KR100648617B1 - 누룩치로부터 분리된 부들레자사포닌 ⅳ을 함유하는 염증질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항염증 활성을 갖는 화합물에 관한 것으로서, 상세하게는 본 발명의 화합물인 부들레자사포닌 Ⅳ(Buddlejasaponin Ⅳ)은 미나리과의 여러해살이 풀인 누룩치(Pleurospermum kamtschaticum)로부터 분리한 것으로서, 귀부종 모델 생쥐에서 염증 억제 효과, COX-2 발현 억제 효과를 나타내므로 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
염증, 누룩치, 부들레자사포닌 Ⅳ, COX-2, 약학조성물

Description

누룩치로부터 분리된 부들레자사포닌 Ⅳ을 함유하는 염증 질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising buddlejasaponin Ⅳ isolated from Pleurospermum kamtschaticum for the prevention and treatment of inflammatory disease}
도 1은 생쥐에서 TPA로 유발한 부종에 대한 부들레자사포닌 Ⅳ의 효과를 나타낸 도이고,
도 2는 생쥐에서 TPA로 유발한 COX-2 단백질 발현에 대한 부들레자사포닌 IV의 효과를 나타낸 도이다.
본 발명은 귀부종 모델 생쥐에서 염증 억제 효과, COX-2 발현 억제 효과를 나타내는 누룩치로부터 분리된 화합물인 부들레자사포닌 IV(buddlejasaponin Ⅳ)를 함유하는 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물에 관한 것이다.
염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러 스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 질환의 주요 병리현상(과민성 질환, 만성 염증)이 되며, 수혈, 약물투여, 장기이식 등 치료과정에서도 장해요인이 된다.
생체에 있어서 염증의 발생 원인으로서는 다양한 생화학적인 현상이 관여하고 있으며, 특히 니트릭옥사이드(nitric Oxide; NO)를 발생시키는 효소인 니트릭옥사이드 신타제 (nitric oxide synthase; NOS)와 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성과 관련된 효소들은 염증 반응을 매개하는데 있어서 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있으며, 따라서 L-아르기닌(L-Arginine)으로부터 NO를 생성시키는 효소인 NOS나, 아라키돈산(Arachidonic acid)으로부터 프로스타글란딘류를 합성하는데 관련된 효소인 COX (시클로옥시게나제)는 염증을 차단하는데 있어서 주된 목표가 되고 있다.
시클로옥시게나제는 2종류의 이소형태가 존재하는데, 시클로옥시게나제-1(cyclooxygenase-1, COX-1)은 세포내에 항상 존재하여 세포보호작용에 필요한 프로스타글란딘(PGs)을 합성하는 작용을 나타내는 것에 반하여, COX-2는 염증 반응 시 세포내에서 급격히 증가되어 염증 반응을 일으키는 데 있어서 중요한 역할을 수 행하는 것으로 알려져 있다(Weisz A., Biochem . J., 316, pp.209-215, 1996). NO와 PGs의 정도를 향상시키는 iNOS 및 COX-2를 포함하는 전사 염증 인자는 다양한 경화(sclerosis), 파킨슨병(parkinson's disease), 알쯔하이머병 및 결장암을 포함하는 만성 질환의 병인에 관련한다.
COX(cyclooxygenase)는 프로스타글란딘의 생합성에 관련하는 주 효소로(Smith et al., The Journal of Biological Chemistry, 271:33157-33160, 1996), 두 종류의 이성 효소, COX-1과 COX-2가 존재한다.
대부분의 비스테로이드 소염 진통제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)의 항염증 효과는 COX 효소 활성을 억제하는 것에 의해 매개된다(Vane et al., Annual Review of Pharmacology and Toxicology, 38, pp.97-120, 1998). COX-1은 위나 신장과 같은 조직에서 일정하게 존재하는 효소로서 정상적인 항상성을 유지하는데 관여하는 반면, COX-2는 염증이나 기타 면역 반응 시 세포분열인자(mitogen)나 사이토카인(cytokines)류에 의해 세포 내에서 일시적이고 빠르게 발현된다. 급성 혹은 류마티스성 관절염과 같은 만성의 염증 질환의 치료에 사용되는 NSAIDs은 COX-2 효소를 억제할 뿐만 아니라 COX-1 효소도 억제함으로써 위장관 장애와 같은 부작용을 나타내는 것으로 알려져 있다(Masferrer et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91, pp.3228-3232, 1994; Seibert et al., Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 91, pp.12013-12017, 1994).
