합버섯균사체를 함유하는 인지기능 또는 기억력 개선용 조성물
본 발명은 차가버섯, 영지버섯 및 상황버섯 3종의 복합버섯균사체를 함유하는 인지기능 또는 기억력 개선용 조성물에 관한 것이다.
상황버섯(Phellinus linteus)은 목질진흙버섯이라고도 하며, 동의보감에서는 상목이(桑木耳)라는 이름으로 탕액편에 기록되어 있다. 뽕나무 줄기에 자생하며 삿갓 표면을 제외하고는 모두 황색이다. 초기에는 진흙 덩어리가 뭉쳐진 것처럼 보이다가 다 자란 후에는 나무 그루터기에 혓바닥을 내민 모습이어서 수설(樹舌)이라고도 한다. 예로부터 상황버섯은 자궁출혈, 월경불순 등에 이용되어 왔으며 최근에는 종양 억제, 면역력 강화 및 미백에 우수한 효과가 있다고 보고된 바 있다.
영지버섯(Ganoderma lucidum)은 여름에 활엽수 뿌리에서 발생한다. 진시황의 불로초라고도 알려져 있고 본초강목에서는 인삼과 함께 이 버섯을 상약의 반열에 올려놓았다. 영지버섯은 강장, 진해, 소종(消腫) 등의 효능이 있어 호흡기 질환, 신경쇠약, 심장병, 고혈압 등에 효과가 있고 콜레스테롤을 낮춰주며 항암 효과가 있다고도 알려져 있다.
차가버섯(Inonotus obliquus)은 러시아, 캐나다, 일본 홋카이도와 같은 한랭지역에서 자생하는 자작나무, 오리나무 등에 기생하는 균핵이다. 미국에서도 차가버섯이 특수 천연 물질로 분류되어 미래 제약 및 건강식품으로 개발 중이다. 우리나라에서도 민간에서 위암 환자와 당뇨병 환자에게 차가버섯을 사용한 결과, 그 효과가 기타 버섯류에 비해 뛰어났던 것으로 보고된 바 있다. 그 외에 차가버섯이 신체 저항력 증가, 종양 발생 억제, 미백 등에도 효과가 있다고 보고되어 있다.
한편, 상기 버섯류를 의약품, 기능성 식품의 혼합 원료로서 사용하기 위해서는 자실체인 버섯을 채취하여 사용해야 하지만 버섯 자체가 자연 상태에서 번식이 잘 되지 않는다는 점과, 채취 남용으로 인해 자원 고갈 및 생태계 파괴가 야기된다는 문제점이 있다. 산업적으로 사용할 수 있을 정도로 원료를 공급하기 위해서도 대량의 생산 시설 및 경비가 소요된다는 난점 때문에 대량 생산의 수요를 충족시키지 못하고 있다. 이와 같이, 상기 버섯류는 항암제나 면역 증강제로서 효과가 있음에도 그 공급이 제한적이며 대량 생산 및 속성 생산이 용이하지 않아 널리 활용되지 못하고 있다. 따라서, 상기 버섯들에 대하여, 버섯균의 자실체와 동등한 효과를 나타내는 균사체를 생산할 수 있는 대량 배양방법에 대한 연구가 최근 활발하게 이루어지고 있다.
대한민국 등록특허 제10-922311호에는 차가버섯, 상황버섯, 영지버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초 균사체를 복합배양하는 방법이 개시되어 있고, 대한민국 등록특허 제10-1358648호에는 차가버섯, 상황버섯 및 영지버섯의 복합배양방법이, 대한민국 등록특허 제10-1652035호에는 차가버섯, 상황버섯 및 꽃송이버섯의 복합버섯 균사체의 배양방법이 개시되어 있다. 그러나 복합버섯균사체는 그 배양조건에 따라 균사체가 갖는 자체의 효소활성이나 베타글루칸 함량 등에 차이가 있으며 이를 이용하여 식품을 가공할 경우에도 각각 다른 맛과 풍미 등을 낼 수 있다.
우리나라는 급속한 인구의 고령화로 인하여 치매 유병률 또한 급속도로 증가하고 있는데, 치매 위험성에 대한 경각심은 높지만 치매 증상에 대한 인식은 세계 평균보다 낮다는 조사결과도 있다. 특히 치매는 서서히 증상이 진행되기 때문에 조기에 병원을 찾아 정확한 진단을 받을 경우 충분한 호전 가능성이 있음에도 많은 사람들이 치료 시기를 놓치고 단시간에 중증 치매증상으로 발전하기 쉬워 이는 삶의 질이 급격히 떨어지는 것은 물론 가족들까지도 매우 큰 영향을 끼쳐 사회적 문제로도 발전하고 있어 치매의 조기진단은 매우 중요한 요소이다.
뇌는 수백억 개의 신경세포로 이루어져 있으며, 체중의 약 2%를 차지하나 무려 체내 산소의 20%, 포도당의 25%를 소비하는 기관임. 신경세포는 높은 수준으로 이미 분화된 세포이므로 손상에 이은 재생능력은 매우 제한적인 데 반하여 산화 스트레스에 의한 손상에 매우 취약하다. 이는, 항산화 기능을 갖는 글루타치온의 함량이 낮고, 신경세포 세포막에는 DHA나 아라키돈산과 같은 불포화 지방산이 많아 과산화에 의한 산화 스트레스를 통해 손상을 입기 쉬운 장기임에 기인한다.
