KR20160071156A - 황칠나무 추출물을 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세아교세포(microglia)에서 발생하는 신경독소 인자 또는 염증성 사이토카인의 생성 감소를 통해 신경 염증 질환을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 황칠나무 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 신경염증과 관련된 미세아교세포의 활성을 효과적으로 억제하므로, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증 등과 같은 신경 염증 질환의 예방 또는 치료제 또는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명의 황칠나무 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 신경염증과 관련된 미세아교세포의 활성을 효과적으로 억제하므로, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증 등과 같은 신경 염증 질환의 예방 또는 치료제 또는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 유용하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 미세아교세포(microglia)에서 발생하는 신경독소 인자 또는 염증성 사이토카인의 생성 감소를 통해 신경 염증 질환을 보다 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있는 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것이다.
염증 반응은 조직(세포)의 손상이나 외부감염원(박테리아, 곰팡이, 바이러스, 다양한 종류의 알레르기 유발물질)에 감염되었을 때 국소 혈관과 체액 중 각종 염증 매개인자 및 면역세포가 관련되어 효소 활성화, 염증매개물질 분비, 체액 침윤, 세포 이동, 조직 파괴 등 일련의 복합적인 생리적 반응과 홍반, 부종, 발열, 통증 등 외적 증상을 나타낸다. 정상인 경우 염증 반응은 외부감염원을 제거하고 손상된 조직을 재생하여 생명체 기능회복작용을 하지만, 항원이 제거되지 않거나 내부물질이 원인이 되어 염증반응이 과도하거나 지속적으로 일어나면 오히려 점막손상을 촉진하고, 그 결과 일부에서는 암 발생 등의 질환을 이끈다.
최근 염증반응이 신경퇴행을 유발하는 주요 기전의 하나라는 사실이 밝혀지고 있다. 미세아교세포(microglia)는 중추신경계(Central Nervous System; CNS)에서 일차적인 면역 기능을 수행하는 세포로서, 가늘고 긴 가지와 얇은 세포체의 모양을 유지하고 있다가 외부에서 유입되거나 내부에서 발생하는 독소들이 존재하게 되면 이들 독소로부터 신경 세포를 보호하기 위해 굵고 짧은 가지와 둥근 모양 형태의 세포체를 가지는 활성화된 모양으로 변화하게 된다. 활성화된 미세아교세포는 정상 상태의 미세아교세포와는 달리 포식작용을 활발히 하고, 세포증식을 하며, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등과 같은 사이토카인, 케모카인, iNOS(inducible nitric oxide synthase), COX-2(cyclooxygenase-2) 등의 유전자를 발현시켜 염증매개물질들을 생성한다. 미세아교세포의 활성화는 손상된 세포를 제거하고 외부에서 침입하는 박테리아나 바이러스로부터 신경세포를 보호하는 일면이 있으나 과도하게 발현이 증가한 iNOS에 의해 생성되는 일산화질소와 COX-2에 의해 생성되는 프로스타글란딘들, TNF-α 등은 신경세포에도 독성을 나타내기 때문에 결과적으로 미세아교세포의 활성화는 신경세포의 손상을 악화시키게 된다. 또 사멸 중인 신경세포가 방출하는 물질들이 미세아교세포의 활성을 다시 유발하게 되므로, 신경퇴행은 지속적인 악순환에 빠지게 된다. 실제로 미세아교세포의 활성이 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병(Creutzfelt-Jakob Disease, CJD), 다발성 경화증 등의 다양한 퇴행성 신경질환과 관계가 있음이 보고되었다.
미세아교세포의 활성화 물질로는 박테리아의 내독소인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)와 인터페론-γ, 베타아밀로이드, 갱글리오사이드 등이 있다. 미세아교세포의 활성화에 관여하는 신호 전달 체계로는 MAPK. PKC, ROS, NF-kB 등이 있다. 마이토젠 활성화 단백질(mitogen-activatied protein, MAP) kinase family는 세포내의 신호 전달 매개체로서 핵심적인 단백질이며 인체에서의 다양한 염증반응, 사멸, 세포 분화, 성장 등의 세포외 신호에 반응하여 활성화되어 전사인자를 활성화시켜 필요한 유전자들의 전사를 조절한다. MAP kinase family는 Erk(extracellular signal regulated kinase), JNK(c-jun N-terminal kinase), p38 MAP kinase 등 3가지가 알려져 있다. Erk는 세포의 성장과 밀접한 관계를 보이고 있으며 많은 세포 성장 인자에 의해서 조절 받는다. JNK 및 p38 MAP kinase는 대부분의 염증 반응, 세포 스트레스 신호, 세포 사멸 신호 등과 밀접한 관계가 있다.
활성화된 미세아교세포에서 발현되는 iNOS와 TNF-α, COX-2 유전자들의 프로모터에는 공통적으로 NF-kB가 결합하는 부분이 있으며, NF-kB의 활성화에 의해 이들 유전자의 발현이 조절된다. 베타아밀로이드와 LPS가 미세아교세포에서 NF-kB를 활성화시킨다는 것이 알려져 있으며, 갱글리오사이드와 트롬빈 역시 미세아교세포에서 NF-kB를 활성화시킨다. 이들 활성화물질에 의한 NF-kB의 활성화는 15분 이내에 일어나 염증성 사이토카인의 생성을 촉진한다.
