KR100579752B1 - 리그난계 화합물을 함유하는 염증성 질환의 치료 또는예방용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 리그난계 화합물을 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans) 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

[일반식 Ⅰ]

상기에서, R₁ 및 R₂ 는 C_1-5 의 알콕시 또는 히드록시 그룹이고, R₃ 는

또는

이다.

상기 일반식 Ⅰ의 리그난계 화합물은 염증 매개 인자인 NO, iNOS, COX-2 및 TNF-α의 생성 또는 발현을 저해시킴으로써 항염증 효과를 나타낸다. 따라서 본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물을 유효성분으로 함유하는 본 발명의 약학적 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

리그난계 화합물, 미리스티카 프라그란스, 항염증

Description

리그난계 화합물을 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition for treating or preventing an inflammatory disease comprising lignan compounds}

도 1은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)로부터 리그난계 화합물을 분리하는 공정도이다.

도 2는 본 발명의 리그난계 화합물의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.

도 3은 본 발명의 리그난계 화합물의 ¹H-NMR 스펙트럼이다.

도 4는 본 발명의 리그난계 화합물의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.

도 5는 본 발명의 리그난계 화합물의 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼이다.

도 6은 본 발명의 리그난계 화합물의 EI-Mass 스펙트럼이다.

도 7은 본 발명의 리그난계 화합물의 세포 독성 효과를 조사한 결과이다.

도 8은 본 발명의 리그난계 화합물의 NO 생성 억제 효과를 조사한 결과이다.

도 9는 본 발명의 리그난계 화합물의 iNOS 발현 억제 효과를 조사한 결과이다.

A: 웨스턴 블럿 분석 결과

B: LPS에 의해 자극된 대조군을 기준으로 하여 상대적인 iNOS 단백질 수준을 나타낸 그래프

도 10은 본 발명의 리그난계 화합물(A) 및 커큐민(B)의 PGE₂ 생성 억제 효과를 조사한 결과이다.

도 11은 본 발명의 리그난계 화합물의 COX-2 발현 억제 효과를 조사한 결과이다.

A: 웨스턴 블럿 분석 결과

B: LPS에 의해 자극된 대조군을 기준으로 하여 상대적인 COX-2 단백질 수준을 나타낸 그래프

도 12는 본 발명의 리그난계 화합물(A) 및 커큐민(B)의 TNF-α 생성 억제 효과를 LPS로 자극된 대식세포에서 조사한 결과이다.

도 13은 본 발명의 리그난계 화합물(A) 및 인도메타신(B)의 TNF-α 생성 억제 효과를 프로피오니박테리움 아크네스(P. acnes)로 자극된 인간 단핵구 U937 세포에서 조사한 결과이다.

본 발명은 리그난계 화합물을 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 하기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물에 관한 것이다.

[일반식 Ⅰ]

상기에서, R₁ 및 R₂ 는 C_1-5 의 알콕시 또는 히드록시 그룹이고, R₃ 는

또는

이다.

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염증 반응이란 조직(세포)의 손상이나 외부감염원에 감염되었을 때 발생하며 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증 매개물질 분비, 체액 침윤, 세포이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종 발열 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 또한 그 결과에 따라 급성 염증과 육아종(granuloma 염증), 류마티스 관절염, 골 관절염 등의 만성염증의 증상으로 나타난다(Goodwin J.S. et al., J. Clin. Immunol., 9: 295-314, 1989).

혈액응고와 염증에 중요한 영향을 미치는 효소 가운데 사이클로옥시게나제(cyclooxygenase, 이하 'COX'라 함)가 중요한 작용을 하는데, COX는 프로스타글란딘(prostaglandin)과 트롬복산(thromboxane)이란 두 가지 주요 산물을 생성한다. 프로스타글란딘은 매우 다양한 생리활성을 갖는 불포화지방산으로 염증 및 통증 전달, 혈관확장, 체온조절, 위액분비 촉진 등 우리 몸에서 국소적 호르몬 또는 세포기능 조절인자로 작용한다(Marnett, L.J. et al., J. Biol. Chem., 274: 22903-22906, 1999). COX-1은 위장관 보호, 신장의 혈류조절 및 혈소판 응집과 같은 정상적인 생리적 반응을 유지함으로서 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 한편, 외부자극에 의해 염증이 유발되어 전달되는 과정에서는 유도성 동종효소인 COX-2가 일시적으로 발현되어 염증이 일어나는 곳에서 프로스타글란딘을 과량 방출 하게 된다. 프로스타글란딘은 염증의 주요 증상인 홍반, 부종 및 통증을 일으키고, 내인성 염증매개물질인 히스타민 등의 작용을 증가시키는 활성이 있으므로 염증부위에서 프로스타글란딘의 생성억제는 염증치료에 많은 도움을 줄 수 있다.

현재 상업적으로 사용되는 비스테로이드 소염제(Non-steroidal anti-inflammatory drugs; NSAIDs)인 아스피린(aspirin), 인도메타신(indomethacin), 나프록센(naproxen), 이부프로펜(ibuprofen) 등은 COX-2 효소의 활성을 억제하여 프로스타글란딘 생성을 저해함으로써 항염효과를 나타낸다(Meade E.A. et al., J. Biol. Chem., 268: 6610, 1993). 그러나 이들 NSAID 약물들은 염증자극에 의해 일시적으로 발현되는 COX-2뿐만 아니라 위장관, 신장 혈소판의 정상기능을 유지하는데 중요한 역할을 하는 COX-1도 억제함으로써 위장관 출혈, 신장 기능부전 등의 심 각한 부작용을 초래하는 문제점이 있다(Surh Y.J. et al., Mutation Research 480-481: 243-268, 2001). 따라서 부작용을 최소화하면서 항염증 작용을 제공하는 물질을 천연물로부터 발굴하는 것은 산업적으로 매우 중요하다.

