CN106574292A - 利用作为指示剂的miRNA的表达区分期望的细胞类型的方法 - Google Patents
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Abstract
一种以高精度区分处于存活状态的活细胞的方法。利用miRNA的表达作为指示剂，从包含两种以上类型的细胞的细胞组区分所期望细胞类型的方法，其中所述方法包括以下步骤：(1)将包含标记基因的mRNA导入细胞组的步骤，所述标记基因可操作地连接至用作为指示剂的miRNA的靶序列；以及(2)利用作为指示剂的所述标记基因的翻译水平区分细胞类型的步骤。
Description
技术领域
本发明涉及利用作为指示剂的miRNA的表达区分期望的细胞类型的方法。
背景技术
多细胞有机体的组织或器官由多种类型细胞组成。人体由大约60万亿(6x 1013)个细胞组成，即使仅考虑成熟细胞，也已知411种细胞类型。对于这些细胞，不仅分析每一种细胞的功能的技术，而且在用于医疗应用的细胞的制备中区分或鉴定细胞类型的技术都已变得重要。
为了鉴定细胞，用于检测在细胞表面上特异表达的配体的方法已广为所知。然而，为了使用抗体检测细胞内的信息，有必要固定化靶细胞和/或允许所述细胞渗透通过细胞膜。因此，利用抗体的检测方法存在不能应用于活细胞的分级的问题。此外，能特异化细胞的受体不一定存在所述细胞表面上。而且，将一种因子分类成两种因子、正性/负性(负性或正性)的方法(即，定性分类方法)，例如利用抗体的配体检测方法，其问题在于可检测组合有限，因而其难以实施分类细化。
作为一种更具体地分类细胞的方法，即，作为一种定量分类细胞的方法，例如基于使用微阵列、下一代测序等的多变量测量方法的细胞分析方法(profiling)已为人们所知。在这些方法中，对于诸如蛋白质或RNA之类的细胞内分子，多种类型分子同时进行定量测量，或者进行诸如多变量分析之类的统计分析，使得所述细胞可被定量分类。然而，由于经测定的细胞被破坏，因此这种方法存在不能测量存活状态的细胞的问题。
microRNA(下文中被称为“miRNA”)作为可以是用于鉴定细胞的指示剂的靶标已引起人们的关注。已使用报告基因分析作为用于在活细胞中检测miRNA的工具，所述报告基因分析通过将包含DNA或病毒的报告基因构建物导入细胞来实施。然而，通过这样一种方法，可能所述报告基因构建物会被整合入宿主细胞的基因组并保留在其中。因此，通过这种方法鉴定的细胞会导致医疗应用的问题。而且，根据所述传统报告基因分析试验的miRNA的检测已致力于探索miRNA的靶基因，且其未被用于鉴定细胞。
发明内容
发明要解决的问题
期望开发一种具有高精度的区分处于存活状态的活细胞的方法。
用于解决问题的方案
本发明发现通过利用具有特定结构的mRNA，定量获得关于miRNA在活细胞中的表达的信息，从而可从包含两种以上类型细胞的细胞组区分期望的细胞类型，从而实现本发明。
具体地，根据一实施方式，本发明涉及一种利用作为指示剂的miRNA的表达，从包含两种以上类型的细胞的细胞组区分期望的细胞类型的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(1)将包含可操作连接至用作为指示剂的miRNA的靶序列的第一标记基因的mRNA导入细胞组的步骤；以及
(2)利用作为指示剂的所述第一标记基因的翻译水平，区分细胞类型的步骤。
在所述方法中，所述步骤(1)优选为同时将用作为指示剂的miRNA的靶序列和两种以上包含不同的第一标记基因的mRNA同时导入细胞的步骤。
在所述方法中，所述期望的细胞类型优选为其中用作为指示剂的miRNA的表达水平低的细胞类型，并且所述步骤(2)优选为区分其中所述第一标记基因的翻译水平高的细胞类型的步骤。
在所述方法中，所述期望的细胞类型优选为其中用作为指示剂的miRNA的表达水平高的细胞类型，并且所述步骤(2)优选为区分其中所述第一标记基因的翻译水平低的细胞类型的步骤。