미세아교세포의 활성화와 퇴행성 신경질환의 관계에 대해서는 아직 완전히 밝혀지지 않았으나, 일반적으로 미세아교세포의 활성이 퇴행성 신경질환의 발병과 진행에 관련되어 있다고 받아들여지고 있다. 그러므로 미세아교세포의 활성을 억제하는 것은 퇴행성 신경질환의 진행을 완화시킬 수 있는 효과적인 치료법이 될 것이다.
한편, 황칠나무(Dendropanax morbifera Lev.)는 두릅나무과에 속하는 식물로써 세계에서 오직 한국의 해남, 완도와 같은 남부 해안 일부 지역과 제주도에서만 자생하는 상록 활엽교목이다. 황칠나무의 수피에 상처를 주면 황색의 수지액이 나오는데 이것으로 황칠(黃漆)이라고 한다. 본초 강목에서는 황칠나무가 번열을 제거하고, 안질 및 화상치료에 효과가 있다고 알려졌으며, 최근 들어서는 황칠나무의 잎이 항암 작용에 효능이 있으며 또한 항산화 작용 및 신경 안정작용이 있는 것으로 보고되었으며, 또한, 황칠나무 추출물이 피부의 멜라닌 색소를 생성하는 타이로시나아제를 불활성화 시켜 피부 미백에 도움을 준다고 알려져 있다. 황칠나무는 비휘발 성분 66.7%, 방향성분 10.8%, 수분 8.1% 및 고형분이 14.4% 로 구성되어 있으며 특히 방향성분은 주로 β-쿠베벤(cubebene), γ-셀리넨(selinene), δ-카디넨(cadiene)으로 이루어져 있다고 보고되고 있다.
최근, 약용 식물로부터 분리된 천연 화합물은 다양한 인간의 치료에 연구되고 있다. 식물 생성물은 일반적으로 화학적으로 합성된 의약품보다 부작용 및 독성이 낮으므로, 식물 유래 물질은 신경염증을 포함하는 많은 질병의 치료에 생화학 활성제로 주목받고 있다.
이에 본 발명자들은 미세아교세포의 활성을 효과적으로 억제하는 천연물질을 선별하기 위해 예의 노력한 결과, 황칠나무 추출물이 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, LPS에 의해 활성화된 미세아교세포에서 종양괴사 인자-α(TNF-α; tumor necrosis factor-alpha), 일산화질소(NO; nitric oxide) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)와 같은 염증성 사이토카인의 증가를 현저하게 억제하고, MAPK(mitogen-activated protein kinases)의 인산화 및 NF-κB(nuclear factor-kappaB)의 활성을 감소시켜, 효과적으로 미세아교세포에 의해 발생하는 신경염증을 감소시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 두번째 해결하려는 과제는, 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상술한 본 발명의 과제를 해결하기 위하여 본 발명은, 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 신경염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 포함한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎으로부터 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 황칠나무 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부탄올 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출한 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 황칠나무 추출물은 총 조성물에 1 내지 100 ㎍/㎖ 농도로 포함될 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 황칠나무 추출물은 신경계의 면역세포인 미세아교세포(microglia)의 활성을 억제하거나, 활성화된 미세아교세포가 신경세포에 미치는 손상에 대하여 보호 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 황칠나무 추출물은 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염증성 사이토카인 또는 일산화질소(NO; nitric oxide)의 생성을 억제할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 황칠나무 추출물은 Erk(extracellular signal regulated kinase), JNK(c-jun N-terminal kinase) 및 p38(p38 MAP kinase)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 MAPK(mitogen-activated protein kinases)의 인산화를 억제하거나, NF-κB(nuclear factor-kappaB)의 활성을 감소시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 신경 염증 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 황칠나무 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, LPS에 의해 활성화된 미세아교세포에서 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha), 일산화질소(NO; nitric oxide) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)와 같은 염증성 사이토카인의 증가를 현저하게 억제하고, MAPK(mitogen-activated protein kinases)의 인산화 및 NF-κB(nuclear factor-kappaB)의 활성을 감소시켜 신경염증과 관련된 미세아교세포의 활성을 효과적으로 억제하므로, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증 등과 같은 신경 염증 질환의 예방 또는 치료제 또는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 황칠헥산가용성 추추물(DMLH; A 및 D), 황칠수포화부탄올가용성 추출물(DMLB; B 및 E) 및 황칠클로로포름가용성 추출물(DMLC; C 및 F)에 의한 미세아교세포인 BV2 세포의 생존율(A, B 및 C) 차이 및 일산화질소(NO) 생성량 변화(D, E 및 F)를 확인한 데이터이다.
도 2는 본 발명의 황칠나무 에틸아세테이트 가용성 추출물에 의한 미세아교세포인 BV2 세포의 일산화질소(NO) 생성량 변화(A) 및 세포 생존율(B)을 확인한 데이터이다.
도 3은 본 발명의 황칠나무 추출물에 의한 미세아교세포인 BV2 세포의 TNF-α(A) 및 IL-6(B)의 생성량 변화를 확인한 데이터이다.
도 4는 미세아교세포인 BV2 세포를 LPS로 자극하였을 때, 시간에 따른 p38(A 및 B), JNK(C 및 D) 및 Erk(E 및 F)의 인산화 정도를 확인한 데이터이다.
도 5는 본 발명의 황칠나무 추출물에 의한 미세아교세포인 BV2 세포의 p38(A 및 B), JNK(C 및 D) 및 Erk(E 및 F)의 인산화 억제효과를 확인한 데이터이다.