치매는 다양한 원인에 의해 초래된 뇌기능의 손상으로 인해 기억력을 포함한 지남력, 언어능력, 판단력 등 인지기능이 저하되어 일상생활과 사회생활에 어려움을 초래하는 질병으로, 치매는 크게 3가지 종류로 나누며 각기 다른 원인에 의해 발생한다.
첫 번째로, 알츠하이머 치매는 가장 흔한 치매(약 70%를 차지)로 점진적으로 뇌의 퇴행성 변화가 와서 기억력을 비롯한 뇌의 전반적인 인지기능 저하가 진행되는 질환이다. 아직 질병의 완치는 힘들지만 증상을 개선시키고 진행을 느리게 하는 약제들이 개발되어 있다. 수많은 연구들이 진행되면서 알츠하이머에 관여하는 단백질들이 발견되고는 있으나 그 발병 원인은 아직 명확히 알려지지는 않은 상태이다. 다만, 환자들의 사후 뇌 조직을 분석한 결과, 신경세포 사이에 베타-아밀로이드 펩타이드가 축적되어 형성된 아밀로이드 플라크(amyloid plaques)와 신경세포 내의 과인산화된 타우 단백질 필라멘트에 의하여 형성된 신경섬유덩어리(neurofibrillary tangles)의 존재가 보고된 바 있다. 베타 아밀로이드는 펩타이드 36~43 개의 아미노산으로 구성되며, 베타 아밀로이드 펩타이드의 축적은 뇌 손상과 신경섬유덩어리의 발달에 앞서는 조기 병인으로 이제는 정설처럼 받아드려지면서 이와 관련된 활발한 연구가 진행되고 있고, 최근에는 베타 아밀로이드 생성을 억제하거나 제거하는 방법들이 알츠하이머 질환의 치료법으로 연구되고 있다.
혈관성 치매는 뇌혈관 질환으로 인해 뇌조직이 손상되어 발생하는 치매로 고혈압, 당뇨병, 고지혈증, 심장질환 등 뇌졸증의 위험인자를 지닌 경우에 많이 발생한다. 위험인자를 잘 관리하면 예방이 가능하고 조기에 치료하면 더 이상 악화되는 것을 막을 수 있다. 이 외의 치매는 약물 중독, 뇌종양 등 다양한 원인에 의한 기타 달리 분류되지 않는 치매가 있다.
한편, 치매가 아니더라도 인지기능저하 증상이 보이나 일상생활에는 지장을 주지 않을 정도의 증상을 경도인지기능장애라 하는데, 이 단계에서는 더 이상 진전되지 않는 경우, 점점 더 진행되는 경우, 서서히 회복되는 경우 등 다양한 양상을 나타낸다. 특히 국내 65세 이상 인구의 25%는 경도인지기능장애를 겪고 있는 것으로 알려져 있다. 이러한 경우 조기 발견 및 치료가 인지기능을 저하시키는 것을 억제하는 데에 가장 큰 도움을 줄 수 있다.
이에 본 발명자들은 복합배양 방법을 통해 얻은 3종 버섯의 균사체 및 이를 이용한 조성물이 기억력 증진, 치매 증상 개선 등의 인지개선 기능 효능이 있음을 확인하여 이들 증상의 치료 또는 개선용 조성물로 제공함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
(특허문헌 1) 대한민국 등록특허 제10-1923408호 (발명의 명칭 : 차가버섯, 영지버섯 및 상황버섯 균사체의 복합배양 방법, 출원인 : 주식회사 기운찬, 등록일 : 2018년11월23일)
(특허문헌 2) 대한민국 등록특허 제10-1652035호 (발명의 명칭 : 차가버섯, 상황버섯 및 꽃송이버섯의 복합버섯 균사체의 생산방법, 출원인 : 주식회사 기운찬, 등록일 : 2016년08월23일)
(특허문헌 3) 대한민국 등록특허 제10-1358648호 (발명의 명칭 : 버섯 추출물을 이용한 차가버섯, 상황버섯 및 영지버섯의 복합배양방법, 출원인 : 이태봉, 등록일 : 2014년01월28일)
(특허문헌 4) 대한민국 등록특허 제10-1269410호 (발명의 명칭 : 버섯배지를 이용한 차가버섯, 상황버섯, 영지버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초의 복합배양방법, 출원인 : 이태봉, 등록일 : 2013년05월24일)
(특허문헌 5) 대한민국 등록특허 제10-0922311호 (발명의 명칭 : 활성화된 당 관련 화합물을 함유하는 물질을 생성하는 차가버섯, 상황버섯, 영지버섯, 꽃송이버섯 및 동충하초의 복식 배양 방법, 출원인 : 이태봉, 등록일 : 2009년10월12일)
본 발명의 목적은 차가버섯, 영지버섯 및 상황버섯 3종의 복합버섯균사체를 함유하는 인지기능 또는 기억력 개선용 조성물을 제공하는 데에 있다.