在所述方法中使用的所述mRNA中，所述miRNA的靶序列优选连接至所述第一标记基因的5'-末端。
在所述方法中，优选使用流式细胞仪进行所述测定。
在所述方法中，优选使用图像分析仪进行所述测定。
优选的是，所述方法进一步包括在所述步骤(1)之前筛选对所述细胞类型具有特异性的用作为指示剂的miRNA的步骤。
而且，根据另一方面，本发明涉及用于区分细胞的试剂盒，其包括包含可操作连接至用作为指示剂的miRNA的靶序列的第一标记基因的mRNA。
发明的有益效果
根据本发明，通过利用作为指示剂的miRNA的活性(其为细胞内信息)，可以高分辨能力区分细胞类型。由于根据本发明的所述方法可应用于存活状态，因而尤其有利的是在完成所述测定之后，细胞可用于各种意向用途，尤其是，用于医疗用途。而且，由于本发明的所述方法可通过将mRNA导入细胞组来实施，以及该mRNA被分解，其半衰期为约1天，并且该mRNA能从所述细胞内部被及时移除，因此本发明方法不会产生问题，以致于在所述细胞中保留的病毒感染或DNA会对所述基因组造成损害。而且，本发明的所述方法还有利的是使用血细胞计数器的简便检测方法。尤其是，通过将合成的mRNA导入细胞，在用作为指示剂的所述活性中的检测错误可被降低，分离能力可得到改善，并且可能实施高精度测定。作为本发明的有效应用，例如，在多能干细胞分化成特定细胞之后，从具有期望性质的多能干细胞，或者从通过诱导多能干细胞分化获得的细胞组区分期望的细胞类型，使得所期望的细胞可被分类、分离或选择性消除。
进一步地，即使在其中细胞组包含的多个细胞类型之间用作为指示剂的miRNA的表达方面仅存在细微差别的情况下，例如，即使在其中所述差别为约1.5倍或更低的情况下，本发明的方法也能通过利用包含可操作连接至用作为指示剂的至少两种miRNA的靶序列的第一标记基因的两种mRNA将这些细胞彼此区分开。这是基于以下的研究结果：从两种共同导入的mRNA表达的报告蛋白的活性率在细胞群中是恒定的，并具有很小的变化。进一步地，通过增加所述共同导入的mRNA的类型，可能基于大量的指示剂区分大量的细胞。
附图说明
[图1]图1是示意性描绘本发明技术和传统技术的视图，通过本发明的所述技术，两种不同类型的细胞在流式细胞仪的点阵图平面上被分离开。
[图2]图2包括显示在其中miRNA响应型报告mRNA或对照mRNA被导入两种不同类型的细胞类型的情况中获得的信号率的柱状图。
[图3A]图3A包括一系列视图，其显示利用一或两种类型的miRNA响应型报告mRNA对现有细胞系的二维分离。
[图3B]图3B包括显示两种荧光信号的比例的柱状图和显示两种类型的miRNA响应型报告mRNA的累积曲线的曲线图。
[图3C]图3C包括显示利用一或两种类型miRNA响应型报告mRNA对两种类型现有细胞系的混合物的二维分离的视图，以及显示两种荧光信号比例的柱状图。
[图4]图4包括一系列视图，其显示利用三种或四种类型的miRNA响应型报告mRNA对现有细胞系的二维分离或三维分离。
[图5A]图5A包括一系列视图，其显示利用四种类型的对照mRNA对三种类型的细胞系的三维分离。
[图5B]图5B包括一系列视图，其显示利用四种类型的miRNA响应型报告mRNA对三种类型的细胞系的三维分离。
[图6]图6是显示miRNA靶序列的插入位点对miRNA响应型报告mRNA的翻译效率的影响的视图。
[图7]图7是显示miRNA响应型报告mRNA对细胞内miRNA活性不具有抑制作用的视图。
[图8]图8包括显示选定的20种类型的miRNA响应型报告mRNA在三种类型的细胞系中的翻译效率的曲线图。
[图9A]图9A包括一系列视图，其显示利用两种类型的miRNA响应型报告mRNA对两种类型的细胞系的二维分离。
[图9B]图9B包括一系列视图，其显示利用两种类型的miRNA响应型报告mRNA对两种类型的细胞系的二维分离。
