KR20180137971A

KR20180137971A - 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 및 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20180137971A
Application number: KR1020170077950A
Authority: KR
Inventors: 최동국; 박신영; 조대준
Original assignee: 건국대학교 글로컬산학협력단
Priority date: 2017-06-20
Filing date: 2017-06-20
Publication date: 2018-12-28

Abstract

본 발명은 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 상세하게는 황칠 열수 추출물을 포함하는 신경 염증 질환 및 신경 세포사 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 황칠 열수 추출물을 포함하는 신경 염증 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물에 관한 것이다.

Description

신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 및 치료용 조성물 {Composition of the hot water extract of Dendropanax morbiferus Lev. having anti-apoptotic activity for preventing and treating of neurodegenerative diseases}

본 발명은 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로 보다 상세하게는 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물에 관한 것이다.

일중추신경계의 분류는 신경세포와 신경교세포로 나뉘어져 있다. 이 중 신경교세포의 경우 신경세포에서 일어나는 면역반응에 대하여 보호 및 회복을 담당하고 있다. 그러나 과도하게 활성화가 된 신경교세포의 경우는 신경 염증을 유발하게 되고, 이에 따른 신경염증면역반응에서는 가역적인 반응을 넘어선 조절에 실패한 비가역적인 반응이 발생된다. 이러한 신경염증 반응은 다양한 신경변성질환의 원인으로 작용한다는 다수의 연구가 보고되어져 왔다. 신경교세포의 활성화에 기인하는 지속적인 신경염증은 다양한 신경변성질환의 원인으로 이끈다는 많은 연구가 보고되고 있다. 활성화된 신경교세포에서는 아질산염 (NO), 활성산소종 (ROS), 전염증성인자인 inducible nitric oxide synthase (iNOS)와 cyclooxygenase-2 (COX-2) 그리고 염증인자인 Intelukin Interleukin-1β (IL-1β), Interleukin-6 (IL-6), Tumor necrosis factor-α(TNF-α) 등이 발생된다. (Graeber and Streit, 2010). 이러한 인자들은 CNS disease의 병리기전에 관여한다는 것으로 알려져 있다. (Kim and Joh, 2006; Koning et al., 2007; Krause and Muller, 2010; Moller, 2010). 따라서 이러한 신경염증인자에 대한 조절이 퇴행성신경변성질환의 예방에 중요한 역할을 할 것이라고 사료되는 바이다.

신경변성질환은 신경세포가 변성하는 병태전체를 포함하지만 일반적으로는 뇌혈관장해, 외상, 대사이상 등으로 밝혀진 신경계 이외 요인에 의거한 것은 포함하고 있지 않다. 치매, 파킨슨병, 근위축성측상경화증, 폴리글루타민여[헌팅턴무도병] 또는 척수소뇌변성증 등에서는 각각 다른 단백질의 굴루타민산 잔기가 신장하면 신경변성이 생기는 것을 초칭한 것으로 보고 있다. 상기의 질병들은 염증반응, 신경세포사 또는 산화 장애가 대부분의 원인으로 작용한다. 치료법으로서는 요인물질, 샤페론적 분자에 의한 이상물질의 정상화를 시도하고 있다.

한편, 황칠은 오래전부터 사용되어 지고 있는 한약재로서 <절강민간상용초약>, <강서초약>, <성호사설>, <지봉유설>, <본초강목>, <중국 문광도서>와 같은 책에서는 ‘풍사와 습사를 제거하고 혈액순환 개선 등을 치료하는 약재’ 로 알려져 왔다. 황칠나무 추출물은 여러 연구팀에 의하여 혈액순환, 집중력 향상, 항우울증, 면역력강화, 뼈와 치아 재생, 신경마비 및 신경통 개선, 통증 완화, 술 해독(간 기능 개선), 어린이 복통, 생리 불순, 피로회복, 안질, 황달, 신장강화, 혈당관리에 효능이 있다고 보고되어 있다. 황칠나무 추출물을 포함하는 신경염증 특허는 발표되어 있으나, 독성이 적은 열수 추출물로 신경염증 억제의 자료는 미흡하였으며, 황칠나무 추출물을 포함하는 신경보호 및 인지기능 개선에 관한 연구는 전무하였다. 본 발명에서는 LPS에 의하여 유도된 염증 인자들의 생산물, mRNA 및 Protein level의 발현에 관련한 기전연구를 수행하였으며, 분자 생화학적 실험 분석법을 바탕으로 황칠 추출물의 효능 분석을 수행하였다. 구체적으로 비정상적인 전염증성 사이토카인의 생성은 염증성 인자를 통하여 조직적인 정상 세포의 손상을 초래하는 것으로 보고된 바 있으며, 신경염증 또한 신경교세포의 활성화로 인해 그 수준이 증가하여 신경세포사를 초래하는 것으로 보고된 바에 따라, Cytokine의 생성을 억제하는 효능이 신경염증 반응 억제를 위한 주요 분석 대상 효능으로 사료되는 바이다. 또한 황칠의 성분인 alpha-amyrin과 beta-amyrin을 확인하였으며, 실험을 통하여 감소되는 염증 인자들을 통하여 황칠의 유효성분이 항염증 효능을 지니고 있음을 추측할 수 있다.