본 발명은 차가버섯, 영지버섯 및 상황버섯 3종의 복합버섯균사체 또는 이의 추출물을 함유하는 인지기능 또는 기억력 개선용 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 치매의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 이용가능하다. 이에 상기 조성물은 치매의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로도 제공할 수 있다.
상기 복합버섯균사체는, (제1단계) 차가버섯, 영지버섯, 상황버섯의 자실체 조직을 각각 PDA(Potato Dextrose Agar)에 접종하여 각 버섯을 균사체 상태가 되도록 별도로 배양하는 단계;
(제2단계) 제1단계에서 배양된 각각의 차가버섯, 영지버섯, 상황버섯 3종의 균사체를 PDB(Potato Dextrose Broth)에 혼합 접종하는 단계;
(제3단계) PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에 접종된 3종의 균사체를 4~6주간 액체배양하여 복합 배양 균사체를 얻는 단계; 및,
(제4단계) 쌀보리 배지에 제3단계의 배양을 통해 얻은 복합 배양 균사체를 접종하고 배양하는 단계;
를 통해 배양된 것일 수 있다.
상기 제3단계의 균사체 액체 배양은 상대습도 10~30%, 25~30℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 또한 초기 1~2주 동안은 정치배양하되, 하루 주기로 1~2회 동안 1~5분간 교반하는 것이 바람직하며, 이후에는 50~150rpm으로 교반하며 진탕배양하는 것이 균사체의 배양에 좋다.
상기 제4단계의 쌀보리 배지는 쌀보리를 4~8시간 수침한 후 탈수하고, 탈수된 쌀보리 100 중량부 기준으로 0.5~2 중량부의 탄산칼슘을 첨가 후 120~125℃에서 30분~2시간 동안 멸균하여 얻은 것일 수 있다. 제4단계의 배양은 4~7주간 수행한다. 상기 제3단계의 균사체 액체 배양은 상대습도 40~60%, 25~30℃에서 수행하는 것이 바람직하며, 정치배양하되 하루 주기로 1~2회 동안 1~5분간 교반하는 것이 좋다.
본 발명에서 버섯 균사체의 배양에 이용되는 PDA(Potato Dextrose Agar)는 총 부피 1ℓ 기준, 감자전분 3~5g, 덱스트로오스 10~30g, 아가로오즈 10~30g이 포함된 것을 멸균하여 제조한 것일 수 있다. 이 때 물은 잔량으로 총 부피 1ℓ가 되도록 첨가될 수 있다.
상기 멸균은 적어도 1.3~1.7기압에서 120~125℃에서 15~20분 동안 수행하는 것이 바람직하며, 이는 모든 배지의 멸균 조건에 동일하게 적용할 수 있다.
PDA(Potato Dextrose Agar)의 가장 바람직한 제조조건은 감자 전분 4g, 덱스트로오스 20g 및 아가로오즈 15g을 총 부피 1ℓ가 되도록 물을 첨가하여 멸균한 것일 수 있다.
또한 본 발명에서 버섯 균사체의 배양에 이용되는 PDB(Potato Dextrose Broth)는 PDA(Potato Dextrose Agar)의 제조 조건에서 아가로오즈 대신 물을 더 추가하여 제조한 것일 수 있다. PDB(Potato Dextrose Broth)의 가장 바람직한 제조조건은 감자 전분 4g 및 덱스트로오스 20g을 총 부피 1ℓ가 되도록 물을 첨가하여 멸균한 것일 수 있다.
상기 제1단계에서 각각의 버섯 자실체를 별도로 배양할 때, 각각의 버섯 자실체 조각을 각각 PDA(Potato Dextrose Agar)에 접종 후 1~3주 동안 25~30℃에서 배양하는 것이 바람직한데, 이 때의 배양기간은 버섯 자실체 개체가 갖는 성장능에 따라 1~3 주 이내에서 적절히 조절할 수 있다. 또한, 이 조건에서의 배양시의 상대습도는 10~60%인 것이 더 좋다. 습도가 10% 미만이거나 60%를 초과하게 되어도 균사체의 성장은 더딜 수 있다.
다만 배양기간이 1주 미만이 되면 균사체가 이후의 액체배양을 활성화할 수 있을 정도로 잘 자라지 않을 수 있고, 3주를 초과하여도 이후의 액체배양시 균사체 배양이 잘 되지 않을 수 있다. 또한 배양 온도가 25℃ 미만이나 30℃를 초과하여도 역시 액체배양시의 균사체 배양에 영향을 주어 바람직하지 않다.
상기 제2단계에서 3종의 균사체를 PDB(Potato Dextrose Broth)에 복합 접종할 때, 제1단계에서 배양된 각 버섯의 균사체를 일정량 비슷한 정도로 접종하기만 하면 되지만, 보다 더 바람직하게는 각각의 배양된 균사체를 평방 0.5~2mm로 절단하고 각 버섯 균사체별로 3~7 절편씩 PDB(Potato Dextrose Broth)에 3종의 균사체를 복합 접종할 수 있다.
