WO2015105172A1 - ｍｉＲＮＡの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法 - Google Patents

ｍｉＲＮＡの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法 Download PDF

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Definitions

  • the present invention relates to a method for discriminating a desired cell type using miRNA expression as an index.
  • the tissues and organs of multicellular organisms are composed of many types of cells. Humans are composed of as many as 60 trillion (6 ⁇ 10 13 ) cells, and there are 411 types of mature cells alone. For these cells, not only analyzing the functions of individual cells but also techniques for discriminating and identifying cell types in the preparation of cells for medical applications.
  • a method for classifying cells for example, profiling of cells based on multivariate measurement using microarrays or next-generation sequencing is known.
  • profiling of cells based on multivariate measurement using microarrays or next-generation sequencing is known.
  • it is possible to classify cells quantitatively by simultaneously quantitatively measuring many types of intracellular molecules such as proteins and RNA, and using statistical analysis such as multivariate analysis. is there.
  • the measured cell is destroyed, there is a problem that it cannot be measured in a state where the cell is alive.
  • Micro RNA (hereinafter referred to as miRNA) has been attracting attention as a target that serves as an index for identifying cells.
  • miRNA RNA
  • a reporter assay performed by introducing a reporter construct using DNA or virus is used.
  • the reporter construct is incorporated into the genome of the host cell and remains, and the cells identified by this method have a problem during medical application.
  • detection of miRNA by a conventional reporter assay is aimed at searching for a target gene of the miRNA, and is not used for identifying a cell.
  • the present inventors quantitatively obtain miRNA expression information in living cells using mRNA having a specific structure, thereby discriminating a desired cell type from a group of cells including two or more types of cells. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention relates to a method for discriminating a desired cell type from a group of cells containing two or more types of cells, using miRNA expression as an index, including the following steps: (1) a step of introducing mRNA containing a first marker gene operably linked to a target sequence of miRNA serving as an index, and (2) a cell type using the translation amount of the first marker gene as an index The process of discriminating.
  • the step (1) is a step of simultaneously introducing two or more mRNAs having different miRNA target sequences serving as indices and different first marker genes into cells.
  • the desired cell type is a cell type with a low expression level of miRNA serving as an index
  • the step (2) is a step of discriminating a cell type with a high translation amount of the first marker gene. Preferably there is.
  • the desired cell type is a cell type with a high expression level of miRNA serving as an indicator
  • the step (2) is a step of discriminating a cell type with a low translation amount of the first marker gene. Preferably there is.
  • the target sequence of the miRNA is preferably linked to the 5 'side of the first marker gene.
  • the discrimination is performed using flow cytometry.
  • the determination is performed using an image analyzer.
  • the method further includes a step of screening miRNA serving as an index specific to a desired cell type before the step (1).
  • the present invention relates to a cell discrimination kit comprising mRNA containing a first marker gene operably linked to a target sequence of miRNA serving as an index.
  • the cell type can be discriminated with high resolution by using the miRNA activity which is intracellular information as an index. Since the method according to the present invention can be applied in a state where the cells are alive, it is particularly advantageous in that the cells after discrimination can be used in various applications, particularly in medical applications.
  • the method of the present invention can be carried out by introducing mRNA into a cell group, and this mRNA is decomposed with a half-life of about 1 day and rapidly removed from the cell. The virus infection and the remaining of DNA in this do not cause problems such as damage to the genome. It is also advantageous in a simple detection method using a cytometer.
  • the present invention for example, when differentiating a pluripotent stem cell into a specific cell, from a pluripotent stem cell having desired characteristics or a cell group obtained by differentiation induction from the pluripotent stem cell By discriminating the desired cell type, the desired cell can be classified, isolated or selectively excluded.
  • the method of the present invention can be used in the case where there is little difference in the expression of miRNA serving as an index between a plurality of cell types included in a cell group, for example, even when the expression is about 1.5 times or less.
  • two mRNAs containing the first marker gene operably linked to the target sequences of miRNA serving as two indicators those cells can be distinguished. This is based on the discovery that the activity ratio of the reporter protein expressed from the two co-introduced mRNAs is constant and has little variation within the cell population.
  • by increasing the types of mRNA to be co-introduced it becomes possible to discriminate a larger number of cells based on more indices.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating the technique of the present invention and the conventional technique for separating two different types of cells on a dot plot plane of flow cytometry.
  • FIG. 2 is a histogram showing the signal rate when miRNA-responsive reporter mRNA or control mRNA is introduced into two different cell types.
  • FIG. 3A is a series of diagrams showing two-dimensional separation of known cell lines by one or two miRNA-responsive reporter mRNAs.
  • FIG. 3B is a histogram showing the ratio of two fluorescent signals and a graph showing the cumulative curves of two miRNA-responsive reporter mRNAs.
  • FIG. 1 is a diagram schematically illustrating the technique of the present invention and the conventional technique for separating two different types of cells on a dot plot plane of flow cytometry.
  • FIG. 2 is a histogram showing the signal rate when miRNA-responsive reporter mRNA or control mRNA is introduced into two different cell types.
  • FIG. 3A is a series of diagrams showing two-dimensional separation
  • FIG. 3C is a diagram showing two-dimensional separation of a mixture of two known cell lines by one or two miRNA-responsive reporter mRNAs and a histogram showing the ratio of the two fluorescent signals.
  • FIG. 4 is a series of diagrams showing two-dimensional or three-dimensional separation of known cell lines by three or four miRNA-responsive reporter mRNAs.
  • FIG. 5A is a series of diagrams showing three-dimensional separation of three cell lines using four control mRNAs.
  • FIG. 5B is a series of diagrams showing three-dimensional separation of three cell lines using four miRNA-responsive reporter mRNAs.
  • FIG. 6 is a diagram showing the influence of the insertion site of the miRNA target sequence on the translation efficiency in the miRNA-responsive reporter mRNA.
  • FIG. 7 is a diagram showing that miRNA-responsive reporter mRNA does not exert an inhibitory effect on intracellular miRNA activity.
  • FIG. 8 is a graph showing the translation efficiency of 20 selected miRNA-responsive reporter mRNAs in 3 cell lines.
  • FIG. 9A is a series of diagrams showing two-dimensional separation of two cell lines using two miRNA-responsive reporter mRNAs.
  • FIG. 9B is a series of diagrams showing two-dimensional separation of two cell lines using two miRNA-responsive reporter mRNAs.
  • FIG. 9C shows two-dimensional separation of a mixture of two cell lines using two miRNA-responsive reporter mRNAs.
  • FIG. 10 is a diagram showing a colored image of a cell and two-dimensional separation of a known cell line in a discrimination method using an imaging analyzer.
  • FIG. 11A is a diagram showing two-dimensional separation using three types of miRNA-responsive reporter mRNAs by flow cytometry and imaging cytometry.
  • FIG. 11B is a diagram showing two-dimensional separation using miRNA-responsive reporter mRNA linked to three types of nuclear localization signal genes by flow cytometry and imaging cytometry.
  • FIG. 12A shows a screening result of miRNA response reporter mRNA for use in separation in IMR-90 in Example 9, and a flow site when miRNA response reporter mRNA is co-introduced into IMR-90 with and without TGF stimulation. It is a figure which shows a measurement analysis result.
  • FIG. 12B is a diagram showing the results of FIG. 12A (c) and FIG. 12C (f) in a histogram.
  • FIG. 12A shows a screening result of miRNA response reporter mRNA for use in separation in IMR-90 in Example 9, and a flow site when miRNA response reporter mRNA is co-introduced into IMR-90 with and without T
  • FIG. 12C is a diagram showing an imaging cytometry analysis result in the case of co-introducing a miRNA-responsive reporter mRNA that expresses a reporter protein that is nuclear-localized in IMR-90 with and without TGF stimulation.
  • FIG. 13 shows the results of screening miRNA response reporter mRNA for use in separation in NHLF in Example 10 and using the same cell population NHLF positive highly correlated miRNA set or not miRNA set. It is a figure which shows the result of having separated and analyzed.
  • FIG. 14 is a diagram showing the results of comparing the results of the first screening between a cell line (IMR-90) and a primary cell line (NHLF).
  • FIG. 15 is a diagram schematically showing an expected result when there are two miRNA activity distributions in a cell group when it is assumed that a certain cell group has taken in the same amount of mRNA.
  • FIG. 16 is a diagram showing the results of co-introducing four types of miRNA-responsive mRNAs selected based on the results of the second screening into IMR-90 as a three-dimensional density plot.
  • FIG. 17 (a) shows control miRNA (hmAG1-M9) and miRNA response reporter to IMR-90 without stimulation (-TGF- ⁇ 1; left) or with stimulation (+ TGF- ⁇ 1; right) with TGF- ⁇ 1.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the imaging cytometry analysis result at the time of co-introducing mRNA ((alpha) (miR-145-5p) -hmKO2-M9).
  • Bright Field indicates a phase contrast image
  • hmAG1 indicates a fluorescence image of hmAG1
  • APC indicates a staining image with ⁇ SMA antibody
  • hmKO2 indicates a fluorescence image of hmKO2
  • Hoechist indicates nuclear staining.
  • An image is shown, and ratio indicates a superimposed fluorescent image.
  • 17 (b) shows that control mRNA (hmAG1-M9) and miRNA response reporter mRNA (stimulated with TGF- ⁇ 1 to IMR-90 without stimulation (-TGF- ⁇ 1: green) or with stimulation (+ TGF- ⁇ 1: purple)). It is a figure which shows the flow cytometry analysis result at the time of co-introducing (alpha) (miR-145-5p) -hmKO2-M9).
  • the present invention relates to a method for discriminating a desired cell type from a group of cells including two or more types of cells using miRNA expression as an index.
  • the discrimination method according to the present embodiment includes the following steps: (1) a step of introducing mRNA containing a first marker gene operably linked to a target sequence of miRNA serving as an index, and (2) a cell type using the translation amount of the first marker gene as an index The process of discriminating.
  • the target cell group is a cell group containing two or more types of cells, and may be a cell group collected from a multicellular species, and the isolated cells are cultured.
  • the cell group obtained by this may be sufficient.
  • the cell group is particularly a cell group containing two or more types of somatic cells collected from mammals (eg, humans, mice, monkeys, pigs, rats, etc.), or cells or mammalian cells isolated from mammals A cell group obtained by culturing a strain.
  • somatic cells include keratinized epithelial cells (eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells of the tongue surface), exocrine glandular epithelial cells (eg, mammary cells), hormone-secreting cells (eg, , Adrenal medullary cells), metabolism / storage cells (eg, hepatocytes), luminal epithelial cells that make up the interface (eg, type I alveolar cells), luminal epithelial cells of the inner chain (eg, blood vessels) Endothelial cells), ciliated cells with transport ability (eg, airway epithelial cells), cells for extracellular matrix secretion (eg, fibroblasts), contractile cells (eg, smooth muscle cells), blood and immune system Cells (eg, T lymphocytes), sensory cells (eg, sputum cells), autonomic nervous system neurons (eg, cholinergic neurons), sensory organs and peripheral neuron support cells
  • undifferentiated progenitor cells including somatic stem cells
  • terminally differentiated mature cells It can be used as the source of somatic cells in the invention.
  • undifferentiated progenitor cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • the mammal individual from which somatic cells are collected is not particularly limited, but is preferably a human.
  • a preferable cell group is a cell group that has been subjected to artificial manipulation after collecting somatic cells, and is a cell group that may contain undesired cells.
  • a cell group comprising iPS cells prepared from the somatic cells, or a cell group obtained after differentiating pluripotent stem cells exemplified by ES sputum cells and iPS cells, and the desired cells It is a cell group which can contain the differentiated cell besides.
  • the cell group to be discriminated is in a living state.
  • the cell being in a viable state means a cell in a state where metabolic capacity is maintained.
  • the present invention can be used for the subsequent use while the cells are subjected to the method of the present invention and remain in a viable state, particularly while maintaining their division ability, without losing their natural characteristics even after completion of the discrimination method. This is advantageous.
  • the “desired cell type” is a group of cells classified as other cell types using miRNA expression as an index. In particular, it refers to a group of cells with common characteristics for miRNA activity, which will be described in detail later.
  • a group of cells classified as other cell types using such miRNA as an index is also referred to as “same type of cells”.
  • the desired cell type discriminated by the method of the present invention may be one or more, for example, three, four, five, six, seven, or eight or more. Also good.
  • the cell types that can be discriminated are not limited. According to the present invention, 100 or more cell types can be discriminated simultaneously.
  • “discriminating a desired cell type” means that a desired specific one or more cell types can be detected differently from other cell types from a group of cells including two or more types of cells.
  • the visually recognizable information is not limited to emitting a signal that can be directly recognized by the cell, but visually recognizes the signal emitted by the cell by a numerical value, a chart, an image, or the like. Information that has been converted into possible information and that can be visually recognized by those skilled in the art.
  • the term “discriminate” includes the recognition of a desired cell type, the identification of the desired cell type, the identification of the desired cell type, the classification of the desired cell type, and the desired cell type. Isolated cell types, removing unwanted cell types, determining the viability of the desired cell type, detecting or quantifying specific biological signals of the desired cell type, It may include fractionation based on a physical or chemical signal.
  • One aspect of discriminating a desired cell type in the present invention is that a cell group that is unknown to contain two or more types of cells is discriminated as a different cell type by using the method of the present invention. Eggplant.
  • the mode of discriminating a desired cell type from the group of cells containing two or more types of cells using the expression of miRNA as an index includes the above-mentioned various modes of discrimination, as well as the “cell group containing two or more types of cells” Are known to some extent in advance, and there is no information about the attribute of the cell group.
  • the case where the attribute of the cell group is known to some extent is a case where the cell type included in the cell group is specified to some extent by another method or the like in advance.
  • the Omics analysis / profiling method which is a profiling method based on multivariate measurement using microarrays and next-generation sequencing, etc., can be applied to specific cell groups as described in the prior art.
  • the specific cell types involved may have been previously analyzed and predicted. Even in such a case, it is useful to discriminate a desired cell type by the method of the present invention while the cells are alive. On the other hand, the present invention can be applied even when there is no information about the attributes of the cell group.
  • the screening method in the step of screening for miRNA serving as an index may be different.
  • Such a screening step may be included in the method of the present invention as an optional pre-step. Details will be described later in the screening step.
  • a messenger RNA (mRNA) containing a first marker gene operably linked to a target miRNA target sequence (hereinafter also referred to as miRNA target sequence) is used.
  • miRNA target sequence a target miRNA target sequence
  • mRNA target sequence a target miRNA target sequence
  • a specific miRNA when a specific miRNA is present, translation of the first marker gene is controlled according to the abundance.
  • the translation of the first marker gene is suppressed according to the amount of the miRNA present, whereby a protein translated from the first marker gene (hereinafter referred to as a marker protein) MRNA) in which the amount of
  • miRNA expression refers to the presence of miRNA in a state in which mature miRNA interacts with a plurality of predetermined proteins to form an RNA-induced silencing complex (RISC).
  • RISC RNA-induced silencing complex
  • miRNA is a single-stranded RNA (20-25 bases), and is generated from pre-miRNA by cleavage by Dicer outside the nucleus, and “pre-miRNA” is obtained by partial cleavage by a nuclear enzyme called Drosha, It originates from pri-mRNA, a single-stranded RNA transcribed from DNA.
  • the miRNA in the present invention is appropriately selected from at least 10,000 types of miRNA.
  • miRNA registered in database information for example, http://www.mirbase.org/ or http://www.microrna.org/
  • database information for example, http://www.mirbase.org/ or http://www.microrna.org/
  • literature information described in the database Is appropriately selected from the miRNAs described in 1. That is, in the present invention, the miRNA serving as an index is not limited to a specific miRNA. An miRNA serving as an index can be appropriately selected according to the characteristics of the cell type determined using the method of the present invention. In particular, in a cell group to be determined, one miRNA or a plurality of miRNAs that are highly expressed (high activity) in one cell and low expressed (low activity) in another cell. It is preferable to select a combination. This is to increase the accuracy of separation.
  • Such miRNA serving as an index is not limited to the miRNA specified at the time of the present application, and includes any miRNA whose presence and function will be specified in the future.
  • the miRNA target sequence refers to a sequence that can specifically bind to an indicator miRNA.
  • the miRNA target sequence is preferably, for example, a sequence that is completely complementary to the indicator miRNA.
  • the miRNA target sequence may have a mismatch (mismatch) with a completely complementary sequence as long as it can be recognized in the miRNA.
  • the mismatch from the sequence that is completely complementary to the miRNA may be any mismatch that can be normally recognized by the miRNA in the desired cell, and the mismatch of about 40 to 50% in the original function in the cell in vivo. There is no problem.
  • mismatch is not particularly limited, but 1 base, 2 bases, 3 bases, 4 bases, 5 bases, 6 bases, 7 bases, 8 bases, 9 bases, or 10 bases or 1% of the total recognition sequence, 5% %, 10%, 20%, 30%, or 40% discrepancy.
  • the part other than the seed region that is, the 5 'side in the target sequence corresponding to about 3' side 16 A region may contain a number of mismatches, and portions of the seed region may contain no mismatches, or may contain 1 base, 2 bases, or 3 bases mismatches.
  • the first marker gene is a gene that is translated in a cell, functions as a marker, and encodes an arbitrary protein that enables discrimination of the cell type.
  • proteins that can be translated into cells and function as markers include, for example, proteins that can be visualized and quantified by assisting fluorescence, luminescence, coloration, or fluorescence, luminescence, or coloration. It may be.
  • fluorescent proteins blue fluorescent proteins such as Sirius and EBFP; cyan fluorescent proteins such as mTurquoise, TagCFP, AmCyan, mTFP1, MidoriishiCyan, and CFP; TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green (for example, hmAG1), ZsGreen, EmGFP, Green fluorescent proteins such as EGFP, GFP2, and HyPer; Yellow fluorescent proteins such as TagYFP, EYFP, Venus, YFP, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, and mBanana; Orange fluorescent proteins such as KusabiraOrange (for example, hmKO2) and mOrange Red fluorescent proteins such as TurboRFP, DsRed-Express, DsRed2, TagRFP, DsRed-Monomer, AsRed2, mStrawberry, etc .; TurboFP602, mRFP1, JRed, KillerRed, mCherry, H
  • a photoprotein is aequorin, but is not limited thereto.
  • proteins that assist fluorescence, luminescence, or coloration include, but are not limited to, enzymes that decompose fluorescence, luminescence, or color precursors such as luciferase, phosphatase, peroxidase, and ⁇ -lactamase.
  • the corresponding precursor is brought into contact with the cell, or the cell is accommodated. This can be done by introducing a precursor that
  • a protein that can function as a marker in a cell is a protein that directly affects the function of the cell.
  • Cell growth protein, cell death protein, cell signal factor, drug resistance gene, transcription control factor, translation control factor, differentiation control factor, reprogramming induction factor, RNA binding protein factor, chromatin control factor, membrane protein can be exemplified However, it is not limited to these.
  • a cell growth protein functions as a marker by proliferating only cells that express it and specifying the proliferated cells.
  • the cell killing protein causes cell death of the cell expressing it, thereby killing the cell itself containing or not containing a specific miRNA, and functions as a marker indicating cell viability.
  • the cell signal factor functions as a marker by the cell that expresses it emits a specific biological signal and specifies this signal.
  • the cell killing protein include Bax and Bim.
  • the translation control factor functions as a marker by controlling translation from other mRNAs to proteins by recognizing and binding to the tertiary structure of specific RNA.
  • Translation control factors include 5R1, 5R2 (Nat Struct Biol. 1998 jul; 5 (7): 543-6), B2 (Nat Struct Mol Biol. 2005 Nov; 12 (11): 952-7), Fox-1 ( EMBO J. 2006 Jan 11; 25 (1): 163-73.), GLD-1 (J Mol Biol. 2005 Feb 11; 346 (1): 91-104.), Hfq (EMBO J.
  • a more preferable translation control factor is MS2 coat, L7Ae.
  • the first marker gene may include a gene encoding a localization signal.
  • the localization signal include a nuclear localization signal, a cell membrane localization signal, a mitochondrial localization signal, a protein secretion signal, and the like.
  • a classical nuclear translocation sequence (NLS), M9 Examples include, but are not limited to, sequences, mitochondrial target sequences (MTS), and endoplasmic reticulum translocation sequences.
  • NLS nuclear translocation sequence
  • M9 Examples include, but are not limited to, sequences, mitochondrial target sequences (MTS), and endoplasmic reticulum translocation sequences.
  • Such a localization signal is particularly advantageous when the discrimination step in the method of the present invention is performed on an image by imaging cytometry or the like described later.
  • mRNA having a second marker gene whose translation is controlled by the translation control factor is simultaneously introduced into the cell.
  • An example of an mRNA having a second marker gene whose translation is controlled by such a protein is an mRNA having a second marker gene sequence operably linked to an RNA sequence capable of binding the protein capable of controlling the translation.
  • the mRNA disclosed in WO2009 / 066757 or WO2014 / 014122 can be mentioned.
  • the entire disclosure of said publication is hereby incorporated by reference.
  • a person skilled in the art can appropriately select an mRNA having a second marker gene whose translation is controlled by a protein that can be suitably used in the method of the present invention by referring to the above publication.
  • the second marker gene to be used can be the same gene as the first marker gene described above.
  • the mRNA used in the method of the present invention includes a first marker gene operably linked to a target sequence of miRNA serving as an index.
  • a target sequence of miRNA serving as an index.
  • such mRNA is also referred to as miRNA-responsive reporter mRNA.
  • the miRNA target sequence and the first marker gene are functionally linked to each other in the 3′UTR in the 5′UTR of the open reading frame (including the start codon) encoding the first marker gene.
  • the mRNA preferably comprises a Cap structure (7 methyl guanosine 5 'phosphate), an open reading frame encoding the first marker gene, and a poly A tail in the 5' to 3 'direction from the 5' end.
  • At least one miRNA target sequence is provided in the 5′UTR, in the 3′UTR, and / or in the open reading frame.
