상기 목적에 따라, 본 발명은 대나무 조추출물 또는 비극성용매 가용추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관보호 및 혈액순환 개선용 약학조성물 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기 대나무 조추출물은 물, 에탄올, 메탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 50%, 70%, 95%의 에탄올, 더욱 바람직하게는 70% 에탄올로 추출한 것을 포함한다.
또한, 상기 대나무 비극성용매 가용추출물은 n-헥산, 디클로로메탄, 클로로포름 또는 에틸아세테이트로 추출한 것을 포함한다.
상기 대나무는 산죽(조릿대, Sasa borealis Makino), 신이대(Sasa coreana Nakai), 이대(Sasa japonica Makino), 섬대(Sasa borealis var. gracilis), 제주 조릿대(Sasa palmata Nakai) 등의 사사(SaSa)속 대나무, 왕대(Phyllostachys bambusoides SIEB. et Zucc), 오죽(Phyllostachys nigra MUNRO), 솜대(분죽, Phyllostachys nigra MUNRI var. henonis STAPF), 죽순대(맹종죽, Phyllostachys pubescens MAZEL ex H. de LEH) 등의 왕대(Phyllostachys)속 대나무를 포함한다.
또한, 상기 사사속 대나무는 바람직하게는 산죽을 포함하며, 왕대속 대나무는 죽순대를 포함한다.
또한, 본 발명은 대나무 추출물로부터 분리되거나 합성 가능한 하기 구조식 (I)의 트리신 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관보호 및 혈액순환 개선용 약학조성물 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
(I)
본 발명의 상기 구조식 (I)의 트리신 화합물은 당업계에서 잘 알려져 있는 공지의 합성 방법 또는 왕대(Phyllostachys bambusoides SIEB. et Zucc), 오죽(Phyllostachys nigra MUNRO), 솜대(분죽, Phyllostachys nigra MUNRO var. henonis STAPF) 및 죽순대(맹종죽, Phyllostachys pubescens MAZEL ex H. de LEH.) 등의 대나무과(Bambusaceae) 식물 또는 산죽(조릿대, Sasa borealis Makino), 신이대(Sasa coreana Nakai), 이대(Sasa japonica Makino), 섬대(Sasa borealis var. gracilis), 제주조릿대(Sasa palmata Nakai), 강아지풀(Setaria viridis BEAUV.) 및 현미(Oryza sativa L.) 등의 벼과(Poaceae) 식물로부터 분리될 수 있으며, 바람직하게는 솜대, 오죽, 맹종죽, 왕대, 신이대, 이대 또는 산죽으로부터 분리될 수 있다.
또한, 상기 염증성 질환에는 염증 및 염증반응에 의해 발생하는 위염, 대장염, 관절염, 신장염, 간염, 암 또는 퇴행성 질환 등이 포함된다.
상기 구조식 (Ⅰ)의 트리신 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 약학적으로 허용 가능한 염 및 용매화물로 제조될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 염으로는 유리산(free acid)에 의해 형성된 산부가염이 유용하다. 산부가염은 통상의 방법, 예를 들면 화합물을 과량의 산 수용액에 용해시키고, 이 염을 메탄올, 에탄올, 아세톤 또는 아세토니트릴과 같은 수혼화성 유기 용매를 사용하여 침전시켜서 제조한다. 동몰량의 화합물 및 물중의 산 또는 알코올(예, 글리콜 모노메틸에테르)을 가열하고 이어서 상기 혼합물을 증발시켜서 건조시키거나, 또는 석출된 염을 흡인 여과시킬 수 있다.
이 때, 유리산으로는 유기산과 무기산을 사용할 수 있으며, 무기산으로는 염산, 인산, 황산, 질산, 주석산 등을 사용할 수 있고 유기산으로는 메탄술폰산, p-톨루엔술폰산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 시트르산, 말레인산(maleic acid), 숙신산, 옥살산, 벤조산, 타르타르산, 푸마르산, 만데르산, 프로피온산 (propionic acid), 구연산(citric acid), 젖산(lactic acid), 글리콜산(glycollic acid), 글루콘산(gluconic acid), 갈락투론산, 글루탐산, 글루타르산(glutaric acid), 글루쿠론산(glucuronic acid), 아스파르트산, 아스코르빈산, 카본산, 바닐릭산, 히드로 아이오딕산 등을 사용할 수 있다.
