KR20230024305A - 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 및 인지기능 장애의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents
죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 함유하는 신경변성질환 및 인지기능 장애의 예방 및 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 포함하는 인지기능개선 또는 기억능력개선용 건강기능식품 조성물 및 퇴행성신경변성질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 죽엽 또는 트리신은 신경교세포에 의해 발생하는 신경염증을 효과적으로 감소시키고 도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 신경염증을 억제시켜 신경세포사를 효과적으로 감소시킨다, 죽엽 추출물 또는 트리신은 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 억제시키며, 스코폴라민이 투여된 기억력 장애 모델에서 죽엽 추출물은 SOD, Cat, GPx와 같은 항산화효소를 향상시키고 산화스트레스에 의해 축적되는 지질과산화물 (Malondealdehyde,MDA)와 신경염증인자를 억제시키는 것을 실험 동물의 해마(Hippocampus), 대뇌피질 (Cerebral cortex)조직에서 확인하고 행동실험분석 등을 통하여 기억력 및 인지기능 개선 또는 퇴생성신경변성질환을 예방 또는 치료 할 수 있는 조성물을 제공한다. 본 발명의 치료 대상이 되는 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병 및 다발성 경화증, 경도인지장애, 건망증 등이 있다.
Description
본 발명은 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 함유하는 인지기능개선 또는 기억력개선용 건강기능식품 조성물 및 퇴행성신경변성질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 본 발명의 죽엽 추출물 또는 트리신은 신경교세포에 의해 발생하는 신경염증을 효과적으로 감소시키고 도파민 신경세포사의 실험동물 (마우스) 모델에서도 신경염증을 억제시켜 신경세포사를 효과적으로 감소시킨다, 죽엽 추출물 또는 트리신은 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 억제시키며, 스코폴라민이 투여된 기억력 장애 모델에서 죽엽 추출물은 SOD, Cat, GPx와 같은 항산화효소를 향상시키고 산화스트레스에 의해 축적되는 지질과산화물 (Malondealdehyde,MDA)와 신경염증인자를 억제시키는 것을 실험 동물의 해마(Hippocampus), 대뇌피질 (Cerebral cortex)의 조직에서 확인하고 행동실험분석 등을 통하여 기억력 및 인지기능 개선 또는 퇴행성신경변성질환을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물을 제공한다.
신경염증반응이 신경퇴행을 유발하는 주요 요인 중 하나라는 사실이 규명되고 있다. 즉 중추신경계에 존재하는 면역세포인 신경교세포는 다양한 외인성, 내인성 물질로 인해 활성화될 수 있으며, 활성화된 신경교세포는 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β, 일산화질소, 프로스타글란딘, 초과산화물 등의 물질을 생산, 방출한다 (Gao 등, J Neurochem, 81, 1285-97, 2002; Nelson, PT. 등, Ann Med, 34, 491-500, 2002; Griffin, W.S. 등,J Neuroinflammation, 3, 5, 2006). 이러한 물질들의 생성은 단기적으로는 면역반응을 유발하지만, 과도한 생산이나 지속적인 생산은 근접한 신경세포들의 사멸을 유도하여 결국 신경퇴행을 유발한다는 것이다.
이와 같이 퇴행성 뇌신경 질환에서의 신경염증 (neuroinflammation) 반응의 중요성을 고려한다면, 이러한 신경교세포 내에서 전염증성 매개 인자들의 발현 수준을 감소시킴으로써 신경염증 및 이로부터 발병될 수 있는 퇴행성 뇌신경 질환을 치료할 수 있다 할 것이다.
활성화된 신경교세포는 연속적으로 일산화질소(NO), 활성산소종(ROS), 염증 효소인 Inducible nitric oxidesynthase(iNOS), Cyclooxygenase-2(COX-2), 그리고 전염증성 매개 인자인 IL-1β, IL-6, TNF-α 등의 활성을 유도함으로써 다발성 경화증, 파킨슨병, 알츠하이머병, 헌팅턴병 등 다양한 중추신경계 질환을 야기하는 것으로 보고되고 있다(Gao et al., 2002; Nelson et al., 2002; Eikelenboom and Van Gool, 2004).
이때, 신경교세포 내에서 전염증성 매개 인자들이 감소하면 이러한 질병들의 발현을 억제할 수 있다(Matsumoto et al., 1992; Liu and Hong, 2003). 세포계 모델에서 LPS에 의해 유도되는 신경교세포의 다양한 전염증성 인자들과 신경 독소들이 염증 과정에 있어서 신경 손상에 기여하는 사실은 기전 연구를 통해 널리 알려져 있다(Kim et al., 2004a,b). 또한, LPS에 의한 활성화된 신경교세포는 전염증성 매개 인자와 세포 독소 등에 의해 신경 독성을 증가시키는 것으로 다수 보고된바 있다(Dawson et al., 1994). 신경 염증에서 염증성 반응의 중요성을 고려하면, 활성화된 신경교세포에서 이러한 염증 관련 인자들의 생산을 억제하는 것이 다양한 신경 염증으로 인한 질환을 치료하는 목표가 될 것이다.
인지기능장애는 기억장애, 언어장애, 시공간능력 저하, 지각력 장애, 수행능력 장애를 포괄하고 있으며, 인지기능장애 (Cognitive impairment)는 뇌질환, 뇌상해, 중독, 노령화 등으로 인한 정신적, 행동학적 장애 및 내분비계의 이상과 대사 영양학적 이상, 약물 등에 따른 정신적인 질환을 포괄하는 의미로서, 증상의 정도에 따라 일시적 단기 기억 장애로 판명되는 건망증 (Anmesia) 뿐만 아니라, 추론능력의 상실, 망각, 학습장애, 집중력 저하, 지능의 저하, 판단력 장애를 유발하는 인지 기능 장애 및 치매 (Dementia) 등 신경변성질환에서도 나타나는 뇌질환의 일종이다. 경도 인지 장애란 동일한 연령대에 비하여 인지 능력이 저하된 상태를 말한다. 기억력, 언어 능력, 판단력 등의 인지 영역이 저하된 상태이다. 고령화 사회로 이어지면서 노인의 인구수가 급격하게 증가하였는데, 이러한 사회 환경에서 노인성 치매 및 파킨슨 질환이 퇴행성 중추신경계 질환으로 인정되고, 그 환자의 수가 날로 증가함에 따라 사회적 이슈가 증가되면서 이에 따른 예방이나 개선 및 치료에 대한 중요성이 날로 새롭게 부각되고 있다.
한편, 인지능력이 점진적으로 소실되는 질환인 노인성치매는 중추신경계의 콜린성 신경세포의 활성과도 관련이 있으며, 이는 뇌에서 아세틸콜린 및 콜린 아세틸트렌스퍼라제(choline acetyltransferase) 활성의 현저한 저하가 주된 원인으로 알려져 있다. 이에 따른 이상적인 콜린성 신경을 보완하고자하는 회복 및 개선의 방향으로 치료제 개발이 활발하게 이루어지고 있다. 스코폴라민을 투여하면 콜린성 신경 기능의 퇴행과 기억력 상실증이 나타나는 것과 습득력, 즉각적인 대응법, 활동기억(Working memory)에 대한 결함이 나타난다고 알려져 있다. (Smith, 1988; Giacobini, E. and Cuadra, G. (1994)).
한편, 대나무는 우리나라에는 왕대, 솜대, 조릿대 등 12 내지 13종이 분포 자생하고 있으며, 한방에서는 왕대(Phyllostachys Bambusoids S. et Z), 솜대 (Phyllostachys nigra var. Henesis Stapf), 조릿대(Sasa borealis (Hackel) Makino), 섬조릿대 (Sasa Kurilensis (Rupr.) Makino et al, Shibata), 등의 여러 종이 함께 쓰인다. 죽엽 (Bambusac Folium)은 벼과 (Graminae)에 속하고 대나무 속 및 조릿대 속의 잎을 말한다. 죽엽은 인체에 이로운 물질로 구성되어 있어 예로부터 한방의 약재로 쓰여왔다. 죽엽은 맛이 쓰고 성질이 차서 해소와 종양, 해열, 상충에 효과가 있고, 곽란, 토혈, 거담, 중풍, 당뇨, 두통, 고혈압, 현기증, 신경쇠약, 임신빈혈, 간질, 불면, 과다음주, 피로회복 등에 효과가 있다고 기록되어 있으며, 죽엽에는 체내의 생화학적 대사를 촉진하는 효과가 있어서 고혈압이나 중풍 치료에 좋고 필수불포화 지방산인 리놀산과 리놀렌산이 많이 함유되어 있어서 항비만 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
한국공개특허공보 제2016-0024243호는 발효 죽엽 추출물의 제조방법 및 이를 이용한 발효 죽엽 추출물을 개시하고 있으며, 한국등록특허공보 제1402936호는 죽엽 추출물 및 황금 추출물을 포함하는 비만 억제 활성을 나타내는 조성물 및 이의 용도를 개시하고 있으나, 본 발명의 죽엽 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경염증 개선, 완화, 치료 및 인지기능 개선용 조성물에 대해서는 개시된 바가 없다.
