KR101028864B1

KR101028864B1 - 배무채로부터 설포라펜을 분리하는 방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101028864B1
Application number: KR1020080062828A
Authority: KR
Inventors: 김종기; 임수연; 이수성
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2008-06-30
Publication date: 2011-04-12
Also published as: KR20100002796A

Abstract

본 발명은 배무채로부터 설포라펜을 분리하는 방법 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 배무채(x Brassica raphanus)로부터 설포라펜(sulforaphene)을 분리하였고, 상기 설포라펜이 위염, 위궤양 및 위암을 유발시키는 데 관여하는 헬리코박터 파이롤리(Helicobacter pyroli) 균의 생성 및 성장을 억제하는 효과를 밝힘으로써 배무채로부터 설포라펜을 분리하는 방법 및 설포라펜의 용도에 관한 것이다.

배무채, 설포라펜, 헬리코박터

Description

배무채로부터 설포라펜을 분리하는 방법 및 이의 용도{A method of separation to sulforaphene from Baemuchae and the use of sulforaphene}

본 발명은 배무채로부터 분리된 설포라펜의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.

위를 보호하는 위점막 층은 여러 종류의 인자로부터 공격을 받아 손상을 받기 쉽다. 대표적인 공격 인자로서 위산, 알코올, 아스피린 등의 비스테로이드성 소염제(NSAID), 헬리코박터 파일로리(Helicobacter pylori) 등의 세균[Suzuki. M. 및S. Miura, Nippon Rinsho , 15(12), 3154-3158, 1993], 스트레스에 의해 유도된 위 점막의 미세순환장애와 저혈압[Tadaoki Mizuno, Yokohama Med. Bull. , 38(3,4) , 87-97, 1987] 등이 있다. 이러한 요인으로 인해 점막층이 손상되었을 때 미란, 발적, 출혈, 부종을 동반한 염증이 발생하게 되며 손상이 심하여 점막 하단 및 근육층까지 손상되었을 때 이를 위궤양이라 한다. 또한, 위와 직접 연결되어 있는 십이지장도 비슷한 요인에 의해 염증과 십이지장궤양이 발생할 수 있다.

한편, 이러한 공격인자로 인해 유발된 위와 십이지장의 염증 및 궤양을 치료 하기 위해서는 위산 분비 억제, 헬리코박터 파일로리 균의 증식 억제, 점액 분비 촉진, 상피세포 재생 촉진, 항염증 등의 효능을 가진 약물이 필요하다. 현재 가장 대표적인 위염 및 위궤양 치료제로는 위산 분비 억제의 효능을 지닌 H2 안타고니스트(antagonist)와 프로톤 펌프 저해제(proton pump inhibitor)류의 약물이며 임상에서 우수한 효과가 입증되었다[J Int Med Res 17(suppl) 9A, 1989 Meth Find Exp Clin Pharmacol 11(suppl 1) 87, 1989; N Eng J Med 323: 1672, 1990]. 하지만, 이러한 위산분비 억제제들은 투여 종료 후 높은 재발율이 문제시 되고 있다[Drug Intell Clin Pharm 21: 493, 1987, Gut 30: 449, 1989 Yale J Biol Med 65: 649, 1992].

속효성의 위산분비 억제제의 단점인 높은 위염 재발율을 낮추기 위해 위염 유발 인자의 재공격에 저항할 수 있도록 점막 조직의 정상과 유사한 정도로 재생을 촉진하는 등의 효능을 지닌 점막보호제는 위염 치료제의 중요한 부분이다. 위점막 보호제로서 현재 레바미파이드(rebamipide), 소팔콘(sofalcone) 등의 약물이 개발되어 있으나, 일반적으로 속효성이 적고 복용량이 많으며, 비교적 장기간 복용해야 하는 단점이 있어서 개선된 약물 개발이 필요하다.

본 발명에서 사용된 배무채는 배추와 무를 속간교잡하여 육성한 신채소로서, 이에 대한 연구는 현재 활발히 이루어지고 있다.