  • the location of the miRNA target sequence in the mRNA may be 5'UTR or 3'UTR, may be within the open reading frame (3'side of the start codon), An array may be provided.
  • the number of miRNA target sequences may be one, two, three, four, five, six, seven, eight or more.
  • one miRNA target sequence is present in the 5 'UTR. This is because efficient translation suppression can be achieved.
  • the number of bases and the kind of base between the cap structure and the miRNA target sequence may be arbitrary as long as they do not include AUG as an initiation codon and do not constitute a stem structure or a three-dimensional structure.
  • the number of bases between the cap structure and the miRNA target sequence can be designed to be 0 to 50 bases, preferably 10 to 30 bases.
  • the number of bases and the type of base between the miRNA target sequence and the start codon may be arbitrary as long as they do not constitute a stem structure or a three-dimensional structure, and the number of bases between the miRNA target sequence and the start codon is 0 to It can be designed to be 50 bases, preferably 10 to 30 bases. It has been confirmed that translational suppression can be achieved even when four miRNA target sequences are present in the 3'UTR.
  • the miRNA-responsive reporter mRNA preferably contains a modified base such as pseudouridine or 5-methylcytidine instead of ordinary uridine and cytidine. This is to reduce cytotoxicity.
  • the positions of the modified bases can be all or part of the uridine and cytidine independently, and if they are part of the base, they can be random positions at an arbitrary ratio.
  • the miRNA-responsive reporter mRNA can be synthesized by those skilled in the art by any method known in genetic engineering if the sequence is determined according to the above. In particular, it can be obtained by an in vitro transcription synthesis method using a template DNA containing a promoter sequence as a template.
  • the miRNA-responsive reporter mRNA may be used alone, depending on the purpose, target, or indicator miRNA activity, and may be used in two or more types, for example, 3, 4, 5, 6, 7, Or 8 or more types may be used.
  • each miRNA-responsive reporter mRNA is different for both the miRNA target sequence and the first marker gene.
  • the number of miRNA target sequences contained in the miRNA-responsive reporter mRNA, the distance from the 5 ′ end of the miRNA target sequence, and other structures in the miRNA-responsive reporter mRNA The characteristic features may be different for each miRNA-responsive reporter mRNA.
  • the step of introducing miRNA-responsive reporter mRNA into cells includes lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method,
  • One or more miRNA-responsive reporter mRNAs are directly introduced into cells included in a cell group using a gene gun method or the like.
  • a control mRNA hereinafter also referred to as control mRNA
  • a plurality of mRNAs can be shared in a cell group. It is preferable to introduce.
  • control mRNA refers to an mRNA that has no miRNA target site and encodes a marker gene different from the first marker gene encoded by the miRNA-responsive reporter mRNA.
  • the amount of control mRNA introduced can also be appropriately selected by those skilled in the art to obtain a desired translation amount.
  • the amount of translation of the first marker gene encoded by the miRNA-responsive reporter mRNA is controlled, for example, when a given miRNA exists as RISC in the cell. The amount is suppressed. The translation amount is quantitatively controlled according to the miRNA activity.
  • the predetermined miRNA does not exist in the cell, or when the predetermined miRNA does not exist as RISC, the translation amount of the first marker gene encoded by the miRNA-responsive reporter mRNA is not suppressed. Therefore, the amount of translation of the first marker gene differs between cells in which the predetermined miRNA is present as RISC and cells that are not present.
  • the case where a predetermined miRNA is present as RISC is also referred to as “when miRNA activity is present”.
  • the control mRNA expresses the marker protein regardless of the miRNA activity. This is because even when introduced, the miRNA target sequence does not exist, and therefore translational control is not performed according to the miRNA expression level.
  • a step of discriminating cells (hereinafter also referred to as a discriminating step) is performed using the translation amount of the first marker gene as an index.
  • the discrimination step cells are discriminated from the translation amount of the first marker gene as described above. That is, the step of discriminating cells in which the desired cell type is a cell in which the expression level of miRNA serving as an indicator is low and the translation amount of the first marker gene is high, and / or the desired cell type
  • the cell can be a step of discriminating cells that have a high miRNA expression level and a low translation amount of the first marker gene.
  • Cells with a low or high expression level of miRNA serving as an index are determined by obtaining the ratio of the translation amount of the first marker gene between cells belonging to a cell group containing two or more types of cells. be able to.
  • the cell is discriminated from the translation amount of the second marker gene simultaneously introduced into the cell.
  • the translation amount of the second marker gene is proportional to the expression level of miRNA serving as an index.
  • the desired cell type is a cell with a low expression level of miRNA serving as an index
  • a cell with a low translation level of the second marker gene is identified, and a cell with a high expression level of miRNA serving as an index
  • the cells with a large amount of translation of the second marker gene are discriminated. Therefore, for example, when a cell death protein is used as the second marker gene, cells with a high expression level of miRNA serving as an indicator can be specifically induced to be removed and removed.
  • the discrimination step can be performed by detecting a signal from the marker protein using a predetermined detection device.
  • the detection device include, but are not limited to, a flow cytometer, an imaging cytometer, a fluorescence microscope, a light emission microscope, and a CCD camera.
  • a detection apparatus those suitable for those skilled in the art can be used depending on the marker protein and the mode of discrimination.
  • the marker protein when the marker protein is a fluorescent protein or a luminescent protein, the marker protein can be quantified using a detection device such as a flow cytometer, an imaging cytometer, a fluorescence microscope, or a CCD camera.
  • a marker protein quantification method using a detection device such as a luminescence microscope, a CCD camera, or a luminometer is possible.
  • a detection device such as a luminescence microscope, a CCD camera, or a luminometer
  • the marker protein is a membrane-localized protein
  • cell surface protein-specific detection reagents such as antibodies and marker protein quantification methods using the above detection devices
  • cells that have not undergone the marker protein quantification process such as magnetic cell separator (MACS)
  • the marker protein is a drug resistance gene
  • the first marker gene can be generated by drug administration. To detect, it is possible method of isolating live cells.
  • Flow cytometry can provide the intensity of light emitted from fluorescent proteins and luminescent enzymes, which are marker proteins translated in individual cells, as discrimination information.
  • fluorescent proteins and luminescent enzymes which are marker proteins translated in individual cells, as discrimination information.
  • the mode of cell type discrimination using one or more miRNA-responsive reporter mRNAs using flow cytometry will be described in each case.
  • a control mRNA can be co-introduced into a cell. It can be said that the translation of the first marker gene of the control mRNA is constant by the cell without being affected by the miRNA.
  • Control mRNA can be designed and prepared in the same manner as miRNA-responsive reporter mRNA except that it does not have a miRNA target site.
  • “dimension” refers to the “dimension” of the translation ratio of the marker gene, particularly the ratio of the measured fluorescence intensity values.
  • the activity ratio of the marker protein expressed from the two mRNAs is constant and small in the cell population. Therefore, by obtaining the ratio of the fluorescence intensity of the marker protein expressed from the two mRNAs, the expression ratio of specific miRNA in each cell can be obtained.
  • the expression ratio of the marker protein is almost constant among the same type of cells, but there is some variation. This is due to the following reasons. (1) The miRNA expression level varies somewhat between the same type of cells. (2) There is also variation in the reaction rate between the expressed miRNA and the co-introduced mRNA. (3) There is some variation in the cell introduction ratio of the two mRNAs to be co-introduced. As a result, there may be some difference in the expression ratio of the marker protein between the same type of cells.
  • the dot plot when the expression intensity of the marker protein encoded by the miRNA-responsive reporter mRNA and the expression intensity of the marker protein encoded by the control mRNA are taken as the X-axis and Y-axis, respectively.
  • allogeneic cells are distributed in a wide band. This width is due to the variation. A plurality of band-like plots corresponding to the number of different cell types appear, and these cells can be distinguished when they are separated.
  • the same type of cells are distributed in a wide band shape.
  • FIG. 1A there are three strip-shaped plot groups. The strips on the paper, top left and bottom right show two different cell groups discriminated on the dot plot plane by co-introducing two miRNA-responsive reporter mRNAs.
  • the middle band plot schematically shows the expression intensity of the marker protein when only control mRNA is introduced into the same cell group as a control experiment. Two different cell groups are discriminated on the dot plot plane. I can't.
  • miRNA (a) is more highly expressed (high activity) in one cell A
  • miRNA (b) is higher in the other cell B.
  • the resolution is increased.
  • the translation of miRNA (a) -responsive mRNA is suppressed in one cell A
  • the translation of miRNA (b) -responsive mRNA is suppressed in the other cell B
  • an arrow from right to left on the paper surface along the X axis and an arrow from top to bottom along the Y axis indicate translation suppression in different directions.
  • the translational suppression of cell A is ⁇ -fold ( ⁇ > 1) stronger than that of cell B
  • the translational suppression of cell B is cell A.
  • ⁇ times ( ⁇ > 1) stronger than ⁇ ⁇ ⁇ is approximately 1.9 times or more
  • cell A and cell B can be distinguished on a flow cytometry dot plot. . If it is preferably 2.0 times or more, more preferably 2.5 times or more, the cells A and B can be more clearly distinguished.
  • the determination can also be made by developing a histogram based on the ratio of two fluorescence values obtained from two mRNAs (for example, the lower left histogram in FIG. 1A). By discriminating using such a ratio, the difference in mRNA introduction efficiency between cells can be offset.
  • FIG. 2 is a diagram schematically showing the principle of the present invention for discriminating between cell type A and cell type B with high resolution.
  • FIG. 1A described above when the fluorescence intensity of a plurality of different miRNA-responsive reporter mRNAs is observed, they are observed as separated bands on a flow cytometry dot plot. From this, it can be seen that the ratio value of the plurality of fluorescence intensity values (lower left of FIG. 1A) gives better separation. That is, when two kinds of mRNA are introduced, two kinds of fluorescence intensity values can be measured, and one kind of fluorescence intensity ratio can be obtained.
  • FIG. 2 (a) is a histogram showing the signal rates when miRNA-responsive reporter mRNA and control mRNA are introduced into two different cell groups A and B, respectively.
  • the distribution width of the fluorescence intensity ratio that is, the width of the band shown on the dot plot is four times.
  • the histogram From the above, it can be seen that two types of cell groups can be separated.
  • FIG. 2B is a schematic diagram illustrating this embodiment that enables high resolution even when there is only a slight difference in translation efficiency. That is, when introduced into cell A, the first miRNA-responsive mRNA (fluorescence intensity FL1 obtained by flow cytometry) that does not require translation efficiency about twice that of control mRNA is introduced into cell B.
  • the second miRNA-responsive mRNA fluorescence intensity FL2 obtained by flow cytometry
  • these two miRNA responses It is shown that sufficient separation can be achieved by using sex reporter mRNA.
  • the translational inhibition of cell A is ⁇ -fold ( ⁇ > 1) stronger than that of cell B
  • the translational suppression of cell B is Assuming that ⁇ times ( ⁇ > 1) stronger than A, the integrated value of ⁇ ⁇ ⁇ is equal to or greater than the distribution width of the certain cell type shown in FIG. 2 (in this figure, four times as an example). If so, the cells A and B can be separated.
  • the four-fold width exemplified here can be said to be a case where a relatively wide width has been created, that is, a case where the degree of difficulty is high.
  • the case of co-introducing a third miRNA-responsive reporter mRNA targeting miRNA (c) will be described.
  • the expression intensity of the first marker protein encoded by the first miRNA-responsive reporter mRNA measured by flow cytometry is FL1
  • the expression intensity of the second marker protein encoded by the second miRNA-responsive reporter mRNA is FL2
  • the expression intensity of the third marker protein encoded by the third miRNA-responsive reporter mRNA is FL3.
  • Two-dimensional separation using three types of miRNA-responsive reporter mRNAs makes it possible to discriminate and separate 25 to 60 or more types of cells whose miRNA activity is different by a factor of two. As described above, in theory, if the integrated value of translation efficiency of two types of miRNA-responsive reporter mRNAs in two types of cells is 1.9 times or more, two types of cells are displayed on the flow cytometry dot plot. It is because it can distinguish. Therefore, two-dimensional separation using three types of miRNA-responsive reporter mRNA can be used practically in discrimination of cell types.
  • Three-dimensional separation using four miRNA-responsive reporter mRNAs In the same manner as in the above embodiment d, three-dimensional separation can be performed using four types of miRNA-responsive reporter mRNAs. That is, when four types of mRNA are introduced, four types of fluorescence intensity values can be measured, and three types of fluorescence intensity ratios can be obtained. Therefore, the target cells are distributed and separated three-dimensionally (in the fluorescence intensity ratio space).
  • a first miRNA-responsive reporter mRNA that targets miRNA (a) to two different cells A and B, and a second miRNA-responsive reporter mRNA that targets miRNA (b) A case where a third miRNA-responsive reporter mRNA targeting miRNA (c) and a fourth miRNA-responsive reporter mRNA targeting miRNA (d) are co-introduced will be described.
  • the expression intensity of the first marker protein encoded by the first miRNA-responsive reporter mRNA measured by flow cytometry is FL1
  • the expression intensity of the second marker protein encoded by the second miRNA-responsive reporter mRNA is FL2
  • the expression intensity of the third marker protein encoded by the third miRNA-responsive reporter mRNA is FL3
  • the expression intensity of the fourth marker protein encoded by the fourth miRNA-responsive reporter mRNA is FL4.
  • Imaging cytometry can be performed using an image analyzer.
  • the image analyzer can obtain information on the temporal change in the translation amount of the first marker gene in the cell, is excellent in terms of imaging and visualization, and can improve the amount of analysis per unit time. , Analysis including cell morphology and location information, identification of cells attached to culture vessels, and cells targeted for planar or three-dimensionally organized cells It is advantageous.
  • the fluorescence intensity ratio of the cells can be converted into color information, and the discrimination process can be used more visually.
  • a plurality of miRNA-responsive reporter mRNAs are designed to include a sequence encoding a nuclear localization signal, for example, M9.
  • the marker protein is translated in the cell while being fused to the nuclear localization signal, and the marker protein is localized in the nucleus in the cell, thereby obtaining a clearer fluorescence image of the cell. it can.
  • a step of screening miRNA as an index is included as an optional pre-process.
  • the screening step one or a plurality of miRNAs having different activities are selected in a plurality of types of cells included in or predicted to be included in the “cell group including two or more types of cells” to be measured. This is to achieve the desired resolution described above.
  • the cell types included in the cell group are known to some extent, one miRNA that is highly expressed (high activity) in one cell A and low expressed in another cell B is selected.
  • miRNA (a) that is highly expressed (high activity) in one cell A and low expressed (low activity) in another cell B, and certain cell A miRNA (a) that is highly expressed (high activity) in one cell A and low expressed (low activity) in another cell B, and certain cell A .
  • a combination of miRNAs that is miRNA (b) that is low expression (low activity) and high expression (high activity) in another cell B is selected. Based on one or more miRNAs determined in this step, the miRNA target sequence in the miRNA-responsive reporter mRNA is determined.
  • the screening process can be performed by a method including the following three steps.
  • a plurality of miRNAs selected from the miRNA library are screened.
  • miRNA-responsive reporter mRNAs are prepared that target each miRNA and encode the same fluorescent protein.
  • each miRNA-responsive reporter mRNA and a control mRNA encoding another fluorescent protein are co-introduced into each of known cells A and B, and translation efficiency (marker protein / miRNA responsiveness translated from control mRNA) is introduced.
  • the second step among the translation efficiency values measured in the first step, two, three, or four types are combined, and a vector composed of these values is assigned to each of cell A and cell B.
  • the coordinate vector (for example, XY coordinates, XYZ coordinates, or arbitrary n-dimensional coordinates (n is an integer of 4 or more)), and calculates the distance between the cells at the coordinates.
  • the shortest distance is calculated among the distances between all the included two cells.
  • the third step increases the distance between the cells calculated in the second step, a set of miRNAs, each of which encodes a different fluorescent protein gene, with 2, 3, or 4 miRNAs as target sequences.
  • Responsive reporter mRNA is prepared.
  • a set of miRNA-responsive reporter mRNAs is co-introduced into cells A and B, or each of three or more cells, and tested for separability.
  • the distribution of the fluorescence ratio of each cell appears in a different region, and the result of the test that the overlap between the distributions is small is used in the following introduction step and discrimination step. preferable.
  • the first step of the screening process separation using another technique is simultaneously performed, and the translation efficiency for each separated cell, that is, An operation such as measuring the value of miRNA activity is further required.
  • Separation methods different from the present invention include, for example, fixing cells at the time of separation, permeating the membrane and detecting intracellular factors using antibodies, or modifying genes in advance even in living cells, although the technique using the cells (reporter line etc.) used for the purpose of a screening process can be considered, it is not limited to these methods.
  • the second step and the third step can be performed in the same manner as described above. This screening method is demonstrated in Example 9.
  • the above-described screening step is performed as a screening step including the following first to fourth steps. Can be substituted.
  • the miRNA activity value of the cell group is measured, and the distribution of miRNA activity exhibited by individual cells in the cell group is obtained.
  • multiple types of miRNAs that exhibit a wide distribution of miRNA activity are selected. For example, it is preferable to select 6 to 10 types of miRNA.
  • the second step creates a set of combinations of 2, 3, or 4 of the miRNAs selected in the first step.
  • a set of miRNA-responsive reporter mRNAs each encoding a different fluorescent protein gene is prepared using two, three, or four miRNAs contained in one set as target sequences.
  • a set of miRNA-responsive reporter mRNAs composed of two, three, or four miRNA-responsive reporter mRNAs prepared in the second step is co-introduced into a cell group, Analyzes the correlation of miRNA activity within a cell population.
  • the fourth step is a set of miRNA-responsive reporter mRNAs composed of two, three, or four miRNA-responsive reporter mRNAs based on the correlation of miRNA activity analyzed in the third step. Is newly prepared, co-introduced into the cell population, and tested for separability. Among the multiple sets, the results of the test that the fluorescence ratio distribution of the cell group is separated into two, three, four, or more groups are obtained in the following introduction step and discrimination step. It is preferable to use it.
  • the discrimination method of the present invention is a method for providing a definition of a new cell type. This screening method is demonstrated in Examples 10 and 11.
  • Another optional pre-step may include a step of synthesizing miRNA-responsive reporter mRNA.
  • a miRNA-responsive reporter mRNA having a miRNA target sequence targeting them or a combination of miRNA-responsive reporter mRNA is synthesized.
  • a step of separating cells may be included after the discrimination step.
  • the present invention also comprises at least one miRNA-responsive reporter mRNA or a combination of two or more miRNA-responsive reporter mRNAs, and optionally further comprises a control mRNA.
  • a kit for discrimination of cell types Such a kit may be formed by enclosing the miRNA-responsive reporter mRNA described above or a combination of two or more miRNA-responsive reporter mRNAs in a storable container. Moreover, you may provide the description about a usage method.
  • the IVT template (template DNA for mRNA synthesis) of the control tagRFP mRNA (SEQ ID NO: 24) was PCR amplified from the plasmid pSRT-tagRFP using T7Fwd5UTR and Rev120A primer sets.
  • a multi-cloning site of pGEM T-easy (Promega) was modified by PCR-based site directed mutagenesis using a primer set of FwdMCS and RevMCS to obtain a pAM empty vector.
  • a DNA fragment obtained by digesting pCDFDuet-1 (Novagen) with NheI and AgeI was blunt-ended and inserted into a DNA fragment digested with pAM DraI to generate a pSM empty vector.
  • the oligo DNA pair Code5UTR and Comp5UTR is annealed and inserted into the EcoRI-NcoI site, and then the annealed Code3UTR and Comp3UTR is inserted into the XbaI-HindIII site (or “site”).
  • tagRFP coding sequence was PCR amplified using an appropriate primer set, digested with NcoI and BglII, and inserted into the NcoI and BglII sites of pSRT to obtain pSRT-tagRFP.
  • the coding regions of hmAG1, hmKO2, and tagBFP were amplified using an appropriate primer set, and the tagRFP region of pSRT-tagRFP was replaced.
  • the M9 sequence was then amplified using primer sets FwdM9 and RevSV40 from p4LambdaN22-3mEGFP-M9 (reference [4]), digested with BamHI and BglII, and inserted into the BglII site.
  • Primer and oligonucleotide sequences are shown in Table 1 below.
  • the mRNA IVT template containing 4 copies of the target sequence of miRNA in the 3′UTR uses the oligo DNA shown in Table 4 instead of the PCR fragment of the 3′UTR, and uses Rev120A-2 instead of Rev120A.
  • PCR amplified and ligated The PCR product was purified using MinElute® PCR® purification® kit® (QIAGEN) according to the manufacturer's instructions. Prior to purification, the PCR product amplified from the plasmid was digested with Dpn I (Toyobo) at 37 C for 30 minutes. The primer sequences are shown in Table 1.
  • the obtained mRNA was purified by FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech) and incubated at 37 degrees for 30 minutes using Antarctic Phosphatase (New England Biolabs). Then, it further refine
  • miRNA-responsive reporter hmAG1 mRNA was co-introduced with control hmKO2 mRNA, and eight miRNAs with significantly different activities depending on the cells were selected.
  • a combination table of four miRNA-responsive reporter mRNAs was created and tested. In this combination table, every two miRNA pairs selected from eight miRNAs are covered by all two combinations that can be selected from four types of marker fluorescent proteins.
  • several new sets of 4 miRNA-responsive reporter mRNAs were combined and tested.
  • IMR-90 cells were cultured on gelatin-coated plates in Eagle's basal medium supplemented with 10% FBS and 1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (Gibco). Normal human lung fibroblasts (NHLF; Lonza) were cultured according to the manufacturer's instructions. IMR-90 was used within 20 passages, and NHLF was used within 10 passages. In order to differentiate IMR-90 cells in vitro, these cells were starved in low serum medium (0.01% FBS) for 48 hours, and 10 ⁇ ng / mL human TGF- ⁇ 1 (mammalian) in low serum medium. Origin: Stimulated for 24 hours in the presence or absence of (PeproTech). Subsequently, it was transfected with the miRNA-responsive reporter mRNA designed and prepared above. Four hours after transfection, the medium was changed to the same medium as at the time of transfection.
