TWI384992B - 取自牛樟芝〈antrodia camphorata〉之新穎化合物 - Google Patents

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取自牛樟芝( ANTRODIA CAMPHORATA )之新穎化合物
本發明係關於取自牛樟芝(Antrodia camphorata )之新穎且具有免疫刺激性及抗發炎性化合物。
牛樟芝(Antrodia camphorata ，其等同於Taiwanofungus camphorata )係台灣原生種。其子實體係非常少見及昂貴之蕈類，其在野外緩慢生長，且極難以在溫室中種植。在台灣，牛樟芝之子實體傳統上已被作為中草藥，且其常稱為「樟芝(jang-jy)」或「牛樟芝(niu-chang-chih)」(Shen C.C. et al.,J. Chin. Med . 2003,14,247-258)。
在自然中，牛樟芝係生長於牛樟(Cinnamomun kanehirai Hay(樟科(Lauraceae)))之內心材壁上，牛樟係一種台灣之特有且瀕臨絕種之原生物種。野生牛樟芝子實體含有脂肪酸、木酚素、苯基衍生物、倍半萜、類固醇、及三萜類化合物(Shen C.C. et al.，上述文獻)。在傳統中醫中，牛樟芝之子實體已被用於治療食物及藥物中毒、腹瀉、異常疼痛、高血壓、皮膚搔癢、以及肝癌
本發明提供來自於牛樟芝之新穎化合物。在本發明中，其已自固態培養之牛樟芝子實體中分離出部分新穎之順丁烯二酸及琥珀酸衍生物。
本發明之目標係提供一種化合物或其醫藥上可接受之鹽，其係選自由下列者所組成之群：
及
其中R獨立係H、、、甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、、或，其中X=H、OH、OR、NH2 、或NHR(其中R=烷基或醯基)。
根據本發明，該等化合物可提供抗發炎或免疫刺激作用。本發明之另一目的係提供一種免疫調節醫藥組合物，其包含該化合物或其醫藥上可接受之鹽，以及醫藥上可接受之載體。
本發明提供一種化合物或其醫藥上可接受之鹽，其係選自由下列者所組成之群：
及
其中R獨立係H、、、甲基、乙基、丙基、丁基、異丙基、、或，其中X=H、OH、OR、NH2 、或NHR(其中R=烷基或醯基)。
本發明之化合物可分離自天然來源，諸如牛樟芝之子實體，或可由化學合成。為自牛樟芝之子實體取得本發明之化合物，可經由任何習知之方法進行萃取。在一實例中，其收集似靈芝(Ganoderma )真菌(如，牛樟芝)之子實體，乾燥，再浸泡於醇中(如，甲醇、乙醇、或其混合物)一段適當之時間(如，至少四天)。在經由，如，真空，除去該醇後，加入水。以適當之極性溶劑(如，EtOAc)對該懸浮相進行分離。將該極性溶劑層濃縮成為黑色之糖漿(如，藉由蒸餾)。接著，經由任何形式之純化，分離該糖漿中之混合物，諸如，但不限於，管柱層析，使用正己烷、EtOAc、及MeOH。以1 H及13 C NMR鑑定該終化合物，取得六種新穎之化合物：反式-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2,5-二酮(式I，其亦稱為化合物1)，反式-1-羥基-3-(4-羥苯基)-4-異丁基吡咯啶-2,5-二酮(式II，其亦稱為化合物2)，順式-3-(4-羥苯基)-4-異丁基二氫呋喃-2,5-二酮(式III，其亦稱為化合物3)，3-(4-羥苯基)-4-異丁基-1H-吡咯-2,5-二酮(式IV，其亦稱為化合物4)，3-(4-羥苯基)-4-異丁基呋喃-2,5-二酮(式V，其亦稱為化合物5)，及二甲基-2-(4-羥苯基)-3-異丁基順丁烯二酸二甲酯(式VI，其亦稱為化合物6)。
