KR20040099300A

KR20040099300A - 온혈 동물의 면역, 소염, 항암 및 ｄｎａ 수복 과정을향상시키기 위한 식물 종의 수용성 추출물의 생체 활성성분을 단리 및 정제하고 그의 구조를 확인하는 방법

Info

Publication number: KR20040099300A
Application number: KR10-2004-7013931A
Authority: KR
Inventors: 로날드 더블유 페로
Original assignee: 로날드 더블유 페로
Priority date: 2002-03-07
Filing date: 2003-03-07
Publication date: 2004-11-26
Also published as: MXPA04008567A; US7947312B2; IL163886A0; US20110263706A1; US8372449B2; US7955626B2; US20060068035A1; US20090281180A1; CN1649610A; CA2477785A1; WO2003074062A2; US7579023B2; US7595064B2; US8372448B2; EP1485114A2; US20110245337A1; US6964784B2; US20030170320A1; BRPI0308253A2; AU2003207894A1

Abstract

본 발명은 (i) C-MED-100(등록상표) 추출물로부터 분무 건조 담체를 침전시켜, 박층 크로마토그래피(TLC)용 반점 혼합물을 수득하고; (iii) C-MED-100(등록상표) 추출물 반점 혼합물로 예비-수행 TLC 플레이트에 반점을 찍고, 플레이트를 용리시켜 R_f=0.2∼0.3을 갖는 형광 밴드를 수득한 다음; (iv) R_f=0.2-0.3을 갖는 밴드를 긁어내고, 이를 암모니아 중에서 용리시킨 후, 용리된 밴드를 동결 건조시켜 분말을 수득하고; (v) 분말을 메탄올로 추출하여 가용화된 실리카겔을 제거하고, 메탄올 용액을 농축시킨 다음, 농축된 용액을 결정화시켜 생체 활성 성분을 수득함을 포함하는, C-MED-100(등록상표) 추출물로 알려진 운카리아 토멘토사(Uncaria tomentosa)의 수용성 추출물의 생체 활성 성분을 단리하는 방법. 단리된 생체 활성 성분은 퀸산 유사체, 바람직하게는 퀸산 락톤이다. 약학 유효량의 생체 활성 성분 및 비독성 불활성 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다. 생체 활성 성분을 사용하여 포유동물에서 면역 수행능력을 향상시키고, 면역계 관련 이상을 치료하며, 염증 반응을 억제하고, 염증 반응 관련 이상을 치료하고, 항암 반응을 향상시키며, 종양 형성 및 성장에 대한 반응과 관련된 이상을 치료할 수 있다.

Description

온혈 동물의 면역, 소염, 항암 및 ＤＮＡ 수복 과정을 향상시키기 위한 식물 종의 수용성 추출물의 생체 활성 성분을 단리 및 정제하고 그의 구조를 확인하는 방법{ISOLATION, PURIFICATION AND STRUCTURAL IDENTIFICATION OF A BIOACTIVE COMPONENT OF A WATER SOLUBLE EXTRACT OF A BOTANICAL SPECIES FOR ENHANCING IMMUNE, ANTI-INFLAMMATORY, ANTI-TUMOR AND DNA REPAIR PROCESSES OF WARM BLOODED ANIMALS}

우나 데 가또(Una de Gato) 또는 고양이 발톱으로 흔히 알려져 있는 운카리아 토멘토사(Uncaria tomentosa)는 역사적으로 천연 치료제로서 널리 사용되어 왔으며, 현재는 매우 다양한 건강상의 이상을 치료하기 위하여 다수의 영양 공급 제제에 존재한다. 출원인이 알고 있는 한도 내에서는, 페로(Pero)의 미국 특허 제 6,039,949 호와 제 6,238,675 B1 호 및 미국 특허원 제 09/824,508 호에 개시되어있는 수용성 추출물("페로 추출물")을 제외한 고양이 발톱의 시판중인 제제는 모두 그의 옥스인돌 알칼로이드 함량에 기초를 두고 있다. 이는 케플링거(Keplinger)(오스트리아) 박사가 1960년대 초 옥스인돌 알칼로이드의 존재를 발견하였기 때문이다(케플링거, 라우스(Laus, G.), 우름(Wurm, M.), 디리히(Dierich, M.P.), 테프너(Teppner, H.), Uncaria tomentosa (Wild.) DC.-Ethnomedicinal use and new pharmacological, toxicological and botanical results, J. Ethanopharmacology 64:23-34, 1999). 페로 추출물(이의 바람직한 실시태양이 C-MED-100(등록상표)으로 시판되고 있음)은, 알칼로이드를 미량으로만(<0.05%) 함유한다는 점에서 임의의 다른 시판 제제와는 상당히 상이한, 운카리아 토멘토사 나무 껍질의 수성 추출물(우냐 데 가또 또는 고양이 발톱 추출물로서도 알려져 있음)이다. 대신, 페로 추출물은 새로운 부류의 활성성분, 즉 기재된 바와 같이 입증된 효능을 갖고 페로 특허에서 보호되는 카복실 알킬 에스테르(CAE)를 함유한다. C-MED-100(등록상표)은 자동-면역 및 DNA 수복-향상 기능을 둘 다 뒷받침하기 위하여 영양 공급 산업에서 제공된 최초의 제품으로서, 자동 면역 질환, 염증 질환 및 신생물 질환 같은 연령-관련 이상의 결과를 감소시키는데 매우 중요하다. 본원에서 C-MED-100(등록상표) 추출물을 언급하는 경우에는, C-MED-100(등록상표)이 바람직한 실시태양인 페로 추출물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

현재까지 페로 추출물의 활성 성분이 정밀하게 화학적으로 확인되지는 않았다. 그러나, 이들 성분의 화학적 및 생물학적 특징은 페로 추출물의 상업적 제조를 표준화시키기에 충분할 정도로 갖추어졌다(페로 특허 참조).