한편, 십자화과 작물의 이소티오시아네이트(isothiocyanates)는 기존에 브로콜리로부터 분리된 설포라판(sulforaphane)이 이미 잘 알려져 있으며, 상기 설포라판이 헬리코박터 균 및 그 밖의 다른 신체 기관에서 항암 효과가 있는 것은 많은 문헌들을 통해 보고된 바 있다.

하지만, 본 발명과 같이 배무채로부터 설포라판(화학식 2)과는 구조적으로 다른 설포라펜(화학식 1)을 분리한 연구에 대한 보고는 아직까지 알려진 바 없다.

[화학식 1]

[화학식 2]

이에, 본 발명자들은 최초로 설포라판과는 다른 이소티오시아네이트 물질인 설포라펜을 배무채로부터 분리해내는데 성공하였고, 또한 상기 설포라펜이 설포라판과는 달리 생육이 연장될수록 그 함량이 감소되지 않음을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다. 또한, 상기 설포라펜이 헬리코박터균의 생성 및 성장을 억제하는 효과를 밝혔다.

따라서, 본 발명은 배무채로부터 설포라펜을 분리하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 설포라펜을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터균 감염 관련 질환 예방 및 치료용 조성물을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

또한, 본 발명은 설포라펜을 유효성분으로 함유하는 건강식품을 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은

1) 배무채를 증류수를 첨가하여 35 ~ 40℃에서 1 ~ 5시간동안 가수분해시키는 단계

2) 상기 가수분해물을 원심분리하여 상등액을 취해 액체-액체식 추출법으로 추출하는 단계

3) 상기 추출물의 수분을 제거한 다음 감압 농축하는 단계

4) 상기 추출물의 단일 동정을 목적으로 고체상 추출에 의한 활성물질을 분획하는 단계

을 포함하여 이루어진 배무채로부터 설포라펜을 분리하는 방법을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 설포라펜을 유효성분으로 함유하는 헬리코박터균 감염 관련 질환 예방 및 치료용 조성물을 그 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 설포라펜을 유효성분으로 함유하는 건강식품을 또 다른 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 배무채로부터 설포라펜(sulforaphene)을 분리하였고, 상기 설포라 펜이 위염, 위궤양 및 위암을 유발시키는 데 관여하는 헬리코박터 파이롤리(Helicobacter pyroli) 균의 생성 및 성장을 억제하는 효과를 밝힘으로써 배무채로부터 설포라펜을 분리하는 방법 및 설포라펜의 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 배무채로부터 설포라펜을 추출하는 방법을 다음에서 상세히 설명하고자 한다.

먼저, 배무채를 증류수로 균질화한 후, 35 ~ 40 ℃에서 1 ~ 5시간 가수분해시킨다. 상기 배무채는 뿌리, 엽의 성숙체 또는 새싹을 모두 포함하지만 부위별 채취를 각각 시행하여 추출을 시도한다. 이때, 용액의 상태는 중성 조건 하에서 가수분해하는 것이 배무채 내 존재하는 글루코시노레이트(glucosinolates)가 가수분해되면서 중성의 조건에서 항암효과가 있다고 알려진 이소티오시아네이트(Isothiocyanates) 형태의 화학구조가 가장 많이 생성되는 이유로 바람직하며, 가수분해 온도와 시간이 상기 범위를 벗어나면 분리하고자 하는 물질의 수득량이 미비하며, 장시간 가수분해 시 항암성이 밝혀지지 않거나 그 효과가 없는 니트릴이나 에피티오니트릴(epithionitrile) 등으로 분해되어 항암효과가 알려져 있는 이소티오시아네이트의 회수율이 급격히 줄어드는 문제가 있다.

상기 가수분해물을 6000 ~ 10000 rpm으로 20 ~ 30 분간 원심분리하여 상등액을 취한 후, 물과 친화력이 매우 약한 용매로 액체-액체식 추출한다. 상기 목적물질의 추출 용매로는 디클로로메탄 또는 클로로포름 등이 바람직하다.

상기 용매 추출물의 수분을 황산나트륨을 첨가하여 제거한 다음 질소감압농축기를 사용하여 30 ~ 40 ℃에서 감압 농축시킨다.