在本發明中，其發現本發明之化合物具有免疫刺激作用，並具有抗發炎作用。就本發明化合物之免疫刺激作用而言，其使用一種巨噬細胞株RAW264.7的細胞激素生成模式進行判定。已知巨噬細胞係組織中源自稱為單核細胞(monocyte)之特定白血球的細胞。其係先天性免疫系統之一部份，其可辨識、吞噬、並摧毀諸多潛在之病原體，包括細菌、病原性原生動物、真菌、及蠕蟲。和分泌細胞相同，活化之巨噬細胞對於免疫反應之調控及發炎之發展而言極為重要；其會大量生產出令人驚異群組之強力化學物質(單核因子(monokines))，包括酶、補體蛋白、以及調控因子，諸如，IL-1β、TNF-α、IL-6、及一氧化氮(NO)。巨噬細胞株(諸如小鼠RAW264.7及人類THP-1)已被推薦作為快速體外篩選免疫調控作用劑之方法(Singh,U. et al.,Clin.Chem . 2005,51,2252-2256)。在本發明之實例中，本發明之化合物經證實可誘發TNF-α之自發性生成(參見實例3)；且該等化合物經證實可抑制IL-6之自發性生成(參見實例4)。
由於其絕佳之體外免疫調控活性，該化合物或其醫藥上可接受之鹽可在用以刺激免疫力或抗發炎之醫藥組合物中作為活性成分。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含該化合物或其醫藥上可接受之鹽，以及醫藥上可接受之載體。特定言之，本發明提供一種用以刺激免疫反應及/或抗發炎之免疫調節醫藥組合物，其包含治療有效量之該化合物或其醫藥上可接受之鹽。
名辭「治療有效量」在本文中係指一種組合物之量，其可在欲治療之對象體內誘發上述之醫學目標結果。舉例而言，足以降低或減少免疫細胞(例如巨噬細胞)之細胞激素(如，TNF-α、IL-6)生成的該化合物或其醫藥上可接受之鹽的量，係為調節免疫力之有效量。在個別情形下，該治療有效量可由熟習技藝者使用技藝中已知且已建立方法而由經驗判定。
本發明之醫藥組合物可由習知之方法而以一或多種醫藥上可接受之載體製造。名辭「醫藥上可接受之載體」在本文中涵括任何標準之醫藥載體。此等載體可包括，但不限於：鹽水、緩衝鹽水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
投藥之途徑可以任何方式投與。舉例而言，其可經口服、皮下、血管內、靜脈內、腹膜內、局部、經鼻、或經肺投藥。
本發明之醫藥組合物可被製成任何適於所選投藥方式之形式。舉例而言，適於口服投藥之組合物包括固體形式，諸如，丸劑、膠囊、顆粒、錠劑、及粉末，以及液體形式，諸如，溶液、糖漿、酊劑、及懸浮液。可用於腸外投藥之形式包括無菌溶液、乳液、及懸浮液。其中可納入本發明之組合物以進行口服或是注射投藥之液體形式包括水溶液、經適當調味之糖漿、水或油懸浮液、以及以食用油(諸如，玉米油、棉籽油、芝麻油、椰子油、或花生油)調成之乳液、以及酊劑及類似之醫藥載劑。
除標準之載體外，本發明之口服醫藥組合物可添加一或多種正常用於口服調配物中之賦形劑，諸如，界面活性劑、助溶劑、安定劑、乳化劑、增稠劑、著色劑、甜味劑、調味劑、以及防腐劑。此等賦形劑係為熟習技藝者所熟知。
本發明進一步由下例實例說明，其目的係為說明而非限制之提供。
材料及方法
一般實驗流程
熔點係以Yanagimoto微熔點裝置測定並未經校正。IR光譜係在Perkin-Elmer 983G分光光度計上記錄。1 H、13 C、及DEPT光譜係在Bruker DMX-400分光光度計上取得，而二維NMR光譜係在Bruker DMX-500分光光度計上取得。EIMS、UV、及比旋光度係分別使用JEOL JMS-HX 300,Hitachi S-3200分光光度計及JASCO DIP-180數位偏光計測定。萃取物首先係在矽膠(Merck 70-230篩目，230-400篩目，ASTM)上進行初步分離，再接著在LDC Analytical-III系統上，以半製備性正常相HPLC管柱(250 x 10mm,7μm,LiChrosorb Si 60)進行純化。
植物材料
牛樟芝之固態培養子實體係由偉翔生技開發股份有限公司(Well Shine Biotechnology Development，台北，台灣)辨識及提供。其憑證樣本寄存於偉翔生技開發股份有限公司。
統計分析
數據係以三次獨立實驗之平均值±標準差表示。各處理組別間之差異顯著性係在整個實驗之中，使用策略應用軟體(Strategic Application Software)(SAS Windows 8.2版；SAS Institute Inc.,Cary,NC)，以非成對史都登氏t檢驗(unpaired Student's t test)進行分析。數據係以平均值±SD表示。p <0.05之數值視為具有顯著性。