[图9C]图9C包括一系列视图，其显示利用两种类型的miRNA响应型报告mRNA对两种类型的细胞系的混合物的二维分离。
[图10]图10是显示在利用图像分析仪的测定方法中细胞的彩色图和现有细胞系的二维分离的视图。
[图11A]图11A是显示根据流式细胞仪和成像细胞计数仪利用三种类型的miRNA响应型报告mRNA的二维分离的视图。
[图11B]图11B是显示根据流式细胞仪和成像细胞计数仪利用连接至三种类型核定位信号基因的miRNA响应型报告mRNA的二维分离的视图。
[图12A]图12A是显示通过筛选用于实施例9中分离IMR-90的miRNA响应型报告mRNA获得的结果，以及在TGF刺激下或未在TGF刺激下miRNA响应型报告mRNA已被共同导入IMR-90的流式细胞检测分析的结果的视图。
[图12B]图12B是以柱状图形式显示图12A(c)和图12C(f)的结果的视图。
[图12C]图12C是显示在在存在或不存在TGF刺激下用于表达核定位报告蛋白的miRNA响应型报告mRNA已被共同导入IMR-90的情况中成像细胞计数仪检测分析结果的视图。
[图13]图13是显示通过筛选用于实施例10中分离NHLF的miRNA响应型报告mRNA获得的结果，以及通过利用对与所述细胞群NHLF具有高度正相关的miRNA相应的mRNA组或者利用不具有所述高度正相关性的miRNA组对所述细胞群NHLF的分离进行分析获得的结果的视图。
[图14]图14是显示通过比较所述细胞系(IMR-90)和原代培养细胞(NHLF)之间的第一次筛选结果获得的结果的视图。
[图15]图15是示意性显示在某一细胞组中存在两种miRNA活性分布的情况中在所述某一细胞组已假设整合与另一种相同量的mRNA时呈现的假设结果的视图。
[图16]图16是显示通过将基于第二筛选的结果选定的四种类型miRNA响应型mRNA共同导入IMR-90获得的结果的视图，其中所述结果以三维密度图形式显示。
[图17]图17(a)是显示在其中未在TGF-β1刺激下(-TGF-β1；左视图)或在TGF-β1刺激下(+TGF-β1；右视图)对照miRNA(hmAG1-M9)和miRNA响应型报告mRNA(α(miR-145-5p)-hmKO2-M9)已被共同导入IMR-90的情况中成像细胞计数仪检测分析的结果的视图。在该图中，亮域指示相位对比图像；hmAG1指示hmAG1的荧光图像；APC指示αSMA抗体的染色图像；hmKO2指示hmKO2的荧光图像；Hoechist指示核染色图像；以及比例指示重叠的荧光图像。图17(b)是显示在其中未在TGF-β1刺激下(-TGF-β1；绿色)或在TGF-β1刺激下(+TGF-β1；紫蓝色)对照mRNA(hmAG1-M9)和miRNA响应型报告mRNA(α(miR-145-5p)-hmKO2-M9)已被共同导入IMR-90的情况中流式细胞检测分析的结果的视图。
具体实施方式
下文中，本发明将详细描述以下的实施方式。然而，未意图使本发明的范围受限于这些实施方式。
根据第一实施方式，本发明涉及利用作为指示剂的miRNA的表达，从包含两种以上类型的细胞的细胞组区分期望的细胞类型的方法。根据本实施方式的所述测定方法包括以下步骤：
(1)将包含可操作连接至用作为指示剂的miRNA的靶序列的第一标记基因的mRNA导入细胞组的步骤；以及
(2)利用作为指示剂的所述第一标记基因的翻译水平区分细胞类型的步骤。