또한, 설포라펜과 이와 같은 비극성물질을 분석에 용이하도록 분획하기 위하여 고체상 추출법을 통해 메탄올로 용출된 추출액을 40 ~ 50 ℃상에서 감압 농축한다. 가수분해물을 유기용매로 추출 후 고체상 추출법을 통하여 수집하여 매우 옅은 연두색 또는 연노란색 물질을 수득하였고, 이를 동정한 결과 설포라펜으로 확인되었다.

이렇게 분리된 설포라펜은 헬리코박터균의 생성을 억제함을 확인하였고, 이를 유효성분으로 함유하는 헬리코박터균 감염 관련 질환 예방 및 치료용 약제를 제조할 수 있다. 상기 헬리코박터균 감염 관련 질환은 위염, 위궤양, 위암 등을 포함할 수 있다.

상기 약제는 통상의 제조방법으로 제조하여 정제, 캡슐제 등으로 제형화하는데, 이들 중 정제 제조시 기제로 사용되는 락토오스, 미세결정 셀룰로오스, 스테아린산 마그네슘 등을 합한 것과 설포라펜을 2 ~ 10 : 1의 비율로 사용하면 헬리코박터균 감염 관련 질환 예방 및 치료에 활성을 갖는 정제를 제조할 수 있다.

이러한 의약물의 제조 시에는 활성 물질 그 자체로도 사용할 수 있지만, 약학적으로 허용되는 담체(carrier), 부형제(forming agent), 희석제(diluent) 등과 혼합하여 분말, 과립, 캡슐 등으로도 제조가 가능하다. 또한, 본 발명에 따른 설포라펜은 체내 흡수도, 체중, 환자의 연령, 성별, 건강상태 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다. 일반적으로 설포라펜은 체중 1 ㎏당 0.05 ∼ 1 ㎎ 정도를 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 이렇게 제형화된 단위투여형 제제는 필요에 따라 약제의 투여를 감시하거나 관찰하는 전문가의 판단과 개인의 요구에 따라 전문화된 투약법을 사용하거나 일정시간 간격으로 수회 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 설포라펜을 유효성분으로 하는 건강식품을 포함한다.

건강식품이란, 설포라펜을 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져 오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기 복용 시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

본 발명에 따른 설포라펜은 헬리코박터균의 생성을 억제하는 효과가 우수하므로 위염, 위궤양 또는 위암 등의 관련 질환 예방 및 치료에 매우 유용하다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 설포라펜의 분리 및 구조 확인

배무채 5 g에 증류수 30 ml을 첨가하고 균질화를 1분간 하여 3시간동안 37 ℃에서 가수분해시킨 뒤 20분간 8000 rpm으로 원심분리하여 얻은 상등액을 채취하여 디클로로메탄으로 3회 추출하고 황산나트륨으로 수분을 제거하여 추출액을 얻었다. 이를 2 ml로 질소감압농축기를 사용하여 35 ℃ 상에서 감압 농축 후, 셉- 팍 실리카 카트리지(sep-pak silica cartridge)를 이용해 고체상 추출(Solid phase extraction) 과정을 거쳐 메탄올 3 ml로 용출하여 얻은 추출액을 0.3 ml로 질소감압농축기를 사용하여 45 ℃ 상에서 감압 농축하여 분석에 이용하였다.

이 추출액을 ELSD(evarporative light scattering detector)를 장착한 HPLC와 GC-Mass를 통해 정량 및 정성 분석을 하였다. 기기의 조건은 다음과 같다.

먼저, HPLC는 Gilson사의 305시리즈를 사용하였고 분석용 컬럼으로는 Macherey-nagel사의 Nucleosil 100-5C18(150 × 4.6mm)을 장착하였다. 아이소크라틱 이동상 용매법을 시행하였고 용매의 조성은 5 mM의 암모늄아세테이트가 포함된 물: 아세토나이트릴: 터트-부틸알콜(tert-butyl alcohol)= 8:1:1의 중량?비율로 정하였다. HPLC 펌프의 유량은 1 mL/min이며 컬럼오븐의 온도는 40 ℃로 유지하였다. 검출기의 조건은 가스의 유량이 2 mL/min이고 검출기의 온도는 50 ℃로 유지하여 gain은 1로 조정하였다.