이에 따라 본 발명자들은, 죽엽 추출물 또는 유효성분 트리신이 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 신경교세포에서 염증성 사이토카인의 증가를 현저하게 억제하고, 신경교세포에 의해 발생하는 신경염증을 효과적으로 감소시키고 도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 신경염증을 억제시켜 신경세포사를 효과적으로 효과적으로 감소시킨다, 죽엽 추출물 또는 트리신은 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 억제시키며, 스코폴라민이 투여된 기억력 장애 모델에서 죽엽 추출물은 SOD, Cat, GPx와 같은 항산화효소를 향상시키고 산화스트레스에 의해 축적되는 지질과산화물 (Malondealdehyde,MDA)와 신경염증인자를 억제시키는 것을 실험 동물의 해마(Hippocampus), 대뇌피질 (Cerebral cortex)조직에서 확인하고 행동실험분석 등을 통하여 기억력 및 인지기능 개선 또는 퇴생성신경변성질환을 예방 또는 치료 할 수 있는 조성물인 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 목적은 죽엽 추출물 및 트리신을 함유하는 퇴행성신경변성질환의 예방 또는 치료용 조성물 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 목적은, 죽엽추출물 및 트리신을 유효성분으로 포함하는 기억력 및 인지 기능 개선용 식품조성물을 제공하는 것이다.
상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방, 치료 또는 기억력 및 인지 기능 개선용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 트리신은 대나무 잎으로부터 추출한 것일 수 있다.
또한, 상기 죽엽 추출물은 신경세포에서 일산화질소(NO)가 생성되는 것을 억제할 수 있으며 상기 죽엽 에탄올 추출물은 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 스코폴라민 유발성 신경염증을 억제하여 인지기능의 개선을 유도할 수 있다. 상기 죽엽 추출물은 스코폴라민이 구강 내 주입된 마우스의 해마(Hippocampus)와 대뇌피질 (Cerebral cortex) 부분에서 항산화효소의 증가, 지질과산화 축적 억제, 신경염증인자의 발현 억제시킬 수 있고 그로 인해 인지기능의 개선 효과를 행동실험을 통해 확인할 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 죽엽 추출물은 트리신을 총 조성물에 1 내지 50 ㎍/ml의 농도로 포함할 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 트리신은 신경세포에서 IκBα또는 p65의 인산화를 감소시켜 NF-κB 활성화를 감소시킬 수 있다. 또한, 상기 트리신은 신경세포에서 ERK(extracellular signal regulated kinase)또는 p38(p38 MAP kinase)의 인산화를 감소시켜 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 활성화를 감소시킬 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면 상기 트리신은 신경 독소(neurotoxin)인 MPTP에 의해 유발되는 신경염증을 억제할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면, 상기 신경염증 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환 또는 기억력 및 인지 기능 개선용 식품 조성물이 제공된다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면 상기 죽엽 추출물은 대나무 잎으로부터 추출한 것일 수 있다.
또한, 상기 죽엽 추출물은 트리신을 총 조성물에 1 내지 50 ㎍/ml농도로 포함할 수 있으며, 상기 신경염증 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 질환일 수 있다.
본 발명은 또한, 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 포함하는, 인지기능장애 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 인지기능장애는 건망증(Anmesia), 추론능력의 상실, 망각, 학습장애, 집중력 저하, 지능의 저하로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나일 수 있으며, 기억력 감퇴 환자를 대상으로할 수 있다.
또한, 상기 기억력 감퇴는 콜린성 시스템(cholinergic system)의 손상 및 소실에 의한 것일 수 있다.
본 발명의 죽엽 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, LPS에 의해 활성화된 미세아교세포에서 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha), 일산화질소(NO; nitric oxide) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)와 같은 염증성 사이토카인의 증가를 현저하게 억제하고, MAPK(mitogen-activated protein kinases)의 인산화 및 NF-κB(nuclear factor-kappaB)의 활성을 감소시켜 신경염증과 관련된 미세아교세포의 활성을 효과적으로 억제하였다. 또한 죽엽 추출물은 아세틸콜린에스터레이즈의 활성을 억제시키고 스코폴라민에 의해 유도된 항산화효소의 억제, 지질과산화의 축적, 신경염증의 증가를 억제하였고, 기억력 및 공간인지능력이 개선됨을 확인하였으며 죽엽 추출물의 유효성분인 트리신이 아세틸콜린에스터레이즈의 활성 억제 및 MPTP에 의해 유도된 신경염증을 억제하여 도파민 신경세포사멸을 보호함으로써 기억력 개선 및 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증 등과 같은 신경 변성질환의 질환의 예방 또는 개선용 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1의 A는 BV-2 신경교세포에서 오죽에서 얻은 죽엽 에탄올 추출물에 의한 LPS (100 ng/ml) 유도 일산화질소(NO)의 생성억제효과를 나타낸 것임, 도 1의 B는 BV-2 신경교세포에서 MTT assay를 통한 죽엽 에탄올 추출물의 세포독성 검사를 나타낸 그래프이다.
도 2의 A는 BV-2 신경교세포에서 죽엽 열수 추출물의 LPS (200 ng/ml)로 유도된 NO의 생성억제효과를 나타낸 것이고, 도 2의 B는 MTT assay를 통한 죽엽 열수 추출물의 세포독성 검사를 나타낸 그래프이다.
도 3는 타크린(Tacrine), 죽엽 분획물 및 죽엽 추출물을 각각 처리한 후 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase)의 활성을 측정한 그래프이다.
도 4는 죽엽 추출물 처리 후 수동 회피 행동 실험을 통하여 밝은 방(명 챔버)에서 어두운 방(암 챔버)으로 이동을 회피하는데 걸리는 시간 TLT(Transfer latency time)을 분석한 수동회피 행동 실험 결과이다.
도 5는 스코폴라민 모델에서 죽엽 추출물 처리 시 순차적으로 미로에 들어가는 상대적 빈도를 측정하는 공간인지능력 (Y-미로실험)을 분석한 결과이다.
도 6 죽엽추출물이 스코폴라민에 의하여 발생한 산화적손상을 감소시키는데 필요한 항산화 효소(SOD, CAT, GPX)의 발현의 증가를 보여주는 그래프이다.
도 7는 스코폴라민 모델에서 죽엽 추출물의 처리 시 활성산소로 인해 생성되는 지질과산화물 (Malondealdehyde, MDA)의 억제효과를 분석한 그래프이다.
도 8은 스코폴라민 모델에서 죽엽 추출물의 처리 시 마우스의 뇌조직 (해마, 대뇌피질)에서 신경염증인자 (TNF-α, IL-1β, IL-6)와 항신경염증인자 (IL-10)의 발현을 분석한 결과이다.
도 9는 죽엽추출물의 분획 및 6가지 성분의 NO 생성 저해 효능을 나타낸 것이다
도 10는 죽엽 추출물로부터 분리된 성분을 각각 마우스 모델에 처리한 후 아세틸콜린에스터아라제(Acetylcholinesterase)의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 죽엽 활성성분 중 가장 효능이 높은 트리신을 선택하여 처리한 후 BV-2 신경교세포에 LPS를 처리하고 관찰한 것이며, 도 11의 A는 NO의 생성량을 나타낸 그래프이고, 도 11의 B는 GAPDH 대비 iNOS의 발현량을, 도 11의 C는 β-actin 대비 iNOS의 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 12의 A는 트리신을 1시간 전처리하고 LPS를 처리한 후, PGE2의 발현량을 나타낸 그래프이며, 도 12의 B는 GAPDH 대비 COX-2의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 12의 C는 β-actin 대비 COX-2의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13의 A는 1시간동안 트리신을 전처리한 다음 LPS를 처리하였을 때 변하는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인의 발현량을 나타낸 것이며, 도 13의 B는 GAPDH 대비 TNF-α의 발현량을, 도 13의 C는 GAPDH 대비 IL-1β의 발현량을, 도 13의 D는 GAPDH 대비 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 14의 A는 BV-2 신경교세포에서 LPS에 의해 유도되는 p65의 이동을 나타내는 형광현미경으로 관찰한 이미지이며, 도 14의 B는 BV-2 신경교세포에 트리신을 처리한 다음 LPS에 의해 유발된 I
Bα와 p65의 인산화 정도를 나타내는 이미지이고, 도 14의 C는 ERK, 도 14의 D는 p38의 인산화 정도를 나타내는 이미지이다.
도 15는 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) 투여 도파민 신경세포사 마우스모델에서 트리신의 중뇌 (midbrain) 내의 도파민 신경세포 보호효과를 나타낸 이미지이다.
도 16은 MPTP 투여 도파민 신경세포사 마우스모델에서 트리신의 선조체 (striatum) 내의 도파민 섬유보호효과를 나타낸 이미지이다.
도 17의 A 및 B는 MPTP 투여된 도파민 신경세포사 마우스 모델의 로타로드(Rota-Rod) 검사를 통한 마우스의 행동 (운동)능력을 평가한 그래프이며, 도 17의 C는 MPTP 처리된 마우스 모델의 폴(Pole) 검사를 통한 마우스의 운동능력을 평가한 그래프이다.
도 18의 A 및 B는 MPTP 처리된 도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 트리신 처리에 따른 iNOS의 발현량을 측정한 것이며 도 18의 C 및 D는 MPTP 처리된 마우스 모델에서 트리신 처리에 따른 COX-2 발현량을 측정한 결과이다.
도 2의 A는 BV-2 신경교세포에서 죽엽 열수 추출물의 LPS (200 ng/ml)로 유도된 NO의 생성억제효과를 나타낸 것이고, 도 2의 B는 MTT assay를 통한 죽엽 열수 추출물의 세포독성 검사를 나타낸 그래프이다.
