KR20210082951A - 마이크로RNA-24-3p의 억제제를 포함하는 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도용 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 마이크로RNA-24-3p의 억제제를 포함하는 신경아세포에서 신경세포로의 분화 촉진용 조성물 및 상기 억제제를 신경아세포에 처리하는 단계를 포함하는 신경세포로의 분화 유도방법에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 miR-24-3p를 하향조절하여 신경세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으며, 이를 통해 분화된 신경세포는 다양한 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료용도로써 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

마이크로RNA-24-3p의 억제제를 포함하는 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도용 조성물 및 방법{Composition and method for inducing differentiation of neuroblast into neural cell comprising inhibitor of microRNA-24-3p}
본 발명은 마이크로RNA-24-3p의 억제제를 포함하는 신경아세포에서 신경세포로의 분화 촉진용 조성물 및 상기 억제제를 신경아세포에 처리하는 단계를 포함하는 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도방법에 관한 것이다.
마이크로 RNA(microRNA 또는 miRNA)는 대략 22개의 뉴클레오타이드로 이루어진 작고 보존성이 높은 암호화되지 않은(non-coding) 단일 가닥 RNA 분자로, 표적 mRNA의 3’UTR에 결합하여 mRNA를 분해하거나 mRNA의 번역을 억제하여 유전자 발현을 제어하는 새로운 물질이다. miRNA는 세포 증식, 세포 분화, 세포 사멸과 같은 다양한 생물학적 과정에서 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. miRNA의 이러한 생물학적 기능에 기반하여, 신경세포 분화에 관여하는 miRNA를 발굴하고 그 작용기전을 규명하기 위한 연구들이 진행되고 있다(KR10-17228621).
신경퇴행성질환(Neurodegenerative disease)은 신경세포의 기능 감소 또는 소실에 의해 운동조절능력, 인지기능, 지각기능, 감각기능 및 자율신경의 기능이상이 발생하는 질환을 말한다. 신경퇴행성질환은 주로 임상적 특징으로 분류되는데, 주요 증상과 침범부위를 기준으로 나누며 알츠하이머병(Alzheimer's disease; AD)과 파킨슨병(Parkinson's disease; PD)이 대표적이고, 헌팅턴병(Huntington's disease)과 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis; ALS)도 여기에 포함된다.
현재까지 신경퇴행성질환에 근본적인 치료제가 없으며, 사용되고 있거나 개발되고 있는 약물은 증상을 완화시키기 위해 신경전달 과정을 표적하는 약물들이 대부분이다. 신경퇴행성질환의 근본적 치료는 질병의 원인을 제거하여 환자의 기능을 정상으로 회복시키거나, 초기에 진단하고 치료하여 더 이상의 진행을 억제할 수 있는 근본적인 치료법의 개발이 필요하다. 또 다른 한 가지 방법은 손상된 신경세포의 기능을 일부라도 회복시키는 것으로, 근본적 치료제가 부재한 상황에서 신경줄기세포를 이용한 세포치료는 다양한 신경퇴행성 질환 치료에 대안을 제시할 수 있다. 따라서 신경계 발달과정에서 다양한 신경세포로의 분화기전 연구를 통해 안전한 신경세포로의 분화기술을 확립할 필요가 있다.
상기와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여, 신경세포로의 분화를 조절할 수 있는 마이크로RNA를 발굴하기 위해 연구 노력한 결과, 마이크로RNA-24-3p가 신경아세포에서 신경세포로의 분화를 효과적으로 조절할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 억제제를 포함하는, 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 억제제를 신경아세포에 처리하는 단계를 포함하는, 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된 신경세포 및 상기 신경세포를 유효성분으로 포함하는 세포치료제를 제공하는 것을 또 다른 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 억제제를 포함하는, 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 miR-24-3p의 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 조성물은 시냅토파이신(synaptophysin; SYP)의 발현수준 또는 신경돌기의 길이를 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명은 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 억제제를 신경아세포에 처리하는 단계를 포함하는, 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도방법을 제공한다.