또한 본 발명자들은 신경독소로 알려져 있는 Oxidopamine으로 알려져 있는 6-OHDA(6-hydroxydopamine)을 이용하여 도파민 신경세포에서의 신경세포사 억제를 확인하였으며, 동물모델을 이용한 또 다른 실험모델인 MPTP에 의해 유발된 신경변성질환모델에서 행동력개선 및 신경세포의 보호를 확인하였으며, 이를 통하여 황칠이 신경세포 보호 효능을 나타낸다는 사실을 확인하였다.

본 발명의 목적은 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 하기의 단계를 포함하는 황칠 추출물의 추출방법을 제공하는 것이다.

(a) 황칠 잎을 채취하여 건조하는 단계;

(b) 황칠 잎을 열수 추출하는 단계;

(c) 상기 황칠 잎 열수 추출물을 여과하는 단계; 및

(d) 상기 여과된 황칠 잎 추출물을 진공농축 및 동결 건조하는 단계.

상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 황칠은 황칠의 잎 부분일 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매증, 피크병, 크루츠펠트-야곱병, 두부손상에 의한 치매, 파킨슨 병, 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea) 및 노인성 치매(senile dementia)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있다.

본 발명은 또 다른 일실시예로서, 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서 상기 황칠은 황칠의 잎 부분일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 퇴행성 신경 질환은 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매증, 피크병, 크루츠펠트-야곱병, 두부손상에 의한 치매, 파킨슨 병, 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea) 및 노인성 치매(senile dementia)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있다.

본 발명은 다른 일실시예로서, 하기의 단계를 포함하는 황칠 추출물의 추출방법을 제공한다.

((a) 황칠 잎을 채취하여 건조하는 단계;

(b) 황칠 잎을 열수 추출하는 단계;

(c) 상기 황칠 잎 열수 추출물을 여과하는 단계; 및

본 발명에 있어서 상기 (a) 단계는 황칠 잎을 3일 내지 5일간 50℃ 내지 60℃의 온도를 유지하여 건조할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 (b) 단계에서는 건조된 황칠 잎을 물 1L 기준으로 건조된 황칠 잎 50g 내지 150g의 비율로 수행하여 추출할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 (c) 단계는 추출한 황칠 잎 열수 추출물을 60 ℃ 내지 70 ℃에서 진공 농축할 수 있다.

상기와 같은 본 발명에 따르면, 황칠 잎으로부터의 추출물은 신경교세포가 유도하는 신경염증 반응 인자들의 활성을 억제함으로써, 이를 이용한 약학 조성물 및 기능성 식품 조성물을 이용하여 신경염증반응이 관여하는 신경변성질환 예방 및 치료할 수 있는 가능성을 제하시는 효과가 있다.

도 1 황칠 잎 추출물의 세포독성검사 및 아질산염 저해 효능을 나타낸 실험결과이다.
도 2 황칠 잎 추출물의 6-OHDA 신경독소인자에 대하여 유발된 도파민 신경 세포에서의 세포사 억제 효능을 나타내는 실험 결과이다.
도 3 황칠의 유효성분의 세포독성검사 및 아질산염 저해 효능을 나타낸 실험 결과이다.
도 4 황칠 잎 추출물의 염증 생성 인자의 유전자 발현 저해 효능을 나타낸 실험결과이다.
도 5 황칠 잎 추출물의 염증 생성 인자의 단백질 발현 저해 효능을 나타낸 실험결과이다.
도 6 황칠 잎 추출물의 유효성분의 염증 생성 인자의 단백질 발현 저해 효능을 나타낸 실험 결과이다.
도 7 황칠 잎 추출물의 세포 내 기전에 대한 저해 효능을 나타낸 실험결과이다.
도 8 황칠 잎 추출물의 MPTP 신경독소인자에 의하여 유발된 신경변성 동물 질환 모델에서 행동학적 개선 효능을 나타낸 실험결과이다.
도 9 황칠 잎 추출물의 MPTP 신경독소인자에 의하여 유발된 신경변성 동물 질환 모델에서 중뇌 내의 염증 생성 인자의 단백질 저해 효능을 나타낸 실험결과이다.
도 10 황칠 잎 추출물의 MPTP 신경독소인자에 의하여 유발된 신경변성 동물 질환 모델에서 중뇌 및 선조체 내의 도파민 신경세포 보호 효능을 나타낸 실험결과이다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.

상술한 과제를 해결하기 위해 본 발명은 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품조성물을 제공한다.