在本发明所述测定方法中用作为靶标的所述细胞组是包含两种以上类型的细胞的细胞组。所述细胞组可以是从多细胞生物的物种采集的细胞组，或者是通过培养分离的细胞获得的细胞组。所述细胞组尤其是包含采集自哺乳动物(例如，人类，小鼠，猴，猪，大鼠等)的两种以上类型的体细胞的细胞组，或者是通过培养从哺乳动物或哺乳类细胞系分离的细胞获得的细胞组。所述体细胞的实例包括角化上皮细胞(例如角化表皮细胞)，粘膜上皮细胞(例如在舌头表面层上的上皮细胞)，外分泌上皮细胞(例如乳腺细胞)，激素分泌细胞(例如肾上腺髓质细胞)，用于代谢/储藏的细胞(例如，肝细胞)，构成边界表面的管腔内上皮细胞(例如，I型肺泡细胞)，在内部链管中的管腔内上皮细胞(血管内皮细胞)，具有运输能力的具有纤毛的细胞(例如，呼吸道上皮细胞)，用于细胞外基质分泌的细胞(例如成纤维细胞)，收缩细胞(例如，平滑肌细胞)，血液与免疫系统的细胞(例如，T淋巴细胞)，关于感觉的细胞(例如视杆细胞)，自主神经系统神经元(例如胆碱能神经元)，支持感觉器官和周围神经元的细胞(例如卫星细胞)，在中枢神经系统中的神经细胞和胶质细胞(例如星形胶质细胞)，色素细胞(例如，视网膜色素上皮细胞)，以及其祖细胞(组织祖细胞)。细胞分化程度、从其采集细胞的动物的年龄等尤其不受限制。在本发明中，未分化的祖细胞(包括成体干细胞)和最终分化的成熟细胞可用作为体细胞的来源。在本文中，未分化的祖细胞的实例包括组织干细胞(成体干细胞)，例如神经干细胞，造血干细胞，间充质干细胞，或牙髓干细胞。在本发明中，作为来源的从其采集体细胞的哺乳动物类型尤其不受限制，且优选为人类。此外，优选的细胞组是其中在采集所述细胞之后在前体细胞上进行人工操作的细胞组，并且其可以是包括不期望的细胞的细胞组。因此，所述细胞组是例如包含从所述体细胞制备得到的iPS细胞的细胞组，或者是在诸如ES细胞或iPS细胞之类的多能干细胞分化之后获得的细胞组，其可包括不同于期望的细胞的经分化的细胞。在本实施方式中，所述作为测定靶标的细胞组优选处于存活状态。在本发明中，所述表述“在存活状态的细胞”用于指在细胞保持代谢能力的状态中的细胞。本发明有利的是，在细胞接受本发明所述方法且所述测定方法随后停止之后，所述细胞保持存活且未丧失它们原有性质，并可用于后续预期用途，尤其是，同时保持分裂能力。
在本发明的所述方法中，待区分的所述“期望细胞类型”是指利用作为指示剂的miRNA的表达，从其它细胞类型分类获得的一组细胞。尤其是，所述期望的细胞类型是指在miRNA活性方面具有共同性质的某一组细胞，其将详细描述于下文中。在本发明中，这样的某一组细胞，其利用作为指示剂的miRNA从其它细胞类型分类获得，还被称为“均一细胞”。通过本发明方法区分的期望细胞类型可以是一种类型，或两种以上类型，例如，三种类型，四种类型，五种类型，六种类型，七种类型，或八种类型或更多种类型。理论上，能区分的细胞类型不受限制，且根据本发明，可同时区分100种或100种以上类型的细胞。
在本发明中，表述“以区分期望的细胞类型”用来意指从包含两种以上类型的细胞的细胞组呈现出期望的特定的一或多种不同于其它细胞类型的细胞类型的可检测信号信息，尤其是，呈现可视觉上识别的信息。应注意的是，所述可视觉上识别的信息不局限于直接从细胞发射的视觉信号，还包括通过利用数值、图表、图像等将从细胞发射的信号转换成可视觉上识别的信息来获得的信息。因此，所述可视觉上识别的信息是指本领域技术人员可视觉上识别的信息。在本说明书中，术语“区分”可包括以下定义：在完成所述测定之后，识别期望的细胞类型，区分期望的细胞类型，鉴定期望的细胞类型，分类期望的细胞类型，分离期望的细胞类型，移除不期望的细胞类型，区分期望细胞类型的生存或死亡，在期望细胞类型中检测或量化特定生物信号，以及基于特定物理或化学信号分级期望的细胞类型。在本发明中，未知的包含两种以上类型的细胞的细胞组通过本发明的方法被区分成包含不同细胞类型，所述细胞组的测定也被认为是期望细胞类型的测定的一个方面。
其中利用作为指示剂的miRNA的表达从包含两种以上类型的细胞的细胞组区分期望的细胞类型的一个方面包括前述的各种测定方面，并且，该方面也被分成其中在某种程度上先前已知关于“细胞组包含两种以上类型的细胞”的特性的情况，以及其中没有关于所述细胞组的所述特性的信息的情况。