상기 제3단계의 균사체 배양은 25~30℃에서 수행하는 것이 바람직한데, 특히, 배양온도가 25℃ 미만이 되면 균사체가 잘 자라지 않을 수 있으며, 30℃를 초과해도 역시 균사체의 배양이 더딜 수 있다. 또한 초기 1~2주 동안은 정치배양하되, 하루 주기로 1~2회 동안 1~5분간 교반하는 것이 바람직하며, 이후에는 50~150rpm으로 교반하며 진탕배양하는 것이 균사체의 배양에 좋다. 한편, 이 조건에서의 배양시의 상대습도는 크게 제한되지는 않으나 바람직하게는 상대습도 10~30%인 것이 더 좋다.
상기 제4단계의 쌀보리 배지에는 제3단계의 배양을 통해 얻은 균사체를 배양액 상태로 1~10㎖씩 접종할 수 있다. 이 때 균사체 배양액이 1㎖ 미만으로 접종되면 균사체 양이 적어 추가배양이 잘 되지 않을 수 있고, 배양액이 10㎖를 초과하여 접종하여도 배양이 더 활성화되지는 않아 바람직하지 않다.
상기 제4단계의 쌀보리 배지는 쌀보리를 4~8시간 수침한 후 탈수하고, 탈수된 쌀보리 100 중량부 기준으로 0.5~2 중량부의 탄산칼슘을 첨가 후 120~125℃에서 30분~2시간 동안 멸균하여 얻은 것일 수 있다. 이 때 쌀보리가 물에 충분히 불려지지 않고 4시간 미만으로 수침한 것을 사용하게 되면 균사체 배양시의 수분이 부족하여 쌀보리를 영양원으로 잘 이용하지 못할 수 있고, 8시간 초과하여 수침하는 것은 그 이상의 수분이 쌀보리에 흡수되지는 않기 때문에 제조시간만 지연시키는 효과를 가져와 바람직하지 않다.
상기 제4단계의 배양은 25~30℃에서 수행하는 것이 바람직하다. 배양온도가 25℃ 미만이 되면 균사체가 잘 자라지 않을 수 있으며, 30℃를 초과해도 역시 균사체의 배양이 더딜 수 있다. 또한, 이 조건에서의 배양시의 상대습도는 40~60%인 것이 더 좋다. 습도가 40% 미만이거나 60%를 초과하게 되어도 균사체의 성장은 더딜 수 있다.
상기 3종 복합버섯균사체 추출물은 3종 복합버섯균사체를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 보다 바람직하게는 용매로서 물을 이용할 수 있고, 3종 복합버섯균사체의 중량 대비 5~20배 중량의 70~75℃의 열수를 가하여 8~15시간 동안 추출한 후의 액상을 동결건조한 것일 수 있다.
상기 3종 복합버섯균사체 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 3종 복합버섯균사체 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피를 사용할 수 있다. 상기 3종 복합버섯균사체 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.
또한, 당분야의 통상적인 방법으로서 상기 3종 복합버섯균사체의 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액 추출물을 물에 녹인 후에 n-헥산, 메틸렌클로라이드, 아세톤, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 n-부탄올로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종 이상의 용매를 사용하여 추가적으로 분획하여 분획물로 제조할 수 있다.
또다른 방법으로는, 3종 복합버섯균사체를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 3종 복합버섯균사체 추출물에, 물을 가하여 현탁한 후, 바람직하게는 3종 복합버섯균사체 추출물의 중량의 1~1000배, 더 바람직하게는 1~500배, 가장 바람직하게는 1~50배의 물을 가하여 현탁한 후, 상기 현탁물에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 얻은 3종 복합버섯균사체 분획물로 제조할 수 있다. 상기 3종 복합버섯균사체 분획물은 바람직하게는, 3종 복합버섯균사체를 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출 농축하여 얻은 3종 복합버섯균사체 추출물을 물에 현탁한 후 헥산과 혼합하여 얻은 헥산층의 농축물, 상기 헥산층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 클로로포름을 혼합하여 얻은 클로로포름층의 농축물, 또는 상기 클로로포름층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 에틸아세테이트를 혼합하여 얻은 에틸아세테이트층의 농축물, 상기 에틸아세테이트층을 제거하고 남은 잔사(물층)에 부탄올을 혼합하여 얻은 부탄올층의 농축물, 또는 상기 부탄올층을 제거하고 남은 잔사(물층)의 농축물일 수 있다. 한편, 이 외의 분획조건은 제한되지는 않으나, 상기 3종 복합버섯균사체 추출물에 3종 복합버섯균사체 추출물의 중량의 1~50배의 물을 가하여 현탁물을 제조한 후, 상기 물과 동량의 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 및, 부탄올로 이루어진 군에서 선택되는 용매를 가하여 분획할 수 있다. 또한, 헥산층을 제거한 후 남은 잔사에 클로로포름을 가하고, 클로로포름층을 제거하고 남은 잔사에 에틸아세테이트를 가하고, 에틸아세테이트층을 제거하고 남은 잔사에 부탄올을 가할 때에도, 단계적으로 이루어질 때도 역시 잔사와 동량의 각 용매(클로로포름, 에틸아세테이트 또는 부탄올)를 순차적으로 가하여 분획할 수 있다.