본 발명의 일구현예로, 상기 miR-24-3p의 억제제 처리 후 신경아세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 배양은 레티노산(Retinoic acid)이 처리된 배지에서 5 내지 9일 동안 이루어지는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 분화된, 신경세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 신경세포를 유효성분으로 포함하는, 세포치료제를 제공한다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 miR-24-3p의 발현을 증가시킨 경우 신경아세포에서 신경세포로의 분화가 저해되는 반면, 상기 miRNA의 발현을 억제시킨 경우 신경세포로의 분화가 촉진되는 것을 확인함으로써 miR-24-3p가 신경아세포에서 신경세포로의 분화를 음성적으로 조절함을 확인하였는바, 본 발명에 의하면 miR-24-3p를 하향조절하여 신경세포로의 분화를 효과적으로 유도할 수 있으며, 이를 통해 분화된 신경세포는 다양한 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료용도로써 유용하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 신경세포 분화에 대한 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 영향을 검증하기 위하여 SH-SY5Y 세포를 신경세포로 분화시키면서 분화 시작 0, 5 및 7일(Day)째에 각각 TaqMan qPCR을 통해 세포 내 miR-24-3p의 수준을 측정한 결과이다.
도 2는 SH-SY5Y 세포에 miR-24-3p의 모방체(miR-24-3p mimic) 및 대조군 모방체(Control mimic)를 형질감염시키고 신경세포로의 분화를 유도한 후 상기 모방체에 의한 신경세포 분화 저해효과를 검증한 결과로서, 도 2a 및 도 2b는 각각 신경세포로의 분화 유도 7일 후 시냅토파이신(synaptophysin; SYP) 유전자의 mRNA(도 2a) 및 단백질(도 2b) 발현수준을 측정하여 비교한 결과이고, 도 2c 및 도 2d는 분화 유도된 세포에 대하여 면역형광염색을 통해 SYP 단백질을 표지하고 신경돌기의 길이를 관찰하고 이를 정량화한 결과이다.
도 3은 SH-SY5Y 세포에 miR-24-3p의 억제제(miR-24-3p inhibitor) 및 대조군 억제제(Control inhibitor)를 형질감염시키고 신경세포로의 분화를 유도한 후 상기 억제제에 의한 신경세포 분화 촉진효과를 검증한 결과로서, 도 3a 및 도 3b는 각각 신경세포로의 분화 유도 7일 후 SYP 유전자의 mRNA(도 3a) 및 단백질(도 3b) 발현수준을 측정하여 비교한 결과이고, 도 3c 및 도 3d는 분화 유도된 세포에 대하여 면역형광염색을 통해 SYP 단백질을 표지하고 신경돌기의 길이를 관찰하고 이를 정량화한 결과이다.
본 발명자들은 miR-24-3p를 하향조절함으로써 신경아세포에서 신경세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 확인하였는바, 이로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 억제제를 포함하는, 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “신경아세포(neuroblast)”란 장차 신경세포나 신경원으로 분화할 배세포, 중추신경계 원기, 신경절원기 등에 다른 종류의 세포와 같이 포함되어 있는 세포이다. 초기 형태는 방추상이며, 후에 양 끝에서 돌기가 나온다. 그 선단은 아메바 운동을 하면서 현저하게 신장하여 최종적으로 신경돌기로 분화한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “신경세포(neural cell)”란 신경 계통의 구조적, 기능적 단위로 하나의 세포체와 그 돌기인 가지 돌기와 신경 돌기로 구성된다. 중추신경 계통에서는 회백질에 모여있고, 말초신경 계통에서는 신경절에 집합해있다.
본 발명에서 사용되는 용어, “분화(differentiation)”란 초기 단계의 미분화 상태의 세포가 각 조직으로써의 특성을 갖게 되는 과정을 일컫는 것으로서, 본 발명의 목적상 신경아세포가 신경세포로써의 특성을 지니게 되는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, “마이크로RNA(microRNA)”란 약 22개의 염기서열로 이루어진 짧은 non-coding RNA를 의미한다. 유전자의 발현 과정에서 전사 후 조절인자(post-transcriptional regulator)로서 기능을 한다고 알려져 있다. 상보적인 염기 서열을 가진 표적(target) mRNA에 상보적으로 결합함으로써 표적 mRNA들을 분해시키거나 단백질로 번역되는 것을 억제한다.