其中在某种程度上先前已知关于所述细胞组的特性的情况是指其中通过另一种方法等等先前已在一定程度上具体说明在所述细胞组中包含的细胞类型的情况。例如，有这样一种情况，其中先前通过使用抗体的分类方法，或者通过组学分析(Omics analysis)/分析方法对包含在特定细胞组中的特定细胞类型进行分析和预测，所述组学分析/分析方法是利用微阵列、下一代测序等等基于多变量测量方法的细胞分析方法，其已在上面被描述为现有技术。即使在这种情况下，通过本发明的方法测定在存活状态中的期望细胞类型也是有用的。
另一方面，即使在其中没有关于细胞组的所述特性的信息的情况下，本发明也是可适用的。
有这样一种情况，其中对于前一种情况和另一种情况，在筛选用作为指示剂的miRNA的步骤中采用的筛选方法是不同的。在本发明的方法中可包含这样的筛选步骤作为可选的预先步骤。将在下文中描述所述筛选步骤的详细内容。
在本发明的方法中，使用包含可操作连接至用作为指示剂的miRNA的靶序列(下文中也被称为“miRNA靶序列”)的第一标记基因的信使RNA(mRNA)。在这样的mRNA中，当存在特定miRNA时，根据所述miRNA的丰度调节所述第一标记基因的翻译。优选地，这是mRNA，其中，在存在特定miRNA时，通过根据所述miRNA的丰度，抑制所述第一标记基因的翻译，来降低从所述第一标记基因翻译得到的蛋白质(下文中被称为“标记蛋白”)的量。
在本发明中“miRNA的表达”是指存在miRNA，其中成熟miRNA与多种预定蛋白相互作用，以形成RNA诱导的沉默复合物(RISC)。所述“成熟miRNA”是单链RNA(20至25个核苷酸)，并且其经Dicer的细胞质裂解(extranuclear cleavage)从miRNA前体产生，而，所述“miRNA前体”由pri-mRNA产生，所述pri-mRNA是通过被称为Drosha的细胞核内酶进行部分裂解，从DNA转录得到的单链RNA。适当地，在本发明中使用的所述miRNA选自至少10000或以上种类型的miRNA。更具体地，本发明的miRNA适当地选自登记在数据库信息(例如http://www.mirbase.org/或http://www.microrna.org/)中的miRNA，和/或在所述数据库中储存的参考信息中描述的miRNA。也就是说，在本发明中，用作为指示剂的miRNA不局限于特定miRNA。可根据待通过本发明的方法区分的细胞类型的性质，适当地选择用作为指示剂的miRNA。而且，尤其是，优选选择一种miRNA或多种miRNA的组合，其在作为测定靶标的细胞组中的一些细胞中以高水平表达(高活性)并且在其它细胞中以低水平表达(低活性)。这是由于分离精度可被进一步提高的结果。可通过下文提及的筛选方法选择这样的miRNA或者这样的多种miRNA的组合。用作为指示剂的所述miRNA不局限于在本申请的申请日详细说明的miRNA，而是还包括所有的miRNA，其出现和功能将在今后被详细说明。
所述miRNA靶序列是指能特异性结合至用作为指示剂的miRNA的序列。例如，所述miRNA靶序列优选是与用作为指示剂的miRNA完全互补的序列。另外，只要所述miRNA靶序列可被miRNA识别，其还可具有与所述完全互补序列的错配。与跟所述miRNA完全互补的序列的错配通常可以是可在期望细胞中由miRNA识别的错配，并且可以考虑可存在有关于在活体中细胞原始功能的大约40％至50％的错配。这样的错配并未特别受到限制，且其可以是例如1个核苷酸、2个核苷酸、3个核苷酸、4个核苷酸、5个核苷酸、6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸、10个核苷酸、或整个识别序列的1％、5％、10％、20％、30％或40％的错配。此外，尤其是，就包含在细胞中的mRNA上的所述miRNA靶序列而言，所述靶序列可在除了种子区域(即在所述靶序列的5'-末端上的区域)以外的部分包含大量的错配，所述种子区域对应于miRNA的3'-末端上的大约16个核苷酸。所述种子区域不能包含这样的错配，或者可包含1个核苷酸、2个核苷酸或3个核苷酸的错配。