상기 추출물 또는 이의 분획물의 제조온도는 20 내지 100℃일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 추출 또는 분획 시간은 특별히 제한되는 것은 아니나, 10분 내지 2일 이내에 추출하는 것이 바람직하며, 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 추출물 또는 분획물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다. 또한, 상기 추출물 또는 분획물은 컬럼크로마토그래피를 이용하여 정제하여 사용할 수 있다.
상기 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 컬럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.
상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.
본 발명은 3종의 복합버섯균사체, 또는 이의 추출물과 약제학적 부형제를 포함하는 인지기능 또는 기억력 개선용 약학 조성물을 제공할 수 있다. 또한 상기 약학 조성물은 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물로도 이용가능하다.
상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 복합버섯균사체에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 복합 배양 균사체는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
또한, 본 발명은 3종의 복합버섯균사체, 또는 이의 추출물과 각종 식품 부형제를 포함하는 인지기능 또는 기억력 개선용 건강기능식품을 제공한다. 또한 상기 건강기능식품은 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품으로도 이용가능하다. 상기 균사체는 본 발명의 건강기능식품에 0.001~100 중량%로 하여 첨가될 수 있다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 드링크제, 육류, 소세지, 빵, 캔디류, 스넥류, 면류, 아이스크림, 유제품, 스프, 이온음료, 음료수, 알코올 음료, 껌, 차 및 비타민 복합제 등이 있다.
본 발명은 복합버섯균사체를 함유하는 인지 기능 개선용 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 복합버섯균사체는 기억력 증진, 공간인지 능력 개선, 뇌신경세포에서의 염증반응을 억제하는 효능이 우수하여, 혈관성 치매, 알츠하이머성 치매를 비롯한 노인성 뇌질환의 개선 효과가 우수한 약학 조성물 또는 건강기능식품으로의 제공이 가능하다.
도 1a 내지 도 1d는 Barnes maze test에서 3종 복합버섯균사체 추출물의 기억력 저하 개선효과를 나타내는 결과 그래프이다. (도 1a:이동거리, 도 1b:이동속도, 도 1c:도피처 도달시간, 도 1d:동선분석)
도 2a 및 도 2b는 치매 랫드에서 도피처 탐색 및 정체시간에 미치는 3종 복합버섯균사체 추출물의 영향을 나타내는 결과 그래프이다. (도 2a:도피처 탐색 동선, 도 2b:도피처 정체시간)
도 3a 및 도 3b는 Y maze test에서 3종 복합버섯균사체 추출물의 기억력 회복효과를 나타내는 결과 그래프이다. (도 3a:Spontaneous alternation, 도 3b:Total entries)
도 4a 및 도 4b는 Passive avoidance test에서 3종 복합버섯균사체의 기억력 회복효과를 나타내는 결과 그래프이다. (도 4a:Step-through latency, 도 4b:Escape latency)
도 5a 및 도 5b는 3종 복합버섯균사체에 의한 해마 CA1 영역 신경세포 사멸 억제효과를 나타내는 결과 그래프이다. (도 5a:해마 CA1 영역 염색, 도 5b:신경세포 수)
도 6a 내지 도 6d는 BV2 미세아교세포 염증반응에 대한 3종 복합버섯균사체의 억제활성을 나타내는 결과 그래프이다. (도 6a:Growth, 도 6b:NO, 도 6c:TNF-α, 도 6d:IL-6)
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
< 실시예 1. 버섯 균사체의 복합 배양>
차가버섯, 영지버섯, 상황버섯의 자실체 조직을 분리하여 PDA에 접종 후, 2주 동안 27~29℃에서 각 버섯의 균사체를 배양하였다. 100㎖ 단위로 소분된 PDB 배지를 준비한 후, PDA에서 배양된 각각의 버섯 균사체를 메스를 이용하여 평방 1mm로 절단하고, PDB 배지가 담긴 삼각플라스크 1병당 절단한 3종의 균사체를 5절편씩 혼합 접종하였다.
긱 균사체가 혼합 접종된 배지를 BOD incubator(Bio-Oxygen Demand 배양기, 저온배양기)에서 27~28℃, 습도 20% 조건에서 1주일간 정치 배양하되, 배양하는 동안 매일 1분 정도 교반하였다. 1주일 후에는 복합 접종되어 배양 중인 플라스크를 진탕배양기로 옮겨 27℃, 100rpm에서 4주 동안 배양하여 3종의 복합버섯균사체 배양액을 제조하였다.
쌀보리를 6시간 동안 수침한 후 8시간 동안 탈수하고, 탈수된 쌀보리 100g 기준 1g의 탄산칼슘을 첨가하여 골고루 혼합하고 고압멸균기에 121℃에서 1시간 동안 멸균하여 쌀보리 배지를 제조하였다. 멸균 종료 후 25℃로 냉각된 쌀보리 배지 1kg당 5주간 배양된 복합버섯균사체 배양액 5ml씩을 분주하여 접종하였다. 접종 후에는 온도 26~28℃, 습도 45~50%로 유지되는 배양실에서 30일간 배양하였다.