도 3는 타크린(Tacrine), 죽엽 분획물 및 죽엽 추출물을 각각 처리한 후 아세틸콜린에스터라아제(Acetylcholinesterase)의 활성을 측정한 그래프이다.
도 4는 죽엽 추출물 처리 후 수동 회피 행동 실험을 통하여 밝은 방(명 챔버)에서 어두운 방(암 챔버)으로 이동을 회피하는데 걸리는 시간 TLT(Transfer latency time)을 분석한 수동회피 행동 실험 결과이다.
도 5는 스코폴라민 모델에서 죽엽 추출물 처리 시 순차적으로 미로에 들어가는 상대적 빈도를 측정하는 공간인지능력 (Y-미로실험)을 분석한 결과이다.
도 6 죽엽추출물이 스코폴라민에 의하여 발생한 산화적손상을 감소시키는데 필요한 항산화 효소(SOD, CAT, GPX)의 발현의 증가를 보여주는 그래프이다.
도 7는 스코폴라민 모델에서 죽엽 추출물의 처리 시 활성산소로 인해 생성되는 지질과산화물 (Malondealdehyde, MDA)의 억제효과를 분석한 그래프이다.
도 8은 스코폴라민 모델에서 죽엽 추출물의 처리 시 마우스의 뇌조직 (해마, 대뇌피질)에서 신경염증인자 (TNF-α, IL-1β, IL-6)와 항신경염증인자 (IL-10)의 발현을 분석한 결과이다.
도 9는 죽엽추출물의 분획 및 6가지 성분의 NO 생성 저해 효능을 나타낸 것이다
도 10는 죽엽 추출물로부터 분리된 성분을 각각 마우스 모델에 처리한 후 아세틸콜린에스터아라제(Acetylcholinesterase)의 활성을 나타낸 그래프이다.
도 11은 죽엽 활성성분 중 가장 효능이 높은 트리신을 선택하여 처리한 후 BV-2 신경교세포에 LPS를 처리하고 관찰한 것이며, 도 11의 A는 NO의 생성량을 나타낸 그래프이고, 도 11의 B는 GAPDH 대비 iNOS의 발현량을, 도 11의 C는 β-actin 대비 iNOS의 발현량을 나타내는 그래프이다.
도 12의 A는 트리신을 1시간 전처리하고 LPS를 처리한 후, PGE2의 발현량을 나타낸 그래프이며, 도 12의 B는 GAPDH 대비 COX-2의 발현량을 나타낸 그래프이고, 도 12의 C는 β-actin 대비 COX-2의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 13의 A는 1시간동안 트리신을 전처리한 다음 LPS를 처리하였을 때 변하는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인의 발현량을 나타낸 것이며, 도 13의 B는 GAPDH 대비 TNF-α의 발현량을, 도 13의 C는 GAPDH 대비 IL-1β의 발현량을, 도 13의 D는 GAPDH 대비 IL-6의 발현량을 나타낸 그래프이다.
도 14의 A는 BV-2 신경교세포에서 LPS에 의해 유도되는 p65의 이동을 나타내는 형광현미경으로 관찰한 이미지이며, 도 14의 B는 BV-2 신경교세포에 트리신을 처리한 다음 LPS에 의해 유발된 I
도 15는 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine) 투여 도파민 신경세포사 마우스모델에서 트리신의 중뇌 (midbrain) 내의 도파민 신경세포 보호효과를 나타낸 이미지이다.
도 16은 MPTP 투여 도파민 신경세포사 마우스모델에서 트리신의 선조체 (striatum) 내의 도파민 섬유보호효과를 나타낸 이미지이다.
도 17의 A 및 B는 MPTP 투여된 도파민 신경세포사 마우스 모델의 로타로드(Rota-Rod) 검사를 통한 마우스의 행동 (운동)능력을 평가한 그래프이며, 도 17의 C는 MPTP 처리된 마우스 모델의 폴(Pole) 검사를 통한 마우스의 운동능력을 평가한 그래프이다.
도 18의 A 및 B는 MPTP 처리된 도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 트리신 처리에 따른 iNOS의 발현량을 측정한 것이며 도 18의 C 및 D는 MPTP 처리된 마우스 모델에서 트리신 처리에 따른 COX-2 발현량을 측정한 결과이다.
이하, 본 발명의 도면을 참조하여 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
상술한 바와 같이, 활성화된 신경교세포는 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-1β, 일산화질소, 프로스타글란딘, 초과산화물 등의 물질을 생산, 방출한다 (Gao 등, J Neurochem, 81, 1285-97, 2002; Nelson, PT. 등, Ann Med, 34, 491-500, 2002; Griffin, W.S. 등, J Neuroinflammation, 3, 5, 2006). 이러한 물질들의 생성은 단기적으로는 면역반응을 유발하지만, 그 과도한 생산이나 지속적인 생산은 근접한 신경세포들의 사멸을 유도하여 결국 신경퇴행이 유발될 수 있다. 이러한 신경퇴행, 신경염증성 질환을 완화, 개선할 수 있는 천연물에 대한 연구가 필요하다.
이에, 본 발명자들은 죽엽 추출물이 신경교세포에 처리하는 경우 일산화질소(NO) 생성을 억제할 수 있으며, iNOS의 발현을 억제, 염증성 사이토카인 등의 생성을 억제할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 대나무 추출물, 특히 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 죽엽 추출물 또는 트리신을 통해 활성화된 신경교세포에서 발생하는 염증매개물질들의 생성을 현저하게 억제하여 보다 효과적으로 신경 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.
본 발명의 용어“치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나 여부를 포함한다. 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화(alleviating)”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 대나무 추출물은 대나무 잎으로부터 추출한 것일 수 있다. 대나무의 잎(죽엽), 줄기, 뿌리 및 종자 등 대나무의 모든 부위를 사용할 수 있지만, 대나무 잎(죽엽) 이외에 다른 부분은 신경 염증 억제 효능이 미흡할 수 있어 죽엽을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 죽엽 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부탄올 또는 헥산 등의 단독 또는 혼합 형태인 용매로 추출할 수 있으며, 보다 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용할 수 있다. 상기 용매를 이용한 일반적인 용매 추출법을 적용하여 추출할 수 있으며, 또한 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 분획물일 수도 있다. 본 발명에 따른 추출물의 제조방법은 본 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 식물 추출방법을 모두 적용할 수 있으며, 예컨대 물, 알코올 또는 혼합용매에 의한 추출, 중탕이나 상온에 의한 추출법 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 메탄올, 에탄올, 부탄올(butanol), 헥산(hexan), 클로로포름(chloroform) 및 에틸아세테이트(ethylacetate)를 용매로 사용하여 대나무 잎 추출물을 추출할 수 있으며, 메탄올 또는 에탄올을 사용하여 추출하였을 경우, 부탄올, 클로로포름 또는 헥산 등의 다른 용매에 비해 활성화된 신경교세포의 신경염증 활성을 보다 효과적으로 억제할 수 있다.
본 발명의 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 죽엽 추출물을 1 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다. 상기 조성물의 용매로는 죽엽 추출물의 신경염증 억제 효과를 방해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 프로필 알코올, DMSO 등일 수 있다. 상기 대나무 추출물 조성물의 농도가 1 ㎍/㎖ 미만일 경우 미세아교세포의 염증매개물질들의 생성 저해 효과가 미흡하여 신경염증 억제 효능이 떨어질 수 있다. 또한, 100 ㎍/㎖보다 더 높은 양의 대나무 추출물이 포함될 수는 있지만, 상기 범위로도 충분한 신경염증 억제 활성을 확인할 수 있으며, 100 ㎍/㎖를 초과할 경우 농도 증가로인한 효능의 향상이 적어 효율이 떨어지는 문제점이 있을 수 있다. 세포독성 효과가 없으면서 우수한 신경염증 억제 효능을 나타내는 대나무 추출물 조성물의 농도는 보다 바람직하게는 10 내지 100 ㎍/㎖일 수 있다.
본 발명의 일실시예에서, 각 추출물에 대한 신경염증 억제 효과를 알아보기 위해 쥐 유래 신경교세포인 BV2 세포에 대나무 추출물을 전처리한 다음, LPS로 BV2세포를 자극시켜 LPS 자극에 의해 발생되는 염증매개성 물질들의 생성 억제 효능 및 세포독성 여부를 관찰하였다.
내독소로 잘 알려진 LPS(lipopolysaccharide)는 대식세포의 활성화에 관여하는 가장 잘 알려진 외부인자로서, 특히 RAW 264.7 세포와 같은 대식세포나 단핵세포에서 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1 beta)와 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 분비하여 염증부위에서 증가되는 것으로 알려져 있다. 또한, LPS가 대식세포를 자극하게 되면 iNOS(inducible nitric oxide synthase)라는 효소에 의해 L-알기닌이 L-시트룰린으로 변하는 과정에서 일산화질소(NO)가 생성됨으로써 대식세포로부터 NO가 생성된다. 포유동물에서 NO는 세 가지 종류의 NO 합성효소(NOS, nitric oxide synthase), 즉 nNOS(neuronal NOS), eNOS(endothelial NOS) 및 iNOS(inducible NOS)에 의해 합성된다. 이 중에서 nNOS와 eNOS에 의해 생성되는 NO는 정상적인 생체기능을 위해 생성되며, 조직 내에서의 농도는 일정수준으로 낮게 유지된다. 그러나 iNOS에 의해 생성된 NO는 과도하게 생성되어 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직 손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 죽엽 추출물 또는 트리신은, 기억력 또는 인지기능 개선 효과를 갖는다.