시판중인 페로 추출물인 C-MED-100(등록상표)은 고양이 발톱의 역사적인 의약 용도에 기초하여 배합되며, 이의 중요한 단계는 약 95℃에서 약 18시간동안 온수로 철저하게 추출하는 것이다. 이어, 추출물을 한외여과하여 고분자량(>10,000 MW)의 독성 공액체를 제거하고, 분무 건조시켜 활성 성분으로서 카복시 알킬 에스테르(CAE) 8 내지 10%를 함유하도록 한다. CAE는 숯으로의 흡수(85%)의 결과 C-MED-100(등록상표)의 유일한 활성성분임을 특징으로 하였다. 흡수되지 않은 분획에서는 생물학적 활성이 관찰되지 않았다. 정제 도구로서 박층 크로마토그래피(TLC)를 사용하였을 때, 활성 성분은 약 200 nm에서 최대 UV 흡광도를 나타내었고, 하이드록실아민 및 염화제이철과 반응하여, 에스테르(예컨대, CAE)로서의 특징을 나타내었다.

C-MED-100(등록상표)을 매일 250 내지 700 mg씩 경구 투여하면 인간에서 효능이 있는 것으로 입증되었다. 이 투여량은 인간을 비롯한 온혈 동물의 소염, DNA 수복, 면역 및 항암 과정을 향상시키는 것으로 밝혀졌다(페로 특허; 람(Lamm, S.), 쉥(Sheng, Y.), 페로, Persistent response to pneumococcal vaccine in individuals supplemented with a novel water soluble extract of Uncaria tomentosa, C-Med-100(등록상표) extract. Phytomed 8:267-274, 1001; 쉥, 리(Li, L.), 홈그렌(Holmgren, K.), 페로, DNA repair enhancement of aqueous extracts of Uncaria Tomentosa in a human volunteer study. Phytomed 8:275-282, 2001; 쉥, 브린겔슨(Bryngelsson, C.), 페로, Enhanced DNA repair, immune function and reduced toxicity of C-MED-100(등록상표) extract, a novel aqueous extract fromUncaria tomentosa. J. of Ethnopharmacology 69:115-126 (2000) 참조).

C-MED-100(등록상표) 추출물의 CAE는, CAE가 DNA 수복 및 면역 세포 반응(이들은 노화를 조절하는 중요한 생리학적 과정임)을 향상시키기 때문에, 보조 식품으로서 탁월한 영양상의 뒷받침을 제공하는 것으로 생각된다(페로 특허, 쉥, 페로, 와그너(Wagner, H.), Treatment of chemotherapy-induced leukopenia in a rat model with aqueous extract from Uncaria tomentosa. Phytomedicine 7(2):137-143 (2000) 및 상기 인용된 문헌 참조). 이들 두 과정은 모두 핵 전사 카파 베타(NF-kB)의 조절을 포함한다. NF-kB는 (i) 아폽토시스에 의한 세포의 사멸로부터 세포를 구하는 핵의 작용 및 (ii) 염증전 사이토카인 생성을 제어하는 것으로 널리 알려져 있다(베그(Beg, AA) 및 발티모어(Baltimore, D.), An essential role for NF-kB in preventing TNF-α induced cell death. Science 274:782-784, 1996; 왕(Wang, C-Y), 마요(Mayo, M.W.), 볼드윈(Baldwin, A.S.), TNF-α and cancer therapy-induced apoptosis: Potentiation by inhibition of NF-kB. Science 274:784-787, 1996). 따라서, 이 메카니즘은 염증전 사이토카인 생성 및 염증을 억제하면서 아폽토시스의 유도를 프로그래밍된 세포 독성에 직접 관련시킨다.

아폽토시스는 세포를 분열(복제)로부터 분화로, 또한 증가된 작용능을 향해 세포를 조절하는 신체의 필수적인 생화학적 과정이다. 아폽토시스가 이루어지는 세포는 분화되고 기능성이 증가되도록 촉진될 뿐만 아니라 결국에는 이 "프로그래밍된 세포 사멸"로 인해 사멸하게 된다. 그러므로, C-MED-100(등록상표) 추출물에 의한 NF-kB 억제로 인해 유도되는 아폽토시스는 (i) 종양 세포를 효과적으로 죽이는(왜냐하면, 종양 세포가 아폽토시스에 의해 복제되지 않고 결국에는 사멸하게 되기 때문임) 동시에 (ii) 면역 세포 반응성을 증가시킨다(왜냐하면, 동시에 이루어지는 DNA 수복의 향상으로 인해 더욱 많은 면역 세포가 분화되게 되고 더욱 오래 살게 되기 때문임).

NF-kB는 또한 염증 세포에게 신호를 보내어 사이토카인(성장 인자)을 생성시키도록 지시한다. 이들 신호는 다시 포식세포가 더 많은 침입 감염체를 죽이도록 촉진시키는데, 이는 적어도 부분적으로는 산소를 함유하지 않는 라디칼을 높은 수준으로 생성시킴으로써 달성된다. 따라서, NF-kB 억제는 정상적인 신체 조직에 유해할 수 있는 염증 과정의 과다반응을 방지하기 때문에 소염 활성을 갖는다. 또한, 염증전 사이토카인이 인간에 있어서 내인성 자유 라디칼의 주요한 생성원이기 때문에, NF-kB 억제는 수년간에 걸쳐 축적될 수 있는 유전자 손상을 감소시킴으로써 돌연변이 유발을 방지한다. 더욱 적은 라디칼이 생성됨에 따라, DNA에 대한 손상이 적으며 천연 치유 억제도 적다. 결과적으로 노화가 줄어든다.