또한, 염기를 사용하여 약학적으로 허용 가능한 금속염을 만들 수 있다. 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염은, 예를 들면 화합물을 과량의 알칼리 금속 수산화물 또는 알칼리토 금속 수산화물 용액 중에 용해하고, 비용해 화합물염을 여과한 후 여액을 증발, 건조시켜 얻는다. 이때, 금속염으로서는 특히 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염을 제조하는 것이 제약상 적합하며, 또한 이에 대응하는 은염은 알칼리 금속 또는 알칼리토 금속염을 적당한 은염(예, 질산은)과 반응시켜 얻는다.
상기의 트리신 화합물의 약학적으로 허용 가능한 염은, 달리 지시되지 않는 한, 트리신 화합물에 존재할 수 있는 산성 또는 염기성기의 염을 포함한다. 예를 들면, 약학적으로 허용 가능한 염으로는 히드록시기의 나트륨, 칼슘 및 칼륨 염이 포함되며, 아미노기의 기타 약학적으로 허용가능한 염으로는 히드로브로마이드, 황산염, 수소 황산염, 인산염, 수소 인산염, 이수소 인산염, 아세테이트, 숙시네이트, 시트레이트, 타르트레이트, 락테이트, 만델레이트, 메탄설포네이트(메실레이트) 및 p-톨루엔설포네이트(토실레이트) 염이 있으며, 당업계에서 알려진 염의 제조방법이나 제조과정을 통하여 제조될 수 있다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명의 대나무 추출물 또는 이로부터 분리된 트리신 화합물은 하기와 같이 수득될 수 있다.
본 발명의 대나무, 바람직하게는 사사속 대나무 또는 왕대속 대나무를, 더욱 바람직하게는 산죽, 신이대, 이대, 섬대, 제주 조릿대, 솜대, 왕대, 오죽 또는 맹종죽을 적절히 세절하고 세척하여 건조한 대나무의 잎 건조중량의 약 1 내지 15배, 바람직하게는 약 10 내지 15배 부피의 물, 메탄올, 에탄올과 같은 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 이들의 약 1:0.1 내지 1:10, 더욱 바람직하게는 1:0.2 내지 1:3의 혼합비를 갖는 혼합용매 또는 물, 50%, 70%, 95%의 에탄올에서 20 내지 100℃, 바람직하게는 50 내지 90℃의 추출 온도에서 약 0.5시간 내지 2일, 바람직하게는 1시간 내지 1일 동안 열수 추출, 냉침 추출, 환류 냉각 추출 또는 초음파 추출 등의 추출방법으로 1회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 3회 반복하여 수득한 후, 감압여과하고 여과한 추출물을 감압농축한 다음, 추출된 잔사를 진공동결건조기로 건조하여 물, 에탄올, 메탄올과 같은 저급알콜 또는 이들의 혼합용매에 가용한 대나무 조추출물을 얻을 수 있다.
상기의 대나무 조추출물을 물에 현탁한 후, 디클로로메탄, 에틸 아세테이트, n-헥산 등의 비극성용매를 이용하여 본 발명의 대나무의 각 용매별 분획물을 수득할 수 있는데, 바람직하게는 대나무 조추출물에 등량의 디클로로메탄과 물의 혼합용매를 사용하여 대나무 디클로로메탄가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있고, 다시 상기의 수가용성 분획물을 에틸아세테이트로 추출하여 대나무 에틸아세테이트가용성 분획물 및 수가용성 분획물을 수득할 수 있다.
더욱 구체적으로는 상기 공정으로 수득된 대나무 비극성 가용 추출물, 바람직하게는 에틸아세테이트 가용성 분획물을 용출용매로 디클로로메탄:아세톤 혼합용매(100:0 ~ 1:1)를 사용하여 실리카겔 컬럼크로마토그래피(Silica gel column chromatography)를 수행하여 5 내지 8개의 분획으로 분리한 후, 하부 분획 4를 메탄올, 에탄올, 부탄올 등의 C1 내지 C4의 저급알콜, 바람직하게는 메탄올로 재결정하여 본 발명의 트리신(Tricin) 결정을 수득할 수 있다.