현재 치료제로 사용되고 있는 NSAIDs 대부분이 위장 장애, 간장애, 신기능 장애 등의 부작용을 야기하여 장기간의 사용이 어려우므로, COX-2 효소만을 선택적으로 억제하여 전신성 만성질환의 치료제로 장기간 사용이 가능한 부작용이 적은 새로운 소염진통제의 개발이 요청되고 있다.
최근에 합성방법으로 제조된 COX-2에 대한 저해제로 NS-398, CGP-29238, SC-58125, L-745337, 메록시캄(meloxicam) 등이 보고되고 있으나 아직 널리 이용되지는 않고 있으며, 그들의 부작용에 대해서도 확실히 검증되지 않은 상태이다.
부들레자사포닌 IV(buddlejasaponin IV ; Yamamoto et al., Chem . Pharm . Bull., 39, pp.2764-2766, 1991; Li et al., Chinese, 383, pp.355-356, 1999)는 항바이러스 활성(Bermejo et al., Planta medica ., 68, pp.106-110, 2002)과 간 보호 효능(Guinea et al., Planta medica, 60, pp.163-167, 1994)을 가지는 물질로 알려져 있다.
그러나 상기 문헌 어디에도 본 발명의 누룩치로부터 분리된 부들레자사포닌 IV 화합물이 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물로서 사용가능하다고 교시되거나 개시된 바는 없다.
따라서 이에 본 발명자들은, 부들레자사포닌 IV가 염증 유도된 생쥐에서 염증을 억제 시키고, 선택적으로 COX-2의 발현을 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 염증을 억제 시키고, 선택적으로 COX-2의 발현을 억제하는 누룩치(Pleurospermum kamtschaticum)로부터 분리된 항염 활성을 갖는 부들레자사포닌 IV를 함유하는 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 염증을 억제 시키고, 선택적으로 COX-2의 발현을 억제하는 하기 화학식 (1)의 부들레자사포닌 Ⅳ 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.
Figure 112005073395725-pat00001
(1)
상기 염증 질환에는 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통 및 관절통과 같은 통증, 신경병증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크 또는 염증성 장 질환을 포함한다.
상세하게는, 본 발명의 부들레자사포닌 Ⅳ는 염증을 억제 시키고, 선택적으로 COX-2의 발현을 억제하는 효과를 갖는 부들레자사포닌 Ⅳ를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 부들레자사포닌 Ⅳ는 미나리과의 여러해살이 풀인 누룩치(Pleurospermum kamtschaticum)로부터 분리됨을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
예를 들어, 누룩치 지상부를 음건하고 세절한 후 시료 중량의 약 2 내지 20배에 달하는 부피의 물 및 메탄올, 에탄올, 부탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급알콜의 극성 용매 또는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10의 혼합비를 갖는 혼합용매로, 바람직하게는 메탄올로 1시간 내지 24시간, 바람직하게는 3 내지 7시간 동안 1 내지 10회, 바람직하게는 1 내지 5회 반복하여 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법으로, 바람직하게는 환류 추출한 후, 추출액을 모아 진공회전농축기로 농축하여 누룩치 메탄올 추출물을 수득하는 제 1단계 ; 상기 제 1단계에서 얻은 누룩치 추출물을 물에 현탁시키고 클로로포름을 가하여 혼합한 후 3 내지 6차례 분획하여 수가용성 분획물 및 클로로포름 가용성 분획물을 얻은 후 클로로포름 가용성 분획물을 건조하여 클로로포름 가용 추출물을 수득하는 제 2단계 ; 상기 제 2단계의 클로로포름이 제거된 수가용성 분획물에 수포화 부탄올을 가하여 혼합한 후 3 내지 6차례 분획하여 수가용성 분획물 및 수포화 부탄올 가용성 분획물을 얻은 후 수포화 부탄올 가용성 분획물을 건조하여 수포화 부탄올 가용 추출물을 수득하는 제 3단계 ; 상기 제 3단계의 수포화 부탄올 가용 추출물을 전개용매로서 클로로포름: 메탄올: 물 = 7 : 3 : 1(lower phase)의 혼합용매를 사용하고, 고정상으로는 실리카겔(Silica gel 580g, 70-230 mesh)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 250개의 하부 분획물로 나눈 후, 그 중 51번 내지 170번 분획물을(80㎖씩 소분하였으며, 소분한 4,080~13,600㎖의 용액) 농축하여 동일한 조건으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 누룩치의 주성분인 조 사포닌을 수득하는 제 4단계 ; 제 4단계의 조 사포닌을 전개용매로서 메탄올 : H2O = 7 :3의 혼합용매를 사용하여 C18 컬럼 크로마토그래피(95g, 5×70 ㎝, YMC gel ODS)를 수행하여, 50번 내지 550번 분획물을(소분한 450~2,750㎖) 모아 농축하여 동일조건의 역상 컬럼 크로마토그래피를 1 내지 3회 실시하고 감압 농축하여 순수 분리된 본 발명의 화합물 부들레자사포닌 Ⅳ를 수득할 수 있다.