도 6은 본 발명의 황칠나무 추출물에 의한 미세아교세포인 BV2 세포의 NF-κB 활성 억제효과를 확인한 데이터이다.
도 2는 본 발명의 황칠나무 에틸아세테이트 가용성 추출물에 의한 미세아교세포인 BV2 세포의 일산화질소(NO) 생성량 변화(A) 및 세포 생존율(B)을 확인한 데이터이다.
도 3은 본 발명의 황칠나무 추출물에 의한 미세아교세포인 BV2 세포의 TNF-α(A) 및 IL-6(B)의 생성량 변화를 확인한 데이터이다.
도 4는 미세아교세포인 BV2 세포를 LPS로 자극하였을 때, 시간에 따른 p38(A 및 B), JNK(C 및 D) 및 Erk(E 및 F)의 인산화 정도를 확인한 데이터이다.
도 5는 본 발명의 황칠나무 추출물에 의한 미세아교세포인 BV2 세포의 p38(A 및 B), JNK(C 및 D) 및 Erk(E 및 F)의 인산화 억제효과를 확인한 데이터이다.
도 6은 본 발명의 황칠나무 추출물에 의한 미세아교세포인 BV2 세포의 NF-κB 활성 억제효과를 확인한 데이터이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 활성화된 미세아교세포는 정상 상태의 미세아교세포와는 달리 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등과 같은 사이토카인 및 일산화질소 등의 염증매개물질들의 생성을 증가시키고, 마이토젠 활성화 단백질(mitogen-activatied protein, MAP) 및 NF-κB를 활성화시켜 신경세포의 손상을 악화시키게 되어 다양한 신경 염증 질환을 유발하게 되는 문제점이 있다.
본 발명은 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 또는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해 활성화된 미세아교세포에서 발생하는 염증매개물질들의 생성을 현저하게 억제하고, 마이토젠 활성화 단백질(mitogen-activatied protein, MAP) 및 NF-kB의 활성을 현저하게 억제하여 보다 효과적으로 신경 염증성 질환을 예방 또는 치료하는 효과가 있다.
따라서, 본 발명은 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎으로부터 추출한 것일 수 있다. 황칠나무의 잎, 줄기, 뿌리 및 종자 등 황칠나무의 모든 부위를 사용할 수 있지만, 황칠나무 잎 이외에 다른 부분은 신경 염증 억제 효능이 미흡할 수 있어 황칠나무 잎을 사용하는 것이 가장 바람직하다.
상기 황칠나무 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부탄올 또는 헥산 등의 단독 또는 혼합 형태인 용매로 추출할 수 있으며, 보다 바람직하게는 에틸아세테이트을 사용할 수 있다. 상기 용매를 이용한 일반적인 용매 추출법을 적용하여 추출할 수 있으며, 또한 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 정제한 분획물일 수도 있다. 본 발명에 따른 추출물의 제조방법은 본 기술분야에 속하는 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 식물 추출방법을 모두 적용할 수 있으며, 예컨대 물, 알코올 또는 혼합용매에 의한 추출, 중탕이나 상온에 의한 추출법 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 일양태에서는 헥산(hexan), 부탄올(butanol), 클로로포름(chloroform) 및 에틸아세테이트(ethyl acetate)를 용매로 사용하여 황칠나무 잎 추출물을 추출하였으며, 에틸아세테이트를 사용하여 추출하였을 경우, 부탄올, 클로로포름 또는 헥산 등의 다른 용매에 비해 활성화된 미세아교세포의 신경염증 활성을 보다 효과적으로 억제하는 것을 확인하였다.
본 발명의 일실시예에서, 각 추출물에 대한 신경염증 억제 효과를 알아보기 위해 쥐 유래 미세아교세포인 BV2 세포에 황칠나무 추출물을 전처리한 다음, LPS로 BV2세포를 자극시켜 LPS 자극에 의해 발생되는 염증매개성 물질들의 생성 억제 효능 및 세포독성 여부를 관찰하였다.
내독소로 잘 알려진 LPS(lipopolysaccharide)는 대식세포의 활성화에 관여하는 가장 잘 알려진 외부인자로서, 특히 RAW 264.7 세포와 같은 대식세포나 단핵세포에서 TNF-α(tumor necrosis factor-alpha), IL-6(interleukin-6), IL-1β(interleukin-1 beta)와 같은 전염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)을 분비하여 염증부위에서 증가되는 것으로 알려져 있다. 또한, LPS가 대식세포를 자극하게 되면 iNOS(inducible nitric oxide synthase)라는 효소에 의해 L-알기닌이 L-시트룰린으로 변하는 과정에서 일산화질소(NO)가 생성됨으로써 대식세포로부터 NO가 생성된다. 포유동물에서 NO는 세 가지 종류의 NO 합성효소(NOS, nitric oxide synthase), 즉 nNOS(neuronal NOS), eNOS(endothelial NOS) 및 iNOS(inducible NOS)에 의해 합성된다. 이 중에서 nNOS와 eNOS에 의해 생성되는 NO는 정상적인 생체기능을 위해 생성되며, 조직 내에서의 농도는 일정수준으로 낮게 유지된다. 그러나 iNOS에 의해 생성된 NO는 과도하게 생성되어 병리적인 혈관확장, 세포독성, 조직 손상 등과 같은 생체에 유해한 작용을 나타낸다.