본 발명에 있어서, 상기 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 억제제는 상기 miR-24-3p를 표적하여 이의 발현 또는 활성을 저해할 수 있는 물질을 의미하며, 상기와 같은 기능을 갖는 물질이라면 그 종류에는 제한이 없으나, 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide)일 수 있고, 더욱 바람직하게는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명자들은 구체적인 실시예를 통해 본 발명에 따른 miR-24-3p의 억제제가 신경아세포에서 신경세포로의 분화를 효과적으로 유도함을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명의 일실시예에서는 SH-SY5Y 세포를 신경세포로 분화시킨 후 세포 내 miR-24-3p의 발현수준을 측정한 결과 분화유도 7일째에 miR-24-3p의 수준이 40% 감소된 것을 확인하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, SH-SY5Y 세포에 miR-24-3p 모방체를 형질감염시키고 신경세포로의 분화를 유도한 다음 신경세포 특이적 유전자인 SYP의 발현수준 및 신경돌기의 길이를 측정한 결과, miR-24-3p의 발현 증가에 의해 신경세포로의 분화가 저해된 것을 확인하였다(실시예 3 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, SH-SY5Y 세포에 miR-24-3p 억제제를 형질감염시킨 후 신경세포로의 분화를 유도한 다음 신경세포 특이적 유전자인 SYP의 발현수준 및 신경돌기의 길이를 측정한 결과, miR-24-3p의 발현 억제에 의해 신경세포로의 분화가 촉진된 것을 확인하였다(실시예 4 참조).
이에, 본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 억제제를 신경아세포에 처리하는 단계를 포함하는 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 miR-24-3p 억제제의 처리는 바람직하게는 신경아세포에 형질감염시키는 것일 수 있으며, 형질감염은 해당 기술분야에서 통상적으로 이용되는 방법 및 조건에 따라 통상의 기술자가 적절히 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 miR-24-3p의 억제제 처리 후 신경아세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있으며, 구체적으로 레티노산(RA)이 처리된 배지에서 5 내지 9일, 바람직하게는 6 내지 8일, 더욱 바람직하게는 약 7일 동안 배양하는 것일 수 있으나, 신경아세포를 신경세포로 분화시킬 수 있는 배양 조건이라면 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 분화방법에 따라 분화된 신경세포 및 상기 신경세포를 포함하는 세포치료제를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 세포치료제는 사람으로부터 분리, 배양 및 특수한 저작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식, 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 지칭한다. 세포치료제는 세포의 분화 정도에 따라 크게 체세포치료제, 줄기세포치료제로 분류된다.
본 발명에 있어서 상기 세포치료제는 신경퇴행성질환의 예방 또는 치료에 이용될 수 있으며, 신경퇴행성질환은 대표적으로 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병, 헌팅턴병, 다발성경화증 등을 포함할 수 있으나 분화된 신경세포를 세포치료제로 이용하여 치료효과를 나타낼 수 있는 질환이라면 상기 종류로 한정되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실험재료 및 실험방법
1-1. 실험재료
세포배양에 필요한 L-글루타민(L-glutamine)이 포함된 DMEM(Dulbecco’s modifed Eagle medium), 고농도 포도당, 피루빈산염(pyruvate) 및 소태아혈청(FBS)은 Gibco(Grand Island, NY, USA)에서 구입하였고 올트랜스레티노산(all-trans retinoic acid; ATRA)은 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 페니실린/스트렙토마이신 및 트립신/EDTA는 WelGENE, Inc.(Daegu, Korea)에서 구입하였다. 항-시냅토파이신(synaptophysin; SYP) 항체(#ab32127)는 Abcam(Cambridge, UK)에서, 항-칼넥신(calnexin) 항체(#ADI-SPA-860-F)는 Enzo Life Sciences(Farmingdale, NY, USA)에서 구입하였고, 2차 항체인 Alexa Fluor® 488-conjugated secondary goat anti-rabbit IgG (H+L) 항체(#A-11008)는 Invitrogen(Carlsbad, CA, USA)에서 구입하였다. 다른 모든 화합물들은 분석 등급으로 준비하였다.
1-2. 세포배양 및 분화 조건
SH-SY5Y 세포는 열로 불활성화시킨 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신이 첨가된 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 조건 하에 배양하였고, 배양배지는 2일에 한번씩 교체해주었다. 신경세포로의 분화를 위해 SH-SY5Y 세포에 50 μM 레티노산(Retinoic acid; RA)을 5일 또는 7일 동안 처리하였고, 배양배지는 50 μM RA가 함유된 것으로 격일로 교체해주었다.