이하, 죽엽 추출물 또는 트리신의 신경염증 질환 예방 또는 치료, 또는 기억력 또는 인지기능의 개선 효과를 실험예를 통해 설명한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 LPS에 의해 자극을 받는 NO 생성에 있어 Phyllostachys nigra MUNRO leaves (PNL) 에탄올 추출물이 어떤 영향을 주는지 연구하기 위하여 BV-2 신경교세포에서 일산화질소(NO)의 축적과 세포독성을 확인하였다.
도 1의 A를 참조하면, BV-2 신경교세포에서 특정 농도의 죽엽 추출물을 전처리하는 것은 LPS에 의해 자극을 받은 NO 증가를 억제하는 것을 알 수 있다. 이 경우, 세포 전체의 생존율에는 변화가 없었다는 것을 도 1의 B를 보면 알 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 LPS 자극을 준 BV-2 신경교세포에 죽엽추출물을 각각 다른 농도 처리하여 일산화질소(NO, Nitric Oxide)의 생성 정도를 확인하였다. 이 경우, 도 2의 B를 참조하면 죽엽 추출물의 농도가 달라져도 세포 전체의 생존율에는 유의한 변화가 없음을 알 수 있다. 그러나 도 2의 A를 참조하면, 죽엽 추출물의 처리 농도가 높아질수록 일산화질소(NO) 생성이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다.
또한, 본 발명의 일 실시예에서는, 죽엽 분획물의 아세틸콜린에스터라아제 저해능을 확인하였다. 신경전달물질 중의 하나로 알려진 아세틸콜린(Acetylcholine)은 시냅스 사이의 신경전달에 관여하는 물질로 알려져 있고, 이러한 아세틸콜린을 아세테이트와 콜린으로 가수분해하는 효소인 아세틸콜린에스터라아제 (AChE) 효소는 인지기능 개선 및 치매 질환 치료제로 사용되는 약품들의 표적 물질로 사용되고 있다. 이러한 특성으로 알츠하이머 질병 환자의 뇌에서 이 효소의 수준이 감소하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 죽엽 분획물과 죽엽 에탄을 추출물은 아세틸콜린에스터아라제의 활성을 타크린(Tacrine)과 유사하게 감소시키는 것을 확인하였다(도 3 참조). 이러한 결과에 따라 죽엽 분획물과 죽엽 에탄올 추출물은 인지기능 개선 및 치매 질환 치료제로 사용될 수 있음을 알 수 있다.
기억력과 인지기능의 감퇴현상은 콜린성 신경계와 밀접한 관계가 있는 것으로 알려져 있으며, 후시냅스(post-synapse)에 있는 무스카리닉성(muscarinic)수용체의 길항제인 스코폴라민(Scopolamine)은 전시냅스(pre-synapse)에서 유리되는 신경전달물질인 아세틸콜린과 무스카리닉 수용체의 결합을 억제하여 정보전달을 하는 것을 일시적으로 차단함으로 학습과 기억력을 손상시키게 되어 학습과 기억력 증진효과를 검증하고자 하는 기억력감퇴동물모델에 통상적으로 이용되고 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 마우스 모델에서 스코폴라민-유발성 신경염증 및 인지기능장애에 대한 죽엽 추출물의 개선 효과를 조사하였다. 스코폴라민에 의해 유도된 인지기능의 장애를 수동회피실험과 공간인지능력 장애를 Y-미로실험을 진행함으로써 관찰하였다. 죽엽 추출물을 주입시키면 스코폴라민에 의해 유도된 인지기능장애(도 4 참조)와 공간인지능력 장애(도 5 참조)을 개선시킬 수 있었다. 이러한 실험결과를 통해, 죽엽추출물이 스코폴라민 유도 인지기능장애를 개선한다는 것을 알 수 있다.
본 발명에서는 신경염증 및 인지기능장애 마우스 모델에서 스코폴라민으로 유도된 신경염증에 대한 죽엽 추출물의 손상 억제효과를 관찰하였다. 죽엽 추출물을 구강 내 주입하면 마우스의 해마와 대뇌피질 부분에서 항산화효소인 SOD(Superoxide Dismutase), CAT(Catalase) activity, GPx(Glutathione peroxidase) 활성이 증가되는 것을 확인하였다(도 6 참조). 또한 스코폴라민에 의해 증가하는 지질과산화물의 축적을 억제하였고 (도 7 참조), 신경염증 인자인 TNF-alpha, IL-1, IL-6의 발현이 감소, 항신경염증 인자인 IL-10의 발현이 증가하는 것을 확인하였다(도 8 참조). 이에 따라 죽엽 추출물이 스코폴라민-유발성 신경염증 및 인지기능장애를 억제한다는 것을 알 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라 Phyllostachys nigra MUNRO leaves (PNL) 에탄올 추출물을 성분 분석한 결과 하기 도 9와 같았다. 도 9를 참조하면, 본 발명의 죽엽 추출물은 이소오리엔틴(Isoorientin), 오리엔틴(Orientin), 비텍신(Vitexin), 루테올린(Luteolin), 6-C-(6“-O-trans-caffeolyglucoside), 비타리플라본(Vittariflav- one) 및 트리신(Tricin)을 일부 성분으로 포함할 수 있음을 알 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명의 죽엽 추출물은 트리신을 총 조성물에 1 내지 50 ㎍/ml의 농도로 포함할 수 있다. 본 발명에서, 트리신이 1㎍/ml미만의 농도로 포함되는 경우, 충분한 인지기능 개선, 신경염증질환 치료 또는 완화 효과가 나타나지 않으며, 트리신의 농도가 50㎍/ml를 초과하는 경우, 세포 독성이 증가하는 문제가 발생할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 각 성분의 아세틸콜린에스터라아제 저해능이 있음을 확인하였다(도 10 참조).
따라서, 본 발명의 죽엽 추출물은 대나무 잎으로부터 추출한 죽엽 추출물일 수 있으며, 트리신을 하나의 성분으로 포함하여 신경염증 질환의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에서는 LPS에 의해 자극을 받는 일산화질소(NO) 생성에 있어 트리신이 어떤 영향을 주는지 연구하기 위하여 BV-2 신경교세포에서 일산화질소(NO) 및 iNOS의 발현을 확인하였다.
도 11의 A를 참조하면, BV-2 신경교세포에서 특정 농도의 트리신을 전처리하는 것은 LPS에 의해 자극을 받은 일산화질소(NO)의 생성을 억제하는 것을 알 수 있다. 또한, 도 11의 B 및 C를 참조하면, 트리신 처리 농도가 높아질수록 GAPDH 및 β-actin 에는 변화가 없으나, iNOS의 발현량이 감소하였다. 즉, 트리신의 처리 시 염증에 의해 매개되는 신경변성을 억제할 수 있음을 알 수 있다.
또한, COX-2에 의해 생성되는 프로스타글란딘, TNF-α 등은 신경세포에 독성을 나타내기 때문에 결과적으로 신경세포의 손상을 악화시키게 되므로, 본 발명에서는 활성화된 신경교세포에 트리신을 처리하여 PGE2, COX-2 유전자 발현 여부를 확인하였다. 그 결과, 트리신의 처리 농도가 높아질수록 PGE2, COX-2의 발현은 감소(도 12의 A, B 및 C 참조)하나, GAPDH 및 β-actin에는 변화가 없음을 알 수 있었다. 이에 따라 트리신은 LPS에 의한 신경염증 유도된 BV-2 신경교세포에서 항염증 효과를 나타남을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는, LPS 자극을 준 BV-2 신경교세포에 트리신을 처리하여 염증성 사이토카인의 생성 여부를 확인하였다. 염증성 사이토카인의 생성의 증가는 뇌로 백혈구가 이동하는 것을 촉진시키는 케모카인의 분비, 부착분자의 유도 및 BBB(Blood Brain Barrier)의 파괴를 통해 CNS에서 염증발달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 대나무 추출물은 트리신을 포함하여 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있고, 이에 따라 활성화된 신경교세포가 신경세포에 미치는 손상에 대하여 보호 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 트리신의 처리 농도가 높아질수록 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha), 인터루킨-1β(IL-1β) 또는 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)인 염증성 사이토카인의 생성을 억제하였다(도 13 참조).
본 발명의 죽엽 추출물은 또한, ERK(extracellular signal regulated kinase) 및 p38(p38 MAP kinase)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 MAPK(mitogen-ac
tivated protein kinases) 또는 IκBα 및 p65로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 NF-κB(nuclear factorkappaB)의 활성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 트리신에 의한 LPS로 자극된 BV2 세포의 MAPK의 활성 억제 효능을 관찰하였다. MAPK(mitogen-activatied protein kinase)는 세포 내의 신호 전달 매개체로서 핵심적인 단백질이며 인체에서의 다양한 염증반응, 사멸, 세포 분화, 성장 등의 세포외 신호에 반응하여 활성화되어 전사인자를 활성화시켜 필요한 유전자들의 전사를 조절하며, Erk(extracellular signal regulated kinase), p38 MAP kinase 등이 알려져 있다. Erk는 세포의 성장과 밀접한 관계를 보이고 있으며 많은 세포 성장 인자에 의해서 조절 받는다. p38 MAP kinase는 대부분의 염증 반응, 세포 스트레스 신호, 세포 사멸 신호 등과 밀접한 관계가 있다.
또한, NF-κB는 염증에 중요한 전사인자로, NF-κB는 활성화된 미세아교세포에서 iNOS, TNF-α, COX-2 및 MARK 신호전달 기전을 포함하는 단백질의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.