따라서, 페로 추출물, 바람직하게는 C-MED-100(등록상표) 추출물은, NF-kB 억제에 의해 자유 라디칼 손상을 방지하고, 아폽토시스에 의한 분화 및 면역 세포 반응성을 유도하며, DNA 수복을 향상시키고, 종양 세포(이는 노화에 관련된 주요 인자임)를 죽이기 때문에, 노화 방지 요법에 대한 궁극적인 영양 보충제이다(쉥, 페로, 아미리(Amiri, A.) 및 브린겔슨, Induction of apoptosis and inhibition of proliferation and clonogenic growth of human leukemic cell lines treated with aqueous extracts of Uncaria Tomentosa. Anticancer Research 18:3363-3368(1998); 샌도발-차콘(Sandoval-Chacon M), 톰슨(Thompson J H), 장(Zhang X J), 류(Liu X), 매닉(Mannick E E), 새도위카(Sadowicka H), 샤보넷(Charbonet R M), 클라크(Clark D A), 밀러(Miller M J), Anti-inflammatory actions of cat's claw: the role of NF-kappa B. Aliment Pharmacol Ther 12:1279-1289, 1998; 샌도발, 샤보넷, 오쿠하마(Okuhama NN), 로버츠(Roberts J), 크레노바(Krenova Z), 트렌타코스티(Trentacosti, AM), 밀러, Cat's claw inhibits TNF alpha production and scavenges free radicals: role in cytoprotection. Free Radicals Biol. Med. 29(1): 71-78, 2000). 그의 활성성분을 확인하는 것이 유리하다. 활성성분을 단리 및 확인함으로써, 그 성분을 정제하여 그의 약학적 사용을 향상시키고 효능을 증가시킬 수 있다.

본 발명은 페로 추출물의 활성성분임을 특징으로 하는 CAE의 단리, 정제 및 확인 방법에 관한 것으로, CAE는 퀸산 유사체로서 확인되고 그 구조가 설명된다.

본 발명은 고양이 발톱(Cat's Claw)(운카리아(Uncaria) 종)의 수 추출물의 생체 활성 성분을 단리 및 정제하고 그의 구조를 확인하는 방법에 관한 것이다. 생체 활성 성분은 퀸산 락톤인 것으로 확인된다. 본 발명은 또한 온혈 동물에서 면역, 소염, 노화 방지, 항암 및 DNA 수복 과정을 향상시키기 위한 상기 생체 활성 성분의 약학적 용도에 관한 것이다.

도 1은 UV 흡광도 대 CAE(기준물로서 다이옥틸 프탈레이트를 사용하여 g/ml 단위로 산정됨)의 선형 회귀 추정을 도시한다.

운카리아 식물 종을 온수로 추출하고(이는 의약 용도를 위해 역사적으로 수행되어 온 절차임) 한외여과하여 예컨대 탄닌의 독성 공액체를 비롯한 고분자량(>10,000) 성분을 고갈시키는 경우, 한외여과되지 않은 분획에는 여전히 강력한 면역, 항암, 소염 및 DNA 수복 향상능을 갖는 운카리아의 새로운 식물성 의약 제제(예컨대, C-MED-100(등록상표) 추출물)가 잔류한다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서는, C-MED-100(등록상표) 추출물을 물에 용해시키고 분무 건조시킨 다음, 90% 에탄올 수용액으로 침전시킴으로써 분무 건조제(전분)를 제거한다. 생성된 용액을실리카겔 상에서 박층 크로마토그래피(TLC)시켜, 생성물에 효능을 부여하는 활성성분(들)을 확인한다. 90% 에탄올 C-MED-100(등록상표) 추출물로 TLC 플레이트(실리카겔 60F₂₅₄) 상에 반점을 찍고(가하고), 약 95%를 초과하는 에탄올중 약 1% 암모니아의 시스템에서 크로마토그래피시킨다. 1% 암모니아 수용액으로 용리시킬 때 TLC 크로마토그램에 생물학적 활성을 갖는 단 하나의 구역(R_f=0.2-0.3)이 있으며, 아폽토시스를 유도함으로써 종양 세포를 죽이는 능력에 대해 생체내 분석을 수행하였다. R_f=0.2-0.3 화합물은 약 200nm에서 물중에서 자외선 최대 흡광도를 나타내고, 숯 상으로 흡수되며, 하이드록실 아민 및 염화제이철과의 반응에 의해 화학적으로 CAE임을 특징으로 한다(바토스(Bartos), Colorimetric determination of organic compounds by formation of hydroxamic acids, Talanta 27:583-590, 1980).

본 발명의 다른 실시태양에서는, 페로 추출물, 바람직하게는 C-MED-100(등록상표) 추출물로부터 단리된 생물학적 활성 CAE를 추가로 정제시키고 그 구조를 확인한 결과 퀸산 유사체임을 밝힌다. 암모니아 수용액을 사용하여 실리카 TLC 플레이트로부터 용리시키는 것은 실리카에 대한 매우 단단한 결합 때문에 필요한 것으로 밝혀졌다. R_f=0.2-0.3 반점이 본질적으로 다른 C-MED-100(등록상표) 추출물 성분을 함유하지 않기는 하지만, 이는 비교적 다량의 용해된 무기 실리카를 함유한다. 실리카 TLC 상에서의 정제 과정으로부터 도입된 무기 성분(들)을 제거하기 위하여, 1% 암모니아 수용액을 동결 건조시킨 다음 메탄올에 재용해시켜, 가용화된실리카를 제거한다. R_f=0.2-0.3 반점을 메탄올로부터 결정화시킨 다음 화학적 분석에 의해 퀸산인 것으로 확인한다.