본 발명의 트리신 화합물은 통상의 치환기들의 합성 및 분획 방법을 통하여도 합성할 수 있다(Herbert O. House: Modern Synthetic Reactions, 2nd Ed., The Benjamin/Cummings Publishing Co., 1972).
본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 대나무 추출물, 바람직하게는 사사속 또는 왕대속 대나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 혈관보호 및 혈액순환 개선용 약학조성물 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 수득된 대나무 추출물로부터 분리된 트리신 화합물을 유효성분으로 함유하는 혈관보호 및 혈액순환 개선용 약학조성물 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.
상기와 같은 방법으로 얻어진 대나무 추출물 또는 이로부터 분리된 트리신 화합물의 혈액순환개선제 및 항염증제로서의 효능을 알아보기 위하여, RAW 264.7 세포주에 대나무 추출물, 바람직하게는 산죽 추출물을 처리하여 염증반응인자에 미치는 영향을 관찰해본 결과, NO 활성이 뛰어나게 억제됨을 확인하였으며, 또한 혈액순환과 관련된 인자에 대하여 트리신 화합물이 미치는 영향을 관찰해본 결과, 혈액순환을 원활하게 하며 세포의 성장에 중요한 역할을 하는 VEGF 및 u-PA를 활성화시키며 혈전을 용해시킴으로써 혈액순환장애 개선 효과를 가짐을 확인하였다.
본 발명의 혈관보호 및 혈액순환 개선 또는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물 또는 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스 (lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물 또는 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 추출물 또는 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 혈관보호 및 혈액순환 개선 또는 염증성 질환의 예방 효과를 나타내는 상기 추출물 또는 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 추출물 또는 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.
또한, 혈관보호 및 혈액순환 개선 또는 염증성 질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물 또는 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물 또는 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.
상기 외에 본 발명의 추출물 또는 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 추출물 또는 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 또는 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 대나무 조추출물의 제조
산죽(조릿대), 신이대, 이대, 섬대, 제주조릿대, 솜대, 왕대, 오죽 및 맹종죽의 한국산 대나무를 분양 받아 깨끗한 물로 수세한 후 10일간 그늘에서 자연 건조하여 추출용 시료로 사용하였다.
건조 후 작은 조각으로 만든 각 대나무의 잎 또는 줄기 10㎏을 70% 에탄올 100ℓ를 넣고 80℃에서 7시간 동안 3회 반복하여 추출한 후 여지(와트만사, 미국)로 감압여과한 다음, 각각의 대나무 줄기 및 잎 조추출물을 수득하였다(표 1 참조).
구분 |
잎 |
줄기 |
산죽(조릿대) |
880g |
880g |
신이대 |
850g |
640g |
이대 |
750g |
550g |
섬대 |
810g |
760g |
제주 조릿대 |
9070g |
790g |
솜대 |
810g |
740g |
왕대 |
1030g |
870g |
오죽 |
840g |
870g |
맹종죽 |
1160g |
840g |
실시예 2. 대나무 분획물의 제조
상기 실시예 1에서 얻은 산죽(조릿대) 줄기 70% 에탄올 추출물 100g을 물 1ℓ에 현탁시킨 후에, 디클로로메탄 1ℓ를 첨가하여 용해한 다음 이를 분획여두에서 디클로로메탄층에 용해되는 성분만 분리해서 진공건조하였다. 이 과정을 3회 반복 수행하여 디클로로메탄 분획물을 수득하였다(17.8g). 남은 수층에 에틸아세테이트 1ℓ를 첨가하여 분획여두에서 에틸아세테이트층에 용해되는 성분만 분리해서 진공건조하였다. 이 과정을 3회 반복 수행하여 에틸아세테이트 분획물을 수득하였으며 (15.4g), 마지막으로 남은 수층을 감압농축하여 수층 분획물을 수득하였다.