實例1：化合物之分離及定性
在室溫下以MeOH(12L)浸漬牛樟芝之固態培養子實體(3.0kg)以進行萃取(4天×3)。在真空下除去MeOH後，加入水使總體積成為1L。以EtOAc(1L×3)對此懸浮相進行分離。對結合之EtOAc層進行蒸餾產生黑色糖漿(212g)。在矽膠管柱上(10 x 70cm，Merk 70-230篩目)，使用漸增極性之正己烷、EtOAc、及MeOH作為溶析液，對該EtOAc層之區份(200g)進行層析，取得9個區份：區份1[8000mL，正己烷/EtOAc(19:1)]，區份2[7000mL，正己烷/EtOAc(9:1)]，區份3[6000mL，正己烷/EtOAc(8:2)]，區份4[10000mL，正已烷/EtOAc(7:3)]，區份5[8000mL，正己烷/EtOAc(1:1)]，區份6[9000mL，正己烷/EtOAc(1:3)]，區份7(8000mL，EtOAc)，區份8[7000mL，EtOAc/MeOH(1:1)]，區份9(6000mL，MeOH)。接著進行液體-液體之分離，以取得具有抗發炎活性之EtOAc層之區份。在矽膠管柱上進行進一步之分級分離，以取得富含抗發炎活性之區份，其中該粗製萃取物及EtOAc層區份，經試驗後發現對於IL-6生成可產生50%抑制之濃度分別為42及30μg/mL。對具有生物活性之區份進行進一步之化學分析，自區份6產生六種新穎之化合物。以4mL/min之正己烷/EtOAc(4:1)作為溶析液而在正常相管柱上進行HPLC的分離，分別產生化合物1(12.5mg)、化合物2(22.6mg)、化合物3(6.8mg)、化合物4(9.4mg)、化合物5(15.0mg)、化合物6(13.2mg)、及化合物7(8.9mg)。上述之化合物1-6分別為：反式-3-異丁基-4-[4-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]吡咯啶-2,5-二酮(式I，其亦稱為化合物1)，反式-1-羥基-3-(4-羥苯基)-4-異丁基吡咯啶-2,5-二酮(式II，其亦稱為化合物2)，順式-3-(4-羥苯基)-4-異丁基二氫呋喃-2,5-二酮(式III，其亦稱為化合物3)，3-(4-羥苯基)-4-異丁基-1H-吡咯-2,5-二酮(式IV，其亦稱為化合物4)，3-(4-羥苯基)-4-異丁基呋喃-2,5-二酮(式V，其亦稱為化合物5)，及二甲基-2-(4-羥苯基)-3-異丁基順丁烯二酸二甲酯(式VI，其亦稱為化合物6)。
式I至式VI化合物之1 H及13 C NMR數據如表1及表2所示。
實例2：諸等化合物之免疫刺激作用
如Chen and Lin(Chen,M.L. et al.,Int. Arch. Allergy Immunol . 2007,143,21-30)所述，以夾層ELISA法測量培養上清液中之細胞激素含量。簡言之，以抗細胞激素抗體(PharMingen,San Diego,CA)塗覆96孔試驗盤(Nunc,Roskilde,Denmark)後在4℃下隔夜反應，並以1% BSA PBS緩衝液進行阻斷30分鐘。將樣本及標準物(重組小鼠細胞激素，PharMingen)加入該等96孔試驗盤中進行2小時之反應。加入生物素複合抗體(生物素連結大鼠抗小鼠細胞激素單株抗體，PharMingen)並進行反應。在清洗後，加入鏈黴親和素複合過氧化酶處理1小時。將受質2,2'-次偶氮基-雙-3-乙基-苯並噻唑啉-6-磺酸(ABTS,Sigma)加入各孔處理20分鐘。在微盤自動分析儀中(Microplate autoreader;Bio-Tek Instruments,Winooski,VT)，在405nm下對該等試驗盤進行判讀。
為評估此等新穎化合物之免疫刺激作用，以無或不同濃度之本發明化合物，於體外處理RAW264.7細胞，並使其細胞激素生成48小時。收集上清液以進行TNF-α分析，並收集細胞以MTT法進行存活率分析。數據係以三次獨立實驗(其各有三次重複)之平均值±SD顯示。