배양이 완료된 복합버섯균사체는 쌀보리가 포함된 채로 건조기를 이용하여 57~60℃에서 24시간 동안 건조하고 핀밀분쇄기를 이용하여 분쇄하여 분말로 제조하였다.
한편, 이 방법은 대한민국 등록특허 제10-1923408호의 실시예 1에 개시된 방법과 동일하다.
< 비교예 1 내지 8. 비교조건 버섯의 배양>
비교예 1
실시예 1의 방법에서 3종 버섯의 균사체를 복합접종하는 대신 차가버섯 균사체만 PDB에 단일 접종하여 이후의 배양과정을 동일하게 하였다.
비교예 2
실시예 1의 방법에서 3종 버섯의 균사체를 복합접종하는 대신 영지버섯 균사체만 PDB에 단일 접종하여 이후의 배양과정을 동일하게 하였다.
비교예 3
실시예 1의 방법에서 3종 버섯의 균사체를 복합접종하는 대신 상황버섯 균사체만 PDB에 단일 접종하여 이후의 배양과정을 동일하게 하였다.
비교예 4
실시예 1의 방법에서 PDB 배양 단계를 생략하고, 3종 버섯의 균사체를 바로 쌀보리 배지에 접종하며, 대신 배양기간을 PDB 배양단계만큼 추가 수행하였다.
비교예 5
실시예 1의 방법에서 PDB 배양 단계를 수행 후, 다시 새로운 PDB 배지에 재접종 하여 추가적인 액체배양을 30일간 수행하였다 (쌀보리 배지에서 배양하는 과정은 생략).
비교예 6
대한민국 등록특허 제10-1652035호의 제조예 1 및 실시예 1의 방법으로 차가버섯, 상황버섯 및 꽃송이버섯의 복합버섯균사체를 제조하였다.
비교예 7
비교예 2와 같이 대한민국 등록특허 제10-1652035호의 제조예 1 및 실시예 1의 방법으로 복합버섯균사체를 제조하되, 꽃송이버섯 대신 영지버섯을 이용하여 복합버섯균사체를 제조하였다.
비교예 8
대한민국 등록특허 제10-1358648호의 실시예 1의 방법으로 차가버섯, 영지버섯 및 상황버섯 균사체의 복합버섯균사체를 제조하였다.
< 실험예 1. 실험동물 및 세포의 준비>
SD rat(수컷, 8주령)를 각 군당 7마리씩으로 하여, 3종 복합버섯균사체 5 mg/kg(시료-L) 혹은 15 mg/kg(시료-H)를 증류수 1mL로 희석하여 1일 1회, 총 3주 동안 경구투여하였다. 위약(vehicle)으로서는 증류수(vehicle)를 사용하였다. 각 군의 투여 종료 1일 후 Bilateral common carotid artery occlusion and hypovolemia (2VO/H) 수술을 통하여 혈관성 치매 rat 모델을 제작하고 다음과 같은 실험을 진행하며 대조군(normal)의 결과와 비교하였다.
또한 미세아교세포인 BV2 세포의 염증반응에 대한 3종 복합버섯균사체 추출물의 억제활성을 측정하였다.
< 실험예 2. Barnes maze test>
바닥으로부터 1.2 m 떨어진, 20개의 원형 구멍이 뚫린 barnes 미로를 준비하고, 원형 구멍들 중 하나의 구멍 아래엔 도피처(platform)를 마련하여 두었다. 미로 위에는 혐오자극의 제공을 위해 LED를 설치하고, 연동된 video-tracking system을 이용하여 동선 추적 및 도피처까지의 도달 시간과 거리 등을 분석하였다.
도피처 도달능 평가를 위하여 하루에 한 번씩 4일 간 최대 2분 간 동일 지점으로부터 도피처까지의 이동 내용을 분석에 이용하였다. 반면 도피처 탐색능 평가를 위해서는 4일 간의 도피처 도달능 평가가 끝난 직후 1회적으로 도피처가 있던 구멍에서 도피처를 없앤 후, 2분 동안 미로에서 도피처를 찾기 위한 이동 내용을 분석에 이용하였다.
이에 대한 결과는 도 1a 내지 도 1d에 나타내었는데, 모든 군은 1일 차보다 4일 차에 점점 도피처로 도달하는 데 소요된 이동거리와 시간이 점차 짧아지는 것으로 나타났다.
그러나 수술에 의해 혈관성 치매가 유발되고 다른 처치를 하지 않은 Vehicle군은 다른 군들보다 이동 거리와 시간의 단축 경사도가 낮은 것으로 관찰되었다.
이와 비교하여, 3종 복합버섯균사체 추출물을 투여한 시료-L 투여군과 시료-H 투여군은 Vehicle군보다 이동 거리와 시간이 현저하게 단축된 것으로 확인되었으며, 이러한 경향은 투여 농도에 의존하는 것으로 나타났다.