상기 건강기능식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 천연 과일 주스 및 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 건강기능식품은 육류, 소세지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 껌류, 아이스크림류, 스프, 음료수, 차, 기능수, 드링크제, 알코올 및 비타민 복합제 중 어느 하나의 형태일 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 황칠 추출물을 함유하는 것 외에는 액체성분에는 특별한 제한은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

또한, 상기 건강기능식품은 식품첨가물을 추가로 포함할 수 있으며, “식품첨가물”로서의 적합여부는 다른 규정이 없는 한 식품의약품안정청에 승인된 식품첨가물공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품첨가물공전”에 수재된 품목으로 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산 칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성품, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고랭색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합 제제류 등을 들 수 있다. 상기 외에 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이때, 건강기능식품을 제조하는 과정에서 식품에 첨가되는 본 발명에 따른 황칠 추출물은 필요에 따라 그 함량을 적절히 가감할 수 있으며, 상기 건강기능식품에 포함된 황칠 추출물의 유효용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있고, 유효성분의 혼합양은 예방 또는 치료적 처치 등의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 황칠은 황칠의 잎 부분일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 퇴행성 신경 질환은 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매증, 피크병, 크루츠펠트-야곱병, 두부손상에 의한 치매, 파킨슨 병, 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea) 및 노인성 치매(senile dementia)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환일 수 있으며, 가장 바람직하게는 파킨스병일 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 실시예에는 신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

용어 “약학적 조성물(pharmaceutical composition)”은 본 발명의황칠 추출물에 희석제 또는 담체와 같은 다른 화학 성분들의 혼합물을 의미한다.

용어 “담체(carrier)”는 세포 또는 조직 내로의 화합물의 부가를 용이하게 하는 화합물로 정의된다. 예를 들어, 디메틸술폭사이드(DMSO)는 생물체의 세포 또는 조직 내로의 많은 유기 화합물들의 투입을 용이하게 하는 통상 사용되는 담체이다.

용어 “희석제(diluent)”는 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키게 되는 물에서 희석되는 화합물로 정의된다. 버퍼 용액에 용해되어 있는 염은 당해 분야에서 희석제로 사용된다. 통상 사용되는 버퍼 용액은 포스페이트 버퍼 식염수이며, 이는 인간 용액의 염 상태를 모방하고 있기 때문이다. 버퍼 염은 낮은 농도에서 용액의 pH를 제어할 수 있기 때문에, 버퍼 희석제가 화합물의 생물학적 활성을 변형하는 일은 드물다. 용어 “치료”는 이롭거나 바람직한 임상적 결과를 수득하기 위한 접근을 의미한다. 본 발명의 목적을 위해서, 이롭거나 바람직한 임상적 결과는 비제한적으로, 증상의 완화, 질병 범위의 감소, 질병 상태의 안정화(즉, 악화되지 않음), 질병 진행의 지연 또는 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 완화 및 경감 (부분적이거나 전체적으로), 검출가능하거나 또는 검출되지 않거나 여부를 포함한다.

또한, “치료”는 치료를 받지 않았을 때 예상되는 생존율과 비교하여 생존율을 늘이는 것을 의미할 수도 있다. “치료”는 치료학적 치료 및 예방적 또는 예방조치 방법 모두를 가리킨다. 상기 치료들은 예방되는 장애뿐만 아니라 이미 발생한 장애에 있어서 요구되는 치료를 포함한다. 질병을 “완화(alleviating)”하는 것은 치료를 하지 않은 경우와 비교하여, 질병상태의 범위 및/또는 바람직하지 않은 임상적 징후가 감소되거나 및/또는 진행의 시간적 추이(time course)가 늦춰지거나 길어지는 것을 의미한다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

본 발명에 있어서 상기 황칠은 황칠의 잎 부분일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 황칠 열수 추출은 물 1L 기준으로 건조된 황칠 잎 50g 내지 150g의 비율로 수행될 수 있으며, 가장 바람직하게는 물 1L 기준으로 건조된 황칠 잎 100g일 수 있다.

상기 신경 세포사는 도파민성 신경 세포에 직접적으로 신경 독소인 6-OHDA를 처리하여 신경 세포사를 유도하였으며, 이에 황칠 잎 열수 추출물을 처리하였을 때 신경 세포사를 억제하는 것을 통하여 황칠 잎 열수 추출물이 신경 세포사의 억제활성을 갖는 것을 특징으로 할 수 있다. 6-OHDA에 의해 유발된 신경세포 사멸에 대하여 황칠 열수 추출물을 처리하여 신경세포사를 억제하는 방법을 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예로서, MPTP에 의해 유발된 실험 동물모델에서 황칠 열수 추출물을 처리하여 신경세포사 억제 방법을 제공 할 수 있다.

MPTP는 1983년 Langston 등이 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP)에 노출된 환자에서 파킨슨 병과 유사한 증상을 유발한다고 보고한 이후, 파킨슨 병 쥐 및 원숭이 모델을 만들기 위한 신경 독성 화합물로 사용되기 시작하였다. 상기 MPTP는 정맥 주사로 투여한 경우에도 뇌-혈관 장벽을 통과한 후, 성상교세포 (astrocyte)와 같은 비 도파민성 세포에서 monoamine oxidase-B(MAO-B)에 의해 1-methyl-4-phenylpyridinium (MPP＋)으로 대사된다. 이러한 활동성 대사물은 도파민 전달체(dopamine transporter)에 의해 카테콜라민 신경세포 내로 들어가서, 미토콘드리아 기능부전 및 세포 사멸을 유도한다.