  • NHLF Penicillin-Streptomycin-Glutamine
  • 0.1-1 pmol miRNA inhibitor or 25-200 ng reporter mRNA which contains the gene for click beetle luciferase CBRluc (Promega) in the ORF and has the same 5 ′ UTR as reporter EGFP
  • reporter mRNA which contains the gene for click beetle luciferase CBRluc (Promega) in the ORF and has the same 5 ′ UTR as reporter EGFP
  • 24 hours after introduction cells were measured by flow cytometry using Accuri C6 (BD Biosciences). The ratio of the fluorescence intensity of the two reporter proteins in each cell was calculated and plotted. Translation efficiency was determined by dividing the average intensity of EGFP in response to miRNA by the average intensity of control tagRFP measured by flow cytometry.
  • a reporter mRNA expressing 100 ng of EGFP and a reporter mRNA expressing 125 ng of hmKO2ga were co-introduced into the cells or a mixture thereof.
  • cells were transfected with 50 ng of reporter hmAG1 (Amalgaam) mRNA and 80 ng of control hmKO2 mRNA.
  • hmAG1 mRNA and hmKO2 mRNAs were doubled.
  • the intensity of EGFP and the intensity of tagRFP were corrected based on a spectral matrix obtained from a data set of cells transfected with EGFP or tagRFP (reference document [5]). Translation efficiency was defined by the value obtained by dividing the average intensity of the corrected EGFP signal by the average intensity of the corrected tagRFP signal.
  • the reporter fluorescent protein was fused to the nuclear localization signal M9 on the C-terminal side to clarify the co-introduced cells.
  • 24 hours after the introduction of the three mRNAs bright-field images and fluorescent images of the cells were obtained using IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare).
  • the fluorescence signals of hmAG1, hmKO2, and tagBFP were measured with a blue laser equipped with a FITC filter, a green laser equipped with a DsRed filter, and a UV laser equipped with a DAPI filter.
  • the obtained image was analyzed using Cell Profiler (reference document [2]).
  • nuclei were identified in the average image of three fluorescent channels.
  • the hmKO2 signal and tagBFP signal were then divided by the hmAG1 signal for each pixel as in flow cytometry.
  • the geometric mean rate was obtained for each nucleus. Images were edited using ImageJ (National Institutes of Health (NIH)).
  • FIG. 3 (a) is a schematic diagram of an in vitro synthesized miRNA-responsive reporter mRNA used in this example.
  • An ARCA cap structure analog
  • a miRNA target sequence a gene encoding a fluorescent protein
  • a poly A tail are located in the direction from the 5 ′ end of the left hand of the paper to the 3 ′ end of the right hand of the paper.
  • the ARCA and miRNA target sequence, and the miRNA target sequence and the start codon were each designed to be about 20 bases apart.
  • FIG. 3 (b) is a graph showing a comparison of translation efficiency when 3 types of miRNA-responsive reporter mRNAs are introduced into 3 types of cell lines, respectively.
  • a gene encoding EGFP was used as the marker gene, and miR-21-5p, miR-24-3p, and miR-203a were used as miRNA target sequences, respectively.
  • FIG. 3 (c) is a dot showing measurement results 24 hours after co-introduction of HeLa cells and 293FT cells into which miR-21-5p-responsive EGFP mRNA and control hmKO2 mRNA (SEQ ID NO: 22) were co-introduced. It is a plot.
  • FIG. 3 (f) is a dot plot showing the measurement results 24 hours after the same mRNA was co-introduced into a mixture of HeLa cells and 293FT cells. When measured using an Accuri-C6 flow-sert meter, three independent tests were performed and representative results were shown. The fluorescence intensity ratio reflecting the difference in miRNA activity indicates that the two cell lines were clearly separated.
  • FIG. 3 (d) shows the HeLa cells and MFC-7 cells co-introduced with miR-24-3p-responsive EGFP mRNA and miR-203a-responsive hmKO2 mRNA (SEQ ID NO: 6), 24 hours after co-introduction. It is a dot plot which shows the measurement result.
  • FIG. 3 (h) is a dot plot showing the measurement results 24 hours after the same mRNA was co-introduced into a mixture of HeLa cells and MFC-7 cells. Referring to FIG. 3 (b), it can be seen that these miRNAs differ slightly in activity and in opposite directions in the two cell lines. Referring to FIGS. 3 (d) and (h), it can be seen that two kinds of cell lines are clearly separated using such a slight difference in activity.
  • FIG. 3 (e) is a histogram showing the ratio of two fluorescent signals. Co-introduction of the set of miRNA-responsive reporter mRNA / control mRNA (EGFP mRNA (SEQ ID NO: 19) or hmKO2 mRNA (SEQ ID NO: 22)) shown in each histogram into HeLa cells, MCF-7 cells, and mixtures thereof did. The cumulative frequency of the fluorescence ratio of cells into which two miRNA-responsive reporter mRNAs have been introduced is shown in the bottom column.
  • FIG. 3 (g) is a histogram showing the ratio of two fluorescent signals in the dot plots of FIGS. 3 (c) and 3 (f).
  • Example 2 Cell separation in high-dimensional space
  • Cell separation was performed with 3 or 4 miRNA-responsive reporter mRNAs.
  • three miRNA-responsive reporter mRNAs ⁇ (miR-24-3p) -EGFP, ⁇ (miR-127-3p) -EGFP (SEQ ID NO: 7), ⁇ (miR-17-5p) -EGFP (SEQ ID NO: 9) and ⁇ (miR-92a-3p) -EGFP (SEQ ID NO: 15) were measured for translation efficiency in HeLa, 293FT, and MCF-7 cells.
  • the results are shown in FIGS. 4 (a) and 4 (d).
  • the numerical value at the top of each column indicates the ratio of translation efficiency for two of the three cell lines.
  • FIG. 4B shows the result of two-dimensional separation using tagBFP (SEQ ID NO: 13).
  • Three types of miRNA-responsive reporter mRNA were co-introduced independently into the three types of cell lines, and analyzed 24 hours later by FACSAria. Flow cytometry data was plotted for two ratios. The two ratios are the hmKO2 intensity divided by the hmAG1 intensity and the tagBFP intensity divided by the hmAG1 intensity.
  • the density of co-introduced HeLa cells, 293FT cells, and MCF-7 cells was plotted on a plane. Colored density plots were prepared as negative images by overlaying images showing the density of 293FT cells, HeLa cells, and MCF-7 cells in red, green, and blue channels, respectively.
  • FIG. 4 (c) shows the result of two-dimensional separation using three types of miRNA-responsive reporter mRNA for a sample in which three types of cells are mixed. Flow cytometry data was plotted for two ratios.
  • Each of HeLa, 293FT, MCF-7, and mixtures thereof includes four control mRNAs, hmAG1 mRNA (SEQ ID NO: 21), hmKO2 mRNA (SEQ ID NO: 22), tagBFP mRNA (SEQ ID NO: 20), hdKeimaRed mRNA (SEQ ID NO: 23) was co-introduced.
  • each of HeLa, 293FT, MCF-7, and mixtures thereof includes four miRNA-responsive reporter mRNAs, ⁇ (miR-24-3p) -hmAG1, ⁇ (miR-127-3p) -hmKO2.
  • ⁇ (miR-92-3p) -tagBFP (SEQ ID NO: 17) and ⁇ (miR-17-5p) -hdKeimaRed (SEQ ID NO: 14) were co-introduced.
  • FIG. 5 is a representative result of three independent experiments. 5A (a) and (b), it can be seen that the three types of cell lines co-introduced with the four types of control mRNA cannot be separated by referring to the plots on any plane. On the other hand, from FIG. 5 (c), the three cell lines co-introduced with the four miRNA-responsive reporter mRNAs can be clearly separated in the dot plots on any plane. Further, from FIG. 5 (d), separation can be visually confirmed in the mixture of the three cell lines. That is, it becomes possible to distinguish the cell line mixture into three types of cell lines.
  • Set A is a group containing dot plots obtained from 4 stages of 2-fold dilution
  • Set ⁇ B is a group containing dot plots obtained from 5 stages of 2-fold dilution.
  • Tables 5A and 5B This experiment, in which multiple control mRNAs are diluted to various concentrations, demonstrates various miRNA-responsive reporter mRNAs that can be generated by miRNA activity in cells.
  • miRNA target sequence insertion and translation efficiency The position of the miRNA target sequence in the reporter miRNA-responsive reporter mRNA was examined.
  • miR-21-5p which is the target site of miR-21-5p, is a miRNA-responsive reporter mRNA ( ⁇ (miR-21-5p) -EGFP (SEQ ID NO: 1) ))
  • miRNA-responsive reporter mRNA EGFP-4x ⁇ (4xmiR-21-5p) (SEQ ID NO: 2)
  • the translation efficiency was examined for these.
  • miR17-5p which is the target site of miR-17-5p, is a miRNA-responsive reporter mRNA ( ⁇ (miR-17-5p) -EGFP (sequence No. 9)) and miR-responsive reporter mRNA (EGFP-4x ⁇ (4xmiR-17-5p) (SEQ ID NO: 10)) in which miR-17-5p is completely complementary to 3'UTR.
  • ⁇ miRNA-responsive reporter mRNA
  • EGFP-4x ⁇ (4xmiR-17-5p) SEQ ID NO: 10
  • Example 4 Activity of miRNA-responsive reporter mRNA as miRNA inhibitor An experiment was conducted to verify the difference between a commercially available miRNA inhibitor and a miRNA-responsive reporter mRNA. The same miR- in the presence of a commercially available miRNA inhibitor or miR-17-5p responsive reporter mRNA ( ⁇ (miR-17-5p) -CBRLuc (SEQ ID NO: 33); luciferase gene does not show fluorescence) The translation efficiency of ⁇ (miR-17-5p) -EGFP in response to 17-5p in HeLa cells was measured.
  • Reporter mRNA (luciferase) that responds to 6 other miRNAs ( ⁇ (miR-21-5p) -CBRluc: SEQ ID NO: 34, ⁇ (miR-92a-3p) -CBRluc: SEQ ID NO: 35, ⁇ (miR-24 -3p) -CBRluc: SEQ ID NO: 36, ⁇ (miR-127b-3p) -CBRluc: SEQ ID NO: 37, ⁇ (miR-16-5p) -CBRluc: SEQ ID NO: 38, ⁇ (miR-203a) -CBRluc: Sequence No. 39) was confirmed not to work as a miRNA inhibitor.
  • Example 5 Translation efficiency of miRNA-responsive reporter mRNA in three cell lines
  • Twenty miRNA-responsive reporter mRNAs were introduced into each of the three cell lines, and the ratio of translation efficiency was examined.
  • FIG. 8 is a graph showing the translation efficiency of these 20 miRNA-responsive reporter mRNAs in 3 cell lines.
  • (A) is a comparison between HeLa and 293FT
  • (b) is a comparison between 293FT and MCF-7
  • (c) is a comparison between MCF-7 and HeLa.
  • Example 6 One-dimensional separation with two miRNA-responsive reporter mRNAs
  • two-dimensional separation based on the fluorescence intensity ratio of the two cell lines was performed using two types of miRNA-responsive reporter mRNA.
  • FIG. 9 shows a series of results. It shows that 293FT and HeLa can be separated or 293FT and MCF-7 can be separated even in two cell lines whose miRNA activity is less than twice the translation efficiency by a miRNA-responsive reporter mRNA .
  • Translation efficiency was measured to examine the activities of miR-24-3p and miR-17-5p in 293FT cells and HeLa cells.
  • ⁇ (miR-24-3p) -EGFP and ⁇ (miR-17-5p) -EGFP were used.
  • a result is shown to Fig.9 (a).
  • the numerical value at the top of each column indicates the translation efficiency ratio.
  • ⁇ (miR-24-3p) -EGFP and ⁇ (miR-17-5p) -hmKO2 (SEQ ID NO: 12) were co-introduced into 293FT and HeLa, and mixtures thereof, and flow cytometry analysis was performed 24 hours after the introduction. Went. EGFP and hmKO2 were used as control mRNAs.
  • FIG. 9B shows the dot plot results. It can be seen that 293FT cells and HeLa cells are distinguished as different band plots. Moreover, the same dot plot about the mixture of 293FT and HeLa is shown in FIG.9 (g). From these results, it can be seen that even when the mixture is measured, each cell can be observed separately.
  • FIG. 9C shows a histogram of the signal ratio. Each cell line was co-introduced with the miRNA-responsive reporter mRNA / control mRNA set shown in each histogram. Two fluorescent signal ratios measured by flow cytometry were calculated and plotted. The cumulative frequency of cells into which two miRNA-responsive reporter mRNAs have been introduced is shown in the bottom column of FIG. 9 (c).
  • FIG. 9E shows the dot plot results. It can be seen that 293FT cells and MCF-7 cells are distinguished as different band plots.
  • FIG. 9 (h) shows a similar dot plot for a mixture of 293FT and MCF-7. From these results, it can be seen that even when the mixture is measured, each cell can be observed separately.
  • FIG. 9F shows a signal ratio histogram. Each cell line was co-introduced with the miRNA-responsive reporter mRNA / control mRNA set shown in each histogram. Two fluorescent signal ratios measured by flow cytometry were calculated and plotted. The cumulative frequency of cells into which two miRNA-responsive reporter mRNAs have been introduced is shown in the bottom column of FIG. 9 (f).
  • Example 7 Co-introduction of three miRNA-responsive reporter mRNAs in which a reporter fluorescent protein is linked to a nuclear localization signal] 40 ng ⁇ (miR-24-3p) -hmAG1-M9 (SEQ ID NO: 25), three miRNA-responsive reporter mRNAs that express nuclear localized fluorescent proteins in HeLa, 293FT, and MCF-7 cells 10 ng of ⁇ (miR-127-3p) -hmKO2-M9 (SEQ ID NO: 26) and 200 ng of ⁇ (miR-17-5p) -tagBFP-M9 (SEQ ID NO: 27) were co-introduced. Imaging cytometry analysis was performed 24 hours after introduction. FIG.
  • FIG. 10 (a) shows a fluorescence image of the introduced cells. In the figure, indicates 100 ⁇ m. hmKO2, hmAG1, and tagBFP are shown as red, green, and blue channels, respectively. From FIG. 10 (a), it can be seen that there are variations in intensity depending on the nucleus.
  • FIG. 10B shows the result of pseudo color processing of data measured for the same object as in FIG. 10A using two ratios. The nuclei of the co-introduced cells were extracted and analyzed for fluorescence intensity at each pixel.
  • the ratio of the fluorescence signal of hmKO2 divided by the fluorescence signal of hmAG1 and the ratio of fluorescence signal of tagBFP divided by the fluorescence signal of hmAG1 are 10-0.25 to 100.75 and 10-0.5 to The range of 100.5 was normalized to 0 to 1 and shown in purple and green.
  • FIG. 10 (c) shows the density plot for these ratios.
  • Example 8 Two-dimensional separation using three types of miRNA-responsive reporter mRNAs by flow cytometry and imaging cytometry]
  • Three control mRNAs, hmAG1, hmKO2, and tagBFP were co-introduced into each of HeLa, 293FT, MCF-7, and mixtures thereof.
  • each of HeLa, 293FT, MCF-7, and mixtures thereof includes three control mRNAs in which a reporter fluorescent protein is linked to a nuclear localization signal, hmAG1-M9 (SEQ ID NO: 28), hmKO2-M9 (sequence) No. 29) and tagBFP-M9 (SEQ ID NO: 30) were co-introduced.
  • each of HeLa, 293FT, MCF-7, and mixtures thereof includes three miRNA-responsive reporter mRNAs, ⁇ (miR-24-3p) -hmAG1, ⁇ (miR-127-3p)- hmKO2 and ⁇ (miR-92-3p) -tagBFP were co-introduced.
  • FIG. 11 (a) shows the results of flow cytometry analysis of HeLa cells, 293FT cells, MCF-7 cells and a mixture thereof into which three kinds of control mRNA have been introduced
  • FIG. 11 (c) shows the results of imaging cytometry. Shown in FIG. 11 shows the results of flow cytometry analysis of HeLa cells, 293FT cells, MCF-7 cells, and a mixture thereof, into which three kinds of control mRNAs in which reporter fluorescent proteins are linked to nuclear localization signals are co-introduced.
  • FIG. 11 (g) shows the results of imaging cytometry in e). From either result, it can be seen that the cells are not separated.
  • FIG. 11 (b) shows the results of flow cytometry analysis of HeLa, 293FT, MCF-7, and mixtures thereof into which three miRNA-responsive reporter mRNAs were introduced
  • FIG. 11 (d) shows the results of imaging cytometry. Shown in In addition, FIG. 11 shows the results of flow cytometry analysis of HeLa, 293FT, MCF-7, and a mixture thereof in which three types of miRNA-responsive reporter mRNAs in which reporter fluorescent proteins are linked to nuclear localization signals are co-introduced.
  • FIG. 11 (h) shows the imaging cytometry results in f).
  • Example 9 Isolation of fibroblast cell line using miRNA-responsive reporter mRNA.
  • IMR-90 was focused on as a typical human normal cell. It is known that IMR-90 differentiates from the resting state to the smooth muscle direction by TGF stimulation. 67 types of miRNAs that have been confirmed to be expressed by IMR-90 and do not contain CAU were selected, and miRNA-responsive reporter mRNA libraries that express hmAG1 as a reporter protein were prepared (SEQ ID NOs: 77 to 143). Each of these was introduced into IMR-90 together with a control hmKO2 mRNA and subjected to flow cytometry analysis.
  • FIG. 12A (a) results are shown in FIG. 12A (a).
  • those with an average fluorescence ratio (FL2 / FL1) of ⁇ 0.199 are judged to be active (0.198 for mRNA that does not respond to control miRNA), and two types of high similarity among 26 miRNA ⁇ ⁇ Twenty-four omitted miRNA responsive mRNAs were extracted.
  • miRNA response reporter mRNAs for 2 miRNAs related to muscle differentiation were prepared (SEQ ID NOs: 144 and 145). In addition to these, a total of 32 mRNA, which combines the 24 mRNAs extracted in the previous section and the 6 mRNAs that responded to miRNAs highly related to TGF signal and muscle differentiation among the mRNAs that were not observed in the previous section.
  • a second-order screening was conducted to search for miRNAs whose activity was changed before and after TGF- ⁇ 1 stimulation against IMR-90. IMR-90 was stimulated with 10 ng / mL of TGF- ⁇ 1 after being starved for 2 days. The next day, mRNA was introduced, and flow cytometry analysis was performed the next day.
  • FIG. 12A (b) The results of searching for a total of 32 types of miRNAs are shown in FIG. 12A (b).
  • the most active miRNA-responsive mRNA ⁇ (miR-145-5p) -hmAG1) (SEQ ID NO: 117) was used in the next experiment.
  • Imaging cytometry was performed as follows. IMR-90 with and without TGF stimulation was simultaneously stained with miRNA-responsive mRNA ( ⁇ (miR-145-5p) -hmAG1 and hmKO2 pair) and anti- ⁇ SMA antibody. Differentiation induction and immunostaining of IMR-90 after introduction of mRNA were performed by the following methods. One day after co-introduction of mRNA, an equal volume of Cytofix Fixation Buffer (BD Biosciences) was added to the medium, and the mixture was allowed to stand at 37 ° C. for 10 minutes to fix the cells.
  • Cytofix Fixation Buffer BD Biosciences
  • the membrane was allowed to stand in Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) for 30 minutes to perform permeabilization of the cell membrane. After washing, it was left on ice for 30 minutes in Blocking One (Nacalai Tesque). Cells were stained with anti- ⁇ SMA antibody diluted 200-fold with Pharmingen Stain Buffer (FBS) containing 10% Blocking One for 30 minutes at room temperature. After washing, it was stained with Hoechist 33342 (Life Technologies). The stained cells were analyzed with IN Cell Analyzer 6000.
  • Phosflow Perm Buffer III BD Biosciences
  • Flow cytometry for intracellular factors was performed as follows. After differentiation induction and mRNA introduction, IMR-90 was detached from the culture plate, and cells were fixed and permeated using the above-mentioned Cytofix Fixation Buffer and Phosflow Perm Buffer III according to the instructions in the instructions. The cells after permeation through the membrane were blocked with Blocking One in the same manner as described above, and then stained with an anti- ⁇ SMA antibody diluted 100 times at room temperature for 30 minutes. After staining, the cells were washed and analyzed by flow cytometry.
  • FIG. 12A (c) The flow cytometry analysis results are shown as a density plot in FIG. 12A (c). From the results of FIG. 12A (c), it was possible to discriminate the difference in the differentiation state of the same cells by using ⁇ (145-5p) -hmAG1.
  • FIG. 12B (d) shows a similar experimental result as a histogram. Here, the result of introducing the control mRNA pair is shown by a solid line and a one-dot chain line.
  • the antibody staining method which is a conventional technique, it is necessary to fix cells, and the distribution range is wide as shown in the histogram, and there are many overlapping portions.
  • live cells can be used as they are, the distribution width is narrow, and sufficient discrimination is possible.
  • FIG. 12C (f) shows a similar experimental result as a histogram. Again, the result of introducing the control mRNA pair is shown by a solid line and a one-dot chain line.
  • FIG. 13 (a) shows an mRNA search strategy for selecting cells (clarifying the mixing condition of cells). In the first screening, miRNA activity was detected and 8 miRNAs were selected from 67 miRNAs. In the second screening, 56 sets of reporter mRNA were searched by combining 8 miRNAs and reporter proteins.
  • FIG. 13A Using the same library of 67 types of miRNA-responsive reporter mRNA as IMR-90, we searched for miRNA activity in primary cultured cells (NHLF) of human normal lung fibroblasts. The results are shown in FIG. 13A (b). In particular, we analyzed the peak width (90% interval) produced by the cell population into which mRNA was introduced, and analyzed the eight broad miRNA (miR-16-5p, miR-17-5p, miR-21 -5p, miR-27a-3p, miR-20a-5p, miR-106a-5p, miR-143-3p, let-7i-5p).