所述第一标记基因是编码任意给定蛋白的基因，所述蛋白在细胞中被翻译，用作为标记，并且能测定细胞类型。在细胞中翻译并能用作为标记的所述蛋白可以是例如可通过荧光、发光或显色(color development)或者通过支持这样的荧光、发光或显色被可视化并且可被量化的蛋白。荧光蛋白的实例包括：蓝色荧光蛋白，例如Sirius或EBFP；青色荧光蛋白，例如mTurquoise,TagCFP,AmCyan,mTFP1,MidoriishiCyan,或CFP；绿色荧光蛋白，例如TurboGFP,AcGFP,TagGFP,Azami-Green(例如hmAG1),ZsGreen,EmGFP,EGFP,GFP2,或HyPer；黄色荧光蛋白，例如TagYFP,EYFP,Venus,YFP,PhiYFP,PhiYFP-m,TurboYFP,ZsYellow,或mBanana；橙色荧光蛋白，例如KusabiraOrange(例如hmKO2)或mOrange；红色荧光蛋白，例如TurboRFP,DsRed-Express,DsRed2,TagRFP,DsRed-Monomer,AsRed2,或mStrawberry；以及近红外荧光蛋白，例如TurboFP602,mRFP1,JRed,KillerRed,mCherry,HcRed,KeimaRed(例如hdKeimaRed),mRasberry,或mPlum，但是所述荧光蛋白的实例不局限于此。
所述发光蛋白的实例是水母发光蛋白(aequorin)，但是实例不局限于此。此外，支持荧光、发光或显色的蛋白的实例包括分解荧光、发光或显色前体的酶，例如，荧光素酶、磷酸酶、过氧化物酶或β-内酰胺酶，但是这种蛋白的实例不局限于此。在本发明中，当支持荧光、发光或显色的蛋白用作为第一标记基因时，通过允许细胞接触相应的前体，或者通过将这样相应的前体导入细胞来实施对期望细胞的测定。
能在细胞中起标记的作用的蛋白的其它实例包括对细胞功能具有直接影响的蛋白。这样的蛋白的特定实例包括细胞生长蛋白，细胞杀伤蛋白，细胞信号传导因子，耐药基因，转录调控因子，翻译调控因子，分化调控因子，重编程诱导因子，RNA-结合蛋白因子，染色质控制因子，以及膜蛋白，但是所述蛋白的实例不局限于此。例如，所述细胞生长蛋白仅允许在其中表达所述蛋白的细胞生长，然后特异化生长细胞，使得其起标记的作用。所述细胞杀伤蛋白导致其中表达该蛋白的细胞发生细胞死亡，杀死包含或不包含特异性miRNA的细胞本身，使得其起用于显示所述细胞生存或死亡的标记的作用。细胞信号传导因子在其中表达该因子的细胞发出特异性生物信号时起标记的作用，并且这些信号随后被特异化。所述细胞杀伤蛋白的实例包括Bax和Bim。例如，所述翻译调控因子识别特异性RNA的三维结构并结合至所述特异性RNA从而其调节另一mRNA翻译成蛋白，使得其起标记的作用。所述翻译调控因子的实例包括5R1,5R2(Nat Struct Biol.1998jul；5(7):543-6),B2(Nat StructMol Biol.2005Nov；12(11):952-7),Fox-1(EMBO J.2006Jan11；25(1):163-73.),GLD-1(JMol Biol.2005Feb 11；346(1):91-104.),Hfq(EMBO J.2004Jan 28；23(2):396-405),HuD(Nat Struct Biol.2001Feb；8(2):141-5.),SRP19(RNA.2005Jul；11(7):1043-50),L1(NatStruct Biol.2003Feb；10(2):104-8.),L11(Nat Struct Biol.2000Oct；7(10):834-7.),L18(Biochem J.2002Mar 15；362(Pt 