실시예 3. 트리신(Tricin)의 분리
상기 실시예 2에서 얻은 산죽(조릿대) 에틸아세테이트 분획물 10g을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 트리신(Tricin)을 분리하였다. 구체적으로 에틸아세테이트 분획물 10g을 용출용매로 디클로로메탄:아세톤 혼합용매(100:0 → 1:1)를 사용하여, 에틸아세테이트층을 7개의 하부 분획으로 분리하고, 이들 분획들 중 4번째 분획을 메탄올로 재결정하여 노란색의 결정 26㎎을 수득하였다. 여기서 수득된 노란색 결정의 화합물을 디클로로메탄:메탄올 혼합용매(20:1)를 사용하여 전개하였을 때 Rf 치가 0.4이었으며, 아니스알데히드-황산(anisadehyde-H2SO
4)에 노란색을 띄며 365nm UV 파장에서 암갈색을 나타내었다. 1H 및 13C-NMR 스펙트럼으로 동정한 결과, 트리신 화합물임을 확인할 수 있었으며, 트리신의 분광학적 데이터는 하기에 나타내었다.
트리신(Tricin): C17H14O7
1H-NMR(300MHz, d6-DMSO) : 12.96(5-OH, 1H, s), 7.33(H-2',6', 2H, s), 6.97(H-3, 1H, s), 6.56(H-8, 1H, d, J=2.0Hz), 6.21(H-6, 1H, d, J=2.0Hz), 3.89(-OCH3, 6H, s)
13C-NMR(75MHz, d6-DMSO) : 182.66(C-4), 164.96(C-2), 164.53(C-7), 162.26(C-5), 158.21(C-9), 149.07(C-3',5'), 140.74(C-4'), 121.30(C-1'), 105.32(C-3), 104.61(C-2',6'), 104.46(C-10), 99.69(C-6), 95.04(C-8), 57.26(-OCH3)
실시예 4. 대나무의 종 및 부위별 트리신 함량분석
상기 실시예 1에서 얻은 산죽(조릿대), 신이대, 이대, 섬대, 제주조릿대, 솜대, 왕대, 오죽 및 맹종죽 각 줄기 및 잎 추출물 10g에 대하여, 상기 실시예 2 및 3과 동일한 방법으로 수행하여 대나무 종 및 부위별 트리신의 함량을 분석하였다. 분석 결과는 하기 표 2에 나타내었다.
부위대나무 종 |
잎 (70%에탄올추출물) |
줄기 (70%에탄올추출물) |
산죽(조릿대) |
13 ㎎ |
18 ㎎ |
신이대 |
15 ㎎ |
28 ㎎ |
이대 |
14 mg |
23 mg |
섬대 |
5 mg |
7 mg |
제주조릿대 |
3 mg |
5 mg |
솜대 |
18 mg |
26 mg |
왕대 |
5 ㎎ |
12 ㎎ |
오죽 |
5 ㎎ |
13 ㎎ |
맹종죽 |
3 ㎎ |
23 ㎎ |
실험예 1. 세포배양 및 시약
1-1. 세포배양
쥐의 대식세포주(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포를 ATCC(Rockville, Maryland, USA)로부터 분양 받아, 2mM L-아르기닌(L-arginine), 100㎍/㎖ 페니실린-스트렙토마이신 및 10% FBS(fetal bovine serum)가 함유된 DMEM(dulbecco's modified Eagle's medium) 배지를 사용하여, 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였다. 계대 배양은 1주일에 2회 시행하였다.
HUVEC(Human umbilical vein endothelial cell) 세포의 배양은 MTT사에서 구입한 HUVEC를 0.2% 젤라틴 코팅(gelatin coating)이 되어있는 플라스크에서 배양한 후, 계대 배양(passage) 3-5 세포를 실험에 이용하였다. HUVEC는 20% FBS가 포함된 EGM-2(Clonetics) 배지에 100×항체(antibiotics), 200×ECGF를 넣어 배양하였다.