  • FIGS. 14 (a) and 14 (b) show the results of comparing the results of the first screening between the cell line (IMR-90) and the primary cultured cell (NHLF). All are the results for 67 types of miRNA response reporter mRNAs.
  • FIG. 14A is a comparison of fluorescence ratios, that is, a comparison of peak locations
  • FIG. 14B is a comparison of 90% interval, that is, comparison of peak widths. In both cases, the mean and standard deviation of two screening experiments were displayed as error bars.
  • 14 (a) and 14 (b) the mean value of miRNA activity was similar to that of IMR-90 established, but miRNA activity was more widely distributed within the cell population, and in a more heterogeneous population. It was shown that there is.
  • Fig. 13 (c) shows a combination table for the second screening. Numbers 1 to 8 are 8 types of miRNA.
  • miR-16-5p, miR-17-5p, miR-21-5p, miR-27a-3p, miR-20a-5p, miR- 106a-5p, miR-143-3p, let-7i-5p are shown.
  • row (h), column (i), and two-digit number (j, k) for each cell indicate the numbers of miRNAs to which hmAG1, hmKO2, tagBFP, and hdKeimaRed respond, respectively. According to this table, it can be seen that all reporter protein combinations are covered for any two miRNA combinations.
  • This table shows that a functional relationship between miRNAs in the target cell population can be found. For example, there is a negative correlation in function between miRNAs with large values, such as the combination of miR-143-3p and miR-21-5p. That is, in this case, miR-21-5p activity is low in cells with high miR-143-3p activity, and miR-21-5p activity is low in cells with low miRNA-143-3p activity.
  • miRNAs with large values such as the combination of miR-143-3p and miR-21-5p.
  • miR-21-5p activity is low in cells with high miR-143-3p activity
  • miR-21-5p activity is low in cells with low miRNA-143-3p activity.
  • combinations of miRNAs with small values have a positive correlation with their functions.
  • RmiR-17, miR-20a, and miR-106a forming miR-17 precursor family also showed a high positive correlation in activity.
  • FIG. 15 is a diagram schematically showing an expected result when there are two miRNA activity distributions in a cell group when it is assumed that a certain cell group has taken in the same amount of mRNA.
  • FIG. 15 (a) shows that when two miRNA activities are positively correlated, the peak of the fluorescence ratio becomes narrower.
  • FIG. 15 (b) shows that the peak of the fluorescence ratio becomes wider when the two miRNA activities are negatively correlated.
  • FIG. 15 (c) shows that when the two miRNA activities are not correlated, a peak with an intermediate width is formed.
  • FIG. 13 (d) shows a reporter mRNA ( ⁇ (miR-106a-5p) -hmAG1 (SEQ ID NO: 116), which responds to three miRNAs with or without a negative correlation with miRNA activity.
  • ⁇ (miR-106a-5p) -hmAG1 SEQ ID NO: 116
  • the results of separation and analysis of NHLF using ⁇ (miR-21-5p) -hmKO2 (SEQ ID NO: 159), ⁇ (miR-143-3p) -tagBFP) are shown.
  • the cell population into which mRNA was introduced was shown by the density distribution of the fluorescence ratio.
  • FIG. 13 (e) shows reporter mRNAs ( ⁇ (miR-20a-5p) -hmAG1 (SEQ ID NO: 111), ⁇ (miR-17-5p) that respond to three miRNAs positively correlated with miRNA activity. ) -hmKO2 (SEQ ID NO: 12), ⁇ (miR-106a-5p) -tagBFP (SEQ ID NO: 171)) shows the results of separation and analysis of NHLF. The cell population into which mRNA was introduced was shown by the density distribution of the fluorescence ratio.
  • the miRNA-responsive mRNA to be used can be selected according to the purpose of discrimination of desired cells.
  • NHLF is considered as a desired cell, and when distinguishing between NHLF and other cells, the desired cell is narrower (specific) using a mRNA set for miRNA that has a high positive correlation.
  • NHLF which can be a cell population and is rich in diversity
  • a population of cells containing the desired cells and wants to separate and sort the desired cells from here, it can be used for negatively correlated miRNA
  • An mRNA selection can be used to collect a desired portion of a widely distributed cell.
  • Example 11 Discrimination of IMR-90 cell population using miRNA-responsive reporter mRNA
  • a second screening similar to NHLF was also performed for IMR-90, a fibroblast cell line.
  • numbers 1 to 8 representing miRNAs shown in FIG. 13 (C) are sequentially assigned to miR-16-5p, miR-17-5p, miR-125b-5p, miR-93-5p, miR-20a.
  • a pair of reporter mRNAs that respond to that miRNA (SEQ ID NOs: 117, 100, 125, 80, 157, 166, 174, 83, 167, 158, 175, 111, 161, 170, 178, 110, 116, 162, 171, 179, 146-156) were analyzed into IMR-90, the peak width (90% interval) of the fluorescence ratio produced by the cell population was analyzed, and the same analysis was performed when control mRNA was introduced Table 7 shows the relative values for the peak widths determined in (1).
  • FIG. 16 shows four types of miRNA-responsive mRNAs ( ⁇ (miR-16-5p) -hmAG1 (SEQ ID NO: 80), ⁇ (miR-26a-5p) -hmKO2 (selected based on the results of the second screening).
  • SEQ ID NO: 148 ( ⁇ (miR-17-5p) -tagBFP (SEQ ID NO: 167), ⁇ (miR-125b-5p) -hdKeimaRed (SEQ ID NO: 153) are co-introduced into IMR-90 in three dimensions As shown by the arrows A and B shown in the figure, it was found that IMR-90 was separated into two cell groups.

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Abstract

生細胞を生きたまま、高精度で判別する方法。以下の工程を含む、２種以上の細胞を含む細胞群からmiRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法； （１）指標となるmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを細胞に導入する工程、および （２）当該マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞を判別する工程。

Description

ｍｉＲＮＡの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法
　本発明は、miRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法に関する。
　多細胞生物の組織や器官は、多種類の細胞で構成されている。ヒトは、６０兆（６ｘ１０１３）個もの細胞から構成され、その種類は、成熟細胞だけでも４１１種にも及ぶ。これらの細胞については、個々の細胞の機能を解析するだけでなくて、医療応用のための細胞調製において、細胞種を判別したり、同定したりする技術が重要になってきている。
　細胞を同定するためには、特異的に発現した細胞表面のリガンドを、抗体で検出する手法が一般的に知られている。しかし、抗体で細胞内の情報を検出するためには、対象細胞を固定・膜透過させる必要があり、生細胞の分取には応用することができないという問題があった。また、細胞表面に必ずしも細胞の特定が可能なレセプターが存在するものではない。また、抗体によるリガンド検出のような、一因子を、positive/negative（陰性または陽性）の２つに分類する手法（すなわち定性的に分類する手法）では、検出可能な組み合わせがごく限られ、詳細な分類が難しいという問題がある。
　細胞をより詳細に分類する方法、すなわち細胞を定量的に分類する方法としては、例えば、マイクロアレイや次世代シーケンシングなどを用いた多変量の測定に基づく細胞のプロファイリングが知られている。これらの方法では、タンパク質やRNAなどの細胞内分子について、多種類の分子を同時に定量測定し、また多変量解析などの統計解析を用いるなどして、定量的に細胞を分類することが可能である。しかし、測定をなされた細胞は破壊されてしまうため、細胞を生存させた状態では測定できないという問題がある。
　細胞を同定するための指標となる対象として、マイクロＲＮＡ（以下、miRNAと指称する）が、着目されている。生細胞内でmiRNAを検出するための手法として、ＤＮＡもしくはウイルスを用いたレポーターコンストラクトを導入して行われるレポーターアッセイが用いられている。しかし、このような方法では、当該レポーターコンストラクトが宿主細胞のゲノムに組み込まれて残存するおそれがあり、この方法で同定された細胞は、医療応用時に問題が残る。また、従来のレポーターアッセイによるmiRNAの検出は、当該miRNAの標的遺伝子を探索することを目的とされており、細胞を同定することには用いられていない。
　細胞を生存させた状態で、高精度で判別する方法が望まれている。
　本発明者らは、特定の構造を有するmRNAを用いて生細胞内のmiRNAの発現の情報を定量的に得ることで、２種以上の細胞を含む細胞群から所望の細胞種を判別することができることを見出し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は、一実施の形態によれば、以下の工程を含む、２種以上の細胞を含む細胞群からmiRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法に関する：
（１）指標となるmiRNAの標的配列と機能的に連結した第一のマーカー遺伝子を含むmRNAを細胞
に導入する工程、および
（２）当該第一のマーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞種を判別する工程。
　前記方法において、前記工程（１）が、指標となるmiRNAの標的配列および第一のマーカー遺伝子が共に異なる２以上のmRNAを同時に細胞に導入する工程であることが好ましい。
　前記方法において、前記所望の細胞種が、指標となるmiRNAの発現量が少ない細胞種であり、前記工程（２）が、当該第一のマーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞種を判別する工程であることが好ましい。
　前記方法において、前記所望の細胞種が、指標となるmiRNAの発現量が多い細胞種であり、前記工程（２）が、当該第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞種を判別する工程であることが好ましい。
　前記方法において用いられるmRNAにおいて、前記miRNAの標的配列が、第一のマーカー遺伝子の５’側に連結されていることが好ましい。
　前記方法において、前記判別が、フローサイトメトリーを用いて行われることが好ましい。
　前記方法において、前記判別が、イメージアナライザーを用いて行われることが好ましい。
　前記方法において、前記工程（１）の前に、所望する細胞種に特異的な指標となるmiRNAをスクリーニングする工程をさらに含むことが好ましい。
　本発明はまた別の局面によれば、指標となるmiRNAの標的配列と機能的に連結した第一のマーカー遺伝子を含むmRNAを含んでなる細胞判別キットに関する。
　本発明によれば、細胞内情報であるmiRNA活性を指標として利用することで、高い分解能で細胞種を判別することができる。本発明による方法は、細胞が生存した状態で適用することができるため、判別後の細胞を種々の用途、特には医療用途において利用することができる点で特に有利である。また、本発明の方法は、細胞群にmRNAを導入することにより実施することができ、このmRNAは約１日程度の半減期で分解されて、細胞内から速やかに除去されるため、細胞内におけるウイルス感染やＤＮＡの残存により、ゲノムに損傷を与えるといった問題を生ずることがない。また、サイトメーターを利用した簡便な検出の方法においても有利である。特に、合成したmRNAを細胞に導入することにより、指標とする活性の検出誤差を低減でき、分離能を向上させることができ、高精度な判別が可能になった。本発明の有効な応用例として、例えば、多能性幹細胞を特定の細胞に分化させるに当たって、所望の特性を備える多能性幹細胞、または当該多能性幹細胞から分化誘導により得られた細胞群より所望する細胞種を判別することによって、当該所望の細胞を分類、単離または選択的に排除することができる。
　さらに、本発明の方法は、細胞群に含まれる複数の細胞種間で、指標とするmiRNAの発現にわずかな差しか存在しない場合、例えば、約１．５倍以下程度である場合でも、少なくとも二つの指標となるmiRNAの標的配列と機能的に連結した第一のマーカー遺伝子を含む２つのmRNAを用いることで、それらの細胞を判別することができる。これは、共導入した２つのmRNAから発現するレポーター蛋白質の活性比は、細胞集団内で一定でばらつきが小さいという発見に基づくものである。また、共導入するmRNAの種類を増やすことによって、より多くの指標に基づき、さらに多数の細胞の判別が可能になる。
図１は、フローサイトメトリーのドットプロット平面上で、異なる二種の細胞を分離する本発明の技術及び従来技術を模式的に説明する図である。 図２は、miRNA応答性レポーターmRNAあるいはコントロールmRNAを、２種類、二つの異なる細胞種に導入した場合の、シグナル率を示すヒストグラムである。 図３Ａは、１種もしくは２種のmiRNA応答性レポーターmRNAによる、既知の細胞株の二次元分離を示す一連の図である。 図３Ｂは、二つの蛍光シグナルの比率を示すヒストグラム及び、2種のmiRNA応答性レポーターmRNAの累積曲線を示すグラフである。 図３Ｃは、１種もしくは２種のmiRNA応答性レポーターmRNAによる、既知の２種の細胞株の混合物の二次元分離を示す図、及び二つの蛍光シグナルの比率を示すヒストグラムである。 図４は、３種もしくは４種のmiRNA応答性レポーターmRNAによる、既知の細胞株の二次元分離もしくは三次元分離を示す一連の図である。 図５Ａは、４種のコントロールmRNAを用いた、3種の細胞株の三次元分離を示す一連の図である。 図５Ｂは、４種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた、3種の細胞株の三次元分離を示す一連の図である。 図６は、miRNA応答性レポーターmRNAにおいて、miRNA標的配列の挿入部位が翻訳効率に及ぼす影響を示す図である。 図７は、miRNA応答性のレポーターmRNAが、細胞内のmiRNA活性に阻害効果を及ぼさないことを示す図である。 図８は、3種の細胞株における、選択された２０種のｍｉＲNA応答性レポーターmRNAの翻訳効率を示すグラフである。 図９Ａは、２種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた、2種の細胞株の二次元分離を示す一連の図である。 図９Ｂは、２種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた、2種の細胞株の二次元分離を示す一連の図である。 図９Ｃは、２種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた、2種の細胞株の混合物の二次元分離を示す図である。 図１０は、イメージングアナライザーを用いた判別方法における、細胞の着色画像、並びに既知の細胞株の二次元分離を示す図である。 図１１Ａは、フローサイトメトリー及びイメージングサイトメトリーによる、３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた二次元分離を示す図である。 図１１Ｂは、フローサイトメトリー及びイメージングサイトメトリーによる、３種の核局在化シグナル遺伝子に連結されたmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた二次元分離を示す図である。 図１２Ａは、実施例９における、IMR-90において分離に用いるためのmiRNA応答レポーターmRNAのスクリーニング結果、及びTGF刺激あり、なしのIMR-90に、miRNA応答レポーターmRNAを共導入した場合のフローサイトメトリー解析結果を示す図である。 図１２Ｂは、図１２Ａ（ｃ）及び図１２Ｃ（ｆ）の結果を、ヒストグラムで示す図である。 図１２Ｃは、TGF刺激あり、なしのIMR-90に核局在するレポーター蛋白質を発現するmiRNA応答レポーターmRNAを共導入した場合の、イメージングサイトメトリー解析結果を示す図である。 図１３は、実施例１０における、NHLFにおいて分離に用いるためのmiRNA応答レポーターmRNAのスクリーニング結果、及び、同じ細胞集団NHLF正の相関性の高い miRNA に対する mRNA セット、またはそうではない miRNA セットを用いてを分離解析した結果を示す図である。 図１４は、第一スクリーニングの結果を細胞株(IMR-90) と初代培養細胞 (NHLF) で比較した結果を示す図である。 図１５は、ある細胞群が同じ量のmRNAを取り込んだと仮定したとき、細胞群で2 つのmiRNA活性の分布がある場合、想定される結果を模式的に示す図である。 図１６は、第二スクリーニングの結果に基づいて選択した4種類のmiRNA応答mRNAをIMR-90に共導入した場合の結果を三次元の密度プロットとして示す図である。 図１７（ａ）は、TGF-β1で刺激なし（-TGF-β1；左図）または刺激あり（+ TGF-β1；右図）のIMR-90へコントロールmiRNA（hmAG1-M9）およびmiRNA応答レポーターmRNA（α(miR-145-5p)-hmKO2-M9）を共導入した場合のイメージングサイトメトリー解析結果を示す図である。図中、Bright Fieldは、位相差像を示し、hmAG1は、hmAG1の蛍光像を示し、APCは、αSMA抗体での染色像を示し、hmKO2は、hmKO2の蛍光像を示し、Hoechistは、核染色像を示し、ratioは、重ね合わせた蛍光像を示す。図１７（ｂ）は、TGF-β1で刺激なし（-TGF-β1：緑）または刺激あり（+ TGF-β1：紫）のIMR-90へコントロールmRNA（hmAG1-M9）およびmiRNA応答レポーターmRNA（α(miR-145-5p)-hmKO2-M9）を共導入した場合のフローサイトメトリー解析結果を示す図である。
　以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。
　本発明は、第一実施の形態によれば、２種以上の細胞を含む細胞群からmiRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法に関する。本実施形態による判別方法は、以下の工程を含む：
（１）指標となるmiRNAの標的配列と機能的に連結した第一のマーカー遺伝子を含むmRNAを細胞に導入する工程、および
（２）当該第一のマーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞種を判別する工程。