정성 분석을 위한 GC-Mass의 분석조건은 HP5890에 장착된 HP5970 검출기를 사용하여 조정하였다. 컬럼은 실리카 캐필러리 컬럼(DB-5, 0.25× 30mm)을 장착하고 GC의 오븐 온도는 50 ℃에서 250 ℃까지 1분당 10 ℃씩 상승시켰다. 인젝터의 온도는 250 ℃으로 유지하였고 이동상은 헬륨가스를 0.8 mL/min으로 흘렸다. E.I.는 70 eV였고 mass scan 범위는 40 ~ 500m/z였다.

특히, 배무채의 새싹을 재배하여 파종 후 7 ~ 11일 사이의 자엽과 배축만을 수집한 샘플 5 g을 추출하여 설포라펜이 함유된 연두색 또는 연노란색 물질 650 ㎍(수율 13%)을 수득하였다. 이 물질을 HPLC와 GC-MS를 실시하여 구조 분석한 결 과, 표준물질과 일치함을 확인함으로써 다음 화학식 1로 표시되는 설포라펜로 분석되었다[도 1 및 도 2].

[화학식 1]

비교예 1: 설포라판의 분리

브로콜리로부터 Vertelli et al[Davide V., Maria P., Daniela B. and Agar M. 1998. Separation by solid phase extraction and quantification by reverse phase hplc of sulforaphane in broccoli., Food Chem. 63:417-421.]을 통하여 다음 화학식 2로부터 설포라판 생체중 1g당 120㎍(수율 12%)을 분리하였다.

[화학식 2]

시험예 1: 함량 비교

식물의 생육단계별 설포라판 및 설포라펜 함량을 비교하여 수율이 가장 높은 생육 일수를 알고자 하였다.

먼저, 배무채 및 브로콜리 종자를 각각 젖은 티슈를 담은 용기에 치상하여 25 ℃와 15시간 광 조건에서 1일 2회 관수하며 발육시켰다. 시료의 채취는 치상일부터 5, 7, 9, 11, 14일로 총 5개의 새싹의 생육일을 구분하여 수행하였고 뿌리를 제외한 가식부위인 자엽과 배축 부위에서 물질을 추출하였다.

이렇게 추출하여 수득한 설포라펜은 평균 147 ㎍이었다.

다음 표 1과 도 3 내지 6에 브로콜리, 배무채 각각의 새싹, 어린 식물, 성숙체가 성장하는 동안 이소티오시아네이트 물질의 함량의 변화를 나타내었다.

[표 1]

도 3 내지 6과 표 1에 나타낸 바와 같이, 브로콜리에서 분리된 설포라판은 식물이 성장하는 동안 함량이 감소되는 것을 확인할 수 있었으나, 배무채에서 분리된 설포라펜은 식물이 성장하는 동안 함량이 감소되지 않았다.

이는 배무채가 식물 개체가 생육 단계에 따라 해충이나 초식류의 공격과 같은 외부 방해 요인에 극복하기 위해 생산하는 설포라펜이 생육단계가 연장되면서 브로콜리처럼 설포라판의 함량이 감소하는 경향과는 다르게 오히려 그 함량을 유지하며 항산화물의 섭취면에서는 그 추출 수율과 효능이 매우 우수한 소재임을 의미 한다.

시험예 2: 헬리코박터균의 생성 억제 효과 확인

헬리코박터 파일로리의 성장을 억제 또는 저해하는 설포라펜의 효능을 알기 위해 헬리코박터 파이로리 성장을 억제하는 항생물질 아목시실린 및 메트로니다졸을 설포라펜과 기존에 알려진 설포라판과 함께 항생력을 비교하는 실험을 수행하였다. 다음 표 2는 헬리코박터 파이로리 특정균주 성장 저해에 있어 설포라펜 및 다른 처리구의 항생력을 비교하였다. 표 2는 파이로리 균주별 설포라펜이 기존 항생물질에 상응하는 효능을 갖거나 그 이상의 효능을 갖는다는 것을 입증한다.