(a) 황칠 잎을 채취하여 건조하는 단계;

(b) 황칠 잎을 열수 추출하는 단계;

(c) 상기 황칠 잎 열수 추출물을 여과하는 단계; 및

본 발명에 있어서 상기 (a) 단계는 황칠 잎을 3일 내지 5일간 50℃ 내지 60℃의 온도를 유지하여 건조할 수 있으며, 바람직하게는 3일 내지 5일간 53℃ 내지 57℃의 온도를 유지하여 건조 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 3일 내지 5일간 55℃의 온도를 유지하여 건조 할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 (b) 단계에서는 건조된 황칠 잎을 물 1L 기준으로 건조된 황칠 잎 50g 내지 150g의 비율로 수행하여 추출할 수 있으며, 바람직하게는 물 1L 기준으로 건조된 황칠 잎 75g 내지 125g의 비율로 수행할 수 있으며, 가장 바람직하게는 물 1L 기준으로 건조된 황칠 잎 100g의 비율로 수행할 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 (c) 단계는, 추출한 황칠 잎 열수 추출물을 60 ℃ 내지 70 ℃에서 진공 농축할 수 있다.

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 하지만, 하기의 실시예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니며, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것으로 해석되어야 할 것이다.

실시예 1. 황칠 추출물의 제조

황칠 잎 (한나수목원, Korea)를 3일~5일간 55 ℃의 온도를 유지하여 건조하였다. 건조된 황칠 잎을 열탕기 100g 당 1L 기준으로 하여 2시간 내지 3시간 100 ℃에서 열수 추출 하였다. 추출한 황칠 잎 열수 추출물을 60 ℃ 내지 70 ℃에서 2시간 동안 진공 농축 한 뒤, 동걸 건조기를 이용하여 -70 ℃, 7일간 동결 건조를 하였다. 동결 건조된 황칠 추출물을 랜덤으로 이용하여 실험에 사용하였다.

실험예 1. 세포독성검사

microglia BV-2 cell은 불활성화 상태의 5 % FBS 및 100 units/ml 1 % penicilline/streptomycin를 첨가한 DMEM에서 습도가 유지되는 5 % CO₂, 95 % O₂ incubator에서 배양하였고, dopaminergic neuron cell N27은 10 % FBS 및 100 units/ml 1 % penicilline/streptomycin을 첨가한 RPMI에서 습도가 유지되는 5 % CO₂, 95 % O₂ incubator에서 배양하였다. 모든 실험에서 세포수는 5 x 10⁵cell/ml을 사용하였다. LPS는 microglial BV-2 cell line에서 200 ng/ml으로 각각 처리하였고, 6-OHDA는 dopaminergic neuron cell N27 cell line에서 100 μM으로 대조군과 비교하여 처리하였다. microglial BV-2 cell line에서는 LPS를 처리하기 1시간 전에 황칠 잎 열수 추출물 (100, 250 및 500 ㎍/㎖), 황칠의 유효성분인 alpha-amyrin, beta-amyrin (6.25, 12.5, 25 및 50 μM)을 배지에 희석 처리하였다. 황칠 잎 열수 추출물 (100, 250 및 500 ㎍/㎖)를 배지에 희석하여 6-OHDA와 동일시간대에 처리하고 24시간 뒤 결과를 확인하였다. 황칠 잎 열수 추출물의 세포 독성 검사의 경우는 MTT assay를 이용할 수 있으며, 구체적으로, NO assay를 수행한 후 , microplate에 있는 세포에 0.5 mg/ml 농도의 MTT를 30ul 투입하고, incubator에서 2시간 반응시켜 DMSO 100ul 로 formazan crystals을 녹여 파장이 540 nm인 Vmax microplate reader를 이용하여 흡광도를 측정하였다. LPS로 자극된 Microglia BV-2 cell에서와 6-OHDA로 사멸이 이루어진 Neuron N27 cell에서 LPS, 6-OHDA 및 황칠 잎 열수 추출물이 세포 생존에 미치는 영향을 확인하였다. 세포 독성 검사는 MTT assay를 수행하였으며, 그 결과 도 1, 2에서 보는바와 같이, MTT 측정 결과 LPS 및 황칠 잎 열수 추출물 단독으로 또는 같이 처리한 모든 실험군에서 대조군에 비하여 세포 생존율이 변하지 않음을 확인 할 수 있었다. 이는 신경염증 유도 물질인 LPS와 황칠 잎 열수 추출물이 세포 생존에는 영향을 주지 않음을 알 수 있다 (도 1B).