한편, 리그난(lignan)은 n-페닐 프로판이 n-프로필 곁사슬의 β 자리에서 결합한 천연 화합물을 총징한 것으로서, 자연계에 널리 분포한다. 혈당강하 작용, 항암작용, 항천식작용, 미백작용 등 리그난의 다양한 생리학적 활성에 대하여 연구되었다. 예컨대, 깨로부터 분리된 리그난인 세사민(sesamin), 에피세사민(episesamin), 세사미놀(sesaminol), 세사몰린(sesamolin) 및 에피세사미놀(episesaminol)이 항염증효과가 있음이 보고된 바 있으며(대한민국 공개특허공보 제1997-7001043호), 신이(Magnoliae flos)로부터 분리된 리그난계 화합물은 항천식 효능제로 사용될 수 있음이 개시되었다(대한민국 등록특허 제0263439호). 또한, 메이스리그난(macelignan)은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)에서 발견되는 대표적인 리그난계 화합물로서(Tuchinda P. et al., Phytochemistry, 59: 169-173, 2002), 세포자가사멸(apoptosis)을 유도하는 카스파제(caspase)-3 증진작용(Park B.Y. et al., Biol. Pharm. Bull., 27(8): 1305-1307,2004) 및 항산화 작용(Sadhu, S.K. et al., Chem. Pharm. Bull., 51(9): 595-598, 2003)에 대한 활성 등이 보고되었다. 그러나, 상기 메이스리그난을 비롯하여 리그난 화합물의 항염증활성에 대해서는 지금까지 전혀 보고된 바 없다.

이에, 본 발명자는 항염증활성을 가지는 천연물 유래 화합물을 찾고자 장기간 탐색한 결과, 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 분리·정제된 리그난계 화합물이 탁월한 항염증활성을 보이는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 분리·정제된 리그난계 화합물의 신규한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

[일반식 Ⅰ]

상기에서, R₁ 및 R₂ 는 C_1-5 의 알콕시 또는 히드록시 그룹이고, R₃ 는

또는

이다.

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이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 분리·정제된 리그난계 화합물의 신규한 용도를 제공하는 데 그 특징이 있다.

본 발명에 따른 리그난계 화합물은 하기의 일반식 Ⅰ으로 표시된다.

[일반식 Ⅰ]

상기에서, R₁ 및 R₂ 는 C_1-5 의 알콕시 또는 히드록시 그룹이고, R₃ 는

또는

이다.

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본 발명의 바람직한 리그난계 화합물은 상기 R₁이 메톡시 그룹, R₂ 가 히드록시 그룹, R₃ 가

인 하기의 화학식 1의 메이스리그난[(8R, 8'S)-7-(3,4-methylenedioxyphenyl)-7'-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-8,8'-dimethylbutane)]일 수 있다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 리그난계 화합물은 염, 바람직하게는 약학적으로 허용 가능한 염의 형태로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염이 바람직하다. 상기 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산 및 아스파르트산을 포함한다. 또한 상기 무기산은 이에 제한되는 것은 아니나, 염산, 브롬산, 황산 및 인산을 포함한다.

본 발명의 리그난계 화합물은 종래의 물질을 추출하고 분리하는 방법을 이용하여 식물 또는 식물의 일부로부터 수득될 수 있다. 줄기, 뿌리 또는 잎은 목적하는 추출물을 획득하기 위하여 적절히 탈수하여 침연(macerated)하거나 단지 탈수하고, 목적하는 추출물은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 알려진 정제 방법을 이용하여 정제된다. 또한 상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물에 상응하는 합성 화합물 또는 이들의 유도체는 일반적으로 구매 가능한 물질이거나, 공지의 합성 방법을 이용하여 화학적으로 제조될 수 있다.

상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 본 발명의 리그난계 화합물은 미리스티카 프라그란스(Myristica fragnance Houtt.)로부터 분리·정제될 수 있다(Jung Yun Lee et al., Kor. J. Pharmacogn. 21(4):270-273, 1990; Masao Hattori et al., Chem. Pharm. Bull., 34(9):3885-3893, 1986; Masao Hattori et al., Chem Pharm. Bull., 35(2):668-674, 1987). 바람직하게는 육두구(nutmeg)나 가종피(aril)로부터 분리·정제될 수 있다. 상기 육두구는 미리스티카 프라그란스의 성숙한 과실 또는 과실 속에 있는 종자를 말한다. 또한 본 발명의 리그난계 화합물은 육두구를 압착하여 얻은 오일로부터 분리·정제될 수 있다. 또한 다른 육두구과 식물인 미리스티카 아르겐티아 워르브(Myristica argentea Warb) 등에서도 분리 정제될 수 있다(Filleur, F. et al., Natural Product Letters, 16: 1-7, 2002). 또한 후박나무(Machilus thunbergii)(Park B.Y. et al., Biol. Pharm. Bull., 27(8): 1305- 1307,2004), 레우카스 아스페라(Leucas aspera)에서도 분리·정제될 수 있다(Sadhu, S.K. et al., Chem. Pharm. Bull., 51(9): 595-598, 2003).

본 발명의 리그난계 화합물의 분리를 위한 추출 용매로는 물 또는 C1-C6의 유기용매를 사용할 수 있다. 바람직하게는 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol), 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane), 시클로헥산(cyclohexane), 석유에테르(petroleum ether) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는 메탄올 또는 헥산을 사용할 수 있다. 미리스티카 프라그란스 추출물로부터 본 발명의 리그난계 화합물의 분리 및 정제는 실리카겔(silica gel)이나 활성 알루미나(alumina)등의 각종 합성수지를 충진한 컬럼 크로마토그라피(column chromatography) 및 고속액체크로마토그라피(HPLC) 등을 단독으로 혹은 병행하여 사용할 수 있다. 그러나 유효성분의 추출 및 분리정제 방법은 반드시 상기한 방법에 한정되는 것은 아니다.

이와 같이 본 발명의 리그난계 화합물은 순수하게 분리·정제된 화합물의 형태로 사용될 수 있으며, 또한 이를 함유하는 추출물의 형태로도 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 기재한 바와 같은 미리스티카 프라그란스의 종자, 과실 또는 가종피 추출물이나 미리스티카 프라그란스의 종자를 압착하여 얻은 오일의 형태로 사용될 수도 있다. 상기 추출물은 상기한 바와 같이 미리스티카 프라그란스을 물 또는 C1-C6의 유기용매로 추출하여 얻을 수 있다. 바람직하게는 미리스티카 프라그란스 의 종자, 즉 육두구 추출물일 수 있다.

본 발명의 리그난계 화합물은 다양한 염증 반응을 매개하는 물질들을 억제하여 항염증 활성을 가진다.