도 1A 및 도 1C에 나타난 바와 같이, 황칠헥산가용성 추출물(DMLH), 황칠클로로포름가용성 추출물(DMLC)을 50 ㎍/㎖ 이상 처리한 샘플에서는 세포독성이 관찰되었고, 도 1B와 도 2A에 나타난 바와 같이 황칠에틸아세테이트가용성 추출물 (DMLE), 황칠부탄올가용성 추출물(DMLB) 또는 LPS에 의한 세포독성은 관찰되지 않았다.
또한, 도 1D 내지 도 1F 및 도 2A에 나타난 바와 같이, 추출 용매와 관계없이 네 종류의 황칠나무 잎 추출물을 처리했을 때, 처리 농도 의존적으로 일산화질소의 생성이 감소하는 것을 확인하였으며, 황칠나무 잎 추출물을 1 내지 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 경우 LPS로 자극된 대조군에 비해 약 10 내지 85% 정도 일산화질소의 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 그 중 황칠에틸아세테이트가용성 추출물 (DMLE)의 일산화질소 감소 효과가 가장 두드러지게 나타난 것을 확인하였다
본 발명의 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 상기 황칠나무 추출물을 1 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 포함할 수 있다. 상기 조성물의 용매로는 황칠나무 추출물의 신경염증 억제 효과를 방해하지 않는 것이라면 특별히 제한되지 않으나, 보다 바람직하게는 물, 에탄올, 프로필 알코올, DMSO 등일 수 있다. 상기 황칠나무 추출물 조성물의 농도가 1 ㎍/㎖ 미만일 경우 미세아교세포의 염증매개물질들의 생성 저해 효과가 미흡하여 신경염증 억제 효능이 떨어질 수 있다. 또한, 100 ㎍/㎖보다 더 높은 양의 황칠나무 추출물이 포함될 수는 있지만, 상기 범위로도 충분한 신경염증 억제 활성을 확인할 수 있으며, 100 ㎍/㎖를 초과할 경우 농도 증가로 인한 효능의 향상이 적어 효율이 떨어지는 문제점이 있을 수 있다. 세포독성 효과가 없으면서 우수한 신경염증 억제 효능을 나타내는 황칠나무 추출물 조성물의 농도는 보다 바람직하게는 10 내지 100 ㎍/㎖일 수 있다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 황칠나무 추출물은 신경세포의 면역세포인 미세아교세포(microglia)의 활성을 억제할 수 있으며, 활성화된 미세아교세포가 신경세포에 미치는 손상에 대하여 보호 효과를 나타낼 수 있다.
상기 황칠나무 추출물은 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha) 또는 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)의 염증성 사이토카인 및 일산화질소(NO; nitric oxide)의 증가를 억제할 수 있으며, Erk(extracellular signal regulated kinase), JNK(c-jun N-terminal kinase) 및 p38(p38 MAP kinase)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 MAPK(mitogen-activated protein kinases) 또는 NF-κB(nuclear factor-kappaB)의 활성을 감소시킬 수 있다.
도 2A에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎 추출물을 농도별로 전처리하였을 때, LPS에 의해 자극된 BV2 세포에서 생성되는 일산화질소의 농도를 측정한 결과, 황칠나무 잎 추출물 처리 농도 의존적으로 일산화질소의 생성이 감소하는 것을 확인하였으며, 황칠나무 잎 추출물을 1 내지 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 경우 LPS로 자극된 대조군에 비해 약 10 내지 85% 정도 일산화질소의 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 또한, 상기와 같은 조건에서 황칠나무 잎 추출물에 의한 세포독성을 확인한 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이 황칠나무 잎 추출물 또는 LPS에 의한 세포독성은 관찰되지 않았다.
황칠나무 잎 추출물을 농도별로 전처리하였을 때, LPS에 의해 자극된 BV2 세포에서 생성되는 TNF-α 및 IL-6의 농도를 측정한 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎 추출물 처리 농도 의존적으로 TNF-α 및 IL-6의 생성을 억제하는 것을 확인하였다. 황칠나무 잎 추출물을 10 내지 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 경우 TNF-α 및 IL-6 각각 LPS로 자극된 대조군에 비해 약 60 내지 85% 및 약 30 내지 85% 정도 생성이 감소하는 것을 확인하였다.
또한, 본 발명의 일실시예에서 실시예 3과 동일한 방법으로 황칠나무 추출물에 의한 LPS로 자극된 BV2 세포의 MAPK의 활성 억제 효능을 관찰하였다.
MAPK(mitogen-activatied protein kinase)는 세포 내의 신호 전달 매개체로서 핵심적인 단백질이며 인체에서의 다양한 염증반응, 사멸, 세포 분화, 성장 등의 세포외 신호에 반응하여 활성화되어 전사인자를 활성화시켜 필요한 유전자들의 전사를 조절하며, Erk(extracellular signal regulated kinase), JNK(c-jun N-terminal kinase), p38 MAP kinase 등 3가지가 알려져 있다. Erk는 세포의 성장과 밀접한 관계를 보이고 있으며 많은 세포 성장 인자에 의해서 조절 받는다. JNK 및 p38 MAP kinase는 대부분의 염증 반응, 세포 스트레스 신호, 세포 사멸 신호 등과 밀접한 관계가 있다.