실험예 2. Nitric Oxide assay

Nitric Oxide 의 생산량을 정량적으로 측정하는 방법으로 microplate assay 방법 중 하나이다. microplate에 세포 5 x 10⁴ cell/well을 배양한 후, 황칠 잎 열수 추출물의 농도차이를 두고 LPS를 첨가하였으며, 24h 인큐베이터 (incubator)에서 반응시키고, 그 중 상층액을 각각 100ul 씩 Griess reagent (1% sulfanilamide/ 0.1% N-(1-naphthyl)- ethylenediamine dihydrochloride/ 2.5% H₃PO₄)와 반응시켰으며, 파장이 550nm인 Vmax 96-well microplate spectrophotometer를 사용하여 값을 측정하였다. LPS로 자극된 Microglial BV-2 cell에서 물질의 농도 의존적인 NO 방출 황칠 잎 열수 추출물의 농도별 (100, 250 및 500 ㎍/㎖). alpha-amyrin, beta-amyrin의 농도별(6.25, 12.5, 25 및 50 μM) 로 처리한 결과, 도 1A와 도3과 같이, 각각 아질산염(NO)의 방출량이 LPS만 처리한 군에 비하여 농도 의존적으로 감소하는 사실을 확인하였다.

실험예 3. iNOS, COX-2의 유전자 및 단백질의 발현 저해 작용

Microglial BV-2 cell line의 전체 RNA 동정을 Trizol reagent (invitrogen, CA, USA)를 이용하여 제조 회사가 제시한 사용법에 따라 total RNA 분리하였다. microglial BV-2 cell line에 TRizol reagent 1 ㎖를 투입하고 chloroform 200 ㎕을 투입한 후 교반하였고 실온에서 5분 동안 반응시킨 후 원심분리(4℃, 10,000rpm, 10분)하였으며, 그 중 상층액 500 ㎕를 새로운 튜브로 이동시켰다. 동일한 양의 isopropanol 500 ㎕을 투입하고 실온에서 10분 동안 반응시킨 후 원심분리(4℃, 14000rpm, 15분)하였으며, 상층액을 제거하고 75% EtOH을 이용하여 2회 세척한 후 pellet을 건조하고 DEPC-water를 이용하여 용해하였다. RT(Reverse Transcription)-PCR은 준비된 RNA의 2.5 ㎍/㎕ 농도로 맞추어 최종 부피는 10㎕로 동일하게 맞추었으며 , Oligo(dT) 15 primer 1 ㎕, Random primers 1㎕ 로 pre-heat한 후, 5 X Reaction Buffer 4㎕, MgCl2 2㎕ , dNTP 1㎕를 반응 조건 25℃ 5분, 42℃ 60분, 70℃ 15분, 4℃ 5분이상 총 20 ㎕을 합성하여 사용되는 template의 농도는 0.5 ㎍/㎕가 되도록 희석하여 사용하였으며, 반응 조성은 5 X Green Gotaq Reaction buffer를 사용했으며, template 1㎕, 2 X dyemix 10 ㎕, primer-F 1 ㎕, primer-R 1 ㎕, 증류수 7 ㎕ 를 반응조건 95℃ 2분, 95℃ 30초 - 58℃ 1분 - 72℃ 1분 25회 반복, 72℃ 5분, 4℃ 보관으로 하여 총 20㎕를 반응시켰다. 사용한 primer들과 그 염기서열, gene bank accession number 및 실험조건들은 표. 1에 명시하였다.

Microglial BV-2 cell에서 단백질의 동정은 세포를 sample buffer(Glycerol, 10 % SDS, 1.0 M Tris-Hcl)를 이용하여 동정하였다. 동일량의 단백질을 10%, 12% SDS-PAGE gel에 전기영동한 후, 0.45μm polyvinylidene fluoride (PVDF, Millipore)를 사용하여 gel에서 membrane으로 이동시켰다. 항체의 사용은 1차 항체로 anti-β-actin (1:10000; sigma), anti-COX-2(1:2000; abcam), anti-iNOS (1:2000; BD)으로 희석하여 4 ℃에서 O/N(over-night)하고 2차 항체로 Horseradish peroxidase(HRP)를 가지고 있는 항체를 실온에서 1시간 반응시킨 후, ECL kit(pierce, CA)로 반응시키고, DAVINCH CAS-400SM(Davinch-K, Korea)를 사용하여 결과를 확인 하였다.

염증생성에 관여하는 효소인 iNOS(inducible Nitric Oxide Synthesis) 및 COX-2 (cyclooxygenase type 2) 유전자 및 단백질의 발현 양상의 변화를 알아보기 위하여, 본 실험에서는 BV-2 cell에 LPS 및 황칠 잎 열수 추출물을 농도별로 처리하고 시간별로 배양하였다.