　本発明の、判別方法において、対象となる細胞群は、２種以上の細胞を含む細胞群であり、多細胞生物種から採取した細胞群であってもよく、単離された細胞を培養することによって得られる細胞群であってもよい。当該細胞群は、特には、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）採取した２種以上の体細胞を含む細胞群、若しくは哺乳動物より単離された細胞又は哺乳動物細胞株を培養することによって得られる細胞群である。体細胞としては、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞 (組織前駆細胞) 等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。また、好ましい細胞群は、前期体細胞を採取後に人為的な操作を加えた細胞群であり、所望しない細胞を含む可能性がある細胞群である。例えば、前記体細胞から調製したｉＰＳ細胞を含んでなる細胞群であり、あるいはES 細胞やｉＰＳ細胞などによって例示される多能性幹細胞を分化させた後に得られる細胞群であって、所望する細胞以外に分化された細胞を含み得る細胞群である。本実施形態において、判別対象の細胞群は、生存状態にあることが好ましい。本発明において、細胞が生存状態にあるとは、代謝能を維持した状態の細胞を意味する。本発明は、細胞を本発明の方法に供し、判別方法の終了後においても、その生来の特性を失うことなく、生存状態のまま、特に分裂能を維持したまま、続く用途に用いることができる点で有利である。
　本発明の方法において、判別される「所望の細胞種」とは、miRNAの発現を指標として、他の細胞種と分類されるある一群の細胞をいう。特には、後に詳述するmiRNA活性について共通する特性を備えるある一群の細胞をいう。本発明においては、このようなmiRNAを指標として、他の細胞種と分類されるある一群の細胞を「同種の細胞」とも指称する。本発明の方法で判別される所望の細胞種は、１種であっても良く、２種以上、例えば、３種、４種、５種、６種、７種、または８種以上であってもよい。理論上、判別可能な細胞種は限定されるものではなく、本発明によれば、同時に１００種以上の細胞種を判別することもできる。
　本発明において、「所望の細胞種を判別する」とは、２種以上の細胞を含む細胞群の中から、所望の、特定の１以上の細胞種について、他の細胞種と異なる検出可能な信号情報を提示することをいい、特には、視覚的に認識可能な情報を提示することをいうものとする。なお、視覚的に認識可能な情報とは、細胞が直接的に視認しうる信号を発することに限定されるものではなく、細胞が発した信号を、数値、図表又は画像等によって視覚的に認識可能な情報に変換された情報であり、当業者が視覚的に認識可能な情報をいう。本明細書において、判別するという文言には、当該判別の後に、所望の細胞種を認識し、所望の細胞種を識別し、所望の細胞種を同定し、所望の細胞種を分類し、所望の細胞種を単離し、所望しない細胞種を除去し、所望の細胞種の生死を判定し、所望の細胞種の特定の生物学的な信号を検出あるいは定量し、所望の細胞種の特定の物理的あるいは化学的な信号に基づいて分画することを含んでも良い。２種以上の細胞を含むことが未知であった細胞群が、本発明の方法を用いることによって異なる細胞種として判別することも、本発明において、所望の細胞種を判別することの一態様をなす。
　２種以上の細胞を含む細胞群からmiRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する態様は、上記のような種々の判別態様を含むほか、「２種以上の細胞を含む細胞群」についての属性が予めある程度既知である場合と、当該細胞群の属性について何ら情報がない場合とに分けられる。
　細胞群の属性が予めある程度既知である場合とは、予め別の方法等で、細胞群に含まれる細胞種がある程度特定されている場合である。例えば、従来技術として説明した、抗体を用いて分類する方法や、マイクロアレイや次世代シーケンシングなどを用いた多変量の測定に基づく細胞のプロファイリングであるOmics解析/profiling法により、特定の細胞群に含まれる特定の細胞種が予め分析され、予測されている場合がある。その場合であっても、細胞が生存した状態で、本発明の方法により、所望の細胞種を判別することは有用である。
　一方、細胞群の属性について何ら情報がない場合であっても本発明は適用することができる。
　前者の場合と、後者の場合とでは、指標となるmiRNAをスクリーニングする工程におけるスクリーニング方法が異なる場合がある。このようなスクリーニング工程は、任意選択的な前工程として本発明の方法に含んでも良い。詳細は、スクリーニング工程において後述する。
　本発明の方法においては、指標となるmiRNAの標的配列（以下、miRNA標的配列ともいう）と機能的に連結した第一のマーカー遺伝子を含むメッセンジャーＲＮＡ（mRNA）を用いる。このようなmRNAは、特定のmiRNAが存在する場合に、その存在量に応じて第一のマーカー遺伝子の翻訳が制御される。好ましくは、特定のmiRNAが存在する場合に、その存在量に応じて第一のマーカー遺伝子の翻訳が抑制されることで、当該第一のマーカー遺伝子より翻訳された蛋白質（以下、マーカー蛋白質と指称する）の量が減少するmRNAである。
　本発明における「miRNAの発現」とは、成熟miRNAが、所定の複数の蛋白質と相互作用して、RNA-induced silencing complex（ＲＩＳＣ）を形成した状態にあるmiRNAが存在していることをいうものとする。「成熟miRNA」は、一本鎖ＲＮＡ（２０～２５塩基）であり、核外でDicerによる切断によってpre-miRNAから生じ、「pre-miRNA」は、Droshaと呼ばれる核内酵素による部分切断によって、ＤＮＡから転写された一本鎖ＲＮＡであるpri-mRNAから生じる。本発明におけるmiRNAとは、少なくとも１０，０００種類以上のmiRNAから適宜選択される。詳細には、データベースの情報（例えば、http://www.mirbase.org/又はhttp://www.microrna.org/）に登録されたmiRNA、及び／または当該データベースに記載されている文献情報に記載されたmiRNAより適宜選択される。すなわち、本発明においては、指標となるmiRNAは特定のmiRNAに限定されるものではない。本発明の方法を用いて判定する細胞種の特性に応じて指標となるmiRNAを適宜選択することができる。また、特には、判定対象となる細胞群中で、ある細胞では高発現（高活性）であり、別の細胞では低発現（低活性）であるような、１つのmiRNA、あるいは複数のmiRNAの組み合わせを選択することが好ましい。分離の精度をより高くするためである。このようなmiRNA、あるいは複数のmiRNAの組み合わせの選択は、後述するスクリーニング方法により実施することができる。このような、指標となるmiRNAは、本出願時において特定されているmiRNAには限定されず、今後、その存在及び機能が特定されるあらゆるmiRNAを含むものとする。
　miRNA標的配列は、指標となるmiRNAに特異的に結合可能な配列をいう。miRNA標的配列は、例えば、指標となるmiRNAに完全に相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該miRNA標的配列は、miRNAにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該miRNAに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にmiRNAが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、４０～５０％程度の不一致があっても良いとされている。このような不一致は、特に限定されないが、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、若しくは１０塩基又は全認識配列の１％、５％、１０％、２０％、３０％、若しくは４０％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えている mRNA 上の miRNA 標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわち miRNA の 3’ 側 16 塩基程度に対応する、標的配列内の 5’ 側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、１塩基、２塩基、若しくは３塩基の不一致を含んでもよい。
　第一のマーカー遺伝子は、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能し、細胞種の判別を可能にする任意の蛋白質をコードする遺伝子である。細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうる蛋白質としては、一例としては、蛍光、発光、呈色、若しくは蛍光、発光又は呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができる蛋白質であってよい。蛍光蛋白質としては、Sirius、EBFPなどの青色蛍光蛋白質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光蛋白質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例えば、hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、などの緑色蛍光蛋白質；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光蛋白質；KusabiraOrange (例えば、hmKO2)、mOrangeなどの橙色蛍光蛋白質；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、などの赤色蛍光蛋白質；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed（例えば、hdKeimaRed）、mRasberry、mPlumなどの近赤外蛍光蛋白質が挙げられるが、これらには限定されない。
　発光蛋白質としては、イクオリンを例示することができるが、これに限定されない。また、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質として、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βラクタマーゼなどの蛍光、発光又は呈色前駆物質を分解する酵素を例示することができるが、これらには限定されない。ここで本発明において、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質を第一のマーカー遺伝子として使用する場合、所望の細胞の判別において、対応する前駆物質と細胞を接触させること、又は細胞内に対応する前駆物質を導入することによって行われ得る。
　また、細胞内でマーカーとして機能しうる蛋白質の別の例としては、細胞の機能に直接影響を与える蛋白質類が挙げられる。細胞増殖蛋白質、細胞死滅蛋白質、細胞シグナル因子、薬剤耐性遺伝子、転写制御因子、翻訳制御因子、分化制御因子、リプログラミング誘導因子、RNA結合タンパク質因子、クロマチン制御因子、膜タンパク質を例示することができるが、これらには限定されない。例えば、細胞増殖蛋白質は、それを発現した細胞のみを増殖させ、増殖した細胞を特定することでマーカーとして機能する。細胞死滅蛋白質は、それを発現した細胞の細胞死を引き起こすことで、特定のmiRNAを含有、もしくは含有しない細胞自体を死滅させ、細胞の生死を示すマーカーとして機能する。細胞シグナル因子は、それを発現した細胞が、特定の生物学的信号を発し、この信号を特定することでマーカーとして機能する。細胞死滅蛋白質として、例えば、BaxまたはBimが例示される。翻訳制御因子は、一例としては、特定のRNAの3次構造を認識して結合することで他のmRNAからの蛋白質への翻訳を制御することでマーカーとして機能する。翻訳制御因子として、5R1、5R2（Nat Struct Biol. 1998 jul; 5(7):543-6）、B2（Nat Struct Mol Biol. 2005 Nov;12(11):952-7）、Fox-1（EMBO J. 2006 Jan 11;25(1):163-73.）、GLD-1（J Mol Biol. 2005 Feb 11;346(1):91-104.）、Hfq（EMBO J. 2004 Jan 28;23(2):396-405）、HuD（Nat Struct Biol. 2001 Feb;8(2):141-5.）、SRP19（RNA. 2005 Jul;11(7):1043-50）、L1（Nat Struct Biol. 2003 Feb;10(2):104-8.）、L11（Nat Struct Biol. 2000 Oct;7(10):834-7.）、L18（Biochem J. 2002 Mar 15;362(Pt 3):553-60）、L20（J Biol Chem. 2003 Sep 19;278(38):36522-30.）、L23（J Biomol NMR. 2003 Jun;26(2):131-7）、L25（EMBO J. 1999 Nov 15;18(22):6508-21.）、L30（Nat Struct Biol. 1999 Dec;6(12):1081-3.）、LicT（EMBO J. 2002 Apr 15;21(8):1987-97.）、MS2 coat（FEBS J. 2006 Apr;273(7):1463-75.）、Nova-2（Cell. 2000 Feb 4;100(3):323-32）、Nucleocapsid（J Mol Biol. 2000 Aug 11;301(2):491-511.）、Nucleolin（EMBO J. 2000 Dec 15;19(24):6870-81.）、p19（Cell. 2003 Dec 26;115(7):799-811）、L7Ae（RNA. 2005 Aug;11(8):1192-200.）、PAZ（PiWi Argonaut and Zwille）（Nat Struct Biol. 2003 Dec;10(12):1026-32.）、RnaseIII（Cell. 2006 Jan 27;124(2):355-66）、RR1-38（Nat Struct Biol. 1998 Jul;5(7):543-6.）、S15（EMBO J. 2003 Apr 15;22(8):1898-908.）、S4（J Biol Chem. 1979 Mar 25;254(6):1775-7.）、S8（J Mol Biol. 2001 Aug 10;311(2):311-24.）、SacY（EMBO J. 1997 Aug 15;16(16):5019-29.）、SmpB（J Biochem (Tokyo). 2005 Dec;138(6):729-39）、snRNP U1A（Nat Struct Biol. 2000 Oct;7(10):834-7.）、SRP54（RNA. 2005 Jul;11(7):1043-50）、Tat（Nucleic Acids Res. 1996 Oct 15;24(20):3974-81.）、ThrRS（Nat Struct Biol. 2002 May;9(5):343-7.）、TIS11d（Nat Struct Mol Biol. 2004 Mar;11(3):257-64.）、Virp1（Nucleic Acids Res. 2003 Oct 1;31(19):5534-43.）、Vts1P（Nat Struct Mol Biol. 2006 Feb;13(2):177-8.）、およびλN（Cell. 1998 Apr 17;93(2):289-99.）が例示される。より好ましい翻訳制御因子は、MS2 coat 、L7Aeである。
　本発明において、第一のマーカー遺伝子は、局在化シグナルをコードする遺伝子を備えていてもよい。局在化シグナルとしては、核局在化シグナル、細胞膜局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、タンパク質分泌シグナル等を挙げることができ、具体的には、古典的核移行配列（NLS）、Ｍ９配列、ミトコンドリア標的配列(MTS)、小胞体移行配列を挙げることができるが、これらには限定されない。このような局在化シグナルは、後述するイメージングサイトメトリー等で、本発明の方法における判別工程を、画像上で行うときに特に有利である。
　本発明において、マーカーとして、翻訳制御因子を用いる場合、当該翻訳制御因子によって翻訳が制御される第二のマーカー遺伝子を有するmRNAを同時に細胞へ導入する。このような蛋白質によって翻訳が制御される第二のマーカー遺伝子を有するmRNAとして、当該翻訳を制御しうる蛋白質が結合できるRNA配列と機能的に連結された第二のマーカー遺伝子配列を有するmRNAが例示され、例えば、WO2009/066757またはWO2014/014122に開示されたmRNAが挙げられる。前記刊行物の全ての開示を参照により本明細書に含める。当業者は上記刊行物を参照することにより本発明の方法に好適に使用可能な蛋白質によって翻訳が制御される第二のマーカー遺伝子を有するmRNAを適宜選択することが可能である。本発明において、使用する第二のマーカー遺伝子は、上述した第一のマーカー遺伝子と同様の遺伝子を用いることができる。
　本発明の方法で用いるmRNAは、指標となるmiRNAの標的配列と機能的に連結した第一のマーカー遺伝子を含む。本発明の説明において、かかるmRNAを、miRNA応答性レポーターmRNAとも指称する。本発明においてmiRNAの標的配列と第一のマーカー遺伝子が機能的に連結するとは、第一のマーカー遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ただし、開始コドンを含む。）の５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、及び／または当該オープンリーディングフレーム内に、少なくとも１つのmiRNA標的配列を備えることを意味する。mRNAは、好ましくは、５’末端から、５’から３’の向きに、Ｃａｐ構造（７メチルグアノシン５’リン酸）、第一のマーカー遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム並びに、ポリＡテイルを備え、５’ＵＴＲ内、３’ＵＴＲ内、及び／またはオープンリーディングフレーム内に少なくとも１つのmiRNA標的配列を備える。mRNAにおけるmiRNA標的配列の位置は、５’ＵＴＲであっても、３’ＵＴＲであってもよく、オープンリーディングフレーム内（開始コドンの３’側）であってもよく、これらのすべてにmiRNA標的配列を備えていてもよい。したがって、miRNA標的配列の数は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つあるいはそれ以上であっても良い。
　好ましくは、miRNA標的配列は、５’ＵＴＲに１つ存在する。効率的な翻訳抑制を達成することができるためである。このとき、ｃａｐ構造とmiRNA標的配列と間の塩基数及び塩基の種類は、開始コドンとなるAUGを含まず、かつステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよい。例えば、ｃａｐ構造とmiRNA標的配列と間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるように設計することができる。また、miRNA標的配列と開始コドンと間の塩基数及び塩基の種類は、ステム構造や立体構造を構成しない限り、任意であってよく、miRNA標的配列と開始コドンと間の塩基数は、０～５０塩基、好ましくは、１０～３０塩基となるように設計することができる。なお、miRNA標的配列が３’ＵＴＲに４つ存在する場合であっても、翻訳抑制を達成することは可能であることが確認されている。
　miRNA応答性レポーターmRNAは、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、５－メチルシチジンなどの修飾塩基を含んでいることが好ましい。細胞毒性を低減させるためである。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
　miRNA応答性レポーターmRNAは、上記に従って配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。特には、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro転写合成法により、得ることができる。
　miRNA応答性レポーターmRNAは、判別の目的、対象、あるいは指標となるmiRNA活性により、１種のみ用いる場合もあり、２種以上、例えば、３種、４種、５種、６種、７種、または８種以上用いる場合もある。例えば、２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いる場合、それぞれのmiRNA応答性レポーターmRNAは、miRNA標的配列、第一のマーカー遺伝子ともに、異なることが望ましい。また、２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いる場合、miRNA応答性レポーターmRNAに含まれるmiRNA標的配列の数、miRNA標的配列の５’末端からの距離、並びにmiRNA応答性レポーターmRNAにおけるその他の構造的特徴は、各miRNA応答性レポーターmRNAにおいて異なっていても良い。
　本発明において、miRNA応答性レポーターmRNAを細胞に導入する工程（以下、導入工程と指称する）は、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて、１種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを直接、細胞群に含まれる細胞に導入する。異なる２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを導入する場合、あるいはmiRNA応答性レポーターmRNAとコントロールとなるmRNA（以下、コントロールmRNAとも指称する）とを用いる場合には、複数のmRNAを細胞群に共導入することが好ましい。共導入した２以上のmRNAから発現するマーカー蛋白質の活性比は、細胞集団内において一定であるためである。この時の導入量は、導入される細胞群、導入するmRNA、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。ここで、コントロールmRNAとは、miRNA標的部位を有さず、miRNA応答性レポーターmRNAがコードする第一のマーカー遺伝子とは異なるマーカー遺伝子をコードするmRNAをいう。コントロールmRNAの導入量もまた、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
　miRNA応答性レポーターmRNAが細胞に導入されると、細胞内では、細胞に所定のmiRNAがＲＩＳＣとして存在する場合、miRNA応答性レポーターmRNAがコードする第一のマーカー遺伝子の翻訳量が制御、例えば翻訳量が抑制される。そして、翻訳量の制御は、miRNA活性に応じて定量的になされる。一方、細胞に所定のmiRNAが存在しない場合、もしくは所定のmiRNAがＲＩＳＣとして存在しない場合、miRNA応答性レポーターmRNAがコードする第一のマーカー遺伝子の翻訳量が抑制されることはない。したがって、所定のmiRNAがＲＩＳＣとして存在する細胞と、存在しない細胞との間で、第一のマーカー遺伝子の翻訳量が異なる。なお、本明細書において、所定のmiRNAがＲＩＳＣとして存在する場合を、「miRNA活性が存在する場合」とも指称する。一方、コントロールmRNAは、miRNA活性に関係なくマーカー蛋白質を発現する。導入されても、miRNA標的配列が存在しないため、miRNA発現量に応じて翻訳制御されることがないためである。
　次いで、第一のマーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞を判別する工程（以下、判別工程とも指称する）を実施する。判別工程では、上記のような第一のマーカー遺伝子の翻訳量から、細胞を判別する。すなわち、所望の細胞種が、指標となるmiRNAの発現量が少ない細胞であり、第一のマーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞を判別する工程、及び／または、前記所望の細胞種が、指標となるmiRNAの発現量が多い細胞であり、当該第一のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を判別する工程とすることができる。このような指標となるmiRNAの発現量が少ない細胞、あるいは多い細胞は、２種以上の細胞を含む細胞群に属する細胞間で、第一のマーカー遺伝子の翻訳量の比率を得ることにより決定することができる。ここで、第一のマーカー遺伝子として、翻訳制御因子を用いた場合、同時に細胞へ導入した第二のマーカー遺伝子の翻訳量から、細胞を判別する。上述した第一のマーカー遺伝子により翻訳が抑制される第二のマーカー遺伝子を有するmRNAを利用することで、第二のマーカー遺伝子の翻訳量は、指標となるmiRNAの発現量と比例する。すなわち、所望の細胞種が、指標となるmiRNAの発現量が少ない細胞である場合、第二のマーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を判別し、指標となるmiRNAの発現量が多い細胞である場合、第二のマーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞を判別する。従って、例えば、第二のマーカー遺伝子として細胞死滅蛋白質を用いた場合、指標となるmiRNAの発現量が多い細胞は、特異的に細胞死を誘導され、取り除かれることができる。