본 발명은 상기의 제조방법으로 얻어진 누룩치로부터 분리되어진 부들레자사포닌 Ⅳ를 유효성분으로 함유하는 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물 중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
본 발명의 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 본 발명의 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
본 발명의 염증 질환 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포 함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 염증 질환의 예방 효과를 나타내는 상기 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
또한, 염증 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같 이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 화합물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 누룩치로부터 부들레자사포닌 IV ( buddlejasaponin IV ; BS IV )의 분리
본 실험에 사용한 누룩치(Pleurospermum kamtschaticum)는 진부 시장에서 구입하여 사용하였으며 실험에 사용된 표본은 상지대학교 자원식물학과에 보관하도록 하였다. 누룩치 지상부를 통풍이 잘 되는 음지에서 건조하여 건조무게 1.8kg을 세절하고 5ℓ 라운드 플라스크에 넣고 냉각수를 환류시키며 메탄올로 5시간씩 3회 추출하였다. 추출액을 모두 모아 회전형 진공농축기(rotary evaporator)로 농축하여 메탄올 추출물 740g를 수득하였다.
메탄올 추출물을 물 1ℓ에 현탁시킨 후, 클로로포름 800㎖를 가하여 5회 분획한 후, 클로로포름 분획은 따로 모으고, 클로로포름층이 제거된 수층에 수포화 부탄올 800㎖를 가하여 다시 5회 분획하였다. 부탄올 분획만을 모두 모아 회전형 진공농축기로 농축하여 수포화 부탄올 농축물 180g를 수득하였고, 부탄올 농축물 90g를 전개용매 클로로포름 : 메탄올 : 물 = 7 : 3 : 1(하층)을 사용하여 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)를 수행하여 80㎖씩 소분하였다(580g, 8×70㎝, Merck, Art 7734, 독일). 소분한 4,080~13,600㎖의 용액에 10% 황산에서 자색으로 발색되는 누룩치의 주성분이 함유되어 있음을 확인하고, 이를 농축하여 동일한 조건으로 실리카 젤 컬럼 크로마토그래피를 실시하였다. 순상에서 얻어진 누룩치의 주성분인 조 사포닌을 전개용매 메탄올 : H2O = 7 : 3으로 C18 컬럼 크로마토그래피 하였다(95g, 5×70 ㎝, YMC gel ODS). 소분한 450~2,750㎖ 까지 모아 농축하여 동일조건의 역상 컬럼 크로마토그래피를 2회 더 실시하여 순수 분리된 표 1, 표 2 및 하기 물성치를 갖는 화학식(1)의 부들레자사포닌 Ⅳ 4g를 수득하였다.
