KR100767051B1 - 오보바톨 또는 오보바탈의 분리방법과 이를 유효성분으로함유하는 비만치료 및 예방용 조성물 및 상기 유효성분의정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 후박나무 [Magnolia obovata Thunberg (Magnoliaceae)]로부터 분리된 오보바톨 (obovatol)과 오보바탈 (obovatal)에서 선택되는 하나 또는 두 성분을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것으로, 오보바톨과 오보바탈은 비만과 비만 세포의 성장에 중요한 역할을 하는 메트릭스 분해 메탈로프로테인효소(MMPs)의 발현과 활성을 효과적으로 저해함으로써 비만 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

후박나무, 오보바톨, 오보바탈, 비만 예방 및 치료

Description

오보바톨 또는 오보바탈의 분리방법과 이를 유효성분으로 함유하는 비만치료 및 예방용 조성물 및 상기 유효성분의 정제방법{Composition comprising obovatol and/or obovatal, Pharmaceutically acceptable salts thereof, or Their derivatives as active ingredient for Curing and Preventing fatness, and Purification method of the active ingredients}

도 1은 MMP2 활성에 대한 오보바톨(obovatol)과 오보바탈(obovatal)의 영향을 나타내는 그림이다.

도 2는 특정병원부재(SPF) SD계 랫트에 대한 오보바톨과 오보바탈의 급성독성실험을 나타내는 그림이다.

본 발명은 비만치료 및 예방용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 오보바톨 (obovatol)과 오보바탈 (obovatal)에서 선택되는 하나 또는 두 성분을 포함하는 비만예방 및 치료제 조성물 및 동 활성성분의 정제하는 방법에 관한 것이다.

비만은 유전적, 환경적, 정신적 요인 등에 의해 인체 내 에너지 대사의 균형이 무너져 생기는 질환으로 생활 습관 변화, 산업화 등으로 인하여 그 환자 수가 지속적으로 증가하고 있는 추세이다. 미국만 하여도 인구의 절반 이상이 과체중이고 이중 3분의 1 이상이 비만 환자들인 것으로 알려지고 있다. 비만은 세계보건기구(WHO)에 의해서 1996년에 이미 질병으로 규정된 바 있고, 2004년 7월 미국의 연방의료보험공단이 '비만은 질병이 아니다'라는 조항을 삭제키로 하였고 비만치료에 대한 의료보험 혜택 가능성을 높였다.

비만은 고혈압, 고지혈증, 심장 질환, 당뇨, 암 등 건강에 심각한 위험을 증가시키기 등 여러 가지 성인병과 직접적인 관련이 있다는 것이 학술적으로 밝혀짐에 따라 반드시 치료되어야할 질병이라는 인식이 확산되었고 이에 따라 비만예방 및 치료제의 필요성이 더욱 절실히 요구되고 있다. 비만이 질병이라는 인식이 확산되면서 선진 산업 국가들을 중심으로 전체 의료비의 5-10% 가량이 비만 분야에 사용되는 등 비만치료는 빠르게 확산되고 있으나 현실적으로 수요를 충족시켜 줄만한 효과적인 제품이 시장에 현재 시장에 출시되는 못한 상태이다.

비만의 치료방법은 식사요법, 운동요법이 가장 기본이 되며 그 외 행동요법, 약물요법, 외과요법 등이 병행되는데, 식사요법은 총 에너지 섭취량을 제어하는 치료방법으로서 신체의 대사율이 저하되기 때문에 기대와 같은 체중감소를 얻기 힘들며 공복감 또는 스트레스를 유발할 수 있다는 문제점을 가지고 있다. 운동요법의 경우 신체의 소비에너지 증가, 인슐린 저항성의 개선 및 체지방의 감소 등의 효과가 있으나 1회에 20분간의 유산소 운동을 주 3회 이상 행하는 것이 필요하다고 되 어 있어 계속적으로 시행하는 것이 매우 힘들다는 단점을 가지고 있다. 극도의 비만에 대한 긴급치료가 필요한 경우 약물요법 및 외과요법이 사용되고 있으나, 외과요법의 경우 환자에게 주는 부담이 크다는 단점이 있다.