　具体的には、判別工程は、所定の検出装置を用いて、マーカー蛋白質からの信号を検出することにより実施することができる。検出装置としては、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、CCDカメラ等が挙げられるが、これらには限定されない。このような検出装置は、マーカー蛋白質及び判別の態様により、当業者が適したものを用いることができる。例えば、マーカー蛋白質が、蛍光蛋白質又は発光蛋白質の場合には、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、CCDカメラといった検出装置を用いてマーカー蛋白質の定量が可能であり、マーカー蛋白質が、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質の場合には、発光顕微鏡、CCDカメラ、ルミノメーターといった検出装置を用いたマーカー蛋白質の定量方法が可能であり、マーカー蛋白質が、膜局在蛋白質の場合には、抗体などの細胞表面蛋白質特異的な検出試薬と、上記の検出装置を用いたマーカー蛋白質の定量方法が可能である他、磁気細胞分離装置(MACS)といった、マーカー蛋白質の定量過程を経ない細胞の単離方法が可能であり、マーカー蛋白質が薬剤耐性遺伝子の場合、薬剤投与により第一のマーカー遺伝子の発現を検出して、生細胞を単離する方法が可能である。
　マーカー蛋白質が蛍光蛋白質の場合の好ましい検出方法の一例として、フローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーは、個々の細胞において翻訳されたマーカー蛋白質である、蛍光蛋白質、発光酵素が発する光の強度を、判別の情報として提供することができる。以下に、フローサイトメトリーを用いた１以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた細胞種の判別の態様について、場合に分けて説明する。
［ａ．miRNA応答性レポーターmRNAを用いる発現強度に基づく分離］
　本発明の一態様によれば、miRNA応答性レポーターmRNAを１種類のみを用いる。miRNA応答性レポーターmRNAを１種類のみをある所望の細胞群に導入した場合に得られる蛍光強度値は、例えば、図１（ａ）を参照すると、グラフ平面外、紙面上の山型の分布のようになる。これは、対象の細胞群中において、各細胞に導入されるmRNAの数にばらつきが生じるためである。たとえば、所望の細胞内のmiRNA活性にしたがって、miRNA応答性レポーターmRNAからの翻訳が抑制されると、所望の細胞の山形の分布が左に移動する。この所望の細胞群から得られる蛍光強度値の分布が、他の細胞群から得られる蛍光強度値の分布と重ならない場合、これらのある所望の細胞群は、特定の蛍光強度値を備えるもののみを分離することにより、他の細胞群と、分離し、判別することができる。あるいは、図１（ａ）紙面上に示されるように、蛍光強度値の分布に重なりがある場合であっても、分布に重なりのない端の領域を判別し、分離することができる。
［ｂ．miRNA応答性レポーターmRNAとコントロールmRNAを用いる一次元分離］
　本発明の一態様によれば、miRNA応答性レポーターmRNAを１種類のみ用い、コントロールmRNAを細胞に共導入することができる。コントロールmRNAの第一のマーカー遺伝子の翻訳は、miRNAの影響を受けることなく、細胞により一定であるといえる。コントロールmRNAは、miRNA標的部位を有さないこと以外は、miRNA応答性レポーターmRNAと同様に設計し、調製することができる。なお、本明細書中において、「次元」とは、マーカー遺伝子の翻訳比率、特には測定された蛍光強度値の比率についての「次元」をいうものとする。
　本発明においては、miRNA応答性レポーターmRNAとコントロールmRNAとが共導入された場合に、２つのmRNAから発現するマーカー蛋白質の活性比は、細胞集団内で一定でばらつきが小さいことがわかっている。したがって、２つのmRNAから発現するマーカー蛋白質の蛍光強度の比率を得ることにより、各細胞における特定のmiRNAの発現比率が得られる。
　マーカー蛋白質の発現比率は、同種の細胞間ではほぼ一定であるが、ある程度のばらつきが存在する。これは、以下のような理由によるものである。
　（１）miRNA発現量は、同種の細胞間でも多少のばらつきがある。
　（２）発現したmiRNAと共導入されるmRNAとの反応率にもばらつきがある。
　（３）共導入される２つのmRNAの細胞導入比率にも多少のばらつきがある。
　その結果として、同種の細胞間でもマーカー蛋白質の発現比率にある程度の差が生ずる場合がある。そして、フローサイトメトリーで測定した場合に、miRNA応答性レポーターmRNAがコードするマーカー蛋白質の発現強度と、コントロールmRNAがコードするマーカー蛋白質の発現強度とをそれぞれＸ軸、Ｙ軸とした場合のドットプロットでは、同種の細胞は幅をもった帯状に分布する。この幅は、上記ばらつきに起因するものである。そして、異なる細胞種の数に対応する複数の帯状プロットが現れ、これらが分離されている場合に、これらの細胞は判別可能である。一例として、判別工程において、フローサイトメトリーで測定した場合に、第１のmiRNA応答性レポーターmRNAがコードする第１のマーカー蛋白質の発現強度と、第２のmiRNA応答性レポーターmRNAがコードする第２のマーカー蛋白質の発現強度とをそれぞれＸ軸、Ｙ軸とした場合のドットプロットでは、同種の細胞は幅をもった帯状に分布する。かかる態様を、図１（ａ）に模式的に示す。図１（ａ）においては、３つの帯状のプロット群が存在する。紙面、左上及び右下の帯状プロットは、２種のmiRNA応答性レポーターmRNAを共導入することにより、ドットプロット平面上で判別された異なる二種の細胞群を示す。真ん中の帯状プロットは、コントロール実験として、同じ細胞群にコントロールmRNAのみを導入した場合のマーカー蛋白質の発現強度を模式的に示すものであり、異なる二種の細胞群はドットプロット平面上で判別することができない。
　図１（ａ）の分離において、例えば、miRNA（ａ）を標的とする、第１のmiRNA応答性レポーターmRNA、miRNA（ｂ）を標的とする、第２のmiRNA応答性レポーターmRNAとを用いる場合について説明する。これらのmRNAを用いて、細胞Ａ及び細胞Ｂを分類するとき、一方の細胞ＡでmiRNA（ａ）がより高発現（高活性）であり、もう一方の細胞ＢでmiRNA（ｂ）がより高発現（高活性）であると分離能が高くなる。言い換えると、一方の細胞Ａで、miRNA（ａ）応答性mRNAの翻訳が抑制され、他方の細胞ＢではmiRNA（ｂ）応答性mRNAの翻訳が抑制されると分離能が高くなる。図１（ａ）中、Ｘ軸に沿って紙面右から左への矢印と、Ｙ軸に沿った紙面上から下への矢印が、異なる方向への翻訳抑制を示すものである。そして、第１のmiRNA応答性レポーターmRNAについて、細胞Ａの翻訳抑制が細胞Ｂに対してα倍（α＞１）強く、第２のmiRNA応答性レポーターmRNAについて、細胞Ｂの翻訳抑制が細胞Ａに対してβ倍（β＞１）強いと仮定したとき、α×βが約１．９倍以上であれば、フローサイトメトリーのドットプロット上で細胞Ａと細胞Ｂとを区別することができる。好ましくは２．０倍以上、さらに好ましくは２．５倍以上であれば、細胞Ａと細胞Ｂとをより明確に区別することができる。他の態様として、２つのmRNAから得られる２つの蛍光値の比率によりヒストグラムを展開することによっても（例えば、図１（ａ）の左下のヒストグラム）、判別することができる。このような比率を用いて判別することで、細胞間のmRNA導入効率の違いを相殺することができる。
　このような態様における、細胞種の分解能について、さらに説明する。図２は、細胞種Ａと細胞種Ｂとを、高い分解能で識別する本発明の原理を模式的に示した図である。前述の図１（ａ）において、複数の異なるmiRNA応答性レポーターmRNAについて、蛍光強度を観察すると、それらがフローサイトメトリーのドットプロット上で、分離した帯状に観察される。このことから、複数の蛍光強度値の比率の値（図１（ａ）左下）が、より良い分離を与えることがわかる。すなわち、２種類のmRNAを導入すると、２種類の蛍光強度値を測定でき、1種類の蛍光強度比率を得ることができる。そのため、対象の細胞は一次元的に（蛍光強度比率の数直線上に）分布し、分離される。図２（ａ）は、miRNA応答性レポーターmRNAと、コントロールmRNAをそれぞれ、二つの異なる細胞群Ａ、Ｂに導入した場合のシグナル率を示すヒストグラムである。ここでは、蛍光強度比率の分布の幅が、すなわちドットプロット上に示される帯の幅が、４倍のときを想定する。図２（ａ）を参照すると、マーカー蛋白質の量比として得られるmiRNA応答性レポーターmRNAの翻訳効率（すなわち当該miRNAの活性）に、細胞A、B の間で４倍の差があれば、ヒストグラム上で、２種類の細胞群の分離が可能であることがわかる。
［ｃ．２種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いる一次元分離］
　本発明の別の態様においては、好ましくは、２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを細胞に共導入する。２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いることにより、細胞の分離能を高めることができるためである。図２（ｂ）は、翻訳効率の差がわずかしか存在しない場合であっても、高分解能を可能とする本実施形態を説明する模式図である。すなわち、細胞Ａに導入したときに、コントロールmRNAと比較して２倍程度の翻訳効率の差しかない第１のmiRNA応答性mRNA（フローサイトメトリーで得られた蛍光強度ＦＬ１）と、細胞Ｂに導入したときに、コントロールmRNAと比較して２倍程度の翻訳効率の差しかない第2のmiRNA応答性mRNA（フローサイトメトリーで得られた蛍光強度ＦＬ２）であっても、これらの２種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いることにより、十分な分離することが可能になることが示される。ここで、第１のmiRNA応答性レポーターmRNAについて、細胞Ａの翻訳抑制が細胞Ｂに対してα倍（α＞１）強く、第２のmiRNA応答性レポーターmRNAについて、細胞Ｂの翻訳抑制が細胞Ａに対してβ倍（β＞１）強いと仮定したとき、α×βの積算値が、図２で示されているそのある細胞種の分布の幅（この図では例として４倍）以上であれば、細胞ＡとＢとは分離できると考えられる。ここで例示されている４倍の幅は、比較的広い幅ができてしまった場合、つまり困難度が高い場合といえる。
　なお、α＞１でβ＜１の場合、図２（ｂ）で説明すると、細胞集団は同じ方向に動くことになる。図では、右矢印に対応するβは（β＞１）、β＜１のとき左向きになる。たとえば、この図ではα＝８でＡが左に８倍動いて、β＝０．５で細胞Bが左に２倍動いても、細胞間には４倍の幅が残り（積算値：８×０．５）、分離される。しかし、この場合、第２のmiRNA応答性レポーターmRNAではなく、miRNAに応答しないレポーターmRNA（β＝１）を使用した方が分離はよくなる（積算値８×１）。
　一方、比率のヒストグラムで細胞の分離を考える（図２）として、あるmiRNA応答性mRNAを使用すると、細胞集団のピークが左右にシフトするだけでなくて、細胞集団の幅も変わる。細胞の分離は、「細胞分布の幅」を超えられるまで、細胞の分布全体を左右にシフトさせる、といえ、分布全体のシフト量（差）がαβの積算値で決まる。一方、細胞分布の幅は、2種類のmiRNA応答性mRNAの組み合わせによっても広がったり、狭まったりする（実施例１０、図１５参照）。そこで、全体のシフト量を犠牲にしても、分布の幅を狭めることの方が、細胞の分離に有利な場合が想定される。
　従来技術に従って、異なる蛍光色素に結合した２種の抗体を用い、細胞の表面抗原により細胞を分離しようとした場合に、同様にフローサイトメトリーで蛍光強度を測定すると、図１（ｃ）に模式的に示すようなドットプロットが得られる。すなわち、細胞Ａと細胞Ｂとの重なる部分が多く、これらの細胞を高精度で分離することは不可能である。これに対し、miRNA応答性レポーターmRNAを用い、かつ上記のようにある細胞では翻訳効率が相対的に抑えられ、別の細胞では翻訳効率が相対的に多くなるような、２種以上のmiRNA応答性mRNAの組み合わせを用いることで、分解能を高めることができる。
［ｄ．３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いる二次元分離］
　さらに、miRNA応答性レポーターmRNAを３種以上用いて、複数の細胞に共導入することにより、同様の原理で分離能をさらに高めることが可能である。例えば、３種類のmRNAを導入すると、３種類の蛍光強度値を測定でき、２種類の蛍光強度比率を得ることができる。そのため、対象の細胞は二次元的に（蛍光強度比率の平面上に）分布し、分離される。一例として、２種の異なる細胞Ａ、Ｂに、miRNA（ａ）を標的とする、第１のmiRNA応答性レポーターmRNAと、miRNA（ｂ）を標的とする、第２のmiRNA応答性レポーターmRNAと、miRNA（ｃ）を標的とする、第３のmiRNA応答性レポーターmRNAとを共導入する場合について説明する。フローサイトメトリーで測定した第１のmiRNA応答性レポーターmRNAがコードする第１のマーカー蛋白質の発現強度をＦＬ１、第２のmiRNA応答性レポーターmRNAがコードする第２のマーカー蛋白質の発現強度をＦＬ２、第３のmiRNA応答性レポーターmRNAがコードする第３のマーカー蛋白質の発現強度をＦＬ３とする。そして、ＦＬ１／ＦＬ３、ＦＬ２／ＦＬ３をそれぞれＸ軸、Ｙ軸としてドットプロットを作成すると、同種の細胞は、帯状ではなく、塊状に表れる。かかる態様を、図１（ｂ）に模式的に示す。図１（ｂ）における紙面左上から右下へ向かう点線上に存在する２つの塊は、第３のmiRNA応答性レポーターmRNAではなく、いずれのmiRNAにも応答しないコントロールmRNAを使用した場合に見られるドットプロットの塊を示す。これは、図１（ａ）の平面を、紙面左上から右下へ向かう大きな矢印で切断した面を示すものともいえる。これに対し、第３のmiRNA応答性レポーターmRNAを共導入することで、miRNA（ｃ）の活性の違いによって、さらに異なる方向へ翻訳制御がなされた結果、点線上に存在する２つの塊が、それぞれ、さらに異なった方向（紙面右上並びに左下）に翻訳制御され、ドットプロット平面状でより明確に細胞Ａと細胞Ｂとが分離されるようになることがわかる。なお、３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いて二次元分離をする場合に、３種のうち、いずれのmiRNA応答性レポーターmRNAからの蛍光強度を上記計算のＦＬ３としても、同様の分離結果を得ることができる。
　３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いる二次元分離によれば、miRNAの活性状態が２倍単位で異なる細胞を２５種～６０種以上判別、分離することが可能になる。上述のように、理論上、2種のmiRNA応答性レポーターmRNAについての2種の細胞における翻訳効率の積算値が１．９倍以上であれば、フローサイトメトリーのドットプロット上で二種の細胞を区別することができるためである。よって、３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いる二次元分離は、細胞種の判別において実用的に用いることができる。例えば、あるmiRNAの活性状態が２倍ずつ５段階違う細胞がありえるとすると、２種類のmiRNA応答性mRNAと１種類のコントロールmRNAを同時に導入して、５×５＝２５種類の細胞を分離できると考えられる。３種類のmiRNA応答性レポーターmRNAでは、計算上、 ５×５×５＝１２５種類の細胞を分離できるが、実際にはオーバーラップがあるため、６１種程度の細胞を分離することができる。このことは、実施例２、図４（ｆ）にて実証している。
［ｅ．４種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いる三次元分離］
　上記ｄの態様と同様にして、４種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いて、三次元分離をすることも可能である。すなわち、４種類のmRNAを導入すると、４種類の蛍光強度値を測定でき、３種類の蛍光強度比率を得ることができる。そのため、対象の細胞は三次元的に（蛍光強度比率の空間中に）分布し、分離される。一例として、２種の異なる細胞Ａ、Ｂに、miRNA（ａ）を標的とする、第１のmiRNA応答性レポーターmRNAと、miRNA（ｂ）を標的とする、第２のmiRNA応答性レポーターmRNAと、miRNA（ｃ）を標的とする、第３のmiRNA応答性レポーターmRNAと、miRNA（ｄ）を標的とする、第４のmiRNA応答性レポーターmRNAとを共導入する場合について説明する。フローサイトメトリーで測定した第１のmiRNA応答性レポーターmRNAがコードする第１のマーカー蛋白質の発現強度をＦＬ１、第２のmiRNA応答性レポーターmRNAがコードする第２のマーカー蛋白質の発現強度をＦＬ２、第３のmiRNA応答性レポーターmRNAがコードする第３のマーカー蛋白質の発現強度をＦＬ３、第４のmiRNA応答性レポーターmRNAがコードする第４のマーカー蛋白質の発現強度をＦＬ４とする。そして、ＦＬ１／ＦＬ４、ＦＬ２／ＦＬ４、ＦＬ３／ＦＬ４をそれぞれＸ軸、Ｙ軸、Ｚ軸としてドットプロットを作成すると、同種の細胞は、三次元空間に、それぞれが塊状に分布する。
　また、更なる高次元分離が理論上可能であり、（ｎ＋１）種類の異なるmiRNA応答性レポーターmRNAを用いれば、（ｎ＋１）種類の蛍光強度値を測定でき、ｎ種類の蛍光強度比率を得ることができる。その結果、ｎ次元空間において、複数種の細胞分離が可能である。この場合も、（ｎ＋１）種類のmiRNA応答性レポーターmRNAにおいて、miRNA標的配列と、第一のマーカー遺伝子がそれぞれ異なる必要がある。特に、蛍光強度で分離する場合は、ｎ種のマーカー蛋白質が、検出可能に異なる波長領域を有する必要がある。
　本発明の判別工程における、別の検出方法の一例として、イメージングサイトメトリーが挙げられる。イメージングサイトメトリーは、イメージアナライザーを用いて実施することができる。イメージアナライザーは、細胞内の第一のマーカー遺伝子の翻訳量の経時変化の情報を得ることができ、また、画像化、視覚化の点で優れており、単位時間あたりの解析量を向上できるほか、細胞の形態情報や位置情報を包含した解析、培養容器に接着した状態の細胞や、平面的あるいは立体的に組織化された細胞群を対象にした細胞の同定といった応用が可能となる点で有利である。
　イメージアナライザーを用いる場合であっても、フローサイトメーターを用いる場合と同様に、２種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAから得られる蛍光強度比をドットプロットとして平面上に示すことで、異なる細胞種を分離することができ、上記ａ～ｄの態様が実施可能である。
　さらには、画像処理により、細胞の蛍光強度比を色情報に変換して、より視覚的に利用可能な判別工程とすることができる。具体的には、複数のmiRNA応答性レポーターmRNAにおいて、核局在化シグナルをコードする配列、例えばＭ９を含むように設計する。これにより、細胞内で、マーカー蛋白質が、核局在化シグナルに融合された状態で翻訳され、細胞内の核にマーカー蛋白質を局在化させて、より鮮明な細胞の蛍光画像を得ることができる。
　本発明の方法においては、任意選択的な前工程として、指標となるmiRNAをスクリーニングする工程を含むことが好ましい。スクリーニング工程では、測定対象となる「２種以上の細胞を含む細胞群」に含まれる、もしくは含まれると予測される複数種の細胞において、活性が異なる１つあるいは複数のmiRNAを選別する。上述の所望の分解能を達成するためである。特に、予め細胞群に含まれる細胞種がある程度分かっている場合には、ある細胞Ａでは高発現（高活性）であり、別の細胞Ｂでは低発現であるような１つのmiRNAを選別する。２種以上の指標となるmiRNAを選択する場合、ある細胞Ａでは高発現（高活性）であり、別の細胞Ｂでは低発現（低活性）であるようなmiRNA（ａ）と、ある細胞Ａでは低発現（低活性）であり、別の細胞Ｂでは高発現（高活性）であるようなmiRNA（ｂ）である、miRNAの組み合わせを選別する。かかる工程において決定された１もしくは２以上のmiRNAに基づいて、miRNA応答性レポーターmRNAにおける、miRNA標的配列を決定する。
　細胞群に含有される細胞が単離された細胞（例えば、細胞Ａおよび細胞Ｂ）としてそれぞれが入手可能な場合、スクリーニング工程は、以下の３つのステップを含む方法によって成し得る。第１ステップは、miRNAライブラリから選択した複数種のmiRNAをスクリーニングする。例えば、６０～７０種のmiRNAについて、各miRNAを標的とし、同一の蛍光蛋白質をコードするmiRNA応答性レポーターmRNAを調製する。そして、既知の細胞Ａ、Ｂのそれぞれに、各miRNA応答性レポーターmRNAと、別の蛍光蛋白質をコードするコントロールmRNAとを共導入し、翻訳効率（コントロールmRNAから翻訳されたマーカー蛋白質/ miRNA応答性レポーターmRNAから翻訳されたマーカー蛋白質）を測定する。
　第２ステップは、第１のステップで測定された翻訳効率の値のうち、２種、３種、あるいは４種を組み合わせて、それらの値で構成されるベクトルを、細胞A、細胞Bのそれぞれの座標ベクトル（例えば、ＸＹ座標、ＸＹＺ座標、あるいは任意のｎ次元座標（ｎは4以上の整数）とし、当該座標における細胞間の距離を算出する。既知の細胞を３種類以上含む場合は、含まれる全ての２細胞間の距離のうち、もっとも短い距離を算出する。
　第３ステップは、第２のステップで計算された細胞間の距離を大きくする、２種、３種、あるいは４種のmiRNAを標的配列とし、各々異なる蛍光蛋白質遺伝子をコードする、１セットのmiRNA応答性レポーターmRNAを調製する。１セットのmiRNA応答性レポーターmRNAを、細胞Ａ、Ｂあるいは３種類以上の細胞それぞれに共導入し、分離能について試験する。複数のセットのうち、それぞれの細胞の蛍光比率の分布が、それぞれ異なる領域にあらわれ、分布間のオーバーラップが小さいという試験結果が得られたものを、以下の導入工程及び判別工程で用いることが好ましい。
　一方、本発明とは異なる分離方法が既知である細胞群の場合には、スクリーニング工程の第１ステップにおいて、別の手法を用いた分離を同時に実施し、分離された細胞ごとの翻訳効率、すなわちmiRNA活性の値を測定する、といった操作をさらに必要とする。本発明とは異なる分離方法とは、例えば、分離時に細胞を固定、膜透過して抗体を用いて細胞内因子を検出する方法や、生細胞であってもあらかじめ遺伝子を改変するなどして、スクリーニング工程を目的に使用する細胞（レポーターラインなど）を用いる手法が考えられるが、これらの方法には限定されない。第２ステップ、第３ステップについては、上記と同様にして実施することができる。本スクリーニング方法については、実施例９に実証する。
　測定対象となる「２種以上の細胞を含む細胞群」に含まれる複数種の細胞が未知である場合には、上記のスクリーニング工程を、以下の第１～第４ステップを含んでなるスクリーニング工程に代えることができる。第１ステップでは、細胞群のmiRNA活性の値を測定するとともに、細胞群内の個々の細胞が示すmiRNA活性の分布を得る。その結果、miRNA活性が広い分布を示すような複数種のmiRNAを選択する。例えば、６～１０種のmiRNAを選択することが好ましい。
　第２ステップは、第１のステップで選択されたmiRNAのうち、２種、３種、あるいは４種の組み合わせのセットをつくる。第２ステップは、１セットに含まれる２種、３種、あるいは４種のmiRNAを標的配列とし、各々異なる蛍光蛋白質遺伝子をコードする、１セットのmiRNA応答性レポーターmRNAを調製する。
　第３ステップは、第２のステップで調製された、２種、３種、あるいは４種のmiRNA応答性レポーターmRNAから構成される１セットのmiRNA応答性レポーターmRNAを、細胞群に共導入し、細胞群内におけるmiRNA活性の相関関係を分析する。
　第４ステップは、第３のステップで分析された、miRNA活性の相関関係に基づいて、２種、３種、あるいは４種のmiRNA応答性レポーターmRNAから構成される１セットのmiRNA応答性レポーターmRNAをあらたに調製し、細胞群に共導入し、分離能について試験する。複数のセットのうち、細胞群の蛍光比率の分布が２種、３種、４種、あるいはそれ以上の集団に分離されるという試験結果が得られたものを、以下の導入工程及び判別工程で用いることが好ましい。このような、「２種以上の細胞を含む細胞群」に含まれる複数種の細胞が未知である場合には、本発明の判別方法は、新しい細胞種の定義を与える方法であるともいえる。本スクリーニング方法については、実施例１０及び１１に実証する。
　別の任意選択的な前工程として、miRNA応答性レポーターmRNAを合成する工程を含んでもよい。かかる合成工程は、前記スクリーニング工程において、指標となるmiRNAもしくはmiRNAの組み合わせが決定されたら、それらを標的とするmiRNA標的配列を備えるmiRNA応答性レポーターmRNA、もしくはmiRNA応答性レポーターmRNAの組み合わせを合成する。 
　さらに、任意選択的な別の工程として、判別工程の後に、細胞を分離する工程を含んでも良い。
　上記においては、細胞の具体的な判別例として、判別工程において、フローサイトメトリー及びイメージングサイトメトリーを用いる場合を例示して説明したが、本発明は上記態様には限定されず、理論的に種々の態様での判別が可能となる。
　本発明はまた、別の局面によれば、１種のmiRNA応答性レポーターmRNAもしくは、2種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAの組み合わせを少なくとも含んでなり、任意選択的にコントロールｍRNAをさらに含んでなる、細胞種の判別のためのキットに関する。このようなキットは、上記で説明したmiRNA応答性レポーターmRNAもしくは、2種以上のmiRNA応答性レポーターmRNAの組み合わせを保存可能な容器等に封入してなるものであってよい。また、使用方法についての説明書を備えるものであっても良い。