Figure 112005073395725-pat00002
(1)
1)m.p. 245-249℃ ;
2)[α]D -6.10° (isopropyl alcohol, c=0.005) ;
3)IR max(cm-1): 3100-3500 (OH), 2929 (CH), 1454, 1362, 1363, 1000-1100 (glycosidic C-O), 906 ;
4)FABMS(positive): m/z 965.3 [M+Na]+
1H-NMR 데이터 (pyridine-d5, 500 MHz)
위치 ppma
아글리콘 부분(Aglycone moiety) 3 11 12 16 23A 23B 24 25 26 27 28A 28B 29 30 퓨코스 부분(Fucose moiety) 1' 글루코스 부분(Glucose moiety) (퓨코스의 C-2에 연결) 1'' 글루코스 부분(Glucose moiety) (퓨코스의 C-3에 연결) 1''' 4.13(1H, dd, J=12.5, 4.0 ㎐) 5.97 (1H, br. d, J=10.0 ㎐) 5.64(1H, dd, J=10.0, 2.5 Hz) 4.49(1H, dd, J=10.0, 6.0 Hz) 3.70 (1H, d, J=11.0 Hz) 4.36 (1H, d, J=11.0 ㎐) 1.06(3H, s) 0.97(3H, s) 1.38 (3H, s) 1.10 (3H, s) 3.30 (1H, d, J=7.0 ㎐) 4.37 (1H, d, J=7.0 ㎐) 0.94 (3H, s) 0.90 (3H, s) 4.91 (1H, d, J=8.0㎐) 5.56 (1H, d, J=8.0㎐) 5.27(1H, d, J=8.0 Hz)
13C-NMR 데이터 (pyridine-d5, 125 MHz)
위치 ppm 위치 ppm
아글리콘 부분 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 39.0 26.4 82.9 44.2 48.2 18.1 32.0 42.6 53.5 36.9 132.6 131.5 84.4 46.0 36.6 64.5 47.4 52.5 38.1 32.0 35.1 26.2 65.0 13.1 19.1 20.4 21.2 73.4 24.2 34.0 퓨코스 부분 1' 2' 3' 4' 5' 6' 글루코스 부분 (퓨코스의 C-2에 연결) 1'' 2'' 3'' 4'' 5'' 6'' 글루코스 부분 (퓨코스의 C-3에 연결) 1''' 2''' 3''' 4''' 5''' 6''' 104.5 77.6 85.2 72.4 70.9 17.6 104.4 76.7 79.2 72.6 77.9 63.5 105.6 75.8 78.8 72.0 78.9 62.9
실험예 1. 부들레자사포닌 IV 의 생쥐 귀부종 모델에서 염증 억제효과
5주령 암컷 생쥐를 폴라스 인터내셔날(서울, 한국)에서 구입하여, 12시간을 주기로 빛과 어두운 환경에서 적응시켰다. 6주~7주령의 생쥐를 각 군당 3마리씩 사용하여 실험하였다. 실시예 1의 방법으로 분리한 부들레자사포닌 IV를 아세톤과 DMSO(1:1) 용매 50㎕에 녹이고 생쥐의 오른쪽 귀에 국소 도포한 다음, 30분 후 TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate) 5nmol/50㎕를 아세톤에 녹여 오른쪽 귀에 도포하였다. 이때 왼쪽 귀에는 용매만을 국소 도포하였다. 4시간 뒤에 양쪽 귀를 모두 소독된 6㎜펀치를 이용하여 같은 크기로 잘라내어 미세 저울로 각각의 무게를 측정하였다. 대조군과 비교하여 저해능을 구하고 통계적으로 유의성이 나타나는 것을 효과가 있는 것으로 간주하였다. 생성된 부종 정도는 오른쪽 귀의 무게에서 왼쪽 귀의 무게를 뺀 값으로 하여, 이를 하기 수학식 1에 대입하여 부종 억제율을 구하였다. 결과는 표 3 및 도 1에 나타내었다.
부종 억제율(%) = 100 - (부들레자사포닌 IV 전처리군의 부종 정도/TPA 처리군의 부종 정도) x 100
ICR 생쥐의 귀에 TPA로 유발한 부종에 대한 부들레자사포닌 IV의 억제 효과
처리a 무게(mg)/punch p-값 저해율 (%)
아세톤/DMSO + 아세톤 아세톤/DMSO + TPA(5nmol/50㎕) 부들레자사포닌 IV(0.15μmol/50㎕)+TPA 부들레자사포닌 IV(1.5μmol/50㎕) +TPA 부들레자사포닌 IV(7.5μmol/50㎕) +TPA 0.52±0.294 6.52±1.637 2.84±0.910 1.44±0.294 1.82±0.814 0.085 0.016 0.031 61.3 84.7 78.3
a부들레자사포닌 IV는 용매(아세톤:DMSO=1:1)에 녹여 사용하였으며, TPA는 아세톤에 녹여 사용하였다.
상기한 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 부들레자사포닌 IV는 부종을 용량 의존적으로 억제하였다.