따라서, 본 발명의 한 실시태양은 (a) 페로 추출물을 증류수와 혼합하고 에탄올을 증발시킴으로써 페로 추출물로부터 분무 건조 담체를 침전시키고, 물에 용해된 추출물을 동결 건조시키며; (b) 동결 건조된 추출물을 증류수 및 에탄올과 혼합하여 박층 크로마토그래피용 반점 혼합물을 수득하고; (c) 예비 수행(pre-run) TLC 플레이트에 혼합물의 반점을 찍고 약 1% 암모니아 및 에탄올의 시스템에서 플레이트를 크로마토그래피시킴으로써, R_f=0.2-0.3을 갖는 형광 밴드를 수득한 다음; (d) R_f=0.2-0.3을 갖는 형광 밴드를 긁어내고; (e) 긁어낸 밴드를 암모니아 수용액으로 용리시키고, 용리된 긁어낸 밴드를 완전히 건조할 때까지 동결 건조시켜 분말을 수득하며; (f) 분말을 메탄올로 추출하여 가용화된 실리카겔을 제거하여 메탄올 용액을 남기고; (g) 메탄올 용액을 농축시킨 후; (h) 농축된 용액을 결정화시켜 생체 활성 성분을 수득함을 포함하는 페로 추출물, 바람직하게는 C-MED-100(등록상표) 추출물의 생체 활성 성분을 단리하는 방법을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시태양은 전술한 방법으로 수득한 페로 추출물, 바람직하게는 C-MED-100(등록상표) 추출물의 생체 활성 성분을 확인함을 포함한다. 이 실시태양에서, 생체 활성 성분은 페로 추출물과 동일한 특성을 나타내고, 본질적으로 퀸산 유사체로 이루어진다. 바람직하게는, 퀸산 유사체는 퀸산 락톤이다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 약학 유효량의 페로 추출물의 생체 활성 성분및 비독성 불활성 담체 또는 희석제를 포함하는 약학 조성물을 포함한다. 본 발명은 또한, (i) TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하기에 유효한 양으로 약학 조성물을 투여함을 포함하는, TNF-α 생성을 억제하거나 또는 백혈구의 아폽토시스를 유도함으로써 포유동물의 면역 수행능을 향상시키기 위한, 약학 조성물의 사용; (ii) TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하기에 유효한 양으로 약학 조성물을 투여함을 포함하는, TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도함으로써 포유동물의 면역 시스템에 관련된 질환을 치료하기 위한, 약학 조성물의 사용; (iii) TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하는데 유효한 양으로 약학 조성물을 투여함을 포함하는, TNF-α 생성을 억제하거나 또는 백혈구의 아폽토시스를 유도함으로써 포유동물의 염증 반응을 억제하기 위한, 약학 조성물의 사용; (iv) TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하는데 효과적인 양으로 약학 조성물을 투여함을 포함하는, TNF-α 생성을 억제하거나 또는 백혈구의 아폽토시스를 유도함으로써 포유동물의 염증 반응 관련 이상을 치료하기 위한, 약학 조성물의 사용; (v) 종양 세포의 아폽토시스를 유도하는데 효과적인 양으로 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 종양 세포의 아폽토시스를 유도함으로써 포유동물의 항암 반응을 향상시키기 위한, 약학 조성물의 사용; (vi) 종양 세포의 아폽토시스를 유도하기에 유효한 양으로 약학 조성물을 투여함을 포함하는, 종양 세포의 아폽토시스를 유도함으로써 종양 생성 및 성장에 대한 포유동물의 반응에 관련된 이상을 치료하기 위한, 약학 조성물의 사용; 또한 (vii) 포유동물의 DNA 수복 과정을 향상시켜 노화 이상을 치료하는데 중요한 돌연변이 유발 방지 활성을 제공하기 위한, 약학 조성물의 사용을 포함하는 실시태양도 포함한다.

본 발명의 방법 및 조성물은 아래 실시예를 참조함으로써 가장 잘 이해된다.

실시예 1:페로 추출물의 생체 활성 성분의 단리 및 정제

페로 추출물, 바람직하게는 C-MED-100(등록상표) 추출물의 제조방법 및 조성은 본원에 참고로 인용되어 있는 페로 특허에 기재되어 있다. C-MED-100(등록상표) 추출물, 즉 페로 추출물의 바람직한 실시태양은 90 내지 100℃에서 18 내지 24시간동안 수행되는 고양이 발톱(운카리아 토멘토사)의 온수 추출물로서, 페로 특허에 이미 기재된 바와 같이 한외여과하여 10,000보다 큰 분자량을 갖는 화합물을 제거한다. 옥수수 전분으로 추출물을 분무 건조(Niro F-10 분무 건조기)시킴으로써, C-MED-100(등록상표) 추출물을 상업적인 용도로 제조한다. 이제 아래 절차를 이용하여, C-MED-100(등록상표) 추출물의 활성성분을 CAE로서 정제하는데, 이 절차는 임의의 페로 추출물에 적용될 수 있는 것으로 생각된다. 이 절차는 다음과 같다:

1.활성성분 평가를 위한 C-MED-100(등록상표) 추출물의 정밀검사: C-MED-100(등록상표) 추출물중의 CAE는 매우 특이한 수용성을 갖는다. 이들은 탄닌 및 다당류 중합체에 결합하는 경향이 있어서, 건조될 때 에탄올 같은 적절한 유기 용매에 재용해시키기 어렵다. 바람직한 절차는 다음과 같고, 제공된 변수가 근사치이며 엄격하게 한정되는 것은 아님을 알아야 한다:

(a) C-MED-100(등록상표) 추출물 100 mg을 유리관 내의 증류수 1 ml에 30분간 용해시킨다. 용해된 용액을 2000 ×g에서 10분간 원심분리시킨다. 생성된 최초의 상청액을 분석하기 위해 보존한다.