1-2. 시약 및 기기
본 실험에 사용한 원심분리기(한일원심기㈜, 한국), 핵자기공명 분광기(NMR Spectrscopy)(1H; 300MHz, 13C; 75MHz, DRX 300, Bruker, Germany) 및 UV(model; Power wave-XS, Bio-Tek, USA)는 한국기초과학연구원에서 보유하고 있는 장비를 사용하였으며, 컬럼 크로마토그래피용 흡착제로는 실리카겔 60H(230 내지 400mesh, Merck, Germany)를 사용하였고, 박층크로마토그래피(TLC)용 플레이트로는 실리카겔 60 F254 플레이트(layer thickness 0.2mm, 20ㅧ20, Art. 5554, Merck, Germany)를 사용하였다. 발색제로는 아니스알데히드-황산 시약(anisaldehyde-H2SO4 reagent)을 사용하였다. 추출용 유기용매는 1급 시약을 사용하였으며, 분리 정제용 용매는 덕산(Duksan, Seoul, Korea)제품을 사용하였다.
실험예 2. 세포독성 시험
분리된 화합물의 세포독성은 기존의 MTT(Sigma, U.S.A) 법(Journal of Immunological Methods, 119, pp203-210, 1989)에서 변형된 방법을 통해 실시하였다. 즉, Raw 264.7 세포주를 2 x 105 세포/웰이 되도록 DMEM 배지로 희석한 후, 평평한 바닥 96-웰 마이크로타이터 플레이트(flat bottom 96-well microtiter plates, Nunc, Sweden)에 상기 희석액 200㎕씩 각각의 웰에 분주한 다음, 상기 실시예 3에서 얻은 트리신 화합물을 여러 농도(50, 25, 12.5, 6.5, 3.25 및 1.625㎍/㎖)로 처리하여 37℃ 에서 24시간 배양하였다. MTT 용액(1㎎/㎖)을 50㎖/웰에 첨가하여 4시간 동안 37℃에서 배양한 후, 상층액을 제거하고 반응 후 생성된 포르마잔(formazan)을 발색시키기 위하여 DMSO 100㎖를 각 웰에 첨가한 다음, 마이크로플레이트 리더(Microplate reader, model; Power wave-XS, Bio-Tek, USA)를 사용하여 550nm의 흡광도에서 발색정도를 측정하였다.
실험결과, 본 발명의 트리신은 50㎍/㎖의 농도에서 51%로 강한 세포독성을 나타내었으나, 25㎍/㎖의 농도에서는 20%의 세포독성을 나타내었으며 12.5㎍/㎖이하의 농도에서는 세포독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다(도 1 참조).
실험예 3. NO 생성 저해활성 측정
RAW 264.7 세포주를 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 1×106세포/㎖가 되도록 96웰 플레이트에 200㎕씩 분주하여 3시간 동안 부착시킨 후, 새로운 10% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교환하여 1㎍/㎖농도의 LPS와 시료군(산죽 추출물 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖, 트리신)을 각각 3웰씩 처리하였다. 이를 37℃, 5% CO2 배양기에서 20시간 동안 배양한 다음, 새로운 96웰 플레이트에 세포배양 상등액 100㎕를 취하고 그리스 시약(Griess reagent, 0.1% N-(1-naphtyl)ethylenediamine. 2HCl, 1% sulfanilamide in 5% conc. H3PO4 in H2O) 100㎕씩을 가하여 10분 동안 실온에서 반응시켰다. 이를 엘리사 리더(ELISA reader, Power wave-XS, Bio-Tek, USA)를 사용하여 550㎚에서 흡광도를 측정하였다.
실험결과, 시료 50㎍/㎖일 경우, 대조군의 NO 저해율이 0.23%인 반면에 산죽 조추출물은 21.5%, 에틸 아세테이트 가용성 분획물은 30.1% 및 수가용성 분획물은 0%였으며, 시료 100㎍/㎖일 경우, 대조군의 NO 저해율은 0.25%인 반면에 산죽 조추출물은 60.3%, 에틸 아세테이트 가용성 분획물은 80% 및 수가용성 분획물은 9.4%로, 대조군에 비하여 탁월한 NO 생성 저해효과를 나타냄을 확인할 수 있었다(표 3 참조).
또한, 트리신은 50㎍/㎖의 농도에서 NO 생성 억제가 49.7%로 활성을 나타내었나, 이는 트리신의 세포독성에 의한 영향으로 판단된다. 세포독성 효과가 없는 25㎍/㎖ 및 12.5㎍/㎖ 농도에서는 각각 74.6% 및 71.2%의 NO 생성 억제 효과를 강하게 나타내었다. 또한, 6.5㎍/㎖의 농도에서도 NO 생성 억제율이 52.0%로 강한 NO 생성 억제 효과를 나타내었고, 3.25㎍/㎖의 농도에서는 38.1%의 NO 생성 억제율을 나타내었다(도 2 참조).