NO는 신경전달, 혈관의 이관 및 세포 매개성 면역반응에 관여하는 물질로서, NOS(nitric oxide synthase)에 의해 L-arginine으로부터 생성된다(Nathan and Xie, 1994; Alderton et al., 2001). 특히 대식세포가 IFN-γ 또는 LPS(lipopolysaccaride)에 의해 자극되면 iNOS(inducible nitric oxide synthase)가 발현되고, 상기 iNOS에 의해서 많은 양의 NO가 생성된다. 본 발명의 리그난계 화합물은 대식세포에서 NO의 생성 및 NO 생성에 관여하는 iNOS의 발현을 농도 의존적으로 억제하는 것으로 나타났다(도 8 및 도 9 참조).

또한 COX-2는 체내의 염증반응에 관여하는 물질로서 염증성 PG를 생산한다. COX-2는 세균류에 의해 분비되는 내독소인 LPS와 염증성 사이토카인류인 IL-1, TNF-α, IFN-γ 등에 의해 발현이 유도된다. 본 발명의 리그난계 화합물은 COX-2의 발현을 억제할 뿐 아니라 PG류의 하나인 PGE₂(Prostaglandin E2)의 생성 또한 농도 의존적으로 억제하는 효과가 있다(도 10 및 도 11 참조).

종양괴사인자인 TNF-α(tumor necrosis factor α)는 그람 음성 박테리아와 다른 감염성 미생물에 대한 급성 염증반응의 주된 매개 인자이다. LPS에 의해 자극된 대식세포는 TNF-α의 합성을 증가시킨다. TNF-α의 생물학적 작용은 저농도 에서 백혈구와 내피세포에 작용하여 급성염증을 유도한다. 중간 농도에서는 염증의 전신적 반응을 매개하고 고농도에서는 패혈증(sepsis) 쇼크의 병리학적 이상으로 사망을 초래한다. 또한 TNF-α는 PG의 합성을 증가하여 열을 생성하고, 트롬보모둘린(trombomodulin)의 발현을 억제하여 혈관성 플러깅(vascular plugging)을 초래한다(Abbas and Lichtman, "Cellular and Molecular Immunology"the fifth edition. pp. 247-253, 2003). 본 발명의 리그난계 화합물은 대식세포와 인간 단핵구 세포에서 TNF-α의 생성을 억제하는 효과가 있다(도 12 및 도 13 참조).

또한 본 발명의 리그난계 화합물을 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate) 처리로 부종을 유발시킨 래트의 귀에 국소도포한 결과, 농도 의존적으로 부종 생성율이 억제되었으며, 현재 상업적인 항염증제로 사용되는 인도메타신보다 높은 부종 억제율을 보였다(표 2 참조). 또한, 리그난계 화합물을 함유하는 크림을 제조한 후 이를 래트의 귀에 국소도포한 결과, 부종 생성율이 크게 억제되었다(표 4 참조).

한편, 본 발명자들은 미리스티카 프라그란스 추출물(메탄올 및 헥산 조추출물)을 TPA 처리로 부종을 유발시킨 래트의 귀에 국소도포한 결과, 농도 의존적으로 부종 생성율이 억제됨을 확인할 수 있었다(표 5 참조).

이러한 결과들은 본 발명의 리그난계 화합물이 COX-2 뿐 아니라 염증 반응을 매개하는 다양한 인자들을 억제하여 탁월한 항염증 작용을 나타내는 것을 의미한다. 또한 미리스티카 프라그란스 추출물 자체로도 동일한 항염증 효과를 얻을 수 있음을 나타내는 것이다. 이와 같은 일반식 Ⅰ로 표시되는 본 발명의 리그난계 화 합물 및 미리스티카 프라그란스 추출물의 항염증 활성에 대해서는 본 발명에서 처음으로 규명한 것이다.

현재 상업적으로 사용되는 비스테로이드 소염제들이 대부분 COX-2 효소의 활성을 억제하여 항염증효과를 나타냄을 볼 때, 본 발명의 리그난계 화합물은 종래 항염증제보다 더욱 우수한 효과를 가지는 항염증제로서 사용될 수 있음을 알 수 있다.

따라서 본 발명은 상기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물, 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 미리스티카 프라그란스 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 미리스티카 프라그란스 추출물의 제조는 위에서 기재한 바와 같다.

본 발명의 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다. 일반적인 의약품의 형태로 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 연고제, 크림제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 상기 일반식 Ⅰ의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물을 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투약량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투약량은 바람직하기로는 유효 약물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

본 발명의 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물의 유효용량은 1회 복용량이 0.1 - 50 mg/kg이고, 바람직하기로는 1 - 10 mg/kg이며, 하루 1 - 3 회 투여될 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량 수준은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 리그난계 화합물을 래트에 경구 투여시의 독성 실험을 수행한 결과, 경구 독성시험에 의한 50 % 치사량 (LD₅₀)은 2,000 mg/kg 이상인 것으로 나타났다.

특히, 본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물을 함유하는 약학적 조성물은 피부 도포용 의약품 즉 연고, 크림의 형태로 제제화될 수 있으며, 제제물 총 중량에 대하여 0.001 - 10.0 중량%, 바람직하게는 0.005 - 5.0 중량%의 범위 내에서 제형에 따라 적절하게 배합될 수 있다. 0.005 중량% 미만으로 첨가하는 경우에는 항염증 활성이 낮아지고, 10.0 중량%를 초과하여 첨가하는 경우에는 첨가량만 많아질 뿐 항염증 활성에 있어서 큰 차이가 없기 때문이다.

본 발명의 약학적 조성물이 적용될 수 있는 염증성 질환은 NO, iNOS, COX-2, PGE₂, TNF-α 등과 같이 일련의 염증 반응을 일으키는 다양한 자극 요인들로 인하여 유발된 염증을 동반하는 질환을 말한다. 상기 염증성 질환에는 부종 등과 같은 일반적인 염증 증상을 포함하여 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절 염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease; 또는 'charcot joint'이라고도 함), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열(familial Mediterranean fever), 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다. 또한 급·만성 습진, 접촉성 피부염, 아토피성 피부염, 지루성 피부염, 박탈 피부염, 일광 피부염, 건선 등 염증성 피부질환도 포함된다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 또한 하기 실시예 및 실험예들에서 특별히 부피%임을 명시하지 않은 %는 중량%를 나타낸다. 또한 모든 활성 분석은 모두 3회 이상 반복 수행하였으며 그 결과는 평균값ㅁ 표준편차로 표시하였다. 또한 통계분석은 Students's t-test를 이용하여 수행하였으며, p 값은 <0.05이하인 경우에 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