비만 쥐에 신생혈관억제제를 처리하면 지방조직의 혈관생성이 억제되어 체지방이 감소되고 이는 체중을 감소시키는 역할을 하게 된다는 연구과가 발표되어 있다. 그리고 지방 세포들을 MMP (Matrix metalloproteinase)라는 효소를 분비한다고 알려져 있는데 이 효소는 지방 세포로 분화하는 과정에서 MMP-2와 MMP-9을 분비하여 MMP활성을 유도하게 된다. 분 발명은 천연물에서 추출한 주성분을 이용하여 MMP-2 활성을 억제함으로써 비만을 방지할 수 있는 기능을 수행하게 된다. MMPs는 콜라겐, 프로테오글리칸 등을 분해하는 효소로 간질 콜라겐효소, MMP2, 스트로머라이신(stromelsin) 등이 있는데 이들 모두 활성 중심부에 아연(Zn)을 가지는 금속효소이고 자이모겐(zymogen) 형태로 분비되어 다른 단백질 분해효소나 유기인 화합물에 의하여 활성화되고 MMP와 함께 분비되는 TIMP(tissue inhibitor of metalloproteinase)에 의해 활성이 저해되며 cDNA 배열에 있어서 상동성을 지니고 있어 MMPs로 분류된다. 실제 전이가 활발한 비만세포에서는 정상적인 세포에 비해 MMP-2나 MMP-9의 활성이 높다.

본 발명에서는, 천연물에서 추출한 주성분을 이용하여 MMP-2 활성을 억제함으로서 비만의 예방 및 치료에 대한 가능성을 조사하였다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래 기술이 가지는 문제를 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 인체 비만세포주의 성장과 메트릭스 분해 메탈로프로테인효소(MMPs)를 효과적으로 저해함으로써 비만 예방 및 치료제에 유용한 약제학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 후박나무로부터 인체 비만세포주의 성장과 메트릭스 분해 메탈로프로테인효소(MMPs)를 효과적으로 저해함으로써 비만 예방 및 치료제에 유용한 성분을 정제하는 방법을 제공하는 것이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 비만을 예방 및 억제하기 위한 유효성분으로서 오보바톨과 오보바탈에서 선택되는 하나 또는 두 성분, 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 이들의 유도체를 함유하는 비만 예방 및 억제용 조성물을 포함한다.

본 발명은 오보바톨과 오보바탈에서 선택되는 하나 또는 두 성분, 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 이들의 유도체를 포함하는 약제조성물의 경구용 제제로서 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 현탁제, 에멀션 또는 캅셀제 등을 포함한다.

본 발명은 오보바톨과 오보바탈에서 선택되는 하나 또는 두 성분, 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 이들의 유도체를 포함하는 비경구용 제제로서 주사 제, 경직장용제제, 경피용제제 등을 포함한다.

또한, 본 발명은 후박나무를 알코올로 추출하는 단계; 상기 추출액을 농축하여 수산화나트륨 용액으로 추출하는 단계; 염기층을 산성화시킨 후 메틸렌 클로라이드로 재추출하는 단계; 상기 메틸렌 클로라이드 추출액을 농축하여 정제하는 단계를 포함하는 비만 예방 및 치료용 유효성분의 정제방법을 포함한다.

이하, 본 발명의 내용을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.

본 발명은 비만을 예방 및 억제하기 위한 하기 화학식(1) 또는 화학식(2)으로 표시되는 오보바톨과 오보바탈에서 선택되는 하나 또는 두 성분, 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 이들의 유도체를 유효성분으로 포함하는 비만 예방 및 억제용 약제조성물을 포함한다.

본 발명의 약제조성물은 비만을 예방 또는 치료하는데 유효한 양의 오보바톨과 오보바탈에서 선택되는 하나 또는 두 성분, 이들의 약제학적으로 허용되는 염, 또는 이들의 유도체를 유효성분으로 함유하며, 이들 화합물은 비만세포에서 지방조직의 혈관생성을 억제하여 체지방을 감소시키므로 체중을 감소시킨다.

상기 화합물의 비만 억제 효과는 본 발명 이전에는 밝혀진 바 없는 새로운 용도로서, 본 발명에 의해 오보바톨과 오보바탈이 MMP-2의 활성을 억제하는 것으로 확인되었다.

본 발명의 약제조성물은 경구 또는 비경구 어느 수단으로라도 투여할 수 있다. 투여 제형에는 특별한 제한은 없지만, 환자의 연령, 성별 또는 질환의 경중뿐만 아니라 제형에 따라 결정될 것이다.

경구용의 제제로는 예를 들면, 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 현탁제, 에멀션, 또는 캅셀제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용의 제제로는, 주사제, 경직장용제제, 경피용제제 등을 들 수 있고, 정맥내, 피하근육내, 복강내 등의 투여경로로 투여될 수 있다. 경구투여가 일반적으로 바람직하다.