[표 2]

시험예 3

헬리코박터 파이로리 균주를 broth 액체배지에 37 ℃ 환경에서 대량 증식시 킨 뒤 균을 수집하여 PBS에 재현탁시켰다. 랫트류에 사료(음식물) 및 수분 섭취를 12시간동안 금지시킨 후 PBS에 용해된 헬리코박터 파일로리 40㎕를 투여하여 파일로리 10⁹ CFU/ml을 처리하였다. 동물을 메타판으로 마취시키고 희생시켜 위저막의 감염상태를 직접 배양 후 우레아제 테스트[Y. Tokunaga et al, J Gastroenterol hepatol (2000)12: 617-621]를 통해 헬리코박터 파일로리의 감염여부를 확인하였다. 확인 후 상기 추출된 설포라펜 및 다른 항생물질을 하루 2회 20 mg씩을 경구 투여하였다. 다음 표 3은 설포라펜이 실제 헬리코박터 파일로리에 감염된 랫트류가 우레아제 테스트를 통해 위점막의 감염상태가 호전되는지를 나타냈으며 설포라펜은 헬리코박터 파일로리에 감염됨 동물을 대상으로 항생물질보다 더 효능이 있거나 유사한 것을 입증한다.

[표 3]

시험예 4: 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 다음과 같이 실시하였다.

군당 2 마리씩의 동물에 설포라펜을 용해시켜 400 mg/kg 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상 여부를 관찰하였다. 그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서, 본 발명에 따른 설포라펜은 모든 랫트에서 400 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소 치사량(LD₅₀)은 400 mg/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

제제예 1: 정제의 제조

본 발명의 설포라펜을 이용하여 다음과 같은 조성으로 경구투여용 정제를 습식과립법 및 건식과립법을 이용하여 제조하였다.

[조성]

설포라펜 20 mg, 경질 무수규산 10 mg, 스테아린산 마그네슘 2 mg, 미세결정 셀룰로오즈 50 mg, 전분 글리콜산 나트륨 25 mg, 옥수수 전분 113 mg, 무수에탄올 적량.

제제예 2: 경피제의 제조

본 발명의 설포라펜을 이용하여 다음과 같은 방법으로 경피제를 제조하였다.

설포라펜 20 mg, 폴리아크릴산 나트륨 1.3 g, 글리세린 3.6 g, 수산화 알루미늄 0.04 g, 메틸 파라벤 0.2 g, 물 14 g.

제제예 3: 음료 제조

설포라펜 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때, 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

도 1은 고속액체크로마토그래피에 의해 분리된 배무채의 설포라펜과 표준물질의 분리패턴을 비교한 것이다[A: 표준물질; B: 배무채로부터 분리된 설포라펜].

도 2는 배무채에서 분리된 설포라펜과 표준물질의 질량분석 결과를 비교한 것이다[A: 표준물질; B: 배무채로부터 분리된 설포라펜].

도 3은 브로콜리 새싹이 성장하는 동안의 설포라판의 함량 변화를 나타낸 것이다.

도 4는 배무채 새싹이 성장하는 동안의 설포라펜의 함량 변화를 나타낸 것이다.

도 5는 브로콜리 어린 식물이 성장하는 동안의 설포라판의 함량 변화를 나타낸 것이다.

도 6은 배무채 어린 식물이 성장하는 동안의 설포라펜의 함량 변화를 나타낸 것이다.

Claims

1) 배무채(x Brassica raphanus)를 증류수를 첨가하여 35 ~ 40℃에서 1 ~ 5시간동안 가수분해시키는 단계

3) 상기 추출물의 수분을 제거한 다음 감압 농축하는 단계

4) 상기 추출물의 단일 동정을 목적으로 고체상 추출법에 의해 활성물질을 분획하는 단계

포함하여 이루어진 것을 특징으로 하는 배무채로부터 다음 화학식 1로 표시되는 설포라펜(sulforaphene)을 분리하는 방법.

[화학식 1]

삭제