如表3所示，化合物1 顯著增加RAW264.7細胞之自發性TNF-α分泌而不影響細胞存活率，其顯示化合物1 具有活化巨噬細胞之潛力。由0.5~5μg/mL之化合物1 刺激RAW264.7細胞產生之TNF-α分泌量係以劑量相關形式增加。此等數據顯示，化合物1 可刺激巨噬細胞分泌TNF-α而無細胞毒性。
實例3：諸等化合物之抗發炎作用
IL-6(一種係感染時具指標性的促發炎細胞激素)係由巨噬細胞在諸多感染及發炎狀態下分泌，包括心臟手術、心源性休克、冠狀動脈繞道、及細菌性敗血症(Kantar,M. et al.,Eur. J. Pediαtr . 2000,159,156-157)。已有研究報導IL-6之血清濃度與疾病之嚴重性具相關性(Pathan,N. et al.,Lαncet 2004,363,203-209)。茲測量經LPS-刺激之巨噬細胞之IL-6生成，以評估諸等化合物之抗發炎作用。將該等細胞以牛樟芝之分離物預處理30分鐘，接著以50ng/mL之LPS刺激48小時。收集上清液進行TNF-α及IL-6分析，並收集細胞以MTT法進行存活率分析。數據係以平均值±SD顯示。
如表4所示，此等化合物並未影響RAW264.7巨噬細胞株之存活率。當該等細胞經LPS刺激時，處理化合物1的組別，其IL-6生成隨劑量漸增而顯著減少。化合物1對IL-6生成產生50%抑制所需之濃度(IC50 )係10μg/mL。化合物3、4、及6亦可抑制IL-6生成，IC50 值分別為17、18、及25μg/mL。化合物2及5之IC50 值分別為54及96μg/mL。
熟習技藝者將可明瞭，可對上述之具體實例進行變化而不偏離其廣泛之發明概念。因此，咸可明瞭，本發明並不限於所揭示之特定具體實例，其係欲涵括由附呈之申請專利範圍所定義之本發明精神及範圍中之修飾。

Claims (12)

  1. 一種化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物係選自由下列者所組成之群：反式-1-羥基-3-(4-羥苯基)-4-異丁基吡咯啶-2,5-二酮，順式-3-(4-羥苯基)-4-異丁基二氫呋喃-2,5-二酮，3-(4-羥苯基)-4-異丁基-1H -吡咯-2,5-二酮，3-(4-羥苯基)-4-異丁基呋喃-2,5-二酮，及二甲基-2-(4-羥苯基)-3-異丁基順丁烯二酸二甲酯。
  2. 根據請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物具有免疫刺激作用。
  3. 根據請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物具有抗發炎作用。
  4. 根據請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，其中該化合物同時具有免疫刺激及抗發炎作用兩者。
  5. 一種醫藥組合物，其包含根據請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽，以及醫藥上可接受之載體。
  6. 根據請求項5之醫藥組合物，其提供免疫刺激作用。
  7. 根據請求項5之醫藥組合物，其提供抗發炎作用。
  8. 根據請求項5之醫藥組合物，其同時提供免疫刺激及抗發炎作用兩者。
  9. 一種用以刺激免疫反應之醫藥組合物，其包含治療有效量之根據請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽。
  10. 一種用以抗發炎之醫藥組合物，其包含治療有效量之根據請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽。
  11. 根據請求項10之醫藥組合物，其中該化合物係 順式-3-(4-羥苯基)-4-異丁基二氫呋喃-2,5-二酮，3-(4-羥苯基)-4-異丁基-1H-吡咯-2,5-二酮，及二甲基-2-(4-羥苯基)-3-異丁基順丁烯二酸二甲酯。
  12. 一種用以刺激免疫反應及抗發炎之醫藥組合物，其包含治療有效量之根據請求項1之化合物或其醫藥上可接受之鹽。
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