　以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものではない。
［プラスミドの構築］
　コントロールtagRFP mRNA（配列番号24）のIVTテンプレート（mRNAの合成用の鋳型DNA）は、T7Fwd5UTR 及びRev120Aのプライマーセットを用いて、プラスミドpSRT-tagRFPからPCR増幅した。最初に、FwdMCS及びRevMCSのプライマーセットを用いて、PCR-based site directed mutagenesisにより、pGEM T-easy (Promega)のマルチクローニングサイトを改変してpAM空ベクターを得た。次に、pCDFDuet-1 (Novagen)をNheI 及び AgeIで消化したDNA断片を平滑末端化し、pAM のDraI で消化したDNA断片に挿入し、ｐSM空ベクターを生成した。次に、pSRT空ベクターを造るために、オリゴDNAのペアであるCode5UTR 及びComp5UTRをアニーリングしてEcoRI-NcoIサイトに挿入し、次いで、アニーリングしたCode3UTR及びComp3UTR を、 XbaI-HindIII サイト（あるいは「部位」）に挿入した。最後に、tagRFPのコード配列を適切なプライマーセットを用いてPCR増幅して、NcoI及びBglIIで消化し、pSRTのNcoI及びBglIIサイトに挿入し、pSRT-tagRFPを得た。
　蛍光蛋白質に、核局在化シグナルであるM9を融合するために、hmAG1、hmKO2、tagBFPのコード領域を適当なプライマーセットを用いて増幅し、pSRT-tagRFPのtagRFP領域を置換した。次いで、M9配列をp4LambdaN22-3mEGFP-M9（参考文献［４］）からのプライマーセットFwdM9及びRevSV40を用いて増幅し、BamHI及びBglIIで消化し、BglIIサイトに挿入した。プライマー及びオリゴヌクレオチドの配列は、以下の表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
   
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
［IVTテンプレートDNAの構築］
　蛍光蛋白質の蛋白質コード領域、コントロール５’UTR及び３’UTR配列は、プラスミドあるいはオリゴDNAからの適当なプライマーを用いて、PCR増幅した。いくつかの５’UTR断片を、プラスミドから生成した。表２に示したDNA断片のペアは、アニールされ、18nt-2xFr15-ECFP （参考文献［３］）のBamHI-AgeI サイトに挿入した。次いで、プライマーセットT7FwdA 及びRev5UTRを用いて、5’ UTRを増幅した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
 
　IVTのテンプレートを生成するために、それぞれ、１０ｐｍｏｌの５’ＵＴＲ断片及び３’ＵＴＲ断片、及び５０ｎｇのレポーター蛋白質の蛋白質コード領域を、表２に示したT7FwdA及びRev120Aのプライマーセットを用いてＰＣＲ増幅して、連結した。表３に示した、他の５’ＵＴＲは、オリゴＤＮＡから合成し、PCRで作製した5’ UTR 断片に替えて、２回目のＰＣＲに添加した。コントロールmRNAまたはスクリーニングライブラリ調製するために、２回目のＰＣＲでは、T7FwdA に替えて、それぞれ、T7Fwd5UTRまたはT7FwdBを使用した。３’ＵＴＲにmiRNAの標的配列を4コピー含むmRNAのIVTテンプレートは、表４に示したオリゴＤＮＡを３’ＵＴＲのＰＣＲ断片の代わりに使用し、Rev120Aに替えて、Rev120A-2を使用してＰＣＲ増幅し、連結した。ＰＣＲ産物は、MinElute PCR purification kit (QIAGEN)を用いて、製造者の指示に従って精製した。精製の前に、プラスミドから増幅されたＰＣＲ産物を、Dpn I (Toyobo)を用いて、37 °Cで３０分消化した。プライマーの配列は、表１に示す。
［mRNAの合成及び生成］
　miRNA応答性レポーターmRNAは、修正されたプロトコル（下記の参考文献［１］を参照）において、MegaScript T7 kit (Ambion)を用いて調製した。この反応にいて、ウリジン三リン酸及びシチジン三リン酸に替えて、シュードウリジン-5’-三リン酸及び5-メチルシチジン-5’-三リン酸(TriLink BioTechnologies)をそれぞれ用いた。IVT（mRNA合成）反応の前に、グアノシン-5’-三リン酸は、Anti Reverse Cap Analog (New England Biolabs)で５倍希釈した。反応混合液を３７度で４時間インキュベートして、TURBO DNase (Ambion)を添加した後、３７度でさらに３０分インキュベートした。得られたｍＲＮＡは、FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech) で精製し、Antarctic Phosphatase (New England Biolabs)を用いて、３７度で３０分インキュベートした。その後、RNeasy MiniElute Cleanup Kit (QIAGEN)により、さらに精製した。
［miRNA応答性ｍRNAのスクリーニング］
　miRNA応答性ｍRNAのスクリーニングは３ステップで行った。第１のステップでは、miRNA応答性reporter hmAG1 mRNA を、コントロールhmKO2 mRNAと共導入して、活性が細胞により大きく異なる８つのmiRNAを選択した。第２のステップでは、４つのmiRNA応答性レポーターmRNAの組み合わせ表を作成して、試験した。この組み合わせ表では、８つのmiRNAから選ばれた、どの２つのmiRNAのペアについても、４種類のマーカー蛍光蛋白質から選ぶことができる、あらゆる２つの組み合わせが網羅されるようにした。第３のステップでは、新たに４つのmiRNA応答性レポーターmRNAを組み合わせて、いくつかのセットについて、試験した。
［細胞培養］
　HeLa細胞及びMCF-7細胞は、10% Fetal Bovine Serum (FBS) 及び 1% Antibiotic Antimycotic Solution (Sigma)を含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)-F12及びRPMI 1640でそれぞれ培養した。293FT細胞(invitrogen)は、10% FBS, 2 mM L-Glutamine (invitrogen), 0.1 mM Non-Essential Amino Acids (invitrogen), 1 mM Sodium Pyruvate (Sgima), 0.5% Penicillin-Streptomycin (invitrogen)を添加したDMEM中で成長させた。細胞を混合した実験においては、それぞれの細胞をHeLa細胞と同じ培地で調製し、同数の細胞を混合して播種した。
　IMR-90細胞(ATCC)は、10% FBS 、1% Penicillin-Streptomycin-Glutamine (Gibco)を添加したイーグル基礎培地中の、ゼラチンコートしたプレート上で培養した。正常ヒト肺線維芽細胞(NHLF; Lonza)は、製造者の指示に従って培養した。IMR-90は２０継代以内、NHLFは１０継代以内のものを用いた。IMR-90細胞をin vitroで分化させるために、これらの細胞を低血清培地 (0.01% FBS)中で４８時間飢餓状態とし、低血清培地中で、10 ng/mLのhuman TGF-β1 (哺乳類由来; PeproTech)の存在下あるいは非存在下、２４時間刺激した。次いで、上記で設計、調製したmiRNA応答性レポーターmRNAでトランスフェクトした。トランスフェクションの４時間後、培地をトランスフェクションのときと同じ培地に交換した。
［miRNA応答性レポーターmRNAによるトランスフェクション］
　培養細胞(HeLa, 293FT, MCF-7, IMR-90)は２４ウェルプレートに播種し、翌日に、合成したｍRNAを導入した。NHLFは２４ウェルプレートに播種し、その日に、合成したｍRNAを導入した。導入には、１μＬのStemFect (Stemgent)を用いて、製造者の指示に従って実施した。翻訳効率の測定においては、それぞれ１００ｎｇの、各種miRNAに応答するレポーターEGFP mRNAと、コントロールtagRFP (Evrogen) mRNAとをそれぞれの細胞に共導入した。ただし、mRNAの設計を比較した実験（実施例３、図６）では、２ｐｍｏｌのmirVana miRNA inhibitor (Applied Biosciences)の存在下で翻訳効率を決定した。
　インヒビターアッセイにおいては、0.1～1pmolのmiRNAインヒビター、または、２５～２００ｎｇのレポーターmRNA（クリックビートルルシフェラーゼCBRluc (Promega)の遺伝子をＯＲＦに含み、レポーターEGFPと同じ５’ＵＴＲを有する）が、２つのレポーターmRNAとともに共導入された。導入の24時間後、Accuri C6 (BD Biosciences) を用いたフローサイトメトリー法で細胞を測定した。各細胞における二種類のレポーター蛋白質の蛍光強度の比を計算し、プロットした。翻訳効率は、miRNAに応答したEGFPの平均強度を、フローサイトメトリーにより測定したコントロールｔａｇＲＦＰの平均強度で割ることにより決定した。
　二つのmiRNA応答性レポーターmRNAを用いて細胞を分離するために、１００ｎｇのEGFPを発現するレポーターmRNA、及び１２５ｎｇのhmKO2 (Amalgaam) を発現するレポーターmRNAを細胞またはその混合物に共導入した。IMR-90細胞の最初のスクリーニングでは、５０ｎｇのレポーターhmAG1 (Amalgaam) mRNA、及び８０ｎｇのコントロールhmKO2 mRNAを細胞にトランスフェクトした。分化させたIMR-90細胞及びNHLF細胞については、hmAG1 mRNA及びhmKO2 mRNAsを２倍にした。３つのmRNAの共導入においては、４０ｎｇのhmAG1 mRNA、１０ｎｇのhmKO2 mRNA、２００ｎｇのtagBFP (Evrogen) mRNAを、４つのmRNAの共導入においては、これらの３つに加えて、２５０ｎｇのhdKeimaRed (Amalgaam) mRNAを用いた。CBG68luc mRNA（配列番号31）は、hmAG1 mRNA, hmKO2 mRNA 及びtagBFP mRNAを希釈するために用いた。培地はトランスフェクションの４時間後に交換した。
［フローサイトメトリー］
　トランスフェクションの２４時間後に細胞を培養皿から分離し、メッシュを通して、フローサイトメトリーにより分析した。２つのmRNAによる共導入の分析には、FL1 (530/30 nm) 及び FL2 (585/40 nm) filters フィルターを備えたAccuri C6 (BD Biosciences)を用いた。３つのmRNAもしくは４つのmRNAによる共導入の分析には、FACSAria (BD Biosciences)を用いた。hmAG1, hmKO2, tagBFP 及び hdKeimaRedは、FITC filter (530/30 nm)を備えたblue laser (488 nm)により検出した。PE filter (585/42 nm)を備えたgreen laser (561 nm)、Pacific Blue filter (450/40 nm)を備えたviolet laser (405 nm)、及びQdot 605 filter (610/20 nm)を備えたviolet laserにより、それぞれ分析した。死細胞及びデブリは、前方及び側方光散乱シグナルにより除外した。翻訳効率の測定においては、EGFPの強度及びtagRFPの強度は、EGFPまたはtagRFPによりトランスフェクトされた細胞のデータセットから得られたspectral matrix（参考文献［５］）に基づいて補正した。翻
訳効率は、補正したEGFPシグナルの平均強度を、補正したtagRFPシグナルの平均強度で割って得られた値により定義した。
［イメージングサイトメトリー］
　レポーター蛍光蛋白質をＣ末端側で核局在化シグナルＭ９に融合し、共導入した細胞を明確化した。３つのmRNAを導入した２４時間後、IN Cell Analyzer 6000 (GE Healthcare)を用いて、細胞の明視野像及び蛍光画像を得た。hmAG1、hmKO2、tagBFPの蛍光シグナルは、FITC filterを備えた青色レーザー、DsRed filterを備えた緑色レーザー、DAPI filterを備えたＵＶレーザーでそれぞれ測定した。得られた画像は、Cell Profiler （参考文献［２］）を用いて解析した。まず、三つの蛍光チャネルの平均イメージにおいて、核を識別した。次いで、フローサイトメトリーと同様に、各ピクセル毎に、hmKO2シグナル及びtagBFPシグナルを、hmAG1シグナルで割った。そして幾何平均率をそれぞれの核について得た。画像は、ImageJ （アメリカ国立衛生研究所（NIH）製）を用いて編集した。
［実施例１　miRNA応答性レポーターmRNAによる、既知の細胞株の一次元分離］
　１種もしくは２種のmiRNA応答性レポーターmRNAによる、既知の細胞株の一次元分離を行った。結果を図３に示す。図３（ａ）は、本実施例において用いた、インビトロ合成されたmiRNA応答性レポーターmRNAの模式図である。紙面左手５’末端から紙面右手の３’末端の向きに、ＡＲＣＡ（キャップ構造アナログ），miRNA標的配列、蛍光蛋白質をコードする遺伝子、ポリＡテイルが位置する。ＡＲＣＡとmiRNA標的配列、miRNA標的配列と開始コドンの間はそれぞれ、約２０塩基離れるように設計した。
　図３（ｂ）は、３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを３種の細胞株にそれぞれ導入した場合の翻訳効率を比較して示すグラフである。マーカー遺伝子としては、いずれもEGFPをコードする遺伝子を用い、miRNA標的配列は、miR-21-5p、miR-24-3p、miR-203aをそれぞれ用いた。３種のmiRNA応答性レポーターmRNA（α(miR-21-5p)-EGFP（配列番号1）、α(miR-24-3p)-EGFP（配列番号3）、α(miR-203a)-EGFP（配列番号5））は、それぞれ、１００ｎｇを、100 ngのコントロールtagRFP mRNA (配列番号24)とともに、HeLa, 293FT 、MCF-7細胞に直接、共導入した。翻訳効率は、共導入の２４時間後のフローサイトメトリー測定で、EGFPの平均強度を、tagRFPの平均強度で割ることにより決定した。各グラフのカラムの上部の数値は、それぞれの細胞株間の翻訳効率の倍率を示す。エラーバーは、平均±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
　図３（ｃ）は、miR-21-5p応答性EGFP mRNAと、コントロールhmKO2 mRNA（配列番号22）とを共導入したHeLa細胞、293FT細胞について、共導入の２４時間後の測定結果を示すドットプロットである。また、図３（ｆ）は同じｍRNAをHeLa細胞と293FT細胞との混合物に共導入した２４時間後の測定結果を示すドットプロットである。Accuri C6 フローサートメーターを用いて測定した場合の、独立に３回の試験を行い、代表的な結果を示した。miRNA活性の相違を反映する蛍光強度比から、２種の細胞株が明らかに分離されたことが示される。
　図３（ｄ）は、miR-24-3p応答性EGFP mRNAと、miR-203a応答性hmKO2 mRNA（配列番号6）とを共導入したHeLa細胞、MFC-7細胞について、共導入の２４時間後の測定結果を示すドットプロットである。また、図３（ｈ）は同じｍRNAを、HeLa細胞とMFC-7細胞との混合物に共導入した２４時間後の測定結果を示すドットプロットである。図３（b）を参照すると、これらのmiRNAは、二つの細胞株で、活性がわずかに及び逆向きに異なっていることがわかる。図３（ｄ）、（ｈ）を参照すると、このようなわずかな活性の差を用いて、２種類の細胞株が明確に分離されていることがわかる。
　図３（ｅ）は、二つの蛍光シグナルの比率を示すヒストグラムである。HeLa細胞、MCF-7細胞、及びこれらの混合物に、各ヒストグラムに示されたmiRNA応答性レポーターmRNA／コントロールmRNA（EGFP mRNA（配列番号19）またはhmKO2 mRNA（配列番号２２））のセットを共導入した。2種のmiRNA応答性レポーターmRNAを導入した細胞の蛍光比率の累積頻度は、一番下のカラムに示す。また、図３（ｇ）は、図３（ｃ）、図３（ｆ）のドットプロットにおける、二つの蛍光シグナルの比率を示すヒストグラムである。
［実施例２　高次元空間での細胞分離］
　３種もしくは４種のmiRNA応答性レポーターmRNAによる細胞分離を行った。まず、３種のmiRNA応答性レポーターmRNAである、α(miR-24-3p)-EGFP、α(miR-127-3p)-EGFP（配列番号7）、α(miR-17-5p)-EGFP（配列番号9）、α(miR-92a-3p)-EGFP（配列番号15）について、HeLa、293FT、MCF-7細胞における翻訳効率を測定した。結果を図４（ａ）（ｄ）に示す。各カラムの頂部の数値は、３種の細胞株のうち、２種についての翻訳効率の比率を示す。エラーバーはそれぞれ、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
　３種のmiRNA応答性レポーターmRNA（α(miR-24-3p)-hmAG1（配列番号4）、α(miR-127-3p)-hmKO2（配列番号8）、α(miR-17-5p)-tagBFP（配列番号13））を用いた二次元分離を行った結果を図４（ｂ）に示す。３種の細胞株に、それぞれ独立に、３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを共導入し、２４時間後に、FACSAriaで分析した。フローサイトメトリーのデータは、２つの比率についてプロットした。２つの比率は、hmKO2強度をhmAG1強度で割った値、及びtagBFP強度をhmAG1強度で割った値である。共導入されたHeLa細胞、293FT細胞、MCF-7細胞密度を平面上にプロットした。着色した密度プロットは、293FT細胞、HeLa細胞、及びMCF-7細胞の密度を、それぞれ、赤、緑、青のチャンネルで示した画像を重ね合わせ、そのネガ画像として作製した。
　３種の細胞を混合したサンプルについて、３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた二次元分離を行った結果を図４（ｃ）に示す。フローサイトメトリーのデータは、２つの比率についてプロットした。
　４種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた三次元分離を行った。HeLa、293FT、MCF-7、及びこれらの混合物のそれぞれに、4種のコントロールmRNAである、hmAG1 mRNA（配列番号21）、hmKO2 mRNA（配列番号22）、tagBFP mRNA（配列番号20）、hdKeimaRed mRNA（配列番号23）を共導入した。また、HeLa、293FT、MCF-7、及びこれらの混合物のそれぞれに、4種のmiRNA応答性レポーターmRNAである、α(miR-24-3p)-hmAG1、α(miR-127-3p)-hmKO2、α(miR-92-3p)-tagBFP（配列番号17）、α(miR-17-5p)-hdKeimaRed（配列番号14）を共導入した。導入の24時間後にフローサイトメトリー分析を行った。４種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた三次元分離を行った結果を図４（ｅ）に示す。フローサイトメトリーによる測定後、３つの比率の幾何平均、すなわち、hmKO2強度をhmAG1強度で割った値、tagBFP強度をhmAG1強度で割った値、及びhdKeimaRed強度をhmAG1強度で割った値を計算して、プロットした。エラーバーは、それぞれの軸における、幾何平均±幾何標準偏差を示す(n=5900～7300)。
　細胞密度は、3つの軸に垂直な3つの平面にプロットし、hmKO2、tagBFP、hdKeimaRedの蛍光強度はそれぞれ、hmAG1の蛍光強度で割った。密度プロットは、図５に示す。図５は、3回の独立した実験のうち、代表的な結果である。図５Ａ（ａ）、（ｂ）より、4種のコントロールmRNAを共導入した3種の細胞株は、いずれの平面のプロットを参照しても分離ができていないことがわかる。一方、図５（ｃ）より、4種のmiRNA応答性レポーターmRNAを共導入した3種の細胞株は、いずれの平面のドットプロットにおいても、明確に分離ができている。また、図５（ｄ）より、3種の細胞株の混合物においても、同様に分離が目視で確認できる。すなわち、細胞株混合物を、3種の細胞株に分離するような判別が可能になる。
　miRNA標的配列を持たない、コントロールmRNAであるhmAG1 mRNA, hmKO2 mRNA、tagBFP mRNAをそれぞれ、2倍ずつ5段階に希釈して、様々な組み合わせでHeLa細胞に共導入した。46通りの独立した導入結果から得られる密度プロットを図４（ｆ）に示す。Set A は、4段階の２倍希釈から得られるドットプロットを含む群であり、Set Bは5段階の２倍希釈から得られるドットプロットを含む群である。詳細な導入条件は、表５Ａ、表５Ｂに示した。複数のコントロールmRNAを種々の濃度に希釈したこの実験は、細胞内でのmiRNA活性により生じうる種々のmiRNA応答性レポーターmRNAを示すものである。すなわち、理論的に、3種類のmiRNAに注目し、そのmiRNAの活性が、細胞ごとに2倍ずつ4段階異なると想定した（最大43=64種類の細胞種を想定できる）場合、3種類のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いることでこれらの細胞を最大37種類に分離することができることを示唆している。またmiRNAの活性が2倍ずつ5段階異なる場合でも、同じ方法で分離できることを示唆している（その場合は最大53=125種類の細胞種が想定でき、３種類のmiRNA応答性レポーターmRNAで61種類にまで分離できる）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例３　miRNA標的配列の挿入と翻訳効率］
　レポーターmiRNA応答性レポーターmRNAにおける、miRNA標的配列の位置について調べた。miR-21-5pの標的部位である、miR-21-5pの完全相補配列が、５’UTRに１つ存在するmiRNA応答性レポーターmRNA（α(miR-21-5p)-EGFP（配列番号1））と、miR-21-5pの完全相補配列が、３’UTRに４つ存在するmiRNA応答性レポーターmRNA（EGFP-4xα(4xmiR-21-5p)（配列番号2））とを調製し、これらについて翻訳効率を調べた。同様にして、miR17-5pの標的部位である、miR-17-5pの完全相補配列が、５’UTRに１つ存在するmiRNA応答性レポーターmRNA（α(miR-17-5p)-EGFP（配列番号9））と、miR-17-5pの完全相補配列が、３’UTRに４つ存在するmiRNA応答性レポーターmRNA（EGFP-4xα(4xmiR-17-5p) （配列番号10））とを調製し、これらについて翻訳効率を調べた。レポーターmRNAが応答するmiRNAに対する阻害剤(inhibitor)の存在下で各レポーターmRNAの翻訳効率を測定した。miR-1 に対する阻害剤をネガティブコントロールとして使用した。阻害剤の濃度は、2 pmolとした。エラーバーはそれぞれ、平均値±標準偏差（ｎ＝２）を示す。結果を図６に示す。
［実施例４　miRNA応答性レポーターmRNAのmiRNAインヒビターとしての活性］
　市販のmiRNA阻害剤とmiRNA応答性レポーターmRNAの違いを検証する実験を行った。市販のmiRNA阻害剤あるいは、miR-17-5p応答性レポーターmRNA （α(miR-17-5p)-CBRLuc（配列番号33）; ルシフェラーゼ遺伝子のため蛍光は示さない）の存在下で、同じmiR-17-5p に応答する α(miR-17-5p)-EGFPの、HeLa細胞中での翻訳効率を測定した。miR-1 に対する阻害剤、miR-1に応答するルシフェラーゼmRNA（α(miR-1)-CBRLuc（配列番号32））をネガティブコントロールとして使用した。結果を図７（ａ）に示す。エラーバーはそれぞれ、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。この結果より、miRNA応答性レポーターmRNAは、miRNAインヒビターとして機能することはほとんどないことがわかる。
　他の6種類のmiRNAに応答するレポーターmRNA（ルシフェラーゼ）（α(miR-21-5p)-CBRluc : 配列番号34、α(miR-92a-3p)-CBRluc : 配列番号35、α(miR-24-3p)-CBRluc : 配列番号36、α(miR-127b-3p)-CBRluc : 配列番号37、α(miR-16-5p)-CBRluc : 配列番号38、α(miR-203a)-CBRluc : 配列番号39）がmiRNA阻害剤としては働かないことを確認した。
それぞれのmiRNAの活性は、そのmiRNAに応答するEGFP レポーターmRNAで測定した。このとき、miR-1 (ネガティブコントロール) または、同じmiRNAに応答するルシフェラーゼレポーターmRNAを導入した。3回の試験結果を図７（ｂ）に示す。
［実施例５　３種の細胞株におけるmiRNA応答性レポーターmRNAの翻訳効率］