한편 도피처 탐색능 실험에 있어서는, 정상군(Normal)은 도피처가 있던 사분면에 50% 이상 머물며 탐색 활동을 하는 것으로 나타났으나, Vehicle군은 Normal군보다 타겟 사분면에 머문 시간이 유의하게 짧아진 것으로 확인되었다(도 2a 및 도 2b). 즉 혈관성 치매 유도에 의해 인지기능이 저하되어 도피처를 찾아 그곳에서 머무는 시간이 짧아진 것으로 판단되었다. 이에 반하여 3종 복합버섯균사체 추출물을 투여한 시료-L 및 시료-H 처리군은 비록 농도의존성은 인정되지 않으나 Vehicle군보다 타겟 사분면에 머문 시간이 유의하게 증가하는 것으로 확인되었다.
< 실험예 3. Y maze test>
Barnes maze test가 끝난 4일 째에 Y자 모양의 검은 색 플라스틱으로 제작된 미로에 각 rat을 위치시켰다. 각 rat 당 8분 동안 A, B, C로 각각 명칭이 붙은 세 개의 arm으로 이동한 총 횟수(total entries; 운동능력을 시사)와 세 개의 arm으로 번갈아가며 이동한 횟수(spontaneous alternation; 기억력을 시사)를 분석하였다.
분석 결과, 모든 군은 total entries 면에서 동일한 결과를 나타내어, 운동능력 면에서는 모든 군이 거의 차이가 없이 동일한 것으로 나타났다(도 3b). 그러나 자발적 교대(spontaneous alternation)에 있어서는 Vehicle군은 Normal군에 비해 낮은 수치를 나타내어, 기억력이 현저하게 감소된 것으로 판단되었다(도 3a). 이에 반하여 시료-L과 시료-H 군에 있어서는 Vehicle군과 비교하여 자발적 교대 능력이 유의하게 상승하는 것으로 나타났다. 이는 3종 복합버섯균사체 추출물 투여에 의해 기억력의 감소가 억제되었다는 것을 의미한다.
< 실험예 4. 수동회피실험(passive avoidance test)>
위에서 기술한 두 가지 행동 평가가 끝난 직후 각 rat을 수동 회피 검사 상자에 위치시켰다. Rat을 밝은 상자에 넣은 후, 가운데 사이막을 제거하여, 자연스레 어두운 상자로 이동하도록 만들고, 이를 3회 반복하여 마지막 회에서 어두운 상자로 이동하기까지의 속도(step-through latencies; 회피 본능 정도를 시사)를 측정하였다. 이와 동시에 어두운 상자에 3초 동안 전기자극을 주고 rat을 꺼냈다. 24시간 후 각 rat을 밝은 상자에 넣은 후, 사이막을 제거한 후, 어두운 상자로 이동하기까지의 시간(escape latencies; 기억력을 시사)을 분석하였다.
분석 결과, 모든 군이 쇼크실 도달시간(step-through latencies)에 있어서 동일한 결과를 보여, 군 간의 실험적 편차는 없었으며, 이는 혐오자극을 기피하는 본능 면에서 각 군 별로 상이하지 않다는 것으로 시사하였다(도 4a). 그러나 탈출잠복기(escape latency) 면에서 Vehicle군은 Normal군보다 수치가 낮아 학습력과 기억력이 저하된 것으로 확인되었다(도 4b). 하지만 3종 복합버섯균사체 추출물을 투여한 시료-L과 시료-H 투여군은 Vehicle군보다 escape latency 수치가 상승하여 학습력 및 기억력이 향상된 것으로 추정되었다(도 4b). 특히 투여량이 높은 시료-H 군에서 시료-L 군 보다도 상승도가 높은 것으로 보아, 높은 투여량에서 효과가 안정적인 것으로 판단되었다.
< 실험예 5. 해마 CA1 영역의 생존 신경세포수 측정>
모든 행동 검사가 끝나고, rat들을 고정액(4% paraformaldehyde)으로 심장 관류시키고 뇌를 적출하여 해마가 위치하는 부분을 관상면으로 잘라서 파라핀 블록으로 제작하였다. 이를 5 μm 두께로 박절하고, cresyl violet 시약으로 염색함. 광학현미경으로 관찰하면서 해마 CA1 영역 단위 면적(500 μm2) 당 생존한 신경세포의 수를 counting하였다.
분석 결과, Normal군은 정상적인 형태의 신경세포가 세포수의 감소 없이 존재하는데 반하여, Vehicle군은 Normal군에 비하여 약 1/4 정도로 신경세포 수가 급감하는 것으로 관찰되었다(도 5a). 이는 2VO/H 유도에 의해 해마 CA1 영역에 광범위한 세포사멸을 동반하는 혈관성 치매가 발생하였음을 시사하는 것이다. 하지만 3종 복합버섯균사체를 투여한 시료-L과 시료-H 처리군은 Vehicle군보다 해당 영역의 생존 신경세포 수가 투여량에 의존하여 유의하게 증가하였다(도 5b). 이는 3종 복합버섯균사체 추출물 투여에 의해 혈관성 치매가 억제되어, 이에 동반되는 신경세포의 사멸이 유의하게 감소되었음을 시사하는 것이다.