(b) 제 1 상청액 200 ㎕를 새 유리관에 넣고, 99.7% 에탄올 4.8 ml를 여기에 첨가한다. 생성된 용액은 약 96% 에탄올에 현탁된 C-MED-100(등록상표) 추출물 4 mg/ml를 함유한다.

(c) C-MED-100(등록상표) 추출물/에탄올 용액을 교반(혼합)하고 2000 ×g에서 원심분리시켜 불용성 물질을 제거한다. 생성된 제 2 상청액을 분석하기 위해 보존한다.

(d) UV 흡광도를 측정하기 위하여, 99.7% 에탄올을 사용하여 제 2 상청액을 C-MED-100(등록상표) 추출물 농도 4 mg/ml에서 30 내지 200 ㎍/ml중 하나로 희석시킨다. 바람직하게는, UV 흡광도에 의해 CAE를 계산하기 위하여 한쌍의 농도로서 60 및 120㎍/ml의 농도를 시험한다.

(e) UV 분광 광도계에서, C-MED-100(등록상표) 추출물의 2가지 농도(바람직하게는 60 및 120 ㎍/ml)에 대해 205 nm에서의 UV 흡광도를 측정한다. C-MED-100(등록상표) 추출물중의 CAE가 205 nm에서 UV 최대 흡광도를 갖기 때문에, CAE의 양은 UV 흡광도에 의해 산정될 수 있다. UV 흡광도에 대한 CAE의 양(㎍/ml 단위)을 보여주는 표준 곡선이 도 1에 도시되어 있다.

(f) 수학식 y=0.0491x+0.212(여기에서, y는 결정된 UV 흡광도 값이고, x는 CAE의 농도(㎍/ml 단위)임)에 의해 가장 잘 맞는 기울기의 선형 회귀 분석에 의해, CAE의 농도(㎍/ml 단위)의 계산치를 결정한다. C-MED-100(등록상표) 추출물중 CAE의 백분율을 계산하는데 있어서, C-MED-100(등록상표) 추출물의 두 가지 상이한 농도(바람직하게는 60 및 120㎍/ml)는 분모로서의 역할을 하고, 이에 대해 UV 표준 곡선으로부터 계산된 CAE는 분자로서의 역할을 한다. 실제로는, 두 값의 평균을 구한다.

(g) CAE의 하이드록삼산으로의 전환 및 염화제이철과의 반응을 포함하는 색도 측정 절차에 대해 상기 절차를 확인한다(바토스(Bartos), Colorimetric determination of organic compounds by formation of hydroxamic acids, Telanta 27:583-590, 1980). 두 절차는 동일한 CAE 함량 산정치를 제공한다.

2.C-MED-100(등록상표) 추출물의 활성성분을 최종 정제하고 단리하기 위한 분석 절차. 여기에서도, 제공되는 변수는 근사치이고 한정하는 것이 아니라 예시하는 것이다:

(i) C-MED-100(등록상표) 추출물의 조질의 수 추출물로부터의 분무 건조 담체(옥수수 전분)의 침전: C-MED-100(등록상표) 추출물의 추출물 5g을 증류수 50ml 및 99.7% 에탄올 950ml와 혼합한다. 에탄올을 공기 중에서 증발시켜버리고, 생성된 용액을 동결 건조시킨다. 수율은 약 1g이다.

(ii) C-MED-100(등록상표) 추출물의 활성성분의 실리카겔 박층 크로마토그래피(TLC) 정제 및 단리:

단계 1: 전분이 제거된(상기 (i) 절차 후) C-MED-100(등록상표) 추출물 200mg에 증류수 200㎕ 및 95.5% 에탄올 200㎕를 첨가한다. 혼합하여 반점 혼합물을 생성시킨다.

단계 2: 단계 1의 반점 혼합물로 4개의 예비-수행 TLC 플레이트(실리카겔 60F₂₅₄)에 반점을 찍는다. 용리 시스템은 에탄올 95% 이상중 NH₃약 1%로 이루어진다. 유일한 활성 성분이 R_f=0.2-0.3에서 발견된다.

단계 3: R_f=0.2-0.3을 갖는 형광 청색 밴드를 긁어낸다. 약 1% 암모니아 수용액으로 용리시키고, 건조해질 때까지 동결 건조시킨다.

단계 4: 단계 3으로부터의 분말을 메탄올로 추출하여 가용화된 실리카겔을 제거한다. 메탄올 용액을 농축시키고 활성성분을 결정화시킨다.

(iii) 활성성분의 고압 액체 크로마토그래피(HPLC) 정량 결정: 칼럼은 바람직하게는 3 ㎛ C₁₈칼럼(83 mm ×4.3 mm 내경, Perkin Elmer Corp., 코넥티컷주 노워크 소재)이다. 바람직한 용매 구배 용리는 다음과 같다: 펌프 B는 메탄올을 함유하고, 펌프 A는 증류수중 1% 아세트산을 함유한다. 25분간에 걸쳐 1.5 ml/분의 유속으로 구배를 10%에서 90%로 수행하였다. UV 254 nm에서 검출한다. 피크는 구배를 수행한지 18분에 나타난다.