<실시예 1>

미리스티카 프라그란스로부터 리그난계 화합물의 분리 및 정제

<1-1> 리그난계 화합물의 분리 및 정제

건조 분쇄한 육두구 100 g(건조중량)에 75 부피% 메탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 상기 용액을 와트만(Whatman) 여과지 제 2번을 이용하여 여과하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 메탄올 여과액을 진공농축하고 동결건조하여 육두구의 메탄올 조추출물(7 g)을 제조하였다. 메탄올 조추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 차례로 분획하여 에틸아세테이트 분획물(4.2 g)을 얻었다. 에틸아세테이트 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck Kieselgel 66; 70-230 mesh)를 이용하여 헥산과 에틸아세테이트를 10:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜, 분획물 Ⅲ(1.0 g)를 얻었다. 진공회전농축기로 용매를 완전히 제거하여 육두구의 조추출물을 제조하였다. 이후, 분획물 Ⅲ를 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(Merck Kieselgel 66; 70-230 mesh)를 이용하여 헥산과 에틸아세테이트를 20:1(v/v)의 비율로 혼합한 용매로 용출시켜, 분획물 Ⅲ-B(0.52 g)를 얻었다. 분획물 Ⅲ-B를 Rp-18 컬럼 크로마토그래피(Merck LiChroprep; 25-40 ㎛)를 이용하여 80% 메탄올로 용출시켜 단일물질 분획 Ⅲ-B-2(0.5 g)를 얻었다. 이와 같은 분리 공정도를 도 1에 나타내었다.

<1-2> 구조 분석

상기 분리된 단일물질 Ⅲ-B-2의 구조를 결정하기 위하여 ¹H-NMR 스펙트럼과 ¹³C-NMR 스펙트럼을 각각 600MHz 와 150MHz(용매: DMSO)에서 측정하였다. 그 결과를 도 2와 도 3에 각각 나타내었다. ¹³C-NMR 스펙트럼과 ¹H-NMR 스펙트럼의 결과를 토대로 ¹H-¹H의 상관관계와 ¹H-¹³C의 상관관계를 측정하기 위하여 ¹H-¹H COSY 스펙트럼과 ¹H-¹³C HMBC 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 4와 도 5 에 각각 나타내었다. ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H-¹³ C HMBC의 결과를 종합적으로 분석하여 표 1에 나타내었다.

Position	13C-NMR	1H-NMR	1H-1H COSY	1H-13C HMBC
1	135.4
2	109.2	6.72 brs		C-7, C-6, C-4, C-3
3	147.3
4	145.1
5	107.9	6.79 d(7.8)	6.61	C-6, C-4, C-3, C-1
6	121.7	6.61 dd(7.8)	6.79	C-7, C-5, C-4, C-2, C-1
7	38.2	2.23 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.23	C-8, C-6, C-2, C-1 C-9, C-8, C-6, C-2, C-1
8	38.7	1.64 brs	0.75, 2.23, 2.66	C-7
9	16.0	0.75 d(6.3)	1.64	C-8, C-7
1'	132.4
2'	112.9	6.66 brs		C-7', C-6', C-4', C-3'
3'	147.1
4'	144.4
5'	115.2	6.66 d(7.9)	6.53	C-6', C-4', C-3', C-1'
6'	121.0	6.53 d(7.9, 1.1)	6.66	C-7', C-5', C-4', C-2', C-1'
7'	38.0	2.17 dd(13.2, 9.3) 2.66 dd(13.2, 4.8)	1.64, 2.66 1.64, 2.17	C-8', C-6', C-2', C-1' C-9', C-8', C-6', C-2', C-1'
8'	38.7	1.64 brs	0.75, 2.17, 2.66	C-7'
9'	16.1	0.75 d(6.3)	1.64	C-8', C-7'
OMe	55.5	3.72(s)
O-CH2-O	100.6	5.95 d(4.8)		C-3, C-4

<1-3> 질량 분석

상기 분리된 단일물질의 질량 분석을 위해 측정한 EI/MS의 결과를 도 6에 나타내었다. 본 화합물은 EI/MS에서 [M]⁺가 m/z 328에서 관측되어 분자량이 328로 판명되었고, 분자식은 C₂₀H₂₄O₄이었다.

이상의 ¹H-NMR, ¹³C-NMR, ¹H-¹H COSY, ¹H- ¹³C HMBC 및 EI/MS에 대한 결과와 기존에 발표된 연구보고(Woo, W.S. et al., Phytochemistry, 26: 1542-1543, 1987)를 비교 분석하여 동정한 결과, 분리된 단일 물질은 하기 화학식 1로 표시되는 메이스 리그난(macelignan)인 것으로 확인되었다.

[화학식 1]

<실시예 2>

본 발명의 리그난계 화합물의 세포 독성 효과 조사

<2-1> RAW264.7 세포주의 배양

상기 실시예 1에서 얻은 메이스리그난이 염증반응 매개물질의 생성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 대식세포 RAW264.7 세포를 사용하였다. 대식세포 RAW264.7 세포는 American Tissue Culture Collection(ATCC TIB TIB-71, Rockville, MD, USA)에서 구입하여 사용하였다. 상기 세포주를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco, USA) 배지로 열에 비활성화된 10% FBS(fetal bovine serum, Gibco, USA), 100 U/㎖ 페니실린 G 및 100 ㎍/㎖ 스트렙토마이신 (streptomycin)을 보충하여, 5% CO₂가 함유된 37℃ 배양기에서 배양하였다.

<2-2> 세포독성(cytotoxicity) 측정

본 발명의 메이스리그난이 RAW 264.7 세포의 생존율을 미치는 영향을 알아보기 위하여 미토콘드리아 탈수소 효소에 의해 자주빛 포르마잔(formazan) 생성물로 변하는 MTT 환원을 바탕으로 한 분석을 수행하였다(Hayon T. et al., Leuk. Lymphoma. 44(11): 1957-1962, 2003). 1×10⁶ cell/㎖의 RAW264.7 세포를 RPMI 1640 배지에 접종하고 6시간 후에 본 발명의 메이스리그난을 1 ㎖당 1~80 μM까지 처리하였다. 24시간 후에 MTT 분석법을 이용하여 세포 생존율을 측정하였다.