먼저, LPS 자극에 의해 BV2 세포에서 MAPK(mitogen-activated protein kinases) 활성 변화가 발생하는지 확인하기 위해 LPS 처리 후 시간 변화에 따른 p38(p38 MAP kinase), JNK(c-jun N-terminal kinase) 및 Erk(extracellular signal regulated kinase)의 인산화 정도를 측정하였다. 도 4에 나타난 바와 같이, LPS 자극에 의해 BV2 세포에서 p38(도 4A 및 B), JNK(도 4C 및 D) 및 Erk(도 4E 및 F)의 인산화가 각각 5배, 10배, 2.5배 증가하는 것을 확인하였다.
하지만, 도 5에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎 추출물을 전처리한 다음, LPS로 BV2를 자극시킨 경우, LPS로 자극된 대조군에 비해 p38, JNK 및 Erk의 인산화가 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 p38 및 JNK의 인산화가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.
p38 및 JNK의 경우, 황칠나무 잎 추출물을 처리하였을 경우 LPS로 자극된 대조군에 비해 각각 약 40 내지 50%(도 5A 및 B) 및 약 80 내지 90%(도 5C 및 D) 정도 인산화가 감소되는 것을 확인하였으며, Erk의 경우, 황칠나무 잎 추출물을 처리하였을 경우 LPS로 자극된 대조군에 비해 약 20 내지 25% 정도 인산화가 감소되는 것을 확인하였다 (도 5E 및 F).
또한, 본 발명의 일실시예에서 실시예 4와 동일한 방법으로 황칠나무 추출물에 의한 LPS로 자극된 BV2 세포의 NF-κB의 활성 억제 효능을 관찰하였다.
NF-κB는 염증에 중요한 전사인자로, NF-κB는 활성화된 미세아교세포에서 iNOS, TNF-α, COX-2 및 MARK 신호전달 기전을 포함하는 단백질의 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다.
도 6에 나타난 바와 같이, BV2에 LPS만을 처리한 경우 NF-κB 활성은 약 4배 이상 증가한 반면, 황칠나무 잎 추출물을 전처리한 경우에는 LPS로 자극된 대조군에 비해 약 40 내지 70% 정도 NF-κB 활성이 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 황칠나무 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 활성화된 미세아교세포에서 발생하는 염증 매개성 물질을 현저하게 감소시키고, MAPK의 인산화 및 NF-κB의 활성을 현저하게 감소시키는 효과가 있는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명의 황칠나무 추출물은 미세아교세포에 의해 발생하는 신경염증을 효과적으로 억제한다고 볼 수 있다. 따라서, 본 발명의 황칠나무 추출물은 신경염증과 관련된 미세아교세포의 활성을 효과적으로 억제하므로, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병, 다발성 경화증 등과 같은 신경 염증 질환의 예방 또는 치료제 또는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 유용하게 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물은 심경 염증을 억제 또는 감소시키는 다른 천연물질 또는 화합물을 추가로 포함할 수 있으며, 본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 여러 가지 제형으로 제제화 할 수 있다. 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제 및 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제제화할 수 있다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 및 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 황칠나무 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제(예를 들면, 전분, 수크로스, 락토오스 및 젤라틴) 등이 섞여 조제될 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등을 들 수 있는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 및 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함될 수 있다. 비수용성용제와 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 글리세롤 및 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여량은 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있다.
본 발명의 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 인체에 투여하는 경우, 천연 추출물인 관계로 다른 합성 의약품에 비하여 부작용의 우려가 적어 안심하고 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 황칠나무 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 포함하는 건강기능식품의 종류는 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등일 수 있다.
상기 건강식품은 상기 황칠나무 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 예를 들어, 상기 황칠나무 추출물을 유효 성분으로 함유하는 신경 염증 질환 예방용 음료는 황칠나무 추출물이 유효성분으로 포함되는 것 이외에 칼슘, 가시오가피 농축액, 액상과당, 정제수 등을 첨가 혼합하여 드링크용 병에 충진하여 살균한 후 실온으로 냉각하여 음료를 제조할 수 있다. 또한, 상기 황칠나무 추출물을 유효 성분으로 함유하는 신경 염증 질환 예방용 건강보조제는 황칠나무 추출물에 영양보조성분(비타민 B1, B2, B5, B6, E 및 초산에스테르, 니코틴산 아미드), 올리고당, 50% 에탄올, 정제수를 첨가 혼합하여 과립상으로 성형하여 진공건조기에서 건조시킨 후, 12~14 메쉬(mesh)를 통과시켜 균일하게 과립을 제조하여 적당량씩 압출 성형하여 정제 또는 분말로 하거나 경질캡슐에 충전하여 경질캡슐제품으로 제조할 수 있다.
상기 건강식품에 함유된 상기 황칠나무 추출물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으며, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.
이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.
황칠나무 추출물 조성물 제조
마른 황칠잎 (Dendropanax morbifera, DM, 390 g)에 70% 메탄올을 가하고 3시간 동안 환류추출하여 추출액을 수득하였다. 추출과정을 3회 반복하여 회수된 추출액을 농축하여 얻어진 황칠 추출물 잔사를 물에 현탁시킨 후, 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 수포화부탄올(n-부탄올을 증류수로 포화시킨 것)을 이용하여 순차적으로 추출하였다. 각 추출액을 농축시켜 황칠헥산가용성 추출물(DMLH), 황칠클로로포름가용성 추출물(DMLC), 황칠에틸아세테이트가용성 추출물(DMLE), 황칠부탄올가용성 추출물(DMLB)을 제조하였다. 제조된 추출물의 회수율은 각각 1.4%, 0.8%, 0.7%, 4.6% (w/w)였다.