먼저, LPS 자극에 의해 BV2 세포에서 MAPK(mitogen-activated protein kinases) 활성 변화가 발생하는지 확인하기 위해 LPS 처리 후 시간 변화에 따른 p38(p38 MAP kinase) 및 ERK(extracellular signal regulated kinase)의 인산화 정도를 측정하였다. 도 14에 나타난 바와 같이, LPS 자극에 의해 BV2 세포에서, IκBα(도 14의 B), p65(도 14의 B), ERK(도 14의 C) 및 p38(도 14의 D)의 인산화는 처리된 트리신의 농도가 높을수록 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 도 14의 A를 참조하면, 트리신은 LPS에 의해 유발된 세포질에서 핵으로 NF-κB 소단위체인 p65가 이동하는 것을 지연시키는 것을 알 수 있다. 즉, BV-2 신경교세포에서 트리신에 의해 NO 생성과 염증성 사이토카인의 생성이 억제되는 것이 NF-κB와 MAPK 신호전달체계의 차단을 통해 연결되어 있다는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 대나무 추출물(바람직하게는 죽엽추출물 또는 트리신)은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 활성화된 신경교세포에서 발생하는 염증 매개성 물질을 현저하게 감소시키고, MAPK의 인산화 및 NF-κB의 활성을 현저하게 감소시키는 효과가 있는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명의 대나무 추출물은 미세아교세포에 의해 발생하는 신경염증을 효과적으로 억제한다고 볼 수 있다. 따라서, 본 발명의 대나무 추출물은 신경염증과 관련된 신경교세포의 활성을 효과적으로 억제하므로, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증 등과 같은 신경 염증 질환의 예방 또는 치료제 또는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 유용하게 활용될 수 있다.
MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)는 중추신경계(CNS: Central Nervous System)에서 미세아교세포의 활성화를 유발할 수 있어 신경염증 및 도파민성 신경세포사를 유도할 수 있는 신경독소로 널리 알려져 있다. 본 발명의 실시예에서는 도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 MPTP 투여 후 유발되는 신경염증에 대한 트리신의 신경보호 효과를 조사하였다. SNpc (Substantia Nigra pars compacta)와 STR (Striatum)에서 MPTP에 의해 유도된 도파민성 신경세포의 손실은 TH(Tyrosine Hydroxylase) 면역염색을 통하여 관찰하였다. 트리신을 투여하면 MPTP에 의해 유도된 도파민신경세포의 손실을 감소(도 15, 도 16 참조)시킴을 확인할 수 있었다. 이러한 실험 결과를 통해, 트리신이 MPTP로 유도된 신경염증을 억제하여 신경세포를 보호한다는 것을 알 수 있다.
본 발명은 또한, MPTP 처리된 도파민 신경세포사의 마우스 모델로 구강 내 트리신을 주입하여 트리신의 신경염증 억제효과 및 인지기능 개선 효과를 확인하였다. 본 발명의 일 실시예에서는 도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 신경염증에 대한 트리신의 행동개선 효과를 관찰하였다. MPTP의 주입은 마우스 행동력을 억제시키지만, 트리신 투여 후 MPTP에 의해 유도된 행동력 억제를 감소시킴을 확인하였다 (도 17 참조).
본 발명에서는 도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 MPTP로 유도된 신경염증에 대한 트리신의 신경염증 억제효과를 관찰하였다. 트리신을 구강 내 주입하면 iNOS(도 18의 A 및 B), COX-2 (도 18의 C 및 D)의 발현이 감소하여 트리신이 MPTP에 유도되는 신경염증를 억제한다는 확인하였다.
특히 본 발명에서는 상기 죽엽 추출물 또는 트리신을 포함하는 약학적 조성물로 구성될 수 있으며, 본 발명에 따른 죽엽추출물 또는 트리신을 유효성분으로 포함하는 신경염증 질환의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선용 약학적 조성물은 신경 염증을 억제 또는 감소시키는 다른 천연물질 또는 화합물을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선용 약학적 조성물은 여러 가지 제형으로 제제화 할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 대나무 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴) 등이 섞여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있다. 비수용성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다.
본 발명의 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 함유하는 신경염증 질환의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선용 약학적 조성물을 인체에 투여하는 경우, 천연 추출물인 관계로 다른 합성 의약품에 비하여 부작용의 우려가 적어 안심하고 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 죽엽 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 활성화된 미세아교세포에서 발생하는 염증 매개성 물질을 현저하게 감소시키고, MAPK의 인산화 및 NF-κB의 활성을 현저하게 감소시키는 효과가 있는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명의 대나무 추출물은 미세아교세포에 의해 발생하는 신경염증을 효과적으로 억제한다고 볼 수 있다. 따라서, 본 발명의 대나무 추출물은 신경염증과 관련된 미세아교세포의 활성을 효과적으로 억제하므로, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증 등과 같은 신경 염증 질환의 예방 또는 치료제 또는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 유용하게 활용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 죽엽 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 함유하는 신경 염증 질환의 예방 또는 기억력 개선 또는 인지기능 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 대나무 추출물 또는 트리신을 유효성분으로 함유하는 신경 염증 질환의 예방 또는 인지기능개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디 류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있다.
상기 건강식품은 상기 죽엽 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 대나무 추출물을 유효 성분으로 함유하는 신경 염증 질환 예방용 음료는 대나무 추출물이 유효성분으로 포함되는 것 이외에 칼슘, 가시오가피 농축액, 액상과당, 정제수 등을 첨가 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조할 수 있다. 또한, 상기 대나무 추출물을 유효 성분으로 함유하는 신경 염증 질환 예방용 건강보조제는 대나무 추출물에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올, 정제수를 첨가 혼합하여 과립상으로 성형하여 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형하여 정제 또는 분말로 하거나 경질캡슐에 충전하여 경질캡슐제품으로 제조할 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 상기 죽엽 추출물 또는 트리신의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
죽엽 추출물의 제조
먼저 죽엽의 일정량을 취하고 6배수의 물을 가하여 1시간 동안 100℃에서 열수추출하였다. 이 액을 여과한 후 30분간 6,000 rpm에서 원심분리 (Dupont Sorvall RC-5C, SORVALL, USA)하여 상청액을 다시 여과하였다. 여과액을 다시 농축하여 얻은 추출물을 다이아이온 칼럼(diaion column)에 충진시켜 밤샘시켰다. 그 후 60％ 에탄올로 2회 반복 추출한 후 60％ 에탄올 추출액을 모아 감압농축 (Rotary vacuum evaporator R-114, Swiss)하여 죽엽 추출물을 수득하였다.
오죽과 조릿대에서 얻은 죽엽 (100g)을 1L 증류수에 넣고 추출기 (DW-290, 대웅전자기기)에서 100℃ 온도로 150분 동안 열 추출을 하였다. 추출액을 여과한 후 동결건조기 (Clean Vac 8, Hanil Science Co., LTD)를 사용하여 동결 건조하고 죽엽 열수 추출물(6.56g)을 수득하였다.
죽엽 (200g)을 1L 에탄올 95.0% (GR Grade)에 넣고 실온에서 30회 (1회당 40 KHz, 1500W 15분, 초음파처리 120분) 반복하여 추출하였다. 여기서 사용된 초음파 추출기는 SDN-900H (SD-Ultrasonic Co., LTD)를 사용하였고 추출액을 여과하고 감압 건조하고 죽엽 에탄올 추출물 (7.7g)을 수득하였다.
LPS 자극을 준 BV-2 신경교세포에서 일산화질소 (NO, Nitric Oxide)의 생성에 대한 죽엽 에탄올 추출물의 효과
마이크로플레이트에 BV-2 신경교세포를 파종한 후, LPS와 죽엽 에탄올 추출물을 처리한 후, 24시간 동안 배양기서 반응시킨 후, 상층액을 96웰에 덜어 각각 100 ㎕씩 Griess 시약 (1% 설파닐아마이드/0.1% N-(1-나프틸)=에틸렌디아민 디하이드로클로라이드/2.5% H3PO4)와 반응시킨 후 파장이 550nm인 Vmax 96-웰 마이크로플레이트 스펙트로포토미터를 사용하여 값을 측정하였다. 구체적으로 24시간 동안 100 ng/ml의 농도로 BV-2 신경교세포에 죽엽 에탄올 추출물을 처리한 다음, 18시간 동안 LPS를 처리하였다. 배양액을 모아 NO의 생성 및 세포 생존을 분석하였다. 그 결과는 도 1에 평균값 ± SEM으로 나타내었다 (n=3).
도 1의 A를 참조하면, LPS를 BV-2 신경교세포에 처리할 경우, 대조군 대비 NO 생성이 현저하게 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (이 경우, 세포 전체의 생존율에는 변화가 없었다(도 1의 B 참조). 그러나 BV-2 신경교세포에서 특정 농도의 죽엽 에탄올 추출물을 전처리하는 것은 LPS에 의해 자극을 받은 NO 증가를 억제하였다.
LPS 자극을 준 BV-2 신경교세포에서 NO의 생성에 대한 죽엽 열수 추출물의 효과
BV-2 신경교세포에 죽엽 열수 추출물을 24시간 동안 100 ng/ml의 농도로 처리한 다음, 18시간 동안 LPS를 처리하였다. 배양액을 모아 NO의 생성 및 세포 생존을 분석하였다. 그 결과는 도 2에 평균값 ± SEM으로 나타내었다 (n=3).