그 결과, 도 7에서 보는 바와 같이 본 발명의 메이스리그난은 1-20 μM 농도에서 RAW264.7 세포의 생존율에 큰 영향을 주지 않았다. 이 결과를 바탕으로 이후의 염증 실험에서는 1-20 μM 농도의 메이스리그난을 사용하였다.

<실시예 3>

본 발명의 리그난계 화합물의 NO 억제 효과 조사

<3-1> NO 생성 억제

IFN-γ 또는 LPS에 의해 자극된 대식세포는 iNOS를 많이 발현시켜 염증 반응의 매개물질인 NO을 대량 생성한다(Miyasaka and Hirata., Immunol. Today., 16: 128-130, 1995; Guzik et al., J. Physiol. Pharmacol., 54(4): 469-487, 2003). 따라서 본 발명의 메이스리그난이 LPS로 활성화된 RAW264.7 세포에서 NO 생성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다.

RAW264.7 세포를 1×10⁶ cell/㎖의 농도로 희석한 후 RPMI 1640 배지에 접종하였다. 5시간 후, 본 발명의 메이스리그난을 1~20 μM의 각 농도로 첨가하여 2시간 동안 전처리하였다. 이후에 LPS(10 ㎍/㎖)를 처리하여 24시간 배양하였다. 대조군에는 LPS만을 처리하였다. NO의 생성량은 세포 배양 여액을 이용하여, NO의 반응 산물인 NO₂ ^-를 측정하는 방법으로 정량하였다(Han et al., Life Sci., 75(6): 675-684, 2004). 배양여액 100 ㎕과 동일한 부피의 Greiss 시약(0.5% sulfanilyamide, 0.05% N-(1-naphthyl) ethylene diamine dihydrochloride/2.5% H₃PO₄)을 96-well 조직 배양 플레이트에서 혼합하여 상온의 어두운 곳에서 10분간 반응시켰다. 이후, 550 nm에서 ELISA 마이크로플레이트 판독기(microplate reader)를 이용하여 시료의 흡광도를 측정하였다. NO₂ ^-의 농도는 NaNO₃ 를 이용하여 표준곡선을 만들고, 이와 비교하여 NO의 생성량을 측정하였다. 모든 실험은 3번 이상 반복하였으며, 각각을 student's t-test를 이용하여 정량하였다.

그 결과, 도 8에서 보는 바와 같이, LPS 단독 처리에 의해 NO의 생성이 크게 증가되었으나, 이는 본 발명에 따른 메이스리그난의 처리에 의하여 농도 의존적으로 억제되는 것을 확인하였다. 특히, 1 μM과 5 μM의 낮은 농도에서도 NO의 생성 억제효과가 우수함을 확인할 수 있었다(P<0.01). 또한 20 μM의 메이스리그난을 처리한 경우에는 무처리군과 거의 유사한 정도로 NO의 생성이 억제되었다.

<3-2> iNOS 발현 억제

LPS로 대식세포를 자극하면 iNOS가 과량 발현되면서 많은 양의 NO를 생성하게 된다. 따라서 상기 실시예 <3-1>에서 확인한 본 발명의 메이스리그난의 NO 생성 억제와 iNOS와의 관계를 알아보기 위하여 상기 메이스리그난이 iNOS 발현에 미치는 영향을 측정하였다.

본 발명의 메이스리그난과 LPS가 처리된 RAW 264.7 세포를 용해한 후 브래드포드 방법으로 단백질을 정량하였다. 단백질 10 ㎍을 10% SDS-PAGE로 분리한 후, 상기 분리된 단백질을 전이 용액(transfer solution; 20% methanol, 25mM Tris, 192 mM glycine, pH 8.3)을 이용하여 니트로셀룰로스 막에 옮겼다(Hall, Methods Mol. Biol., 261: 167-174, 2004). SDS-폴리아크릴아미드 겔과 니트로셀룰로스 막을 밀착시킨 후, 미니-겔 트랜스퍼 키트에 장착하였다. 이후, 샘플을 로딩하고, 100V에서 1시간동안 전이시켰다. 이후, TBST(tris buffered saline tween-20) 용액으로 1회 세척하고, 상기 막을 건조된 여과지에 옮겨 상온에서 건조시켰다. 비 특이적인 반응을 제거하기 위해서 5% 비지방 스킴 밀크(skim milk)가 함유된 TBST로 4℃에서 24시간 이상 충분히 흔들며 방치시켰다. 이후, TBST 용액으로 3회 세척하고 항-iNOS 항체(1:2,000)(Calbiochem 사)를 주입하여 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 다시 TBST 용액으로 막을 3회에 걸쳐 10분씩 세척하였다. HRP(Horse radish peroxidase)가 부착된 항-래빗 IgG-HRP(1:2,000)(Calbiochem사)를 주입하 고, 1시간 동안 쉐이커(shaker) 위에서 반응시켰다. 이후 상기 막을 다시 TBST 용액으로 3회 세척한 후, ECL(enhanced chemiluminescence) 용액에 담가 1분간 흔들어 주면서 고루 적셨다. 상기 ECL 용액의 제조는 용액 A(luminol과 enhancer를 포함)와 용액 B(hydrogen peroxide를 포함)를 동량으로 혼합한 후 1분간 잘 흔들어서 제조한 것이다. 상기 ECL 용액으로부터 상기 막을 꺼내어 물기를 제거한 후, 암실에서 엑스레이 필름으로 스캔하였다.

그 결과, 도 9에서 보는 바와 같이, 본 발명의 메이스리그난은 대식세포에서 iNOS의 발현을 농도 의존적으로 억제하였으며, 5 μM부터 억제효과가 현저한 것으로 확인되었다(P<0.01).

상기 결과들로부터 본 발명의 메이스리그난이 염증 유발 인자인 NO의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 이를 생성하는 iNOS의 발현도 억제함을 확인할 수 있었다.

<실시예 4>

본 발명의 리그난계 화합물의 COX-2 억제 효과 조사

<4-1> PEG ₂ 생성 억제

iNOS가 염증반응과 밀접한 관련이 있는 것과 마찬가지로 COX-2는 염증반응을 매개하는 PG류를 생성하는 데에 필수적인 효소이며, iNOS와 COX의 발현 및 활성은 상호 관련성이 있는 것으로 알려져 있다(Surh et al., Mutat. Res., 481: 243- 268, 2001). 따라서, 본 발명의 메이스리그난이 LPS에 의해 활성화된 대식세포에서 PGE₂의 생성에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다.