또한, 본 발명의 약제조성물은 상기 유효성분에 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용되는 부형제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 용해제, 보존제, 안정제, 완충제, 코팅제 등과 혼합함으로써 원하는 투여형태로 만들 수 있다.

상기에서 정제 제형을 위해서 당 업계에서 공지된 다양한 담체를 사용할 수 있다. 전형적인 담체의 예로는 : 락토오스, 사카로오스, 염화 나트륨, 글루코오스, 우레아, 스타치, 칼슘 카르보네이트, 카올린, 결정 셀룰로오스 및 규산과 같은 부형제 ; 물, 에탄올, 프로판올, 단미시럽, 글루코오스 용액, 스타치 용액, 젤라틴 용액, 카르복시메틸셀룰로오스, 쉘락, 메틸 셀룰로오스, 포타슘 포스페이트 및 폴리비닐 피롤리돈 슈거 등과 같은 결합제 ; 드라이 스타치, 소듐 알기네이트, 아거 파우더, 나미나란 파우더, 소듐 바이카르보네이트, 칼슘 카르보네이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소듐 라우릴 술페이트, 스테아르산 모노글리세라 이드, 스타치 및 락토오스와 같은 붕해제 ; 사카로오스, 스테아린, 카카오 버터 및 수소화 오일과 같은 붕해보조제 ; 4 급 암모늄염 및 소듐 라우릴 술페이트와 같은 흡수 촉진제 ; 글리세린 및 전분과 같은 습윤제 ; 전분, 락토오스, 카올린, 벤토나이트 및 콜로이드 규산과 같은 흡수제 ; 정제 탈크, 스테아레이트, 붕산 파우더 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제를 포함한다. 필요하다면, 정제를 코팅(예컨대, 슈거코팅, 젤라틴코팅, 장용코팅 또는 필름코팅)할 수 있고, 정제를 이층정 또는 다층정으로 형성할 수 있다.

환제 제형을 위해서, 당 업계에서 공지된 다양한 담체를 사용할 수 있다. 그 예로는, 글루코오스, 락토오스, 스타치, 카카오 오일, 수소화 식물유, 카올린 및 탈크와 같은 부형제 ; 아라비아 검 분말, 트라가칸트 파우더, 젤라틴 및 에탄올과 같은 결합제 ; 및 라미나란 아거와 같은 붕해제를 포함한다.

주사제로 제형화할 경우에는, 혈액과 등장인 멸균액 또는 현탁액이 바람직하다. 액제, 에멀션 또는 현탁액 제형을 위해서, 당 업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 희석제를 사용할 수 있다. 그 예로는, 물, 에틸 알코올, 프로필렌 글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 프로폭실화 이소스테아릴 알코올 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르를 포함한다. 이러한 경우에, 염화 나트륨, 글루코오스 또는 글리세린을 등장액으로 제조하기에 충분한 양 또는 통상의 용해 보조제, 완충제, 스무딩제 등을 가하기에 충분한 양으로 포함할 수 있다. 또한, 발색제, 보존제, 아로마 화학제, 향미제, 감미제 또는 그 외의 약제를 필요하다면 가할 수 있다.

본 발명의 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 체중 ㎏당 5 내지 50mg의 양, 바람직하게는 5 내지 20mg의 양을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1회 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명에서 오보바톨 또는 오보바탈은 천연 물질로부터 분리하거나 당 분야에 널리 공지된 방법을 이용하여 합성할 수 있다. 또한, 상기 화합물을 추출할 수 있는 천연물질로서 후박나무가 바람직하게 사용될 수 있다.

후박나무 [Magnolia obovata Thunberg는 목련과 (Magnoliaceae) 식물로 한국, 일본, 중국의 대부분의 지역에 자생하는 높이 5m의 낙엽수이다. 후박나무의 건조된 수피는 위장약 등으로 사용되고 있다. 후박나무의 잎과 수피의 추출물에서 분리된 호노키놀이나 마그놀올 등의 다양한 생리 활성에 대한 보고는 많이 있으나, 후박나무로부터 분리된 오보바톨과 오보바탈의 항비만 효과를 갖는다는 것에 대해서는 보고 된 바 없다.