도 4, 도 5 및 도 6는 LPS로 자극된 microglial BV-2 cell 에서 iNOS 및 COX-2의 유전자 및 단백질 단계에서의 황칠 잎 열수 추출물과 위 염증성 인자들의 단백질 단계에서의 alpha-amyrin, beta-amyrin의 농도에 따른 저해 효능을 나타낸 것이다. 도 4는 6well plate에 세포를 10 X 10⁵ cell/well로 배양하여 6시간 후, 세포 상층액을 제거하고, 세포에서 RNA를 동정하여, iNOS 및 COX-2 유전자를 RT-PCR을 사용하여 분석한 결과이다. 도 5, 6 는 6well plate에 세포를 10 X 10⁵ cell/well로 배양하여 18시간 후, 세포에서 단백질을 동정하여 다클론성 항체인 iNOS 및 COX-2를 사용하여 western blot에 의해 분석한 결과이다. 6시간 후 RNA를 동정하여 RT-PCR을 시행하고 유전자의 발현 양상을 정량적인 방법을 통하여 분석하여 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현 양상의 변화를 확인하였다. 도 4 에 도시한 바와 같이, LPS만 처리한 군에서의 발현량은 대조군에 비해 증가함을 확인하였고, 황칠 잎 열수 추출물을 농도별 (100, 250 및 500 ㎍/㎖)로 처리한 발현량은 LPS만 처리한 군에 비하여 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2 유전자의 발현량을 감소시키는 사실을 확인할 수 있었다. 또한, 도 5 내지 6에서는 18시간 후 Protein을 동정하여 Western blot을 시행하여 iNOS 및 COX-2 단백질의 발현 양상을 확인하였다. GAPDH은 유전자 발현 분석의 대조군으로, β-actin은 단백질 발현 분석의 대조군으로 사용하였다.

실험예 4. 염증 매개 사이토카인 유전자 발현 저해 작용

염증 매개 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6 유전자의 발현 양상의 변화를 도출하기 위하여 본 실험에서는 microglial BV-2 cell 에 LPS 및 황칠 잎 열수 추출물을 농도별로 처리하고, 6시간 배양한 후에 RNA를 동정하고 RT-PCR을 시행하여 유전자의 발현 양상을 정량적인 방법을 통하여 분석함으로써 세 가지 유전자에서 공통적인 발현 양상을 확인할 수 있었다. 도 4는 LPS로 자극된 microglial BV-2 cell에서 전염증성 매개체인 TNF-α, IL-1β, IL-6 유전자에 대한 황칠 잎 열수 추출물의 농도의존적인 저해 효능을 나타낸 것이다. microglial BV-2 cell을 6 well plate에 5 X 10⁵ cell/㎖이 되도록 한 후, 24시간 배양하고, 황칠 잎 열수 추출물을 농도별로 1시간 전처리하였다. 그리고 LPS(200 ng/㎖)로 세포를 자극하였다. 6시간 후, 세포 상층액을 제거하고, 세포에서 RNA를 동정하여 TNF-α, IL-1β, IL-6 유전자를 RT-PCR에 의해 분석하였다. 도 3에 도시한 바와 같이, LPS를 처리하지 않은 대조군에서는 TNF-α, IL1-β, IL-6 유전자의 발현량이 거의 없음을 확인하였으며 LPS (200 ng/㎖)를 처리한 실험군에서는 대조군에 비하여 TNF-α, IL1-β, IL-6 유전자의 발현량이 확연히 증가했고, 황칠 잎 열수 추출물 처리 시, 농도 의존적으로 감소하는 발현 양상 변화를 확인하였다 (도 4). GAPDH는 유전자 정량 분석의 대조군으로 사용하였다.

실험예 5. MAPK 활성화에 대한 억제 효과 확인

실시예 3과 같이 세포 실험을 진행한 뒤 단백질을 추출하여 MAPK의 활성화를 보았다. 황칠 잎 열수 추출물에 의해 MAPK 신호전달체계가 조절되는지를 확인하기 위하여, MAPK 구성중 하나인 JNK의 인산화에 대한 황칠 잎 열수 추출물의 효과를 살펴보았다. 도 7에 도시된 바와 같이, 황칠 잎 열수 추출물은 농도 의존적으로 LPS에 의해 유도된 JNK의 인산화를 약화시켰다. 이러한 실험결과는 활성화된 microglial cell line에서 JNK가 황칠 잎 열수 추출물에 의해 효과적으로 차단될 수 있음을 나타내는 것이다. 그러므로, 황칠 잎 열수 추출물은 JNK의 활성화를 조절할 수도 있고, JNK 신호 전달체계의 지연을 통해 LPS에 의해 자극을 받은 microglial BV-2 cell에서 Nitric Oxide 또는 사이토카인 발현의 억제에 관여할 수도 있는 것이다 (도 7).

실험예 6. NF-κB의 억제 효과 확인

실시예 3과 같이 세포 실험을 진행한 뒤 단백질을 추출하여 NF-κB의 활성화를 보았다.황칠 잎 열수 추출물의 효능 분석을 위하여 본 실험에서는 LPS에 의한 염증 유도시 전염증성 사이토카인들을 발현시키는 전사인자인 NF-κB의 활성화를 NF-κB를 구성하는 IκBα의 분해로 p-IκBα의 발현을 Western blot에 의해 확인하였고, NF-κB를 구성하는 p65의 핵질에서 핵 안으로의 유입을 면역형광 염색법을 통하여 확인하였다. 도 4는 LPS로 자극된 BV-2 신경교세포에서 NF-κB 활성에 따른 황칠 잎 열수 추출물의 농도 의존적인 저해 효능을 나타낸 것이다. 도 7은 BV-2 microglia 세포를 6well plate에 10 X 10⁵cell/㎖이 되도록 한 후, 24시간 배양하고, 황칠 잎 열수 추출물을 농도별로 1시간 전 처리하며, LPS(200 ng/㎖)로 세포를 자극하고, 30분 후 세포 상층액을 제거한 후, 세포질에서 단백질을 동정하며, 다클론 항체인 p-IκBα를 사용하여, Western blot에 의해 분석한 결과이다. 도 7에 도시한 바와 같이, LPS 처리 시, IκBα는 분해되어 p-IκBα 양이 증가하는 것을 확인하였고, 황칠 잎 열수 추출물의 농도 의존적으로 단백질 p-IκBα 양이 감소함을 확인하였다. β-actin은 정량 확인의 대조 단백질이다.