3):553-60),L20(J Biol Chem.2003Sep 19；278(38):36522-30.),L23(J Biomol NMR.2003Jun；26(2):131-7),L25(EMBO J.1999Nov15；18(22):6508-21.),L30(Nat Struct Biol.1999Dec；6(12):1081-3.),LicT(EMBO J.2002Apr15；21(8):1987-97.),MS2被壳蛋白(coat)(FEBS J.2006Apr；273(7):1463-75.),Nova-2(Cell.2000Feb4；100(3):323-32),核壳体(Nucleocapsid)(J Mol Biol.2000Aug11；301(2):491-511.),核仁素(Nucleolin)(EMBO J.2000Dec15；19(24):6870-81.),p19(Cell.2003Dec 26；115(7):799-811),L7Ae(RNA.2005Aug；11(8):1192-200.),PAZ(PiWiArgonaut and Zwille)(Nat Struct Biol.2003Dec；10(12):1026-32.),RnaseIII(Cell.2006Jan 27；124(2):355-66),RR1-38(Nat Struct Biol.1998Jul；5(7):543-6.),S15(EMBO J.2003Apr 15；22(8):1898-908.),S4(J Biol Chem.1979Mar 25；254(6):1775-7.),S8(J Mol Biol.2001Aug10；311(2):311-24.),SacY(EMBO J.1997Aug 15；16(16):5019-29.),SmpB(J Biochem(Tokyo).2005Dec；138(6):729-39),snRNP U1A(Nat StructBiol.2000Oct；7(10):834-7.),SRP54(RNA.2005Jul；11(7):1043-50),Tat(Nucleic AcidsRes.1996Oct15；24(20):3974-81.),ThrRS(Nat Struct Biol.2002May；9(5):343-7.),TIS11d(Nat Struct Mol Biol.2004Mar；11(3):257-64.),Virp1(Nucleic AcidsRes.2003Oct 1；31(19):5534-43.),Vts1P(Nat Struct Mol Biol.2006Feb；13(2):177-8.),和λN(Cell.1998Apr 17；93(2):289-99.)。其中，较优选的翻译调控因子是MS2被壳蛋白和L7Ae。
在本发明中，所述第一标记基因可包括编码定位信号的基因。所述定位信号的实例包括核定位信号，细胞膜定位信号，线粒体定位信号，和蛋白质分泌信号。特定实例包括经典核定位序列(NLS)，M9序列，线粒体靶序列(MTS)，和内质网定位序列，但是实例不局限于此。在本发明的方法中的所述测定步骤是在图像上、在下文提及的成像细胞计数仪等中实施时，这样的定位信号是特别有利的。
在本发明中，当所述翻译调控因子用作为标记时，其翻译是由所述翻译调控因子调节的具有第二标记基因的mRNA被同时导入细胞中。其翻译是由所述蛋白调节的具有第二标记基因的所述mRNA的实例是具有可操作连接至RNA序列的第二标记基因序列的mRNA，能调节所述翻译的所述蛋白结合至所述RNA序列。所述mRNA的特定实例是在WO2009/066757或WO2014/014122中公开的mRNA。这些出版物的公开内容均通过引用方式被全部并入本文中。通过参考上述出版物，本领域技术人员可适当选择在本发明方法中可优选采用的其翻译是由蛋白调节的具有第二标记基因的mRNA。在本发明中，与上面描述相同的所述第一标记基因可用作为第二标记基因。