후박나무로부터 추출하는 경우, 후박나무의 잎을 메탄올로 추출하고 이 추출물을 실리카겔 크로마토그래피 칼럼을 통해서 에칠아세테이트와 핵산을 사용하여 용출시켜 활성분획을 분리한 후, 분리된 활성 혼합물을 다시 일련의 크로마토그래피, 즉 C18 크로마토그래피 칼럼에 흡착시킨 후 메탄올과 물로 용출시켜서, 박막 크로마토그래피를 수행하고 고속 액체 크로마토그래피 칼럼에 메탄올과 물의 구배, 바람직하게는 50 : 50에서 70 : 30의 구배로 용출시켜 순수하게 분리할 수 있다.

상기 방법에서 알코올 추출은 후박나무의 잎, 열매, 수피 또는 이들 모두를 사용할 수 있다. 알코올 추출에 사용되는 알코올은 메탄올이 바람직하게 사용된다.

본 발명을 위하여 후박나무로부터 오보바톨과 오보바탈 화합물을 추출하여 분리 정제하고, 정제한 화합물 오보바톨과 오보바탈의 MMP2에 대한 활성을 조사하였다. 또한, 상기한 바와 같이 정제된 화합물을 UV 흡광도 측정, IR 흡광도 측정, 고 해상도 질량분석 및 NMR 분석을 통해 확인하였다. 본 발명에서 오보바톨과 오보바탈의 독성 실험을 위하여 특정병원부재 SD계 랫트에 대한 급성독성 실험을 실시하였다.

본 발명에 의하면, 후박나무로부터 유기용매를 이용하여 추출되는 상기 오보바톨과 오보바탈 화합물은 비만세포의 성장을 억제할 수 있는 효과를 가지며, 이러한 효과는 비만 세포의 성장에 중요한 역할을 하는 MMP2의 활성을 억제함으로 이루어진다. 또한, 오보바톨과 오보바탈은 랫트에 대한 독성 실험에서 독성변화가 관찰되지 않음으로 안정성이 입증되었다.

본 발명에서 제시한 MMP-2 저해제는 안정성이 입증된 생약으로부터 분리한 화합물로서 정기 복용에 따른 부작용이 적을 것으로 예상되며, 식품 공전에 수재된 물질로 사람을 대상으로 한 기능성 식품으로 개발하는데 있어 큰 어려움이 없을 것이다.

이러한 배경 하에서, 본 발명자들은 생약제로 오랫동안 사용해온 후박나무 [Magnolia obovata Thunberg (Magnoliaceae)]로부터 오보바톨과 오보바탈 화합물을 분리 정제하였다. 그리고 이 화합물이 비만세포주의 성장에 중요한 역할을 하는 메트릭스 분해 메탈로프로테인효소-2 (MMP-2)의 활성을 억제시킴을 확인하였다.

이하 본 발명을 하기 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시 예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 후박 나무로부터 오보바톨 및 오보바탈 화합물의 추출 및 분리 정제

후박나무(대한민국 중부지방에 자생하는 것을 채취) 잎, 열매 또는 수피를 잘게 분쇄하여 메탄올을 넣어 상온에서 48시간 방치한 후 교반하여 여과지를 이용해서 액상과 고체부분을 분리하였다. 액상을 모아서 감압 하에서 농축한 후 메탄올을 가하여 용해시켰다. 활성물질을 함유하고 있는 유기용매 층을 모아 감압 하에 농축하였다. 농축된 추출물을 메틸렌클로라이드에 녹인 후 실리카겔(Merck, Art No. 9385)에 가하여 활성물질을 흡착시킨 다음, 에칠아세테이트와 헥산의 비율을 90 : 10에서 80 : 20으로 변화시키면서 실리카겔 칼럼 크로마토그래피하여 활성분획을 분리하였다. 수득한 분획물을 C18 칼럼에 흡착시킨 다음 메탄올과 물로 용출시켜 부분 정제한 활성 물질을 얻었다. 부분 정제된 화합물을 대상으로 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 실시하여 순수한 화합물을 얻었다.

최종적으로 잎 2㎏을 메탄올로 추출하여 추출물 120g를 얻었으며, 이로부터 순수한 화합물 오보바톨 (obovatol)과 오보바탈 (obovatal)을 각각 25g 과 1.5g의 수율로 얻었다.