먼저 1×10⁶ cell/㎖의 RAW264.7 세포를 96-well 조직 배양 플레이트에 접종하고 5시간 동안 상온에서 방치하였다. 이후, 본 발명의 메이스리그난을 1~20 μM의 농도로 각각 첨가하여 2시간 동안 전처리하였다. 음성 대조군에는 아무 것도 처리하지 않았으며, 양성대조군에는 PGE₂ 억제 활성을 가진 보고된 커큐민(curcumin)(Curcuma longa으로부터 분리된 것임, Sigma사)을 처리하였다. 이후, 1 ㎍/㎖의 LPS을 처리하여 18시간 배양하였다. 대식세포에서의 PGE₂의 생성량을 어세이 키트(R&D System Inc, Minneopolis, USA)의 방법을 이용하여 ELISA법으로 정량하였다(Chen et al., Biochem. Pharmacol., 68: 1089-1100, 2002).

그 결과, 도 10에서 보는 바와 같이, LPS 단독 처리에 의해 PGE₂가 크게 생성되었으나, 이는 본 발명의 메이스리그난의 처리에 의하여 농도 의존적으로 억제됨을 확인하였다. 그 억제효과는 5 μM 에서도 나타났다. 이와 같은 본 발명의 메이스리그난의 PGE₂ 생성 억제 효과는 커큐민을 처리한 경우와 거의 유사하였으며, 실시예 3에서 확인한 NO 및 iNOS 억제 효과와 동일한 경향을 나타내었다(P<0.05).

<4-2> COX-2 발현 억제

본 발명자들은 PGE₂ 생성에 직접적으로 영향을 미치는 COX-2의 발현을 웨스 턴 블럿 분석을 이용하여 조사하였다. 1차 항체로서 항-COX-2 항체(1:2,000)(Calbiochem사)를, 2차 항체로서 항-염소 IgG-HRP(1:2,000)(Calbiochem사)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실시예 <3-2>에 기재된 방법과 동일한 방법으로 수행하였다.

그 결과, 도 11에서 보는 바와 같이, 본 발명의 메이스리그난은 COX-2 단백질의 발현을 농도 의존적으로 억제함을 확인할 수 있었다. 특히, 10 -20 μM의 농도에서 유의적으로 발현양이 감소되었다.

상기 결과들로부터 본 발명의 메이스리그난이 염증 유발 인자인 PEG₂의 생성을 억제할 뿐만 아니라, 이를 생성하는 COX-2의 발현도 억제함을 확인할 수 있었다.

<실시예 5>

본 발명의 리그난계 화합물의 TNF-α 억제 효과 조사

TNF-α는 염증 반응에 중요한 작용을 하는 염증성 사이토카인이다. 따라서 본 발명의 메이스리그난이 TNF-α의 생성에 미치는 영향을 조사하였다.

<5-1> 대식세포주에서의 TNF-α 생성 억제

먼저 1×10⁶ cell/㎖의 RAW264.7 세포를 96-well 조직 배양 플레이트에 접종하고 5시간 상온에서 방치하였다. 이후, 본 발명의 메이스리그난을 1~20 μM의 농 도로 각각 첨가하여 2시간 동안 전처리하였다. 음성 대조군에는 아무 것도 처리하지 않았으며, 양성 대조군에는 커큐민(curcumin, Sigma사)을 처리하였다(Araujo and Leon, Mem. Inst. Oswaldo. Cruz., 96(5): 723-728, 2001; Chainani-Wu, J. Altern. Complement., 9(1): 161-168, 2003). 이후, 1 ㎍/㎖의 LPS를 처리하여 18시간 배양하였다. 대식세포에서의 TNF-α의 생성량을 어세이 키트(R&D System Inc, Minneopolis, USA)의 방법을 이용하여 ELISA법으로 정량하였다(Chen et al., J. Dermatol. Sci. 29: 97-103, 2002).

그 결과, 도 12에서 보는 바와 같이, 본 발명의 메이스리그난 5 μM를 처리했을 때부터 TNF-α의 생성이 유의적으로 감소하는 경향을 나타내었다(P<0.05).

<5-2> 인간 단핵구세포에서의 TNF-α 생성 억제

본 발명자들은 프로피오니박테리움 아크네스(Propionibacterium acnes)로 활성화된 인간 단백구(Human monocytic) U937 세포에서의 TNF-α의 생성량을 상기 실시예 <5-1>과 동일한 방법에 따라 측정하였다. 단, 양성 대조군에는 인도메타신(Sigma사)을 처리하였다(Walch and Morris, Endocrinology. 143(9): 3276-3283, 2002).

그 결과, 도 13에서 보는 바와 같이, 인간 단핵구세포에서의 TNF-α 생성이 본 발명의 메이스리그난에 의해 농도 의존적으로 감소함을 확인할 수 있었다(P<0.01).

상기 결과들로부터 본 발명의 메이스리그난이 급성 염증 및 염증의 전신적 반반응을 유도 및/또는 매개하는 TNF-α의 생성을 억제함을 확인할 수 있었다.

<실시예 6>

동물 모델을 이용한 본 발명의 리그난계 화합물의 항염증 활성 조사

상기 실시예 1에서 분리·정제한 리그난계 화합물의 항염증 활성을 동물 실험을 통하여 확인하였다. 상기 항염증 활성은 래트(rat)에 대한 부종억제 실험을 통하여 측정하였다. 실험동물은 5주령의 Wistar 래트(대한바이오링크, 한국)를 이용하였다. 사료는 표준 펠렛 형태의 쥐 사료(제일제당)를 공급하였으며, 사료와 물은 자유 급식시켰다. 래트는 12시간의 형광등 일조, 25± 2℃ 및 습도 60± 10%의 조건하에서 사육하였다. 기염제로서 TPA(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate; Sigma사)는 아세톤에 200 ㎍/mL가 되도록 용해하였다. 래트 귀의 부종은 TPA 용액을 국소적으로 귀의 바깥 면과 안쪽 면에 각각 10 ㎕/ear가 되도록 가하여 유도하였다(4 ㎍/ear). 상기 실시예 1에서 순수 정제한 메이스리그난과 대조물질로서 비스테로이드 소염제인 인도메타신은 아세톤에 녹여 20, 200, 2000 ㎍/ear가 되도록 하였다. 메이스리그난과 인도메타신은 TPA 처리후 30분 후에 래트의 귀에 각각 국소 도포하였다. 대조군에는 아세톤을 국소 도포하였다. 래트 귀의 두께는 각 물질을 처리한 후 8시간 후에 캘리퍼(calliper)를 이용하여 측정하였다. 귀 두께의 증가는 시료를 처리하지 않은 군과 비교하였으며, 부종억제율을 산출함으로써 염증억제 효과를 측정하였다. 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