얻어진 상기 황칠나무 추출물은 용매 DMSO에 100 ㎎/㎖ 농도로 녹여 황칠나무 추출물 조성물을 제조하였다.
황칠나무 추출물에 의한 일산화질소
감소능
확인 및 세포독성 확인
2-1 : 세포배양 및
LPS
자극
쥐 유래 미세아교세포인 BV2 세포주는 미세아교세포의 여러 특성을 가지고 있어, 미세아교세포 활성 메커니즘을 조사하기 위해 주로 사용되며, 본 발명에서도 황칠나무 추출물이 미세아교세포에서 신경염증을 억제할 수 있는지 확인하기 위해 BV2 세포를 사용하였다.
먼저, BV2 미세아교세포는 미국 피츠버그 대학(University of Pittsburg)의 Dr. Michael Zigmond 실험실에서 받았으며 5% FBS(fetal bovine serum; Hyclone, 미국) 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin; Hyclone, 미국)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium; Hyclone, 미국)을 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
상기에서 배양한 BV2 세포를 6-, 24- 또는 96-웰 플레이트(6-, 24-, 96-well plate)에 1 ×105개/㎖의 세포가 되도록 접종한 다음, 37℃, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하였다. BV2 세포의 자극은 LPS(lipopolysaccharide; Calbiochem, 미국)을 100 ng/㎖ 농도로 BV2 세포에 처리한 다음, 24시간 동안 배양하였으며, 실시예 1에서 제조한 황칠나무 추출물은 각각 0, 1, 10, 50, 100 ㎍/㎖ 농도로 LPS 처리하기 한 시간 전에 전처리(pretreatment) 하였다.
황칠나무 추출물 전처리 없이 LPS로 자극시킨 BV2 세포를 양성대조군으로 하였으며, LPS 자극 없이 아무것도 처리하지 않은 군, LPS 자극 없이 DMSO를 처리한 군 및 LPS 자극 없이 각각의 황칠나무 추출물을 처리한 군을 음성대조군으로 하였다.
이후의 실험에서 각 그룹 간의 차이는 t-테스트로 분석하였다. 집단 간의 다중 비교는 사후 Scheffe'의 시험과 분산의 한 방법 분석(ANOVA)에 의해 수행되었다. 통계 분석은 그래프 패드 프리즘 (그래프 패드 소프트웨어, 미국)를 사용하여 수행하였다.
2-2 : 일산화질소 감소 효과 확인
상기 실시예 2-1에서 황칠나무 추출물에 의한 신경염증 억제 효과를 확인하기 위해 BV2세포에서 생성하는 이산화질소(nitric oxide; NO)의 농도를 측정하였다.
이산화질소(nitric oxide; NO)의 농도는 LPS 처리 24시간 후에 Griess 시약(0.1% naphthylethylenediamine, 1% sulfanylamide 및 2.5% H3PO4; Promega, 미국)의 발색반응을 이용하여 상등액에 포함된 산화질소 대사물인 아질산염(nitrite (NO2-)의 축적 수준을 측정하여 결정하였다. 흡광도는 마이크로플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 1D, E, F및 도 2A에 나타난 바와 같이, 추출 용매와 관계없이 네 종류의 황칠나무 잎 추출물을 처리했을 때, 처리 농도 의존적으로 일산화질소의 생성이 감소하는 것을 확인하였으며, 황칠나무 잎 추출물을 1 내지 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 경우 LPS로 자극된 대조군에 비해 약 10 내지 85% 정도 일산화질소의 생성이 감소하는 것을 확인하였다. 그 중 황칠에틸아세테이트가용성 추출물(DMLE)의 일산화질소 감소 효과가 가장 두드러지게 나타난 것을 확인하였다.
2-3 : 황칠나무 추출물의 세포독성 확인
황칠나무 추출물의 세포독성 확인은 실시예 2-1의 방법과 동일한 방법으로 세포를 배양한 다음, BV2 세포의 생존율을 측정하였다.
BV2세포의 생존율 측정은 CellTiter-Blue® Cell Viability assay (Promega, cat. No G8080, 미국)을 사용하여 매뉴얼을 참고로 수행하였다. 상기 측정법은 증식, 세포독성 또는 약제감수성 측정에서 살아있는 세포의 수를 결정하기 위한 발색 분석 방법(colorimetric method)이다. 실시예 2-1와 동일한 방법으로 96-웰 플레이트에 배양한 세포에 LPS를 처리하여 24시간 배양한 다음, 10 ㎕의 CellTiter-Blue® Cell Viability assay 용액을 첨가한 후 1 내지 4시간 동안 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다. 형광은 마이크로플레이트 리더기(Spectra-MAX 190 microplate reader; Molecular Devices, 미국)를 이용하여 560/590nm에서 측정하였다.
그 결과, 도 1A, C에 나타난 바와 같이 황칠헥산가용성 추출물(DMLH), 황칠클로로포름가용성 추출물(DMLC)을 50 ㎍/㎖ 이상 처리한 샘플에서는 세포독성이 관찰되었고, 도 1B와 도 2A에 나타난 바와 같이 황칠에틸아세테이트가용성 추출물 (DMLE), 황칠부탄올가용성 추출물(DMLB) 또는 LPS에 의한 세포독성은 관찰되지 않았다.