1-3. 마이크로RNA(miRNA) 모방체 및 억제제의 형질감염(transfection)
마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 모방체(mimic) 및 음성대조군 miRNA는 제놀루션사에서 합성하였고, 서열 특이적인 miR-24-3p 억제제(inhibitor)(cat. no. IH-300497-05-0005, miRIDIAN microRNA Human hsa-miR-24-3p-Hairpin Inhibitor) 및 이에 상보적인 비특이적 대조군(cat. no. IN-001005-01-20, miRIDIAN microRNA Hairpin Inhibitor Negative Control #1)은 Dharmacon사에서 구입하였다. miR-24-3p 모방체 및 억제제의 서열은 하기 표 1에 나타내었다. 상기 모방체 또는 억제제의 형질감염을 위해, 형질감염 하루 전에 SH-SY5Y 세포를 분주하고 모방체 또는 억제제 각각을 리포펙타민 RNAiMAX 형질감염 시약을 이용하여 세포 내로 일시적으로 형질감염시켰다.
명칭 서열(5'-3') 서열번호
miR-24-3p inhibitor CUGUUCCUGCUGAACUGAGCCA 1
miR-24-3p mimic UCGCCUAAUGGUCUCUGAGCCAUU 2
Mimic negative control UUGUACUACACAAAAGUACUGUU 3
1-4. RNA 추출 및 역전사-정량적 중합효소연쇄반응(RT-qPCR)
배양된 세포로부터 RNAiso Plus(Takara Bio Inc., Ohtsu, Japan)를 이용해 총 RNA를 추출하였다. 이후 정제된 총 RNA 300 ng에 대하여 GoScript™ 역전사효소 및 랜덤 프라이머(Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 이용해 역전사를 실시하여 qPCR 수행을 위한 cDNA를 합성하였다. PCR 조건은 95℃에서 10분, 이어서 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분을 40회 반복하는 것으로 하였으며, 각 샘플은 이중으로 실험하고 독립적인 실험에서 적어도 3개의 샘플을 분석하였다. 2-ΔΔCt 방법을 이용해 상대적 정량화를 수행하였으며, 유전자 발현은 내부 대조군인 GAPDH로 보정하였고, 사용된 SYP 및 GAPDH 유전자에 특이적인 프라이머 서열은 하기 표 2에 나타내었다.
유전자 방향 서열(5'-3') 서열번호
SYP Forward CAACACCTCGGTGGTGTTCG 4
Reverse CCTGAGGCCCGTAGGAATC 5
GAPDH Forward CAAGATCATCAGCAATGCC 6
Reverse CTGTGGTCATGAGTCCTTCC 7
1-5. 웨스턴 블롯팅(Western blotting)
세포를 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.5 % Triton X-100 및 Complete™ EDTA-free 프로테아제 억제제 칵테일(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN, USA)로 구성된 차가운 저장성 용해 완충액(lysis buffer)으로 용해시켰다. 15-30 μg의 단백질 샘플을 NEXT GEL® 15% 폴리아크릴아미드 겔 (Amresco, Solon, OH, USA)을 이용하여 전기영동한 다음 PVDF 맴브레인(Merck Millipore, Darmstadt, Germany)으로 트랜스퍼하였다. 다음으로 상기 맴브레인에 5% non-fat dried milk를 처리하여 1시간 동안 블로킹을 실시하고, 래빗 항-SYP 항체(1:20,000) 및 항-칼넥신(1:2000) 항체를 각각 처리하여 반응시켰다. 이후 HRP가 접합된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA )를 1:2000으로 희석하여 반응시켰으며, enhanced chemiluminescence(Thermo Fisher Scientifc, Rockford, IL, USA)를 이용하여 특이적인 단백질 밴드를 검출하고 Image J 소프트웨어를 이용해 단백질 발현량을 정량하였다.