도 2의 B를 참조하면 LPS를 BV-2 신경교세포에 처리할 경우, 대조군 대비 NO 생성이 현저하게 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (이 경우, 세포 전체의 생존율에는 변화가 없었다(도 2의 B참조). 그러나 BV-2 신경교세포에서 특정 농도의 죽엽 열수 추출물을 전처리하는 것은 LPS에 의해 자극을 받은 NO 증가를 억제하였다.
죽엽 분획물의 아세틸콜린에스터라아제 저해능
신경전달물질 중의 하나로 알려진 아세틸콜린(Acetylcholine)은 시냅스 사이의 신경전달에 관여하는 물질로 알려져 있고, 이러한 아세틸콜린을 아세테이트와 콜린으로 가수분해하는 효소인 아세틸콜린에스터라아제 (AChE) 효소는 인지기능 개선 및 치매 질환 치료제로 사용되는 약품들의 표적 물질로 사용되고 있다. 이러한 특성으로 알츠하이머 질병 환자의 뇌에서 이 효소의 수준이 감소하는 것으로 알려져 있다.
특정농도의 죽엽 분획물 (0.1μg/ml)과 죽엽 에탄올 추출물(0.1μg/ml)은 아세틸콜린에스터아라제의 활성을 0.1 mM의 타크린(Tacrine)과 유사하게 감소시켰다(도 3).
스코폴라민 (Scopolamine)으로 유도된 인지기능장애 마우스모델에서 수동회피능력에 대한 죽엽 열수 추출물과 에탄올 추출물의 효능 분석
수컷 C57BL/6 마우스 (25 g, 8주령)는 대한바이오링크에서 구입하였다. 이들을 4개의 그룹으로 나누어 표준조건 하에서 1주 순화하였으며 이후 실험에 사용되었다(온도 22±2 ℃, 습도 55±5 %, 12 h-명/암 사이클, 음식/물 자유식). 모든 실험은 실험동물관리기준(NIH publication No. 85-23, revised 1985)의 가이드라인과 건국대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행하였다. 마우스는 6마리씩 4개의 그룹 (1. vehicle (대조군), 2. Scopolamine 2 mg/kg, 3. Tacrine(TAC) 10 mg/kg, 4. 죽엽 열수 추출물 100 mg/kg, 죽엽 에탄올 추출물 100 mg/kg으로 나누어진 후 실험에 투입되었다. 모든 처리군은 생리적 식염수에 녹여 사용하였다. 죽엽 열수 추출물과 죽엽 에탄올 추출물, Tacrine(TAC)은 Scopolamine 처리 전 7일 동안 100 mg/kg를 매일 경구 투여를 통하여 마우스에 투여하였으며, Scopolamine는 2 mg/kg를 복강주사를 통하여 투여하였다. 기억력 평가를 위해 수동 회피 실험을 진행하였으며, 수동 회피 행동을 위한 훈련 및 시험을 위해서는 두 개의 동일한 명/암 정방형 상자를 가진 미국 GEMINI 사(San Diego Instruments, San Diego, CA, USA)의 수동 회피 실험 시스템(Active and passive avoidance system)을 사용하였다. 이러한 장치는 명 챔버(밝은 방)과 암 챔버(어두운 방)을 가지고 있으며, 컴퓨터로 조절되는 문에 의해 구분된다. 마우스를 밝은 방에 넣은 후 빛을 주어 어두운 방으로 가게 한 후 전류를 통하게 하여 마우스가 이를 기억하게 하였다. 즉, 마우스가 어두운 방으로 들어가면 문이 자동으로 닫히고 5초간 0.5 mA의 전기적 발 쇼크(Electrical foot shock)를 준다. 이때, 밝은 방에서 어두운 방으로 회피하는데 걸리는 시간 TLT(Transfer latency time)를 컴퓨터를 통해 기록, 저장하였으며, 전기적 쇼크 및 문의 개폐는 부착된 장치 시스템에 의해 조절되었다. 마우스가 180초 동안 밝은 방에 머물 경우, 마우스가 1회 훈련 시도 후 수동 회피 훈련을 기억하는 것으로 하여, 수동 회피 실험 결과를 분석하였다.
도 4는 죽엽 추출물의 스코폴라민에 의한 인지기능 장애 개선효과를 확인하기 위한 수동 회피 실험 결과를 나타낸 그래프이다. 도 4의 A는 수동 회피 실험 직후, 도 4의 B는 수동 회피 후 실험 7일 차 결과를 나타낸다. 도 4를 참조하면, 실험대상 마우스에 스코폴라민만을 처리한 경우 TLT시간이 대조군에 비하여 짧아졌으며, 이 때 실험직후(A)와 7일 차(B)의 차이는 미미한 것으로 나타났다. 그러나, TAC및 죽엽 열수추출물을 스코폴라민과 함께 처리한 경우 실험직후(A)보다 7일차(B)에 TLT시간이 현저하게 증가함을 알 수 있다.
즉, 도 4를 참조하면, 수동 회피 행동 실험에서 밝은 방(명 챔버)에서 어두운 방(암 챔버)으로 이동을 회피하는데 걸리는 시간 TLT (Transfer latency time)는 대조군에서 최종 결과에서 현저하게 증가하였다. 7일 동안 Tacrine 투여군과 죽엽 열수 추출물과 에탄올 추출물을 전처리한 그룹에서는 최종 결과에서 TLT가 현저하게 증가하였다. Tacrine의 효능과 유사한 추출물의 효능을 확인한 것을 통해 스코폴라민을 이용한 수동 회피 실험에서의 죽엽 열수 추출물과 에탄올 추출물의 인지기능에 대한 개선 효능을 나타낸 것으로 확인하였다.
스코폴라민으로 유도된 인지기능장애 마우스모델에서 공간 인지능력에 대한 죽엽 에탄올 추출물의 효과
마우스를 4개의 그룹으로 나누어 표준조건 하에서 1주 순화하였으며 이후 실험에 사용되었다. 마우스는 6마리씩 4개의 그룹 (1. vehicle (대조군), 2. Scopolamine 2 mg/kg (비교군 1), 3. Tacrine(타크린, TAC) 10 mg/kg (실험군 1) 4. 죽엽 에탄올 추출물 100 mg/kg (실험군 2))으로 나누어진 후 실험에 투입되었다. 모든 처리군은 생리적 식염수에 녹여 사용하였다. 죽엽 에탄올 추출물과 타크린은 Scopolamine 처리 전 7일 동안 100 mg/kg를 매일 경구 투여를 통하여 마우스에 투여하였으며, Scopolamine은 2 mg/kg를 복강주사를 통하여 투여하였다. 기억력 평가를 위해 공간 인지능 검사 (Y-maze)을 진행하였다. Y-미로 시험은 마우스의 새로운 환경을 탐색하는 의지를 시험하는 방법으로, 실험동물이 주변의 단서를 파악하고 순차적으로 미로에 들어가는 상대적 빈도를 측정하는 방법이다. 마우스는 본능적으로 새로운 환경을 탐색하려는 경향을 가지고 있으나 스코폴라민을 처리한 기억력 감퇴 마우스는 새로운 환경을 탐색하는 능력 [변경 행동력 검사 (Spontaneous alteration), %]이 유의적으로 감소되었다. 하지만 죽엽 에탄올 추출물을 구강 투여한 기억력 감퇴 마우스는 탐색 본능이 회복되는 것을 확인하였다 (도 5 참조).
도 5는 죽엽 추출물 처리 시 스코폴라민 모델이 순차적으로 미로에 들어가는 상대적 빈도를 측정하는 공간인지능력(Y-maze)을 분석한 결과이다. 도 5의 A는 실험 직후, 도 5의 B는 실험 개시 7일 후 결과를 나타낸 그래프이며, 도 5를 참조하면, 미로에 들어가는 상대적 빈도가 대조군에 비하여 비교군에서 감소하였으나, 실험군 1 및 2에서 증가함을 알 수 있다. 즉, 죽엽추출물의 처리 시 스코폴라민에 의해 유도된 기억력 감퇴가 개선되는 것을 알 수 있다.
스코폴라민으로 유도된 인지기능장애 마우스모델에서 산화적스트레스 (oxidative stree)에 대한 죽엽 에탄올 추출물의 효과
30 분간 스코폴라민이 투여된 대조군과 tacrine, 죽엽 에탄올 추출물 처리군의 마우스의 뇌를 적출하였다. 그 후 마우스의 뇌로부터 조심스럽게 해마(Hippocampus)와 대뇌피질 (Cerebral cortex) 부분을 분리하여 SOD(Superoxide Dismutase), CAT(Catalase) activity, GPx(Glutathione peroxidase) 활성 등을 측정하였다.
항산화 효소 SOD, CAT 및 GPx의 활성화를 확인하기 위해 10 % w/v 0.1 M Phosphate buffer를 이용하여 뇌 조직 균질 추출물을 준비하였다. superoxide dismutase, catalase assay kits (Cell Biolabs, Dan Diego, CA)를 사용하였고 Glutathione peroxidase activity는 GPx colorimetric assay kit (BioVision, USA, CA)를 사용하였다. SOD는 490 nm, CAT는 520 nm, GPx는 340 nm의 파장으로 측정하였다.