이에 본 발명의 황칠나무 추출물 중 황칠에틸아세테이트가용성 추출물 (DMLE)이 세포에 독성을 나타내지 않고 일산화질소 감소 효과가 가장 두드러지는 것을 확인하여 이후 실험은 황칠에틸아세테이트가용성 추출물(DMLE)만으로 실험을 진행하였다.
황칠나무 추출물에 의한 염증성 매개물질
감소능
확인
염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 발현수준은 ELISA 키트(eBiosecence, 미국)을 이용하여 매뉴얼에 따라 측정하였다. 각 실험당 3개 웰을 측정하였으며, 적어도 3번 이상 반복되도록 각 조건별로 반복 실험하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎 추출물 처리 농도 의존적으로 TNF-α 및 IL-6의 생성을 억제하는 것을 확인하였다. 황칠나무 잎 추출물을 10 ㎍/㎖ 및 100 ㎍/㎖ 농도로 처리하였을 경우 TNF-α 발현수준은 양성 대조군에 비해 각각 약 60% 및 85%정도 감소하였으며, IL-6 발현수준은 약 30% 및 85%정도 감소하는 것을 확인하였다.
즉, 본 발명의 황칠나무 추출물 중 황칠에틸아세테이트가용성 추출물(DMLE)은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 활성화된 미세아교세포에서 발생하는 염증 매개성 물질을 현저하게 감소키는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명의 황칠나무 추출물은 미세아교세포에 의해 발생하는 신경염증을 효과적으로 억제한다고 볼 수 있다.
황칠나무 추출물에 의한 MAPK 활성 억제 확인
4-1 :
LPS
자극에 의한
MAPK
활성 정도 확인
LPS 자극에 의해 BV2 세포에서 MAPK(mitogen-activated protein kinases) 활성 변화가 발생하는지 확인하기 위해 LPS 처리 후 시간 변화에 따른 p38(p38 MAP kinase), JNK(c-jun N-terminal kinase) 및 Erk(extracellular signal regulated kinase)의 인산화 정도를 웨스턴블랏(western blot) 방법을 사용하여 측정하였다.
먼저, BV2 세포는 6-웰 크기의 세포배양용기(6-well plate)에 1 ×105개/㎖ 개의 세포로 접종한 다음, 37℃, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양한 다음, LPS를 100 ng/㎖ 농도 처리하였다. 그 후, LPS를 100 ng/㎖ 농도 처리한 BV2 세포는 시간별로(0, 15, 30, 60, 120 분) 회수한 다음, 1×프로테이즈 칵테일 저해제(1×protease cocktail inhibitors) 및 1×포스파테이즈 칵테일 저해제(1×phosphatase cocktail inhibitor; Thermo Scientific, 미국)가 포함된 세포 용해버퍼(lysis buffer; 250 mM sucrose, 50 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) in 20 mM Tris-HCL; pH 7.2)를 처리하여 얼음(-4℃)위에서 30분 동안 반응시켰다.
그 다음, 14,000rpm에서 15분 동안 원심분리하여 BV2세포를 제거하고, 세포용해물의 단백질 농도를 BCA 단백질 어세이 키트(BCA protein assay kit; Thermo Scientific, 미국)을 이용하여 측정하였다. 일반적으로 웨스턴블랏 분석을 위해 각 웰당 10~20 ㎍의 단백질을 로딩하여 SDS-PAGE를 수행하였으며, 단백질은 Trans-Blot SD Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell(Bio-Rad, 미국)을 사용하여 전기이동(electrotransfer)으로 PVDF 막(polyvinylidene fluoride membrane; Millipore, 미국)으로 옮겨졌다. 그 다음, PVDF 막을 5% 탈지분유가 포함된 TBST(tris buffered saline-0.1% Tween 20) 버퍼를 처리하여 1시간 동안 상온에서 블로킹하였다. 그 다음, 1차 항체(p38, p-p38, JNK, p-JNK, Erk, p-Erk; Cell Signaling Technology, 미국)를 처리하여 하룻밤 동안(대략적인 시간; 8~12시간) 반응시킨 다음 TBST로 세척하였다. 그 후 겨자무과산화효소가 결합된 이차항체(horseradish peroxidase conjugated secondary antibody)를 포함하는 블로킹 용액을 처리하여 1시간 동안 상온에서 반응시킨 다음, TBST로 세척하였다. 세척한 막을 화학발광 키트(enhanced chemiluminescence kit; Thermo Scientific, 미국)을 사용하여 매뉴얼에 따라 분석하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, LPS 자극에 의해 BV2 세포에서 p38(도 4A 및 B), JNK(도 4C 및 D) 및 Erk(도 4E 및 F)의 인산화가 각각 5배, 10배, 2.5배 증가하는 것을 확인하였다.
4-2 : 황칠나무 추출물에 의한
MARK
활성 억제 확인
황칠나무 추출물의 신경염증 억제 활성을 확인하기 위해 BV2 세포에서 LPS 자극에 의한 Erk, JNK 및 p38의 인산화를 웨스턴블랏으로 모니터링하였다.
BV2 세포는 6-웰 크기의 세포배양용기(6-well plate)에 1 ×105개/㎖ 개의 세포로 접종한 다음, 37℃, 5% CO2 조건에서 하룻밤 동안 배양하였다. 황칠나무 추출물은 10 ㎍/㎖ 농도로 LPS 처리 한 시간 전에 전처리하였으며, LPS는 100 ng/㎖ 농도로 처리하여 3시간 동안 배양한 다음, 세포를 회수하여 실시예 4-1과 동일한 방법으로 웨스턴블랏을 수행하였다.