　３種の細胞株に、それぞれ、20種のmiRNA応答性レポーターmRNAを導入し、翻訳効率の比率を調べた。図８は、3種の細胞株における、これら20種のmiRNA応答性レポーターmRNAの翻訳効率を示すグラフである。（ａ）は、HeLaと293FTの比較、（ｂ）は、293FTとMCF-7との比較、（ｃ）は、MCF-7とHeLaと比較を示す。エラーバーはそれぞれ、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。本結果で得られた翻訳効率の値を用いて、この値で構成されるベクトルを考えた場合の座標における細胞間の距離を算出して、他の実施例で使用したmiRNA応答性レポーターmRNAの組み合わせを選択した。
［実施例６　２種のmiRNA応答性レポーターmRNAによる一次元分離］
　実施例１と同様に２種のmiRNA応答性レポーターmRNAによる、2種の細胞株の蛍光強度比率に基づく一次元分離を行った。図９に一連の結果を示す。あるmiRNA応答性レポーターmRNAによる翻訳効率、すなわちmiRNA活性が2倍以下である2種の細胞株においても、293FTとHeLaの分離、もしくは、293FTとMCF-7の分離が可能であったことを示す。エラーバーはそれぞれ、平均値±標準偏差（ｎ＝３）を示す。
　293FT細胞とHeLa細胞における、miR-24-3p、miR-17-5pの活性を調べるために翻訳効率を測定した。測定には、α(miR-24-3p)-EGFP、α(miR-17-5p)-EGFPを用いた。結果を図９（ａ）に示す。各カラムの頂部の数値は、翻訳効率の比率を示す。293FTとHeLa、及びこれらの混合物に、α(miR-24-3p)-EGFP、α(miR-17-5p)-hmKO2（配列番号12）を共導入し、導入の24時間後にフローサイトメトリー分析を行った。コントロールmRNAとしては、EGFP、hmKO2を用いた。図９（ｂ）にドットプロットの結果を示す。293FT細胞とHeLa細胞が、異なる帯状プロットとして、判別されていることがわかる。また、図９（ｇ）に、293FTとHeLaとの混合物についての同様のドットプロットを示す。これらの結果から、混合物について測定した場合でも、それぞれの細胞が分離して観察できることがわかる。図９（ｃ）にシグナル比率のヒストグラムを示す。それぞれの細胞株に、各ヒストグラムに示されたmiRNA応答性レポーターmRNA／コントロールmRNAのセットを共導入した。フローサイトメトリーで測定した2種の蛍光シグナル比を計算し、プロットした。2種のmiRNA応答性レポーターmRNAを導入した細胞の累積頻度は、図９（ｃ）の一番下のカラムに示す。
　同様に、293FT細胞とMCF-7細胞における、miR-17-5p、miR-127-3pの活性を調べるために翻訳効率を測定した。測定には、α(miR-17-5p)-EGFP、α(miR-127-3p)-EGFPを用いた。結果を図９（ｄ）に示す。各カラムの頂部の数値は、翻訳効率の比率を示す。293FTとMCF-7、及びこれらの混合物に、α(miR-17-5p)-EGFP、α(miR-127-3p)-hmKO2を共導入し、導入の24時間後にフローサイトメトリー分析を行った。コントロールmRNAとしては、EGFP、hmKO2を用いた。図９（ｅ）にドットプロットの結果を示す。293FT細胞とMCF-7細胞が、異なる帯状プロットとして、判別されていることがわかる。また、図９（ｈ）に、293FTとMCF-7との混合物についての同様のドットプロットを示す。これらの結果から、混合物について測定した場合でも、それぞれの細胞が分離して観察できることがわかる。図９（ｆ）にシグナル比率のヒストグラムを示す。それぞれの細胞株に、各ヒストグラムに示されたmiRNA応答性レポーターmRNA／コントロールmRNAのセットを共導入した。フローサイトメトリーで測定した2種の蛍光シグナル比を計算し、プロットした。2種のmiRNA応答性レポーターmRNAを導入した細胞の累積頻度は、図９（ｆ）の一番下のカラムに示す。
［実施例７　レポーター蛍光蛋白質が核局在化シグナルに連結した３種のmiRNA応答性レポーターmRNAの共導入］
　HeLa、293FT、MCF-7細胞に、核局在化蛍光蛋白質を発現する3種のmiRNA応答性レポーターmRNAである、40 ngのα(miR-24-3p)-hmAG1-M9 (配列番号25)、10 ngのα(miR-127-3p)-hmKO2-M9 (配列番号26)、200 ngのα(miR-17-5p)-tagBFP-M9 (配列番号27)を共導入した。導入の24時間後にイメージングサイトメトリー分析を実施した。図１０（ａ）は、導入した細胞の蛍光画像を示す。図中、は100 μmを示す。hmKO2, hmAG1、tagBFPはそれぞれ、赤、緑、青のチャンネルで示した。図１０（ａ）から、核により、強度のばらつきがあることがわかる。図１０（ｂ）は、図１０（ａ）と同一の対象について測定したデータを、二つの比率を用いて疑似カラー処理した結果を示す。共導入された細胞の核を抜きだし、それぞれのピクセルにおける蛍光強度について分析した。hmKO2の蛍光シグナルを、hmAG1の蛍光シグナルで割った比率、及びtagBFPの蛍光シグナルを、hmAG1の蛍光シグナルで割った比率をそれぞれ、１０‐０．２５～１００．７５と、１０‐０．５～１００．５の範囲を０～１に正規化して、紫色、緑色で示した。図１０（ｃ）は、これらの比についての密度プロットを示す。
［実施例８　フローサイトメトリー及びイメージングサイトメトリーによる、３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた二次元分離］
　HeLa、293FT、MCF-7、及びこれらの混合物のそれぞれに、３種のコントロールmRNA、hmAG1、hmKO2、tagBFPを共導入した。また、HeLa、293FT、MCF-7、及びこれらの混合物のそれぞれに、レポーター蛍光蛋白質が核局在化シグナルに連結した3種のコントロールmRNA、hmAG1-M9（配列番号28）、hmKO2-M9（配列番号29）、tagBFP-M9（配列番号30）を共導入した。同様に、HeLa、293FT、MCF-7、及びこれらの混合物のそれぞれに、３種のmiRNA応答性レポーターmRNAである、α(miR-24-3p)-hmAG1、α(miR-127-3p)-hmKO2、α(miR-92-3p)-tagBFPを共導入した。同様に、HeLa、293FT、MCF-7、及びこれらの混合物のそれぞれに、レポーター蛍光蛋白質が核局在化シグナルに連結した3種のmiRNA応答性レポーターmRNAである、α(miR-24-3p)-hmAG1-M9、α(miR-127-3p)-hmKO2-M9、α(miR-92-3p)-tagBFP-M9を共導入した。これらを導入の24時間後に、フローサイトメトリー分析及び、イメージングサイトメトリー分析を実施した。3回の独立した実験のうち、代表的な結果を図１１に示す。
　３種のコントロールmRNAを導入した、HeLa細胞、293FT細胞、MCF-7細胞、及びこれらの混合物の、フローサイトメトリー分析結果を図１１（ａ）に、イメージングサイトメトリー結果を、図１１（ｃ）に示す。また、レポーター蛍光蛋白質が核局在化シグナルに連結した3種のコントロールmRNAを共導入した、HeLa細胞、293FT細胞、MCF-7細胞、及びこれらの混合物の、フローサイトメトリー分析結果を図１１（ｅ）に、イメージングサイトメトリー結果を、図１１（ｇ）に示す。いずれの結果からも、細胞の分離ができていないことがわかる。
　３種のmiRNA応答性レポーターmRNAを導入した、HeLa、293FT、MCF-7、及びこれらの混合物の、フローサイトメトリー分析結果を図１１（ｂ）に、イメージングサイトメトリー結果を、図１１（ｄ）に示す。また、レポーター蛍光蛋白質が核局在化シグナルに連結した3種のmiRNA応答性レポーターmRNAを共導入した、HeLa、293FT、MCF-7、及びこれらの混合物の、フローサイトメトリー分析結果を図１１（ｆ）に、イメージングサイトメトリー結果を、図１１（ｈ）に示す。3種のmiRNA応答性レポーターmRNAを導入した場合、フローサイトメトリーでも、イメージングサイトメトリーでも、同様に3種の細胞の分離が可能になった。混合物においても、独立したプロット群が認められることから、3種の細胞の分離が可能であることがわかる。さらに、レポーター蛍光蛋白質が核局在化シグナルに連 結した3種のmiRNA応答性レポーターmRNAを用いた場合にも、同様の結果が得られた。
　［実施例９　miRNA応答性レポーターmRNAを用いた線維芽細胞株の分離］
　由来の異なる細胞株だけでなく、同一の細胞株の状態の違いを識別する実験を行った。ここでは、代表的なヒト正常細胞として、IMR-90 に注目した。IMR-90は静止状態から TGF刺激で平滑筋方向に分化することが知られている。IMR-90で発現が確認されており、かつCAUを含まないmiRNAを67種類選び、hmAG1をレポーター蛋白質として発現するmiRNA応答レポーターmRNAのライブラリーを作製した（配列番号77～143）。これをそれぞれ、IMR-90にコントロールhmKO2 mRNAとともに導入して、フローサイトメトリー解析を行った。
　次いで、1次スクリーニングしてIMR-90で活性な、26のmiRNA 応答 mRNAを得た。結果を図１２Ａ（ａ）に示す。図１２Ａ（ａ）中、平均蛍光比率（ＦＬ２／ＦＬ１）が 0.199 以上のものを活性ありと判断し（コントロールのmiRNAに応答しないmRNAでは 0.198）、26 の miRNA 中、類似度の高い２種類を省略した２４の miRNA 応答 mRNAを抽出した。
　さらに筋分化に関連する２のmiRNAに対するmiRNA応答レポーターmRNAを作製した（配列番号144、145）。これらに加えて、前項で抽出した２４のmRNAと、前項では活性が観察されなかったmRNAのうち、TGFシグナルや筋分化に関連の高いmiRNAに応答する６のmRNAを合わせた、合計32 mRNAについて、IMR-90に対するTGF-β1刺激の前後で活性が変化したmiRNAを探索する2 次スクリーニングを実施した。IMR-90は2日間飢餓状態においた後、10ng/mL のTGF-β1で刺激した。翌日mRNAを導入し、さらに翌日フローサイトメトリー解析を行った。これら合計32種類のmiRNAを探索した結果を、図１２Ａ（ｂ）に示す。図１２Ａ（ｂ）中、最も活性が高かったmiRNA応答mRNA（α(miR-145-5p)-hmAG1）（配列番号117）を次の実験で用いた。
　イメージングサイトメトリーは以下の通りに行った。TGF刺激あり、なしのIMR-90をmiRNA応答mRNA（α(miR-145-5p)-hmAG1とhmKO2のペア）と抗αSMA 抗体で同時に染色した。
分化誘導、およびmRNA導入後のIMR-90の免疫染色は以下の方法で行った。mRNA共導入の1日後、培地と等量のCytofix Fixation Buffer (BD Biosciences) を加え、37°Cで10分間静置して、細胞を固定した。次いで、Pharmingen Stain Buffer (FBS, BD Biosciences) で洗浄後、Phosflow Perm Buffer III (BD Biosciences) 中で氷上30分静置して、細胞膜の透過処理を行った。洗浄後、Blocking One (ナカライテスク) 中で氷上30分静置した。10% Blocking Oneを含むPharmingen Stain Buffer (FBS) を用いて 200倍希釈した抗αSMA抗体で、細胞を室温30分間染色した。洗浄後、Hoechist 33342 （Life Technologies）で染色した。染色後の細胞は IN Cell Analyzer 6000 で解析した。
　細胞内因子に対するフローサイトメトリーは以下の通りに行った。分化誘導、およびmRNA導入後のIMR-90を培養プレートから剥離させ、上記のCytofix Fixation BufferおよびPhosflow Perm Buffer IIIを用いて、説明書の指示に従って細胞を固定、膜透過させた。
膜透過後の細胞を、上記と同様に、Blocking One で細胞をブロッキングした後、100倍希釈した抗αSMA抗体を用いて、室温30分間染色した。染色後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー解析を行った。
　フローサイトメトリー解析結果を図１２Ａ（ｃ）に密度プロットで示した。図１２Ａ（ｃ）の結果より、α(145-5p)-hmAG1を用いることで同一の細胞の分化状態の差を判別することができた。図１２Ｂ（ｄ）に同様の実験結果をヒストグラムで示した。ここではコントロールのmRNAペアを導入した結果を実線及び一点鎖線で示した。従来技術である抗体染色法の場合には、細胞を固定する必要があり、ヒストグラムに示されるように分布の幅が広く、重なり部分も多かった。一方、本発明の方法では生細胞をそのまま使用することができ、分布の幅が狭く、十分な判別が可能であることが示された。
　同様の実験を核局在するレポーター蛋白質を用いて行い、イメージングサイトメトリーを実施した。結果を図１２Ｃ（ｆ）に示す。ここでは、画像解析を行って、ピクセルあたりの蛍光比率(hmKO2/hmAG1) を計算し、写真上で緑色で示した。抗体からの蛍光強度はマゼンタで示した。図１２Ｂ（ｅ）に同様の実験結果をヒストグラムで示した。ここでもコントロールのmRNAペアを導入した結果を実線及び一点鎖線で示した。
　図１２Ｂ（ｅ）、図１２Ｃ（ｆ）の結果から、本発明のmRNAを用いた場合、TGF-β1刺激があった場合と無かった場合では、核に局在した蛋白質の量比が異なることが示された。そして、この結果は、図１２Ｂ（ｄ）に示したフローサイトメトリー解析で得られた結果と良く合致していることがわかった。
　さらに、miRNA応答mRNAのレポーター蛋白質の組み合わせを変えて、α(miR-145-5p)-hmKO2とhmAG1のペアを用いて同様の解析を行った。イメージングサイトメトリーの結果を図１７（ａ）へ、およびフローサイトメトリーの結果を図１７（ｂ）に示す。その結果、上記のα(miR-145-5p)-hmAG1とhmKO2のペアを用いた場合同様に、TGF-β1の添加により、筋分化させることで、SMA陽性細胞におけるmiR-145-5pの発現が高くなり、対応するレポーター蛋白質の発現が減少することが確認された。
　以上より、レポーター蛋白質の種類に依存せず、生細胞を判別が可能であることが示された。
　［実施例１０　miRNA応答性レポーターmRNAを用いたprimary culture (NHLF) の細胞集団の判別］
　同じ67 miRNAライブラリーを使って、株化細胞ではなく、ヒト正常肺線維芽細胞の初代培養細胞(NHLF)の集団内のmiRNA 活性を調べた。図１３（ａ）に、細胞を選別する（細胞の混合具合を明らかにする）mRNAの探索戦略を示す。第一スクリーニングではmiRNAの活性を検出して67 miRNAから8 miRNAを選別した。第二スクリーニングでは 8 miRNA とレポーター蛋白質を組み合わせて、56セットのレポーター mRNAを探索した。
　IMR-90 と同じ67種類のmiRNA応答レポーターmRNAのライブラリーを使用して、ヒト正常肺線維芽細胞の初代培養細胞 (NHLF) におけるmiRNA活性を探索した。結果を図１３Ａ（ｂ）に示す。ここでは特に、mRNAを導入された細胞集団がつくる蛍光比率のピーク幅 (90% interval) を解析し、その幅が広い8つのmiRNA (miR-16-5p, miR-17-5p, miR-21-5p, miR-27a-3p, miR-20a-5p, miR-106a-5p, miR-143-3p, let-7i-5p) を選んだ。
　図１４（ａ）、（ｂ）は、第一スクリーニングの結果を細胞株 (IMR-90) と初代培養細胞 (NHLF) で比較した結果を示す。いずれも６７種類のmiRNA応答レポーターmRNAについての結果である。図１４（ａ）は、蛍光比率の比較、つまりピークの場所の比較であり、（ｂ）は 90% interval の比較、つまりピークの幅の比較である。どちらも2回のスクリーニング実験の平均値と標準偏差をエラーバーとして表示した。図１４（ａ）、（ｂ）から、miRNA 活性の平均値は株化されたIMR-90と同様だったが、miRNA 活性は細胞集団内でより広く分布しており、より不均質な集団であることが示された。
　図１３（ｃ）に第二スクリーニング用の組み合わせ表を示す。１～８の番号は8種類のmiRNAを、この実験では、順に、miR-16-5p, miR-17-5p, miR-21-5p, miR-27a-3p, miR-20a-5p, miR-106a-5p, miR-143-3p, let-7i-5pを示す。表の行(h), 列(i), 各升目の2桁の数字 (j,k) はそれぞれ hmAG1, hmKO2, tagBFP, hdKeimaRedが応答するmiRNAの番号を示す。この表に従うと、どのmiRNAの2 つの組み合わせについても、全てのレポーター蛋白質の組み合わせが網羅されることがわかる。
　次いで、これらのmiRNA活性の相関関係を得た。各miRNAの組み合わせについて、そのmiRNAに応答するレポーターmRNAのペア（配列番号114、81、115、102、80、111、83、116、157～181）をNHLFに導入したとき、細胞集団がつくる蛍光比率のピーク幅 (90% interval) を解析した。以下の6種類の組み合わせで得られた値の平均値を求めた。たとえば、miR-143-3p とmiR-21-5pの場合、
　（Ａ）　α(miR-143-3p)-hmAG1（配列番号114） + α(miR-21-5p)-hmKO2（配列番号159）
　（Ｂ）　α(miR-143-3p)-hmAG1 + α(miR-21-5p)-tagBFP（配列番号168）
　（Ｃ）　α(miR-143-3p)-hmAG1 + α(miR-21-5p)-hdKeimaRed（配列番号176） 
　（Ｄ）　α(miR-21-5p)-hmAG1（配列番号81） + α(miR-143-3p)-hmKO2（配列番号163）
　（Ｅ）　α(miR-21-5p)-hmAG1 + α(miR-143-3p)-tagBFP（配列番号172）
　（Ｆ）　α(miR-21-5p)-hmAG1 + α(miR-143-3p)-hdKeimaRed（配列番号180）
　このピーク幅は、コントロール mRNAを導入したときに、同様の解析で求めたピーク幅
に対する相対値として下記表６に表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
  
 
　この表から、対象の細胞集団にある、miRNA間の機能的な関係性を見いだせることがわかる。たとえば、miR-143-3p と miR-21-5p の組み合わせなど、値の大きなmiRNAの間には、その機能に負の相関がある。すなわちこの場合、miR-143-3pの活性が高い細胞では、miR-21-5p の活性は低く、miRNA-143-3pの活性が低い細胞ではmiR-21-5pの活性は低い。また、値の小さなmiRNAの組み合わせには、その機能に正の相関がある。実際、miR-17 precursor family を形成する miR-17, miR-20a, miR-106a には活性においても高い正の相関を示すことがわかった。
　なぜ、miRNA活性の関係性がわかるのかについて、図１５を用いて説明する。図１５は、ある細胞群が同じ量のmRNAを取り込んだと仮定したとき、細胞群で2 つのmiRNA活性の分布がある場合、想定される結果を模式的に示す図である。図１５（ａ）は、2 つのmiRNA活性が正に相関する場合、蛍光比率のピークは細くなることを示す。図１５（ｂ）は、2つのmiRNA活性が負に相関する場合、蛍光比率のピークは広くなることを示す。図１５（ｃ）は、2 つのmiRNA活性が相関しない場合、中間的な幅のピークができることを示す。
　図１３の（ｄ）は、miRNA活性に負の相関がみられたあるいは相関が見られなかった3つのmiRNAに応答するレポーターmRNA（α(miR-106a-5p)-hmAG1（配列番号116）, α(miR-21-5p)-hmKO2（配列番号159）, α(miR-143-3p)-tagBFP）を用いて、NHLFを分離解析した結果を示す。mRNAを導入した細胞集団を蛍光比率の密度分布で示した。
　図１３の（ｅ）は、miRNA活性に正の相関がみられた3つのmiRNAに応答するレポーターmRNA（α(miR-20a-5p)-hmAG1（配列番号111）, α(miR-17-5p)-hmKO2（配列番号12）, α(miR-106a-5p)-tagBFP（配列番号171））を用いて、NHLFを分離解析した結果を示す。mRNA を導入した細胞集団を蛍光比率の密度分布で示した。
図１３（ｄ）、（ｅ）から実証されるように、対象が同じ細胞集団の場合であっても、このような正の相関性の高い miRNA に対する mRNA セットを使うと、細胞は極めて均一な集団として表示される（ｆ）が、そうではない miRNA セットを使うと、細胞の異質性が観察された（ｅ）。したがって、所望の細胞の判別の目的に応じて、使用するmiRNA応答性mRNAを選択することができる。例えばこの場合、NHLFを所望の細胞と考え、NHLFとそれ以外の細胞を判別する場合には正の相関性の高い miRNA に対する mRNA セットを用いて、所望の細胞をより広がりの狭い（特異的な）細胞集団とすることができ、多様性に富んだNHLFを、所望の細胞を含む細胞の母集団と考え、ここから所望の細胞を分離分別したい場合には、負の相関性の高い miRNA に対する mRNA セットを用いて、幅広く分布された細胞のうちの所望の一部分を採取することができる。
　［実施例１１　miRNA応答性レポーターmRNAを用いたIMR-90の細胞集団の判別］
　NHLFと同様の第二スクリーニングを株化された線維芽細胞であるIMR-90についても実施した。この実験では、図１３（Ｃ）で示されるmiRNAを表す番号１～８を、順に、miR-16-5p, miR-17-5p, miR-125b-5p, miR-93-5p, miR-20a-5p, miR-106a-5p, miR-145-5p, miR-26a-5pとした。各miRNAの組み合わせについて、そのmiRNAに応答するレポーターmRNAのペア（配列番号117、100、125、80、157、166、174、83、167、158、175、111、161、170、178、110、116、162、171、179、146～156）をIMR-90に導入したとき、細胞集団がつくる蛍光比率のピーク幅 (90% interval) を解析し、コントロール mRNAを導入したときに、同様の解析で求めたピーク幅に対する相対値として下記表７に表される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
  
 
　図１６は、第二スクリーニングの結果をもとに選んだ、4種類のmiRNA応答mRNA(α(miR-16-5p)-hmAG1（配列番号80）, α(miR-26a-5p)-hmKO2（配列番号148）, α(miR-17-5p)-tagBFP（配列番号167）, α(miR-125b-5p)-hdKeimaRed（配列番号153）をIMR-90に共導入した場合の結果を三次元の密度プロットとして示した。図中に示されるＡ、およびＢの矢印で示されるように、IMR-90が２つの細胞グループに分離されることがわかった。
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Claims (9)

  1. 　以下の工程を含む、２種以上の細胞を含む細胞群からmiRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法；
    （１）指標となるmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを細胞群に導入する工程、および
    （２）当該マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞種を判別する工程。
  2. 　前記工程（１）が、指標となるmiRNAの標的配列およびマーカー遺伝子が共に異なる２以上のmRNAを同時に細胞に導入する工程である、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記所望の細胞種が、指標となるmiRNAの発現量が少ない細胞種であり、前記工程（２）が、当該マーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞種を判別する工程である、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　前記所望の細胞種が、指標となるmiRNAの発現量が多い細胞種であり、前記工程（２）が、当該マーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞種を判別する工程である、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 　前記miRNAの標的配列が、マーカー遺伝子の５’側に連結されている、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 　前記判別が、フローサイトメーターを用いて行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 　前記判別が、イメージアナライザーを用いて行われる、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記工程（１）の前に、指標となるmiRNAをスクリーニングする工程をさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
  9. 　指標となるmiRNAの標的配列と機能的に連結したマーカー遺伝子を含むmRNAを含んでなる細胞判別キット。 
     
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