1-6. 면역형광염색법(Immunofluorescence staining)
세포를 24-웰 플레이트 각 웰 내의 커버슬립상에서 배양하고, 4% (w/v) 파라 포름알데히드가 함유된 0.1% (w/v) 피크르산(picric acid)/PBS로 고정시킨 다음, 항-SYP 항체(1:200)를 처리하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 이후 1:2000으로 희석한 Alexa Fluor® 488-접합된 염소 항-토끼 IgG 2차 항체를 처리하여 배양한 다음, 세포를 Vectashield로 슬라이드에 마운팅하였고, SYP-양성 세포는 형광현미경으로 촬영하였다. 신경돌기 성장(Neurite outgrowth)은 모든 양성으로 확인된 신경돌기-함유 세포에서 신경돌기의 길이를 측정함으로써 평가하였으며, 세포 당 평균 신경돌기의 길이는 Image J 소프트웨어를 이용하여 계산하였다.
일차 신경돌기의 길이는 세포체(soma)에서 가지(branch) 끝까지의 거리로 정의하였고, 이 분석을 위해 세포가 25 μm 이상(세포체의 평균 직경)이 되었을 때 가지는 신경돌기인 것으로 임의로 정의하였다. 각각의 그래프에서, 신경돌기 길이를 측정한 데이터는 3회의 독립적인 실험으로부터 적어도 5개의 독립적인 배양물에서 무작위로 선택된 영역으로부터 생성되었고, 각 실험에서 각 조건에 대해 100개 이상의 세포를 측정하였다.
1-7. miRNA의 TaqMan RT-qPCR
내인성 miRNA 발현수준을 측정하기 위해, 10 ng의 정제된 총 RNA를 TaqMan® MicroRNA 역전사 키트(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 역전사시켰다. 이를 통해 생성된 cDNA를 이용해 제조사의 지시에 따라 TaqMan® MicroRNA 어세이(Applied Biosystems)를 사용하여 PCR로 증폭시켰다. cDNA 증폭 및 검출은 CFX Connect™ 실시간 PCR 검출 시스템을 이용해 하기 조건으로 수행되었다: 95℃에서 10분 동안 초기 변성시킨 후, 95℃에서 15초 및 60℃에서 1분 과정을 40회 반복. miR-24-3p에 대한 Ct(threshold cycle) 값은 선형 증폭 단계 내에서 자동적으로 결정되었으며, 대조군인 U6 snRNA 값으로 보정하여 ΔCt 값을 계산하였다. 분리된 세포에서 miR-24-3p 발현수준(ΔΔCt)간의 상대적인 차이를 계산하고 fold induction(2-ΔΔCt)으로 나타내었다.
1-8. 통계분석
모든 정량적 데이터는 평균의 평균 ± 표준 오차(SEM)로 나타내었다. 각각의 실험에서, 모든 측정은 적어도 3회 수행되었으며, 데이터는 two-tailed, unpaired 스튜던트 t 검정을 사용하여 분석하였고, P 값이 < 0.05인 경우 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
실시예 2. miR-24-3p의 신경세포로의 분화 조절 검증
본 발명자들은 신경세포의 분화에 영향을 미칠 수 있는 마이크로RNA를 발굴하기 위해 연구한 결과, miR-24-3p가 신경아세포에서 신경세포로의 분화를 조절할 가능성이 있다고 판단하고 이의 영향을 검증하고자 하였다.
먼저, 신경세포로의 분화 동안 miR-24-3p의 발현수준 변화를 알아보기 위하여 SH-SY5Y 세포를 상기 실시예 1-2의 방법에 따라 신경세포로 분화시킨 후 상기 실시예 1-7에 기재된 TaqMan qPCR 분석을 통해 miR-24-3p의 수준을 정량화하였다. 그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 분화 유도 후 7일째(Day 7)에 miR-24-3p 수준이 분화 시작 (Day 0)과 비교하여 약 40% 감소된 것을 확인하였다. 이를 통해 miR-24-3p가 신경세포 분화를 음성적으로 조절하며, miR-24-3p의 발현을 저해함으로써 신경세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 알 수 있었다.
실시예 3. miR-24-3p 증가에 의한 신경세포의 분화 저해효과 검증
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 얻어진 결과를 검증하기 위하여, miR-24-3p의 모방체를 이용하여 신경세포로의 분화에 미치는 영향을 조사하였다.