Microglial BV-2 cell에서 NF-κB p65의 이동을 측정하기 위하여 (5×10⁴cells/well in 24-well plate) 커버 슬립 상에서 24시간 동안 배양하였다. 황칠 잎 열수 추출물을 1시간 동안 전처리한 후, LPS 처리 30분 경과 시 상층액 제거 후 메탄올 250 ㎕를 첨가하고 -20℃에서 20분 동안 고정하며 PBS (in 0.02% Tween) 로 세척한 후, 항체를 침투하기 위하여 1% Triton으로 10분 동안 처리하여 세포막을 관통하였다. 1차 항체로는 monoclonal mouse anti-NF-κB (p65) (1:100; Santa Cruz Biotechnology Inc, Santa Cruz, CA)로 희석하여 4 ℃에서 O/N(over-night)하고, 2차 항체로는 1 : 100의 비율로 희석한 Alexa Fluor 568-labeled goat anti-mouse antibody (Invitrogen, CA)를 60분 동안 실온에서 처리하였다. 2차 항체와 같이 1 μM Hoechst를 처리하여 세포핵을 염색하였으며, 이후에 박제를 위하여 mounting solution으로 커버글라스에 고정하였으며, 박제 후 형광 염색된 cells을 관측하기 위하여 암실에서 형광 현미경을 이용하여 관측함으로써 결과를 확인하였다. 면역형광법을 통하여 NF-κB를 구성하는 p65 단백질이 핵질에서 핵 내로 유입되는 정도를 확인하였다. 아무것도 처리하지 않는 경우에는 단백질 p65가 핵질에 많이 내재되어 있는 사실을 확인하였으며, LPS 처리 시 단백질 p65가 핵 안으로 많이 유입된 사실을 확인하였고, 황칠 잎 열수 추출물을 처리하면 단백질 p65의 핵 안으로의 유입을 방지하는 사실을 확인하였다 (도 7).

실험예 7. MPTP-처리된 신경변성 마우스 모델에 대한 개선 효과

수컷 C57BL/6 마우스 (25 g, 6주령)는 대한바이오링크에서 구입하였다. 이들을 3개의 그룹으로 나누어 표준조건 하에서 1주 순화하였으며 이후 실험에 사용되었다.(온도 22±2 ℃, 습도 55±5 %, 12 h-명/암 사이클, 음식/물 자유식). 모든 실험은 실험동물관리기준(NIH publication No. 85-23, revised 1985)의 가이드라인과 건국대학교 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에 따라 수행하였다. 마우스는 6마리씩 3개의 그룹 ( 1. vehicle, 2. MPTP 20 mg/kg 2시간 간격 4회 , 3. 황칠 잎 열수 추출물 200 mg/kg)으로 나누어진 후 실험에 투입되었다. 황칠 잎 열수 추출물와 MPTP는 생리적 식염수에 녹여 사용하였다. 황칠 잎 열수 추출물은 MPTP 처리 전 7일 동안 200 mg/kg를 매일 경구투여를 통하여 마우스에 투여하였으며, MPTP는 20 mg/kg를 2시간 간격 4회 복강주사를 통하여 투여하였다. Pole test 장치는 8 mm의 직경 및 55 cm의 높이의 rough-surfaced pole로 bradykinesia를 측정하는 장치로 마우스를 pole의 가장 높은 위치에 놓고 내려오는 시간을 측정한다. 마우스를 봉에 놓고 5번씩 측정하였다. MPTP는 중추신경계에서 미세아교세포의 활성화를 유발할 수 있는 신경염증 및 도파민성 신경변성을 유도할 수 있는 신경독소로 널리 알려져 있다. 신경변성 마우스 모델에서 MPTP-유발성 신경염증에 대한 황칠 잎 추출물의 행동력 개선 및 신경보호 효과를 조사하였다. 도 8A 및 도 8B인, Rota-rod test와 도 8C인, Pole test에서는 동물의 운동신경능력에 대한행동력을 확인하는 실험으로써, 이에 도시된바와 같이, MPTP의 주입은 동물의 행동력을 현저하게 감소시켰다. 그러나 황칠 잎 열수 추출물을 투여한 군에서는 행동력이 증가함을 관찰하였다. MPTP를 처리한 후 2일 차인 동물의 급성 염증 모델에서는 도 9에서와 확인한 것과 같이 염증성 인자들의 발현량을 비교해보면, 황칠 잎 열수 추출물을 투여한 군에서의 염증성 인자들의 발현량이 감소하는 것을 확인하였다. 이를 통하여 황칠 잎 열수 추출물이 세포 내에서 뿐만 아니라, 생체 내에서도 항염증성 역할을 함에 대하여 크게 사료되어지는 바이다. 또한 MPTP를 처리한 후 7일이 된 동물의 만성 염증 모델에서는 동물의 세포사를 확인하였다. SNpc(substantia nigra pars compacta)에서 MPTP에 의해 이루어진 도파민성 신경세포의 소실은 TH(tyrosine hydroxylase)-보유 신경(positiveneuron)을 측정함으로써 관찰하였다. 도 10에 도시된 바와 같이, MPTP의 주입은 TH의 단백질 발현을 현저히 감소시켰다. 그러나, 황칠 잎 열수 추출물을 투여한 군에서는 MPTP에 의해 유도된 TH의 발현 손실을 감소시킬 수 있었다. 또한, 면역조직화학 염색법 (IHC : immunohistochemistry) 실험을 통하여 STR(striatum)에서의 대조군과 비교하였을 때, Neuron의 소실을 통한 염색이 덜 된 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과를 통해, 황칠 잎 열수 추출물이 MPTP-유발성 신경염증으로부터 신경세포를 보호한다는 것을 알 수 있었다.