항산화 효소의 활성을 보기위해 SOD, CAT, GPx의 수준을 확인하고자 정상군과 처리군에scopolamine을 처리한 실험에서 죽엽 에탄올 추출물 처리군은 Scopolamine에 의해 감소된 효소들의 수준을 정상군과 유사한 값을 확인할 정도로 향상시켰으며 이는 뇌의 대뇌 피질과 해마부분에서 동일하게 증가하는 결과를 보였다 (도 6 참조).
도 6은, 스코폴라민으로 유도된 인지기능 장애 마우스 모델에서 산화적 스트레스에 대한 죽엽 추출물의 효과를 뇌조직 해마와 뇌조직 대뇌 피질에서 확인한 것으로, 도 6의 A는 SOD를 도 6의 B는 CAT를, 도 6의 C는 GPx의 발현 정도를 확인한 그래프이다. 도 6을 참조하면, 스코폴라민만을 처리한 경우 항산화 효소인 효소 SOD, CAT 및 GPx의 활성화 정도가 유의하게 낮아졌으나, 죽엽추출물을 함께 처리한 경우 SOD, CAT 및 GPx의 활성화 정도가 회복되는 것을 알 수 있다. 즉, 본 발명에 따른 죽엽 추출물은 산화적 스트레스를 완화시켜 스코폴라민으로 유도된 인지기능 장애 치료에 효과적임을 알 수 있다.
스코폴라민으로 유도된 인지기능장애 마우스모델에서 지질과산화에 대한 죽엽 에탄올 추출물의 효과
30 분간 스코폴라민이 투여된 대조군과 tacrine, 죽엽 에탄올 추출물 처리군의 마우스의 뇌를 적출하였고 조심스럽게 해마와 대뇌피질 부분을 분리하여 MDA (Malondialdehyde) 활성 등을 측정하였다.
지질과산화 (Lipid peroxidation; MDA)를 확인하기 위해 10 % w/v 0.1 M Phosphate buffer를 이용하여 뇌 조직 균질 추출물을 준비하였다. MDA로는 colorimetric/fluorometric assay kit (BioVision, USA, CA)를 이용하였다. MDA는 410 nm의 파장으로 측정하였다.
지질 과산화는 생체외적인 요인뿐 아니라 내적인 요인에 의해 생성된 산소 자유라디칼이 관여함으로써 야기되며 뇌는 산화적 반응이 쉬운 다중 불포화지방산의 함량이 높고, 체내산소 소모량이 다른 장기에 비하여 많아 산화적 손상을 받기 쉬운 것으로 보고되고 있으며, 이로 인한 지질 과산화물의 축적은 세포기능 이상을 야기하며 중추신경계의 기능을 퇴화시키는 것으로 알려져 있다. 지질 과산화의 수준은 죽엽 에탄올 추출물 처리군에서 감소하였으며 이는 뇌의 대뇌 피질과 해마부분에서 동일하게 감소하는 결과를 보였다 (도 7 참조).
도 7을 참조하면, 스코폴라민 (scop) 단일 처리 시보다 죽엽추출물을 함께 처리하였을 때 뇌조직 해마와 뇌조직 대뇌 피질에서 지질 과산화물의 축적정도(MDA Eq)가 낮아지는 것을 확인할 수 있다. 즉, 죽엽 추출물은 뇌조직 해마와 뇌조직 대뇌 피질에서 지질 과산화물의 축적을 감소시켜 중추신경계의 기능의 퇴화를 방지함을 알 수 있다.
스코폴라민으로 유도된 인지기능장애 마우스모델에서 신경염증인자에 대한 죽엽 추출물의 효과
스코폴라민이 투여된 대조군과 tacrine, 죽엽 에탄올 추출물 처리군의 마우스의 뇌로부터 조심스럽게 해마와 대뇌피질 부분을 분리하여 TNF-α, IL-1, IL-6 및 IL-10의 발현량을 측정하였다.
위의 신경염증인자를 확인하기 위해 10 % w/v 0.1 M Phosphate buffer를 이용하여 뇌 조직 균질 추출물을 준비하였다. TNF-α, IL-1, IL-6 및 IL-10 Duoset ELISA kit (R&D systems, MN)를 사용하였고 각 450 nm의 파장으로 측정하였다. 이는 도 8에 나타나있다.
도 8의 A 내지 C를 참조하면, 항염증효능을 보기위해 TNF-alpha, IL-1, IL-6의 수준을 확인하고자 정상군과 처리군에 스코폴라민(scopolamine)을 처리한 실험에서 죽여 에탄올 추출물 처리군은 스코폴라민(scopolamine)에 의해 증가된 염증성관여 사이토카인들의 수준을 감소시켰으며 이는 뇌의 대뇌 피질과 해마부분에서 동일하게 감소하는 결과를 보였다.
반면, 도 8의 D를 참조하면, 항염증관여 사이토카인(IL-10)의 수준은 스코폴라민(scopolamine)보다 회복되는 경향을 확인하였고, 이는 뇌의 대뇌 피질과 해마부분에서 동일하게 증가하는 결과를 보였다.
죽엽 추출물의 활성성분들에 대한 NO 생성 저해능 분석
죽엽 추출물의 성분분석을 통해 확인한 6 종(이소오리엔틴, 오리엔틴, 루테올린, 비타리플라본, 트리신, 비텍신)의 활성성분을 1시간 동안 BV-2 신경교세포에 처리한 다음, 18시간 동안 LPS를 처리하였다. 배양액을 모아 NO의 생성 및 세포 생존을 분석하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다 (n=4).
도 9를 참조하면 LPS를 BV-2 신경교세포에 처리할 경우, 대조군 대비 NO 생성이 현저하게 증가되는 것을 (이 경우, 세포 전체의 생존율에는 영향을 가하지 않았다.) 특정 농도의 6 종의 죽엽 추출물의 활성성분을 전처리함으로 LPS에 의해 자극을 받은 NO 증가를 억제하였고 그 중 트리신(Tricin)이 저해 효능이 가장 높은 결과를 보였다.
죽엽 추출물의 활성성분들에 대한 아세틸콜린에스터라아제 저해능 분석
죽엽 추출물로부터 분리한 6종의 활성성분인 이소오리엔틴(Isoorientin), 오리엔틴(Orientin), 비텍신(Vitexin), 루테올린(Luteolin), 비타리플라본(Vittarifl
avone) 및 트리신의 아세틸콜린에스터아라제의 활성 정도를 확인하였다. 도 10를 참조하면, 각각의 활성성분은 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 감소시키는 것을 확인하였고, 이러한 결과는 추출물에서 분리한 6종의 활성성분 중 트리신이 인지기능 개선 및 치매 질환 치료제로 사용될 수 있음을 추측하게 한다 (도 10).
LPS 자극을 준 BV-2 신경교세포에서 NO의 생성과 iNOS 발현에 대한 유효성분인 트리신의 효과
트리신의 항염증 효능은 분석하기 위해, 동일한 신경염증 유발 인자인 LPS로 자극된 BV-2 신경교세포에서 NO의 저해 효능을 평가하였다. NO의 생산량을 정량적으로 측정하였다. 염증생성에 관여하는 효소인 iNOS의 유전자 및 단백질 단계 발현 양상의 변화를 알아보기 위하여, 본 연구에서는 BV-2 신경교세포에서 LPS 및 트리신을 농도별로 처리하여 배양하였다. 구체적으로 6시간 동안 LPS를 처리한 후, 세포 상층액을 제거하고, 세포에서 RNA를 동정하여 iNOS 유전자를 RT-PCR을 사용하여 분석하였다. 또한 18시간 동안 LPS를 처리한 후, 세포 상층액을 제거하고, 세포에서 단백질을 동정하여 iNOS 단백질을 웨스턴 블랏을 사용하여 분석하였다.
LPS를 BV-2 신경교세포에 처리할 경우, 대조군 대비 NO 생성 및 iNOS 발현이 현저하게 증가되는 것을 관찰할 수 있었다 (이 경우, 세포 전체의 생존율에는 변화가 없었다. 그러나 BV-2 신경교세포에서 특정 농도의 트리신을 전처리하는 것은 농도 의존적으로 LPS에 의해 자극을 받은 일산화질소(NO)의 증가를 억제하였으며(도 11의 A), mRNA와 단백질 수준에서 iNOS의 발현도 억제하였다(도 11의 B, C).
LPS 자극을 준 BV-2 신경교세포에서 PGE2 및 COX-2 발현에 대한 유효성분인 트리신(Tricin)의 효과
아라키돈산으로부터 합성되어 염증을 유도하는 PGE2의 발현을 확인하기 위하여 prostaglandin E2 parameter assay kit (R&D System, MN, USA)를 사용하였고, 제조사의 권장사용방법을 통하여 분석하였다. BCA protein 정량법을 통하여 정량을 진행하였다. 동일량의 단백질을 10% SDS-PAGE gel에 전기영동한 후, 0.45μm polyvinylidene fluoride (PVDF, Milipore)를 사용하여 gel에서 membrain으로 이동시켰다. 항체의 사용은 1차 항체로 anti-COX-2 (1:1000, Santa Cruz)으로 희석하여 4℃에서 Over-night 하고 2차항체로 Horseradish peroxidase (HRP)를 가지고 있는 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL kit (Pierce, CA)로 반응시키고, DAVINCH CAS-400SM(Davinch-K, Korea)를 사용하여 결과를 확인하였다. LPS를 BV-2 신경교세포에 처리할 경우, 대조군 대비 PGE2의 생성 및 COX-2 발현이 현저하게 증가되는 것을 관찰할 수 있었다. 그러나 BV-2 신경교세포에서 특정 농도의 트리신(Tricin)을 전처리하는 것은 농도 의존적으로 LPS에 의해 자극을 받은 PGE2 증가를 억제하였으며(도 12의 A 참조), mRNA와 단백질 수준에서 COX-2의 발현도 억제하였다(도 12의 B 및 C 참조).