투여약물	래트수(마리)	투여량(㎍/ear)	부종두께(㎛)	부종억제율(%)
대조군	20	0	248±8	-
본 발명의 메이스리그난	20	20	157±9*	36.7
	20	200	98±6*	60.5
	20	2000	52±4*	79.0
인도메타신	20	20	185±5*	25.0
	20	200	108±8*	56.5
	20	2000	64±7*	74.2

^* p<0.01

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 메이스리그난은 TPA로 유발되는 래트의 부종을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(통계학적 유의성 p<0.01). 본 발명의 메이스리그난과 인도메타신의 ID₅₀ 값은 각각 120.6 ㎍/ear과 162.9 ㎍/ear로서, 본 발명의 메이스리그난이 종래 소염제로서 사용되고 있는 인도메타신보다 더 높은 부종억제효과를 나타내었다.

<실시예 7>

본 발명의 리그난계 화합물 함유 크림의 제조 및 이의 항염증 활성 조사

<7-1> 크림의 제조

본 발명의 메이스리그난을 이용하여 하기 표 3에 기재된 다양한 조성을 지니는 크림을 각각 제조하였다. 먼저 하기 표 3에서 B로 표시된 물질들을 75~80℃에 서 녹였다. 또한 하기 표 3에서 C로 표시된 물질 중 세틸 알코올과 보존료를 같은 온도에서 녹였다. 상기 C 물질들을 상기 B 물질들에 유화시켰다. 이후, 하기 표 3에서 A로 표시된 본 발명의 메이스리그난을 5.0, 0.5, 0.05, 0.005%의 농도로 각각 넣어 혼합하였다. 마지막으로 향료를 넣고 정제수로 정량을 맞추어 크림을 제조하였다.

		1	2	3	4
주 요 구 성 성 분	A	메이스리그난 5.0%	메이스리그난 0.5%	메이스리그난 0.05%	메이스리그난 0.005%
	B	글리세린 2.0%	글리세린 2.0%	글리세린 2.0%	글리세린 2.0%
		프로필렌글리콜 2.0%	프로필렌글리콜 2.0%	프로필렌글리콜 2.0%	프로필렌글리콜 2.0%
		염화 라우릴 설파이드 8.0%	염화 라우릴 설파이드 8.0%	염화 라우릴 설파이드 8.0%	염화 라우릴 설파이드 8.0%
		스테아린 5.4%	스테아린 5.4%	스테아린 5.4%	스테아린 5.4%
		미네랄 오일 4.5%	미네랄 오일 4.5%	미네랄 오일 4.5%	미네랄 오일 4.5%
	C	향료 0.02%	향료 0.02%	향료 0.02%	향료 0.02%
		세틸 알코올 6.5%	세틸 알코올 6.5%	세틸 알코올 6.5%	세틸 알코올 6.5%
		정제수 잔부	정제수 잔부	정제수 잔부	정제수 잔부
		보존료 0.1%	보존료 0.1%	보존료 0.1%	보존료 0.1%

<7-2> 항염증 활성 조사

상기 실시예 <7-1>에서 제조된 메이스리그난 함유 크림의 항염증 활성은 래트에 대한 부종억제 실험을 통하여 측정하였다. 부종 억제 실험은 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 실시하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

시료	1	2	3	4
메이스리그난 함유량	0.005%	0.05%	0.5%	5%
부종억제율(%)	14.2	42.3	64.6	88.7

상기 표 4의 결과에서 보는 바와 같이, 본 발명의 메이스리그난 함유 크림이 크림 내 함유된 메이스리그난의 농도에 의존적으로 TPA로 유발되는 래트의 부종을 억제하는 것을 알 수 있다.

<실시예 8>

미리스티카 프라그란스 추출물의 항염증 활성 조사

<8-1> 메탄올 추출물 제조

건조 분쇄한 육두구 100 g(건조중량)에 95 부피% 메탄올 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 상기 용액을 와트만(Whatman) 여과지 제2번을 이용하여 여과하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 메탄올 여과액을 진공농축하고 동결건조하여 메탄올 조추출물(16.2 g)을 제조하였다.

<8-2> 헥산 추출물 제조

건조 분쇄한 육두구 100 g(건조중량)에 100 부피% 헥산 400 ㎖을 가하여 상온에서 이틀 동안 방치하였다. 상기 용액을 와트만(Whatman) 여과지 제2번을 이용하여 여과하였다. 상기 과정을 2회 반복하였다. 헥산 여과액을 진공농축하고 동 결건조하여 헥산 조추출물(37.0 g)을 제조하였다.

<8-3> 동물 모델을 이용한 미리스티카 프라그란스 추출물의 항염증 활성 조사

상기 실시예 <8-1> 및 <8-2>에서 제조한 미리스티카 프라그란스 추출물의 항염증 활성을 동물 실험을 통하여 확인하였다. 상기 항염증 활성은 상기 실시예 6과 동일한 방법에 따라 래트에 대한 부종억제 실험으로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

투여약물	래트수(마리)	투여량(㎍/ear)	부종두께(㎛)	부종억제율(%)
대조군	20	0	248±8	-
메탄올 조추출물	20	50	198±3*	20.2
	20	500	119±8*	52.0
	20	5000	83±10*	66.5
헥산 조추출물	20	50	207±4*	16.5
	20	500	146±9*	41.1
	20	5000	106±7*	57.3

^* p<0.01

상기 표 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 미리스티카 프라그란스의 메탄올 조추출물과 헥산 조추출물 모두 TPA로 유발되는 래트의 부종을 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(통계학적 유의성 p<0.01).