이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다

제조예 1. 주사제

상기 실시예 1-1에서 제조한 황칠 추출물: 100㎎

소듐 메타비설파이트: 3.0㎎

메틸파라벤: 0.8㎎

프로필파라벤: 0.1㎎

주사용 멸균 증류수: 적량

상기 성분을 혼합하고 통상의 방법으로 최종 부피가 2 ㎖이 되도록 제조하여, 앰플에 충전하고 멸균하여 주사제를 제조하였다.

제조예 2. 정제

상기 실시예 1-1에서 제조한 황칠 추출물: 100㎎

감자 전분: 100㎎

락토오스: 100㎎

콜로이드성 규산: 16㎎

스테아린산 마그네슘: 적량

통상의 정제 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 타정하고 정제를 제조하였다.

제조예 3. 캡슐제

상기 실시예 1-1에서 제조한 황칠 추출물: 100㎎

유당: 50㎎

전분: 50㎎

탈크: 2㎎

스테아린산 마그네슘: 적량

통상의 캡슐 제조방법에 따라 상기 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제조예 4. 환제

상기 실시예 1-1에서 제조한 황칠 추출물: 100㎎

옥수수 전분: 100㎎

멸균 증류수: 적량

상기 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법에 따라 적절한 크기를 갖는 구형으로 제환하여 환제를 제조하였다.

제조예 5. 건강 기능 식품

1) 건강 음료

올리고당(2%), 액상과당(0.5%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%) 등의 음료 재료에 상기 실시예 1-1에서 제조된 황칠 추출물을 적량 혼합하여, 살균함으로써 음료를 제조하였다.

2) 기능성 식품

상기 실시예 1-1에서 제조한 황칠 추출물을 각종 비타민 및 미네랄 함유 기능성 식품에 적량 혼합하여 황칠 추출물이 함유된 기능성 식품을 제조하였다.

Claims

신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 황칠은 황칠의 잎 부분을 추출하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매증, 피크병, 크루츠펠트-야곱병, 두부손상에 의한 치매, 파킨슨 병, 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea) 및 노인성 치매(senile dementia)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
신경 세포사 억제 활성을 갖는 황칠 열수 추출물을 포함하는 퇴행성 신경 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 황칠은 황칠의 잎 부분을 추출하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 알츠하이머병, 뇌혈관성 치매증, 피크병, 크루츠펠트-야곱병, 두부손상에 의한 치매, 파킨슨 병, 헌팅톤 무도병(Huntington's chorea) 및 노인성 치매(senile dementia)로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
(a) 황칠 잎을 채취하여 건조하는 단계;
(b) 황칠 잎을 열수 추출하는 단계;
(c) 상기 황칠 잎 열수 추출물을 여과하는 단계; 및
(d) 상기 여과된 황칠 잎 추출물을 진공농축 및 동결 건조하는 단계;
를 포함하는 황칠 추출물의 추출방법.
제 7항에 있어서, 상기 (a) 단계는 황칠 잎을 3일 내지 5일간 50℃ 내지 60℃의 온도를 유지하여 건조하는 것을 특징으로 하는, 황칠 추출물의 추출방법.
제 7항에 있어서, 상기 (b) 단계에서는 건조된 황칠 잎을 물 1L 기준으로 건조된 황칠 잎 50g 내지 150g의 비율로 수행하는 것을 특징으로 하는, 황칠 추출물의 추출방법.
제 7항에 있어서, 상기 (c) 단계는 추출한 황칠 잎 열수 추출물을 60 ℃ 내지 70 ℃에서 진공 농축으로 수행하는 것을 특징으로 하는, 황칠 추출물의 추출방법.