(iv) 분광 광도법에 의한 활성성분의 검출: C-MED-100(등록상표) 추출물의 활성성분은 약 200 nm의 UV 범위에서 물 중에서 최대 흡광도를 갖는다. 따라서, 약 200 nm에서 흡광도 최대치를 갖는 C-MED-100(등록상표) 추출물의 조질 추출물및 그의 정제된 활성 성분(예컨대, CAE 및 이들의 상응하는 유기 산)은, 공지의 CAE 기준물에 대한 이 파장에서의 UV 흡광도에 기초하여 추정될 수 있다.

C-MED-100(등록상표) 추출물의 활성성분의 생물학적 활성 분석은 아래와 같이 준비된다: CO₂배양기에서 37℃에서 5일동안 HL-60 W6899 세포를 웰(96개 웰 플레이트)당 5000개의 세포로 미소배양액에 노출시킨다. 배양 후, 세포를 염수로 세척하고 MTT 분석에 의해 클론 발생성을 평가한다. 분석 결과는 하기 표 1에 요약되어 있다.

실시예 2:C-MED-100(등록상표) 추출물의 활성성분을 분석에 의해 퀸산으로 확인함. TLC에 의해 단리된 생체 활성 성분(샘플 약 1mg)을, 변위 시약을 첨가하지 않은 채 NMR을 위해 D₂O 약 0.7ml에 완전히 용해시킨다. 하기 스펙트럼이 기록된다:

NMR 020108ta

-1:¹H

-2:¹H/¹H-관련 스펙트럼; COSY

-3:¹H/¹³C-관련 스펙트럼; HMBC

-4:¹³C-Dept135

-5:¹H/¹³C-관련 스펙트럼; HMQ.

¹H-스펙트럼은 주요 화합물로부터의 신호를 함유한다. 4.03, 3.90 및 3.43 ppm에서의¹H-신호는 메틴기로부터의 신호인 것으로 밝혀진다(HMQC 참조). 또한, 66.9 B 75.1에서 수득된¹³C-신호는 이들 양성자에 관련된 것으로, 이들의 화학적 변위는 탄소가 산소에 결합됨(아마도 CHOH-기로서)을 암시한다. 3개의 신호는 COSY 스펙트럼에서 발견되는 것처럼 서로 직쇄로 결합된다.

주요 화합물은 또한 약 40 ppm의¹³C-신호와 관련된 약 1.72 B 1.99ppm에서의¹H-신호도 나타내었다. HMQC 스펙트럼은 이들 신호가 CH₂-기임을 보여주고, COSY 스펙트럼은 각 CH₂-기의 개별 양성자가 동일하지 않음을 암시한다.

COSY 스펙트럼으로부터 판단하건대, 2개의 외부 CHOH-기는 상이한 CH₂-기에 결합된다. 이는 하기 부분적인 화학식을 제공한다:

그러나, 다수의¹H-¹H-커플링이 정상적인 커플링에 비해 더 크거나 작기 때문에, 화합물 회전이 입체 이상된 것으로 보이는 바, 고리 시스템이 제안되었다. 또한, CH₂-기의¹³C- 변위가 40ppm 부근이므로, R1=R2=탄소원자인 것을 생각되었다.이에 의해 하기 부분적인 화학식이 제공되었다:

화합물의 X 및 Y를 설명하는 신호는 NMR 스펙트럼에서 찾을 수 없었다. NMR 스펙트럼을 수득한 후 MS-분석도 수행하였다. 주입에 의해 샘플을 MS 내로 도입하였다. 아세토나이트릴(ACN)로 희석된 D₂O 용액(50/50)의 MS 스펙트럼은 197의 질량수(음이온, M-D=195)를 제공하였다. 이어, 온화한 질소 스트림에 의해 용액을 증발시키고 H₂O/ACN(50/50)에 재용해시켰다. 여기에서는 192의 질량수가 달성되었다(음이온, M-H=191). 결론적으로, 화합물의 질량수는 192이고, 5개의 교환가능한 양성자를 함유한다. NMR 및 MS로부터 수득된 정보를 조합하면, 주요 화합물에 대해 아래의 화학식이 제안된다:

이 화학식은 퀸산이다. 진짜 퀸산을 사용하여 수득된 기준 스펙트럼은 C-MED-100(등록상표) 추출물로부터 단리 및 정제된 것과 동일하였다.

이제 C-MED-100(등록상표) 추출물의 활성성분으로 확인된 퀸산은 다수의 방향족 화합물의 천연 합성에서 중간 대사산물로서 발생되는 공지의 화합물이다(봄(Bohm, BA), Shikimic acid(3,4,5-trihydroxy-1-cyclohexene-1-carboxylic acid),Chem. Rev. 65:435-466, 1965). 따라서, 본원에서는 퀸산 및 그의 유사체가 다수의 식물 종에서 발생하여 식물에 영양상 및 건강상 이점을 제공하는 것으로 기재된다.

퀸산 및 그의 유사체의 임의의 의약 용도를 개시하는 유일한 공지의 종래 기술은 피부 주름 치료(미국 특허 제 5,656,665 호 및 제 5,589,505 호) 및 신경아미다제 저해제로서 인플루엔자 치료를 위한 것이다. 퀸산 및 그의 유사체가 노화, 염증, 면역 억제 및 종양 성장 억제 및 DNA 수복 같은 C-MED-100(등록상표) 추출물이 유용한 이상을 치료하는데 유용하리라는 것을 개시한 종래 기술은 없다.