그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 황칠나무 잎 추출물을 처리한 군은, LPS로 자극된 양성 대조군에 비해 p38, JNK 및 Erk의 인산화가 감소하는 것을 확인하였으며, 특히 p38 및 JNK의 인산화가 현저하게 억제되는 것을 확인하였다.
p38 및 JNK의 경우, 황칠나무 잎 추출물을 처리하였을 경우 LPS로 자극된 대조군에 비해 각각 약 40 내지 50%(도 5A 및 B) 및 약 80 내지 90%(도 5C 및 D) 정도 인산화가 감소되는 것을 확인하였으며, Erk의 경우, 황칠나무 잎 추출물을 처리하였을 경우 LPS로 자극된 대조군에 비해 약 20 내지 25% 정도 인산화가 감소되는 것을 확인하였다 (도 5E 및 F).
황칠나무 추출물에 의한 NF-κB 활성 억제 확인
실시예 1에서 제조한 황칠나무 추출물의 신경염증 억제 활성을 확인하기 위해, BV2 세포에서 NF-κB 전사활성을 NF-κB 루시퍼레이즈 리포터 어세이를 사용하여 측정하였다.
BV2 세포는 실시예 2-1과 동일한 방법으로 96웰 플레이트에 접종하여 하룻밤 배양하였다. 그 후, BV2 세포에 pGL4.32 NF-κB 루시퍼레이즈 리포터 벡터(luciferase reporter vector) 및 pGL4.74 레닐라 루시퍼레이즈(pGL4.74 Renilla luciferase; Promega, 미국)를 Amaxa(Lonza, 스위스)를 사용하여 함께 형질전환(co-transfection)시키고 매뉴얼에 따라 측정하였다.
레닐라 루시퍼레이즈는 형질전환 효율의 차이를 노멀라이제이션(Normalization) 시키기 위한 내부 컨트롤 리포터 벡터로 사용하였다. 형질전환 24시간 후에, 세포에 100 ng/㎖ LPS를 처리하여 3시간 동안 반응시켰다. 세포에 듀얼 루시퍼레이즈 용해버퍼(dual luciferase lysis buffer)로 용해시킨 다음, 10 ㎕의 세포용해액 각 웰에 분주하여 루미네센스 마이크로플레이트 리더(luminescence microplate reader) 및 듀얼 류시퍼레이즈 어세이 시스템(dual luciferase assay system; Promega, 미국)을 이용하여 측정하였다. 각 구조의 전사활성은 레닐라 루시퍼레이즈 활성에 대응하여 반딧불 루시퍼레이즈 활성(firefly luciferase activity)을 노멀라이제이션하여 계산하였으며, 각각은 아무것도 처리하지 않은 군을 기준으로 하여 계산되었다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, BV2에 LPS만을 처리한 경우 NF-κB 활성은 약 4배 이상 증가한 반면, 황칠나무 잎 추출물을 전처리한 경우에는 LPS로 자극된 대조군에 비해 약 40 내지 70% 정도 NF-κB 활성이 감소하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 황칠나무 추출물은 세포에 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라, 활성화된 미세아교세포에서 발생하는 염증 매개성 물질을 현저하게 감소시키고, MAPK의 인산화 및 NF-κB의 활성을 현저하게 감소시키는 효과가 있는 것을 확인하였으며, 이는 본 발명의 황칠나무 추출물은 미세아교세포에 의해 발생하는 신경염증을 효과적으로 억제한다고 볼 수 있다.
이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (16)
- 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎으로부터 추출한 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름, 부탄올 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 총 조성물에 10 내지 100 ㎍/㎖ 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 신경세포의 면역세포인 미세아교세포(microglia)의 활성을 억제하거나,
활성화된 미세아교세포가 신경세포에 미치는 손상에 대하여 보호효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염증성 사이토카인 또는 일산화질소(NO; nitric oxide)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 Erk(extracellular signal regulated kinase), JNK(c-jun N-terminal kinase) 및 p38(p38 MAP kinase)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 MAPK(mitogen-activated protein kinases)의 인산화를 억제하거나,
NF-κB(nuclear factor-kappaB)의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 신경 염증 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 황칠나무(Dendropanax Morbifera) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 황칠나무 잎으로부터 추출한 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 물, 알코올, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 헥산으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 총 조성물에 1 내지 100 ㎍/㎖ 농도로 포함된 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 신경세포의 면역세포인 미세아교세포(microglia)의 활성을 억제하거나,
활성화된 미세아교세포가 신경세포에 미치는 손상에 대하여 보호효과을 나타내는 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 종양괴사 인자-α (TNF-α; tumor necrosis factor-alpha) 및 인터루킨-6(IL-6; interleukin-6)으로 구성되는 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 염증성 사이토카인 또는 일산화질소(NO; nitric oxide)의 생성을 억제하는 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 황칠나무 추출물은 Erk(extracellular signal regulated kinase), JNK(c-jun N-terminal kinase) 및 p38(p38 MAP kinase)로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상의 MAPK(mitogen-activated protein kinases)의 인산화를 억제하거나,
NF-κB(nuclear factor-kappaB)의 활성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제9항에 있어서, 상기 신경 염증 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 루게릭병, 크로이츠펠트야콥병 및 다발성 경화증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 신경 염증 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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