<제조예 1>

본 발명에 따른 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 함유하는 약제의 제조

<1-1> 정제의 제조

본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물 25㎎을 부형제 직타용 락토오스 26㎎과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 3.5㎎, 붕해 보조제인 나트륨 전분 글리코네이트 1.5㎎, 그리고 결합제인 직타용 L-HPC(low-hydrosyprophylcellulose) 8㎎과 함께 U형 혼합기에 넣고 20분간 혼합하였다. 혼합이 완료된 후 활탁제로서 마그네슘 스테아레이트 1㎎을 추가로 첨가하고 3분간 혼합하였다. 정량 시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여 정제를 제조하였다.

<1-2> 시럽제의 제조

본 발명의 메이스리그난 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분 2%(W/V)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 메이스리그난의 산부가염 2g, 사카린 0.8g 및 당 25.4g을 온수 80g에 용해시켰다. 상기 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0g, 향미료 0.04g, 에탄올 4.0g, 소르브산 0.4g 및 적량의 증류수를 혼합하였다. 상기 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되도록 하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물 50㎎, 유당 50㎎, 전분 46.5㎎, 탈크 1㎎ 및 적량의 스테아린산 마그네슘을 혼합하고 이를 경질 젤라틴 캡슐에 충진함으로써 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사액제의 제조

유효성분 10㎎을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다: 본 발명의 메이스리그난의 염산염 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<적용예 1>

위염증성 소화기질환

위염증은 여러 가지 외부요인의 작용과 불규칙한 식습관이 관여하지만 헬리코박터 파이로이균이 주원인균으로 밝혀졌다. 헬리코박터 파이로이균은 위궤양, 위염뿐만 아니라 더 나아가 위암에도 영향을 끼친다. 헬리코박터 파이로이균이 증식하는 과정에서 COX-2(cyclooxygenase-2)라는 효소가 동시에 증가한다(Nam N.T. et al., Clin. Cancer Res. 10(23): 8105-8113, 2004). 헬리코박터가 감염되면 위 점막세포가 암세포로 진행되도록 증식하는데, COX-2 억제제는 위 점막세포가 암세 포로 성장ㅇ증식하는 것을 저지하며 정상조직에서 암 조직으로 바뀌는 것을 억제하는 역할을 하는 것으로 밝혀졌다. COX-2 억제제를 투여한 군이 투여하지 않은 군에 비해 아폽토시스(apoptosis)라는 방법으로 암조직을 사멸하는 효과가 탁월한 것으로 나타났다(Nam N.T. et al., Clin. Cancer Res. 10(23): 8105-8113, 2004). 따라서 본 발명의 리그난계 화합물의 COX-2 억제효과는 위암을 조기에 예방할 수 있는 위염증치료에 도움을 주므로 충분한 치료 효과를 갖는다는 것을 제시해 준다.

<적용예 2>

관절염

관절염은 자가면역 이상이 원인이지만 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증이 혈관신생을 유도하여 연골이 파괴된다. 관절염에는 감염성 관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 대퇴골두 무혈성 괴사, 강직성 척추염, 선천성 기형에 의한 관절염 등 여러 종류가 있으나 원인을 불문하고 병이 진행하는 과정에서 활액강에 생긴 만성염증이 혈관신생을 유도한다고 알려져 있으며 새로운 모세혈관이 관절을 침습하여 연골이 손상되는 것이 특징이다(Kocb A. E. et al., Arth. Rheum., 29:471-479, 1986; Stupack D. G. et al., J. Med. Biol. Rcs., 32:578-281, 1999; Koch A. E., Arthritis Rheum., 41:951-962, 1998). 이때, 종류에 따라 염증반응이 일차적, 이차적으로 생겨 연골을 파괴하여 병의 진행에 중요한 역할을 하며, 관절 내로의 신생 혈관의 형성이 중요한 병리기전으로 작용한다고 보고되고 있다(Colville-Nash, P.R. et al., Ann. Rheum. Dis., 51, 919- 925, 1992; Eisenstein, R., Pharmacol. Ther., 49:1-19, 1991). 관절염의 치료는 원인에 따른 치료보다는 통증을 억제하는 것과 염증 현상을 억제하여 관절이나 근육 등의 파괴속도를 최대한 늦추고 기능 소실을 최소화하는 것을 우선으로 한다. 따라서 본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물을 유효성분으로 함유하는 항염증 조성물은 관절염의 진행 방지와 치료에 대단히 효과적이다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 리그난계 화합물은 염증 매개 인자인 NO, iNOS, PGE₂, COX-2 및 TNF-α의 생성 또는 발현을 저해시킴으로써 염증 반응을 억제하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 리그난계 화합물 또는 미리스티카 프라그란스 추출물을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 염증성 질환의 치료 또는 예방에 매우 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (6)

1. 하기 일반식 Ⅰ로 표시되는 리그난계 화합물 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.

   [일반식 Ⅰ]

   

   상기에서, R₁ 및 R₂ 는 C_1-5 의 알콕시 또는 히드록시 그룹이고, R₃ 는

   

   또는

   

   이다.
2. 제1항에 있어서, 상기 리그난계 화합물은 하기 화학식 1로 표시되는 메이스리그난인 것을 특징으로 하는 조성물.

   [화학식 Ⅰ]

   
3. 미리스티카 프라그란스(Myristica fragrans)를 물 또는 C1-C6의 유기용매로 추출한 추출물을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.
4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 염증성 질환은 염증성 장 질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 알러지성 비염, 낭포성 섬유증, 급성 기관지염, 만성 기관지염, 급성 세기관지염, 만성 세기관지염, 골관절염, 통풍, 척추관절병증, 강직성 척추염, 라이터 증후군, 건선성 관절병증, 장질환 척추염, 연소자성 관절병증, 연소자성 강직성 척추염, 반응성 관절병증, 감염성 관절염, 후-감염성 관절염, 임균성 관절염, 결핵성 관절염, 바이러스성 관절염, 진균성 관절염, 매독성 관절염, 라임 병, '혈관염 증후군'과 관련된 관절염, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(neuropathic joint disease), 출혈성 관절증(hemarthrosic), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 척추측만증(scoliosis), 혈색소증, 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 급성 폐손상(acute lung injury), 기관지 폐 형성장애(broncho- pulmonary dysplasia) 및 염증성 피부질환으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 리그난계 화합물이 NO(nitric oxide), iNOS(inducible nitric oxide synthase), PGE2(Prostaglandin E2), COX-2(cyclooxygenase-2) 및 TNF-α(tumor necrosis factor α)의 생성 또는 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제1항 또는 제3항의 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물을 함유하는 소염제.

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