따라서, 이 개시내용은 퀸산 및 그의 유사체, 바람직하게는 퀸산 락톤의 새로운 부가적인 용도이다. 또한, 퀸산은 CAE를 위한 확실한 화학적 반응은 나타내지 않는다. 그러나, 이 구조를 살펴보면, 퀸산이 가열시 퀸산 락톤을 형성하고, 이것이 CAE로서 반응하게 될 것임이 명백해진다(피셔(Fischer, H.O.) 및 당샤트(Dangschat, G.), Helv. Chim Acta 18:1200, 1935).

또한, 1% 암모니아 수용액으로 퀸산 락톤을 처리하면 퀸산 락톤을 퀸산으로 역전환시킬 수 있다. 이것은 정제된 퀸산을 사용하여 확인되었으며, C-MED-100(등록상표) 추출물에 존재하는 활성성분이 이 고양이 발톱 생성물을 역사적으로 의약용도로 제조하는 동안 합성되었음이 확인된다. 실시예 3은 이러한 확인 과정을 제공한다.

실시예 3: 본 실시예에서는 실시예 1 및 2에 제공된 생화학적 지식을 이용하여, C-MED-100(등록상표) 추출물의 활성성분이 실제로 퀸산 락톤인지를 결정한다. C-MED-100(등록상표) 추출물, 퀸산 및 퀸산 락톤을 모두 숯에 흡수시키고, 이들이 생물학적 활성을 수행하였을 때 C-MED-100(등록상표) 추출물의 200 nm에서의 UV 흡광도가 또한 제거되었다. 이 데이터는 C-MED-100(등록상표) 추출물의 생체 활성 성분이 200 nm에서 최대 흡광도를 나타냄을 교시한다. TLC 결과는 이러한 최대 흡광도를 갖는 C-MED-100(등록상표) 추출물의 성분은 2가지 밖에 없음을 보고한다. R_f=0.05 및 R_f=0.3에 위치하는 성분을 에탄올중 1% 암모니아에서 크로마토그래피시켰을 때, 이들 성분은 각각 퀸산 및 퀸산 락톤에 상응한다.

그러나, 평가시, C-MED-100(등록상표) 추출물의 생체 활성 성분의 생체내 활성은 거의완전히 퀸산 락톤에 의한 것일 수 있다. 그 결과, C-MED-100(등록상표) 추출물의 노화 방지, 소염, 면역 향상 및 DNA 수복 향상 및 항암 특성은 퀸산 락톤의 존재에 기인한다. 이들 특성은 본원에서 퀸산 락톤에 기인하는 것으로 기재된다.

표 1은 (i) C-MED-100(등록상표) 추출물의 단리된 생체 활성 성분, (ii) 퀸산, 및 (iii) 퀸산 락톤의 상대적인 생화학적 활성을 예시한다. 퀸산은 시그마(Sigma)에서 구입할 수 있다(>99%). 상기 기재된 바와 같이 250℃에서 승화시킴으로써 퀸산으로부터 퀸산 락톤(>95)을 합성하였다(피셔(Fischer HOL) 및 당샤트, Zur konfiguration der skikimisaure. Helv. Chim Act 18:1204, 1935). 시험 화합물의 연속적인 희석액을 96개 웰이 있는 평판의 인간 HL-60 백혈병 세포(0.05×10⁶개 세포/ml)에 첨가하여 3000 ㎍/ml 이하의 배양액내 최종 농도를 제공하였다. 미소적정판을 37℃에서 72시간동안 배양하고, 20 ㎕ MTT(5 mg/ml)로 3시간동안 펄스시킨 후, 상기 기재된 바와 같이 540 nm에서 분광 광도법에 의해 색상을 평가하였다(슈바이처(Schweitzer, CM) 등, Spectrophotometric determination of clonogenic capacity of leukemic cells in semisolid microtiter culture systems. Experimental Hematology 21:573-578, 1993).

퀸산 및 그의 락톤에 대한 C-MED-100(등록상표) 추출물의 활성성분의 비교(변수는 근사치임)

화학적 변수	C-MED-100(등록상표) 추출물 활성성분	퀸산
화학적 변수	C-MED-100(등록상표) 추출물 활성성분	퀸산	락톤
물중에서의 숯 흡수	있음	있음	있음
물중에서의 A_UV최대치	200nm	200nm	200nm
검출을 위해 A₂₀₀nm를 사용하는, 에탄올 99%중 암모니아 약 1% 중에서의 TLC	R_f=0.2-0.3	R_f=0-0.05	R_f=0-0.05R_f=0.2-0.3
하이드록삼산/염화제이철 유색 착체의 형성	형성됨	형성되지 않음	형성됨
HL-60 세포에서 IC₅₀을 이용한 생체내 분석 효율	40㎍/ml	>3000㎍/ml	80㎍/ml
1% 암모니아 수용액 후 생체내 분석, IC₅₀HL-60 세포	>300㎍/ml	>300㎍/ml	>300㎍/ml

상기 비교로부터, C-MED-100(등록상표) 추출물의 생체 활성성분이 실제로 퀸산 락톤임이 명백하다. 구체적으로, C-MED-100(등록상표) 추출물 생체 활성 성분, 퀸산 및 퀸산 락톤의 상대적인 IC₅₀값은 생체 활성 성분이 퀸산 자체일 수 없고, 1% 암모니아로 처리함으로써 형성되는 퀸산 락톤 또는 염 같은 그의 유사체가 분명함을 확인시켜준다. C-MED-100(등록상표) 추출물 생체 활성 성분과 퀸산 락톤의 IC₅₀값의 차이는 크지 않고, C-MED-100(등록상표) 추출물에 존재하는 다른 성분의 상승 효과에 기인한 것으로 생각된다. 그러나, 퀸산의 순수한 형태보다 C-MED-100(등록상표) 추출물중의 활성성분, 즉 퀸산 락톤의 효율이 더 높은 것은, 퀸산 락톤이 퀸산 또는 그의 암모늄 염 같은 C-MED-100(등록상표) 추출물중의 다른 천연 발생 성분의 존재하에서 더욱 활성임을 나타낸다.