실험예 2. 부들레자사포닌 IV 의 COX -2 발현 억제 효과 측정
5주된 암컷 생쥐를 폴라스 인터내셔날(서울, 한국)에서 구입하여, 12시간을 주기로 빛과 어두운 환경에서 적응시켰다. 실험에는 6주~7주령에 있는 생쥐를 사용하였다. 생쥐 등의 털을 제거한 다음 이틀 후에 부들레자사포닌 IV를 용매(아세톤: DMSO = 1:1), 200㎕에 녹여 생쥐 피부에 국소 도포하였다. 30분 뒤 TPA (10nmol/200㎕)를 아세톤에 녹여 국소 도포하고 4시간 뒤에 생쥐를 희생시켰다. 피부를 잘라내어 얼음 위에서 지방조직을 제거하고 액체 질소를 가한 후 유봉을 이용하여 분말로 만들었다. 분말에 단백질 용해 용액(150 mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 50mM Tris-HCl, pH 7.4, 20mM EGTA, 1mM DTT, 1mM Na3VO4, protease inhibitor cocktail tablet)을 가하고 균질기(homogenizer)로 균질화 한 후 4시간 동안 얼음 위에 방치하였다. 원심분리(15000rpm, 10분)하여 상층액을 수득하여, 상층액의 단백질을 정량(Pierce-BCA protein assay)하였다. 각각의 시료에서 일정량을 가지고 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 시행한 후, 분리된 단백질을 PVDF(Poly vinyl difluoride) 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 PVDF 막을 인산 완충액에 녹인 5% 탈지 분유액에 3시간 담근 다음, 1:1000으로 희석한 COX-1, COX-2에 대한 일차 항체를 4℃에서 12시간 붙이고, 이 일차 항체에 특이적으로 반응하는 이차 항체를 붙였다. 각 단계가 끝난 후 0.1% PBST(phosphate buffered salin Tween 20)로 씻어주었고 ECL(Enhanced chemiluminesence) 용액으로 반응시킨 후 x-ray 필름에 노출시켜 COX-1, COX-2의 변화를 확인하였다. β-엑틴(β-actin)을 정량 대조군으로 사용하였다.
염증반응을 유도하는 TPA를 생쥐 피부에 국소 도포하면 COX-2의 발현이 현저히 증가된다는 것이 알려져 있다(Katiyar et al, Journal of Cellular Biochemistry. Supplement, 27, pp.59-67, 1997). 본 실험에서도 생쥐 피부에 TPA를 국소 도포시 COX-2의 발현이 현저히 증가되는 것이 관찰되었다. 0.15, 1.5, 7.5μmol의 부들레자사포닌 IV를 각각 전처리시 TPA에 의해 증가된 COX-2의 발현이 용량 의존적으로 감소하였다(도 2 참조). 따라서 부들레자사포닌 IV는 COX-2의 발현을 억제함으로써 TPA로 유도된 염증반응을 억제함을 확인할 수 있었다.
본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
부들레자사포닌 IV 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
부들레자사포닌 IV 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
부들레자사포닌 IV 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
부들레자사포닌 IV 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO412H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
부들레자사포닌 IV 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 음료의 제조
부들레자사포닌 IV 100 ㎎
비타민 C 15 g
비타민 E (분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 화합물인 부들레자사포닌 IV는 누룩치(Pleurospermum camtschaticum)로부터 분리한 것으로서 귀부종 모델 생쥐에서 염증 억제 효과, COX-2 발현 억제 효과를 나타내므로 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 및 건강기능식품으로 이용될 수 있다.

Claims (5)

  1. 부종을 억제하고 COX-2 발현을 억제하는 하기 화학식 (1)의 부들레자사포닌 Ⅳ 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 염증 질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물:
    Figure 112005073395725-pat00003
    (1)
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 누룩치(Pleurospermum kamtschaticum)로부터 분리됨을 특징으로 하는 약학조성물.
  3. 제 1항 있어서, 상기 염증 질환은 동맥경화, 류마티스성 관절염, 천식, 급성 통증, 만성 통증, 신경병적 통증, 수술 후 통증, 편두통 및 관절통과 같은 통증, 신경병증, 신경손상, 과민성 장증후군, 내독소에 의한 쇼크 또는 염증성 장 질환인 약학조성물.
  4. 염증 질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 제 1항의 부들레자사포닌 Ⅳ 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조첨가제를 포함하는 건강기능식품.
  5. 제 4항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.
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