[실시예 2] 분리된 화합물의 구조분석

UV 흡광도 분석, IR (infrared) 흡광도 분석 및 고해상도 질량분석기 분석을 실시하여 상기 순수 정제된 화합물의 분자량 및 분자식을 결정하였다. 구체적으로, UV 흡광도 분석은 시마주사의 UV-265 분광광도계(Shimadzu UV-265 spectrophotometer)로 측정하였으며, IR 흡광도는 바이오-라드사의 디지랩 디비존 FTS-80 분광광도계(Bio-Rad Digilab Division FTS-80 spectrophotometer)로 측정하였고, 분자량 및 분자식은 VG70-SEQ 질량 분광계(mass spectrometry; MS)를 이용한 고해상도(High resolution) MS를 측정하여 결정하였다. 또한 핵자기공명기(Varian 300 ㎒, 500 ㎒ NMR)를 이용하여 ¹H, ¹³C-NMR 스펙트럼(spectrum)을 얻었으며, 이들 스펙트럼을 종합적으로 분석하여 구조를 결정하였다.

오보바톨의 ¹H-NMR (CDCl₃): 6.28(H-4, d, J = 1.8 Hz), 6.56 (H-6, d, J = 1.8 Hz), 3.18 (H-7, d, J = 6.6 Hz), 5.97 (H-8 and H-8', m), 5.09 (H-9 and H-9', m), 6.93 (H-2' and H-6', d, J = 9 Hz), 7.14 (H-3' and 5', d, J = 9 Hz), 3.36 (H-7', d, J = 6.6 Hz).

오보바탈의 ¹H-NMR (CDCl₃): 9.35 (H-9, d, J = 7.5 Hz), 7.38 (H-7, d, J = 15.3 Hz), 7.07 (H-3' and H-5', d, J = 9 Hz), 6.98 (H-4, d, J = 1.8 Hz), 6.78 (H-2' and 6', d, J = 9 Hz), 6.75 (H-6, d, J = 1.8Hz), 6.42 (H-8, dd, J = 7.5, 15.3 Hz), 4.51 (H-8', m), 5.09 (H-9', m), 3.30 (H-7', d, J = 6.6 Hz).

표 1. 오보바톨 (obovatol)

외형(appearance)		엷은 녹색
분자식		C18H18O3
분자량		282
융점(℃)		액체
용해성	가용성	Alcohols, DMSO
	불용성	Hexane, H2O

표 2. 오보바탈 (obovatal)

외형(appearance)		엷은 노란색
분자식		C18H16O3
분자량		280
융점(℃)		161-162 ℃
용해성	가용성	Alcohols, DMSO
	불용성	H2O

[실시예 3] MMP 효소 검정 (MMP-2)

7-메톡시쿠마린-4-일-아세틸-Pro-Leu-Gly-Leu-(2-[2,4-다이나이트로페닐]-2,3-다이아미노프로피오닐)-Ala-Arg-NH₂(Mca-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH₂)를 기질로, 전효소 MMP-2를 0.5mM ρ-아미노페닐머큐릭아세테이트(APMA)와 함께 반응완충용액에서 37℃에서 15분간 활성화된 것을 효소로 하여 TNBC 완충용액 (20mM Tris-HCl, 5mM CaCl₂, 및 0.15M NaCl, pH 7.5)를 이용하여 반응값을 측정하였다. 각각의 대조군과 시료 처리군으로 나누어 일정한 반응시간 간격으로 325㎚에서 420㎚ 파장에서 반응값을 비교 측정하였다. 오보바톨과 오보바탈은 MMP2의 활성을 각각 90 및 0.5 ㎍/㎖에 50%이상 억제 시켰다(도 1).

[실시예 4] 랫트에 대한 경구투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 다음과 같이 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 상기 활성물질을 주사용 증류수에 용해시켜 1 g/㎏/㎖의 용량으로 단회 경구 투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 그 결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 따라서 본 발명에 따른 오보바톨과 오보바탈은 모든 랫트에서 500 ㎎/㎏까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소 치사량(LD₅₀)은 500 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단되었다(도 2).

이상에서 살펴본 바와 같이, 오보바톨과 오보바탈은 인체 비만세포주의 성장과 메트릭스 분해 메탈로프로테인효소(MMPs)를 효과적으로 저해함으로써 비만 예방 및 치료제에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (4)

1. 비만을 예방 및 치료하기 위한 유효성분으로서 오보바톨과 오보바탈에서 선택되는 하나 또는 두 성분, 또는 이들의 약제학적으로 허용되는 염을 포함하는 비만 예방 및 치료용 조성물
2. 제 1항의 유효성분을 포함하며, 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 현탁제, 에멀션 또는 캅셀제인 약제조성물의 경구용 제제
3. 제 1항의 유효성분을 포함하며, 주사제, 경직장용제제, 경피용제제인 약제조성물의 비경구용 제제
4. 삭제

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