본 발명을 구체적인 특정 실시태양과 관련하여 기재하였지만, 당해 분야의 숙련자가 본 발명에서 벗어나지 않으면서 다수 변형 및 변화시킬 수 있음을 알 것이다. 따라서, 본 발명의 진정한 원리 및 영역에 속할 수 있는 이러한 변경 및 변화를 모두 포괄하고자 한다.

Claims

식물 종의 수용성 추출물(상기 추출물은 약 199 nm에서 UV 최대치를 나타내고, 100℃ 미만의 온도에서 24시간동안 안정하며, 약 121℃에서 20분 이하 동안의 오토클레이빙에 의한 멸균에 대해 안정하고, 약 -20℃에서 액체 형태로 동결될 때 6개월 이상동안 생물학적 활성을 유지하고, 주로 약 12,000 이하의 분자량을 갖는 분자로 이루어짐)의 생체 활성 성분을 단리하는 방법으로서,

(a) 제1 알콜 용액으로 침전시킴으로써 상기 수용성 추출물로부터 알콜 불용성 성분을 제거하는 단계,

(b) 단계 (a)에서 생성된 상기 수용성 추출물을 예비-수행 박층 크로마토그래피(TLC) 플레이트에 스폿팅한 다음, 상기 스폿팅한 플레이트를 제2 알콜 용액 중 약 1%의 암모니아의 시스템 중에서 크로마토그래피시킴으로써, R_f=0.2∼0.3을 갖는 형광 밴드를 수득하는 단계,

(c) R_f=0.2∼0.3을 갖는 상기 형광 밴드를 분리하는 단계,

(d) 상기 분리된 형광 밴드를 수성 암모니아로 용리시키고, 상기 용리된 분리된 형광 밴드를 건조시켜 분말을 제조하는 단계,

(e) 상기 분말을 제3 알콜 용액으로 추출하여 비-알콜 가용화된 실리카겔을 제거하여 상기 제3 알콜 용액을 얻는 단계,

(f) 상기 제3알콜 용액을 농축시키는 단계, 및

(g) 상기 농축된 제3알콜 용액으로부터 상기 생체 활성 성분을 분리시키는 단계

를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 식물 종은 운카리아(Uncaria) 종인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 수용성 추출물은 운카리아 토마토사(Uncaria tomatosa)인 것인 방법.
식물 종의 수용성 추출물의 생체 활성 성분으로서, 1종 이상의 카복시 알킬 에스테르(CAE)를 주성분으로 하는 생체 활성 성분.
제4항에 있어서, 상기 CAE는 퀸산 유사체인 것인 생체 활성 성분.
제5항에 있어서, 상기 퀸산 유사체는 퀸산 락톤 또는 퀸산의 염을 포함하는 것인 생체 활성 성분.
제4항에 있어서, 상기 CAE는 퀸산 존재하에 존재하는 것인 생체 활성 성분.
a) TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하기 위한 약학 유효량의 1종 이상의 카복시 알킬 에스테르(CAE), 및

b) 비독성 불활성 담체 또는 희석제

를 포함하는 약학 조성물.
제8항에 있어서, 상기 CAE는 퀸산 유사체인 것인 약학 조성물.
제8항에 있어서, 상기 퀸산 유사체는 퀸산 락톤 또는 퀸산의 염을 포함하는 것인 약학 조성물.
제8항에 따른 약학 조성물을 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는 투여 방법.
제11항에 있어서, 제8항의 약학 조성물을 TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하는데 유효한 양으로 상기 포유동물에게 투여함으로써, TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하여 포유동물의 면역 수행능력을 향상시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 제8항의 약학 조성물을 TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하기에 유효한 양으로 상기 포유동물에게 투여함으로써, TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하여 포유동물의 면역계 관련 이상을 치료하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 제8항의 약학 조성물을 TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하는데 유효한 양으로 상기 포유동물에게 투여함으로써, TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하여 포유동물의 염증 반응을 억제하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 제8항의 약학 조성물을 TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하는데 유효한 양으로 상기 포유동물에게 투여함으로써, TNF-α 생성을 억제하거나 백혈구의 아폽토시스를 유도하여 포유동물의 염증 반응 관련 이상을 치료하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 제8항의 약학 조성물을 종양 세포의 아폽토시스를 유도하기에 유효한 양으로 상기 포유동물에게 투여함으로써, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하여 포유동물의 항암 반응을 증대시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 제8항의 약학 조성물을 종양 세포의 아폽토시스를 유도하기에 유효한 양으로 상기 포유동물에게 투여함으로써, 종양 세포의 아폽토시스를 유도하여 종양 형성 및 성장에 대한 포유동물의 반응과 관련된 이상을 치료하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 약학 유효량의 제8항의 약학 조성물을 상기 포유동물에게 투여함으로써, 포유동물의 DNA 수복 과정을 향상시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 약학 유효량의 제8항의 약학 조성물을 상기 포유동물에게 투여함으로써, 포유동물의 노화 관련 이상을 치료하는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 제8항의 약학 조성물을 상기 포유동물에게 투여함으로써, 독성 대사적 또는 환경적 노출로부터 제거한 후의 말초 혈액 세포의 회수를 자극하여, 포유동물의 면역 수행능력을 증대시키는 것을 더 포함하는 것인 방법.
제1항의 방법에 의해 단리된, 식물 종의 수용성 추출물의 생체 활성 성분.