대나무 |
시료 |
대조군 |
LPS |
조추출물 |
에틸아세테이트층 |
수층 |
산죽(조릿대) |
50㎍/㎖ |
0.23% |
0.15% |
21.5% |
30.1% |
0% |
100㎍/㎖ |
0.25% |
0.14% |
60.3% |
80% |
9.4% |
실험예 4. RNA 분리 및 RT-PCR
HUVEC 세포로부터 RNA 분리는 퀴아겐(Qiagen) 사의 Rneasy 미니 키트(cat# 74103)를 이용하여 분리하였다. 구체적으로 용해 완충액(lysis buffer)인 RLT 완충액 600㎕(10% beta-mercaptoethanol 포함)를 세포에 직접 처리한 다음, 10여 분간 방치한 후 70% 에탄올을 동량 넣어주고 피펫팅(pipetting)하여 컬럼으로 옮겼다. 이를 11,000rpm에서 1분간 원심분리하고, 다시 컬럼에 RW1 완충액 700㎕를 넣어준 다음 같은 조건에서 원심분리하였다. 컬럼에 다시 RPE 완충액 500㎕를 넣어 10,000rpm에서 1분간 원심분리한 후, 동량의 RPE 완충액을 넣어주고 다시 13,000rpm에서 2분간 원심분리하였다. 이후 25㎕의 RNase-제거된(free) 증류수를 넣어주어 컬럼에 부착된 RNA를 수분간 녹여낸 다음, 11,000 rpm에서 1분간 원심분리하여 RNA를 얻었다.
RT-PCR 반응은 어플라이드 바이오시스템(Applied biosystem)에서 제공하는 SDS 7700 기기를 이용하였으며, 그 반응 조건은 SDS 7700의 조건에 따랐다. 즉, 96 웰 플레이트의 RT에서 얻은 cDNA를 각각 5㎕씩 웰에 넣어준 다음, MgCl2 5.6mM, PCR 완충액 1×, dNTP 2mM, 젤라틴 0.05%, 목표 유전자(target gene)의 프라이머 각 1μM, 목표 유전자 프로브(target gene probe) 0.5μM, 관리 유전자 프라이머(housekeeping gene primer) 각 0.16μM, 관리 유전자 프로브 (housekeeping gene probe) 0.025μM, 태크 효소(Taq enzyme) 1.25U의 혼합물을 넣어준 다음, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분, 95℃에서 15초, 60℃에서 1분씩 40 주기(cycle)를 진행시켰다. 그 결과 나온 최종 cT 값을 읽은 뒤 계산하였다.
정상 배지 상태에서 분리된 트리신을 혈관세포에 처리하여 mRNA의 발현을 관찰한 결과, 세포의 성장에 중요한 역할을 하는 VEGF(vescular endothelial growth factor) 및 혈관의 혈전 용해 작용이 있는 u-PA의 유전자 발현이 증가되었으며, 영양고갈 상태에서 혈관의 확장에 영향을 미치는 eNOS의 발현 또한 증가함을 확인할 수 있었다(표 4 참조).
mRNA |
대조군 |
0.5㎍/㎖트리신 |
1㎍/㎖트리신 |
5㎍/㎖트리신 |
uPA
|
1 |
1.619배 |
1.103배 |
2.962배 |
VEGF
|
1 |
2.046배 |
1.469배 |
1.545배 |
eNOS(혈청 제거된 배지) |
1 |
3.024배 |
4.711배 |
0.452배 |
본 발명의 추출물 또는 화합물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1. 산제의 제조
트리신 화합물 300 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
제제예 2. 정제의 제조
트리신 화합물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
제제예 3. 캅셀제의 제조
산죽 추출물 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
제제예 4. 주사제의 제조
트리신 화합물 50 mg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5. 액제의 제조
산죽 추출물 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예 6. 건강 식품의 제조
트리신 화합물 1000 ㎎
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7. 건강 음료의 제조
산죽 추출물 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.