< 실험예 6. BV2 미세아교세포 염증반응 억제 실험>
BV2 microglia 세포의 염증반응은 이 세포를 1x104/well이 되도록 96 well plate에 넣은 후, 100 ng/ml의 LPS(Lipopolysaccharide)를 24시간 처리하여 유도하였다. 3종 복합버섯균사체 추출물의 염증억제 활성은, 세포에 LPS를 처리하기 전에 이 시료를 여러 농도(0-500 μg/ml)로 12시간 전처리하여 측정하였다. 항염증 활성은 세포 배양액 중에 분비된 염증매개인자인 Nitric Oxide(NO), TNF-α(Tumor Necrosis Factor-α), IL-6(Interleukin 6) 등을 정량하여 판정하였다.
미세아교세포는 뇌에서 염증을 유도하여 치매와 같은 뇌병변을 유발하는 세포로서, 이 세포의 염증반응 억제는 치매 및 인지기능의 개선에 직결된다. LPS로 유도된 BV2 미세아교세포 염증반응에 대해 3종 복합버섯균사체는 NO, TNF-α, IL-6 등 염증매개인자의 생성을 유의하게 억제하였다(도 6a 내지 도 6d). 이 결과를 통해 3종 복합버섯균사체 추출물에 의한 인지기능 개선효과가 미세아교세포의 염증반응 억제와 관련된 것임이 입증된다.
< 실험예 7. 아밀로이드 베타의 응집 저해 활성 확인>
실시예 1의 복합버섯 균사체가 갖는 퇴행성 신경질환 유발원인 물질인 아밀로이드 베타의 응집 완화 효과를 형광분석법(ThioflavinT assay)으로 측정하였다. 아밀로이드 베타 펩티드(Aβ1-42)는 5 μM의 농도로 사용하였으며, 사용 전 -80 ℃에 보관하였다. 각 추출물은 증류수에 시험농도별로 희석하였다. Aβ1-42 응집 억제 정도를 특정하기 위하여 0.01 M 인산소다 완충용액 92.5 ㎕에 각 시료 추출물 희석액을 5 ㎕씩 가하고 5 μM Aβ1-42 2.5 ㎕를 가한 뒤, 37 ℃에서 26시간 반응시킨 후, 5 μM 티오플라빈T 2,000 ㎕를 가하여 형광분광 분석기로 측정하였다. 이 때 처리된 각 시료는 최종 농도가 1㎍/㎖이 되도록 하였다.
이에 대한 결과는 표 1에 무처리군의 응집값을 기준으로 대비하여 나타내었는데, 실시예 1의 균사체의 추출물이 아밀로이드 베타의 응집 저해 효과가 우수한 것으로 확인된다.
각 균사체 추출물 아밀로이드 응집 억제율
실시예 1 95.38
비교예 1 23.20
비교예 2 33.21
비교예 3 31.25
비교예 4 34.24
비교예 5 45.28
비교예 6 51.34
비교예 7 53.12
비교예 8 54.12
<제제예 1. 약학적 제제>
제제예 1-1. 정제의 제조
본 발명 실시예 1의 복합버섯 균사체 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.
<제제예 2. 식품 제조>
제제예 2-1. 조리용 양념의 제조
본 발명 실시예 1의 복합버섯 균사체를 조리용 양념에 1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.
제제예 2-2. 밀가루 식품의 제조
본 발명 실시예 1의 복합버섯 균사체를 밀가루에 0.1 중량%로 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.
제제예 2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조
본 발명 실시예 1의 복합버섯 균사체를 스프 및 육즙에 0.1 중량%로 첨가하여 건강 증진용 수프 및 육즙을 제조하였다.
제제예 2-4. 유제품(dairy products)의 제조
본 발명 실시예 1의 복합버섯 균사체를 우유에 0.1 중량%로 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.
제제예 2-5. 야채주스 제조
본 발명 실시예 1의 복합버섯 균사체 0.5g을 토마토주스 또는 당근주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채주스를 제조하였다.
제제예 2-6. 과일주스 제조
본 발명 실시예 1의 복합버섯 균사체 0.1g을 사과주스 또는 포도주스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일주스를 제조하였다.

Claims (6)

  1. 차가버섯, 영지버섯, 상황버섯의 복합버섯균사체를 함유하는 것을 특징으로 하는 인지기능 또는 기억력 개선용 조성물.
  2. 제1항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  4. (제1단계) 차가버섯, 영지버섯, 상황버섯의 자실체 조직을 각각 PDA(Potato Dextrose Agar)에 접종하여 각 버섯을 균사체 상태가 되도록 별도로 배양하는 단계;
    (제2단계) 제1단계에서 배양된 각각의 차가버섯, 영지버섯, 상황버섯 3종의 균사체를 PDB(Potato Dextrose Broth)에 혼합 접종하는 단계;
    (제3단계) PDB(Potato Dextrose Broth) 배지에 접종된 3종의 균사체를 4~6주간 액체배양하여 복합 배양 균사체를 얻는 단계; 및,
    (제4단계) 쌀보리 배지에 제3단계의 배양을 통해 얻은 복합 배양 균사체를 접종하고 배양하는 단계;
    를 포함하여 배양된 복합버섯균사체를 함유하는 것을 특징으로 하는 인지기능 또는 기억력 개선용 조성물.
  5. 제4항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제4항의 조성물을 함유하는 것을 특징으로 하는 치매 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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