이를 위해, 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 miR-24-3p의 모방체(miR-24-3p mimic) 및 대조군 모방체(Control mimic)를 SH-SY5Y 세포에 형질감염시킨 후 RA를 처리하고 7일 동안 신경세포로의 분화를 유도하였다. 7일 후 분화 유도된 신경세포에서 신경세포 특이적 유전자인 시냅토파이신(synaptophysin; SYP)의 발현수준을 측정한 결과, 도 2a 및 도 2b에 각각 나타낸 바와 같이 miR-24-3p의 모방체를 형질감염시킨 경우 SYP의 mRNA 및 단백질 수준이 대조군에 비하여 유의하게 감소된 것으로 나타났다.
또한, 상기 실시예 1-6에 기재된 방법에 따라 항-SYP 항체를 이용해 분화 유도된 신경세포를 면역염색하고 형광현미경으로 관찰하여 신경돌기의 길이를 측정하였다. 그 결과, 도 2c에 나타낸 바와 같이 miR-24-3p 모방체를 형질감염시킨 경우 대조군과 비교하여 신경돌기의 성장이 크게 감소된 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 도 2d의 신경돌기 길이의 정량결과를 통해서도 확인할 수 있었다. 상기 결과들을 통해 miR-24-3p의 발현을 증가시키는 경우 신경세포로의 분화가 저해되는 것을 알 수 있었다.
실시예 4. miR-24-3p 억제에 의한 신경세포의 분화 촉진효과 검증
본 발명자들은 상기 실시예 2의 결과에 더하여, 이와는 반대로 miR-24-3p의 억제제 처리 시 신경세포로의 분화가 촉진되는지 여부를 검증하고자 하였다.
이를 위해, 상기 실시예 1-3의 방법에 따라 miR-24-3p의 억제제(miR-24-3p inhibitor) 및 대조군 억제제(Control inhibitor)를 SH-SY5Y 세포에 형질감염시킨 후 RA를 처리하고 7일 동안 신경세포로의 분화를 유도하였다. 7일 후 분화 유도된 신경세포에서 신경세포 특이적 유전자인 SYP의 발현수준을 측정한 결과, 도 3a 및 도 3b에 각각 나타낸 바와 같이 miR-24-3p의 억제제를 형질감염시킨 경우 SYP의 mRNA 및 단백질 수준이 대조군에 비하여 유의하게 증가된 것으로 나타났다.
또한, 항-SYP 항체를 이용해 분화 유도된 신경세포를 면역염색하고 형광현미경으로 관찰한 결과, 도 3c에 나타낸 바와 같이 miR-24-3p 억제제를 형질감염시킨 경우 대조군과 비교하여 신경돌기의 성장이 크게 증가된 것으로 나타났으며, 이러한 결과는 도 3d의 신경돌기 길이의 정량결과를 통해서도 확인할 수 있었다. 상기 결과들을 통해 miR-24-3p의 발현을 억제시키는 경우 신경세포로의 분화가 촉진되는 것을 알 수 있었다.
종합적으로, 상기 결과들은 miR-24-3p가 신경세포 분화를 음성적으로 조절하며, 상기 miRNA를 저해함으로써 신경아세포에서 신경세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 입증하는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
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Claims (9)

  1. 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 억제제를 포함하는, 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 miR-24-3p의 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 분화 유도용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 시냅토파이신(synaptophysin; SYP)의 발현수준 또는 신경돌기의 길이를 증가시키는 것을 특징으로 하는, 분화 유도용 조성물.
  4. 마이크로RNA-24-3p(miR-24-3p)의 억제제를 신경아세포에 처리하는 단계를 포함하는, 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 miR-24-3p의 억제제는 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 안티센스 올리고뉴클레오티드인 것을 특징으로 하는, 분화 유도방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상기 miR-24-3p의 억제제 처리 후 신경아세포를 배양하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 분화 유도방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 배양은 레티노산(Retinoic acid)이 처리된 배지에서 5 내지 9일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, 분화 유도방법.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분화된, 신경세포.
  9. 제8항의 신경세포를 유효성분으로 포함하는, 세포치료제.
KR1020190175451A 2019-12-26 2019-12-26 마이크로RNA-24-3p의 억제제를 포함하는 신경아세포에서 신경세포로의 분화 유도용 조성물 및 방법 KR102285380B1 (ko)

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