따라서, 트리신(Tricin)은 LPS에 의한 신경염증 유도된 BV-2 신경교세포에서 항염증 효과를 나타냄을 알 수 있다.
LPS 자극을 준 BV-2 신경교세포에서 염증성 사이토카인의 생성에 대한 트리신의 효과
염증성 사이토카인의 생성의 증가는 뇌로 백혈구가 이동하는 것을 촉진시키는 케모카인의 분비, 부착분자의 유도 및 BBB(Blood Brain Barrier)의 파괴를 통해 CNS에서 염증발달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 따라서 1시간 동안 BV-2 신경교세포에 트리신을 2.5, 5, 10 μM으로 처리한 다음, 6시간 동안 LPS를 처리하였다. 세포 상층액을 제거하고, 세포에서 RNA를 동정하여 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 mRNA 발현량을 분석하였다.
BV-2 신경교세포를 LPS로 자극을 주면 TNF-α, IL-1β 및 IL-6와 같은 염증성 사이토카인의 레벨이 증가한다. 그러나, 트리신을 처리하면 이러한 사이토카인의 유전자 발현이 낮아지면서 농도의존적으로 사이토카인의 생성도 현저하게 억제되었다(도 13 참조). 이를 통해 트리신은 LPS에 의해 자극을 받은 염증성 사이토카인의 생성을 억제할 수 있다는 것을 확인하였으며, 이러한 억제는 전사단계에서 이루어짐도 알 수 있다.
LPS 자극을 준 BV-2 신경교세포에서 NF-κB 및 MPAK 활성화에 대한 트리신(Tricin)의 효과
LPS는 NF-κB 활성화를 통해 iNOS 유전자 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. 이에 트리신이 NF-κB 신호전달체계의 활성화를 억제하는지 알아보기 위하여, 트리신(Tricin)이 LPS에 의해 유도된 BV-2 신경교세포에서 세포질의 IκBα와 p65의 인산화 및 핵으로의 이동에 대한 어떤 효과를 나타내는지 조사하였다. 또한 또 다른 신경염증 신호기전인 MPAK 신호전달체계가 조절되는지를 확인하기 위하여, MAPK 물질인 ERK 및 p38의 인산화에 대한 트리신의 효과를 살펴보았다.
트리신은 LPS에 의해 유발된 세포질에서 핵으로 NF-κB 소단위체인 p65가 이동하는 것을 지연시켰고(도 14의 A), 트리신의 농도의존적으로 세포질에서 LPS에 의해 유발된 IκBα와 p65의 인산화를 감소시키는 것을 확인하였다(도 14의 B).
또한 트리신은 농도의존적으로 LPS에 의해 유도된 ERK 및 p38의 인산화를 약화시켰다(도 14의 C 및 D).
따라서, BV-2 신경교세포에서 트리신에 의해 NO 생성과 염증성 사이토카인의 생성이 억제되는 것이 NF-κB와 MAPK 신호전달체계의 차단을 통해 연결되어 있을 수 있다는 것을 알 수 있다.
MPTP로 유도된 도파민 신경세포사 마우스모델에서 유효성분 트리신의 도파민 신경세포사 억제 효능
MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine)는 CNS에서 미세아교세포의 활성화를 유발할 수 있는 신경염증 및 도파민성 신경변성을 유도할 수 있는 신경독소로 널리 알려져 있다. 도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 MPTP에 의해 유도된 신경염증에 대한 트리신의 신경보호 효과를 분석하였다. 중내 뇌의 SNpc (Substantia Nigra pars compacta, 흑질)와 STR (Striatum, 선조체)에서 MPTP에 의해 유도된 도파민 신경세포의 손실은 TH(Tyrosine Hydroxylase, 타이로신 하이드록실아제)에 염색된 신경세포를 측정함으로써 분석하였다. MPTP의 주입은 SNpc와 STR의 도파민 신경세포 수와 신경섬유를 현저히 감소시켰고, TH의 발현도 감소시킴을 확인하였다. 그러나, 트리신을 구강 내로 투여하면 MPTP에 의해 유도된 도파민신경세포의 손실을 감소시키고 TH의 손실도 감소시킬 수 있었다(도 15 및 도 16 참조). 따라서, 트리신이 MPTP로 유도된 신경염증을 억제함으로서 신경세포를 보호한다는 것을 확인할 수 있었다.
MPTP로 유도된 도파민 신경세포사 마우스모델에서 유효성분 트리신(Tricin)의 행동장애 개선 효능
도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetr
ahydropyridine)-유발성 신경염증에 대한 트리신의 행동개선 효능을 확인하였다. MPTP에 의해 유도된 행동력 저해는 Rota-Rod와 Pole test를 이용함으로써 관찰하였다. 행동력 저해는 마우스의 하강에 걸리는 시간(latency to fall), 이동 거리(Distance travelled), 지연시간(latency time)으로 나누어 판단하였다. MPTP의 주입은 마우스 행동력을 억제시키지만, 트리신을 구강 내 주입하면 MPTP에 의해 유도된 행동력 억제를 감소시켰다(도 17 참조). 이러한 실험 결과를 통해, 트리신이 MPTP 투여로 유발된 행동력 저해를 억제한다는 것을 알 수 있었다.
MPTP로 유도된 도파민 신경세포사 마우스모델에서 유효성분 트리신의 신경염증 억제 효과
도파민 신경세포사의 마우스 모델에서 MPTP(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetr
ahydropyridine)에 의해 유도되는 신경염증에 대한 트리신의 신경염증 억제효과를 분석하였다. STR에서 MPTP에 의해 유도된 신경염증은 iNOS(도 18의 A 및 B)와 COX-2(도 18의 C 및 D)를 측정함으로써 관찰하였다. 도 18의 A 및 B를 참조하면, 트리신의 처리시 파킨슨병 마우스 모델에서 iNOS의 생성이 감소하였으며, 도 18의 C 및 D를 참조하면 트리신의 처리 시 파킨슨병 마우스 모델에서 COX-2의 생성이 억제되었다. MPTP의 주입은 신경염증을 촉진시키지만, 트리신을 구강 내 주입하면 MPTP에 의해 유도된 신경염증을 감소시켰다. 이에 따라, 트리신이 MPTP로 유도된 신경염증을 억제한다는 것을 알 수 있다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (17)
- 죽엽 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는,
신경염증의 예방, 치료 또는 기억력 및 인지 기능 개선용 약학적 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 죽엽 에탄올 추출물은 트리신을 유효성분으로 함유하는, 신경염증의 예방, 치료 또는 기억력 및 인지 기능 개선용 약학적 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 죽엽 에탄올 추출물은 신경세포에서 일산화질소(NO)가 생성되는 것을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경염증의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선용 약학적 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 죽엽 에탄올 추출물은 아세틸콜린에스터라아제의 활성을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경염증의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선용 약학적 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 죽엽 에탄올 추출물은 트리신을 총 조성물에 1 내지 50 ㎍/ml의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 신경염증의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선용 약학적 조성물. - 제5 항에 있어서,
상기 트리신은 신경세포에서 IκBα또는 p65의 인산화를 감소시켜 NF-κB 활성화를 감소시키는 것을 특징으로 하는 신경염증의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선용 약학적 조성물. - 제6 항에 있어서,
상기 트리신은 신경세포에서 ERK(extracellular signal regulated kinase)또는 p38(p38 MAP kinase)의 인산화를 감소시켜 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 활성화를 감소시키는 것을 특징으로 하는 신경염증의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선용 약학적 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 신경염증의 예방 또는 치료는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 경도인지장애 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 질환을 예방 또는 치료하는 것인, 신경염증의 예방, 치료 또는 인지 기능 개선용 약학적 조성물. - 죽엽 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, 신경염증 또는 인지 기능 개선용 식품 조성물.
- 제9 항에 있어서,
상기 죽엽 에탄올 추출물은 트리신을 유효성분으로 포함하는, 신경염증 또는 인지 기능 개선용 식품 조성물. - 제9 항에 있어서,
상기 죽엽 에탄올 추출물은 트리신을 총 조성물에 1 내지 50 ㎍/ml농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 신경염증 또는 인지 기능 개선용 식품 조성물. - 제10 항에 있어서,
상기 신경염증의 개선은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 경도인지장애 및 다발성 경화증으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나의 질환의 병태를 개선하는 것인, 신경염증 또는 인지 기능 개선용 식품 조성물. - 죽엽 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는, 인지기능장애 개선용 식품 조성물.
- 제13 항에 있어서,
상기 인지기능장애는 건망증(Anmesia), 추론능력의 상실, 망각, 학습장애, 집중력 저하, 지능의 저하로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나인, 인지기능장애 개선용 식품 조성물. - 제13 항에 있어서,
상기 조성물의 섭취대상은 기억력 감퇴 환자인, 인지기능장애 개선용 식품 조성물. - 제15 항에 있어서,
상기 기억력 감퇴는 콜린성 시스템(cholinergic system)의 손상 및 소실에 의한 것인, 인지기능장애 개선용 식품 조성물. - 제13 항에 있어서,
상기 죽엽 에탄올 추출물은 트리신을 유효성분으로 포함하는, 인지기능장애 개선용 식품 조성물.
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