在本发明中使用的mRNA包括可操作连接至用作为指示剂的miRNA的靶序列的第一标记基因。在本发明的说明书中，这样的mRNA还被称为“miRNA响应型报告mRNA”。在本发明中，表述“第一标记基因可操作连接至miRNA的靶序列”是指至少一种miRNA的靶序列被包含在编码所述第一标记基因的开放阅读框的5'-UTR和3'-UTR(包括起始密码子)，和/或包含在所述开放阅读框中。在从5'-末端至3'-末端的方向上，所述mRNA优选包括帽子结构(7-甲基鸟苷5'-磷酸酯)，编码所述第一标记基因的开放阅读框，以及多聚(A)尾巴，并且还在5'-UTR、3'-UTR和/或所述开放阅读框中包括至少一种miRNA靶序列。在所述mRNA中miRNA靶序列的位置可以是5'-UTR或3'-UTR，或者还可以位于所述开放阅读框中(在所述起始密码子的3'-末端)。另外，所述mRNA可在所有这些位置中包括miRNA靶序列。因此，所述miRNA靶序列的数量可以是1,2,3,4,5,6,7,8或更多。
优选地，一个miRNA靶序列存在于所述5'-UTR中。这是因为它可以实现有效的翻译抑制。这时，在所述帽子结构和所述miRNA靶序列之间的核苷酸数量和核苷酸类型可以被自由地区分，只要它们不包括用作为起始密码子的AUG以及不构成茎结构或立体结构。例如，可设计所述帽子结构和所述miRNA靶序列，使得在所述帽子结构和所述miRNA靶序列之间的核苷酸数量可以是0至50个核苷酸，优选10-30个核苷酸。而且，在所述miRNA靶序列和所述起始密码子之间的核苷酸数量和核苷酸类型可以被自由地区分，只要它们不构成茎结构或立体结构。可设计所述miRNA靶序列和所述起始密码子，使得在所述miRNA靶序列和所述起始密码子之间的核苷酸数量可以是0至50个核苷酸，优选10-30个核苷酸。已经证实的是，即使在3'-UTR存在四个miRNA靶序列，也可实现翻译抑制。
所述miRNA响应型报告mRNA优选包括修饰的核苷酸，例如假尿苷和5-甲基胞苷，而不是普通的尿苷或胞苷。这是因为细胞毒性被降低。在尿苷和胞苷这两种情况下，所述修饰的核苷酸可以独立地被定位或者作为所述mRNA的一部分。在被包含作为一部分的情况下，所述核苷酸可以任意给定比例被随意定位。
在如上所述已区分所述miRNA响应型报告mRNA的序列之后，本领域技术人员可根据任意现有的遗传工程方法合成所述miRNA响应型报告mRNA。尤其是，可使用包含启动子序列的模板DNA作为模板，根据体外转录合成方法获得miRNA响应型报告mRNA。
有一种情况是其中使用仅一种类型的miRNA响应型报告mRNA，或者有另一种情况是其中使用两种以上类型的(例如三种类型、四种类型、五种类型、六种类型、七种类型或八种类型或以上的)miRNA响应型报告mRNA，这取决于测定的目的、靶标、用作为指示剂的miRNA的活性。例如，在使用两种以上类型的miRNA响应型报告mRNA的情况下，期望的是在各个miRNA响应型报告mRNA中包含的miRNA靶序列和第一标记基因均彼此不同。此外，在使用两种以上类型的miRNA响应型报告mRNA的情况下，在各个miRNA响应型报告mRNA中，在所述miRNA响应型报告mRNA中包含的miRNA靶序列的数量、所述miRNA靶序列到5'-末端的距离和所述miRNA响应型报告mRNA的其它结构特征可以是不同的。
在本发明中，在将miRNA响应型报告mRNA导入到细胞中的步骤中(下文中被称为“导入步骤”)，通过采用脂质体转染法、脂质体方法、电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、DEAE-葡聚糖方法、显微注射法、基因枪法等，将一或多种类型的miRNA响应型报告mRNA直接导入到包含在细胞组中的细胞内。在导入两种以上类型的miRNA响应型报告mRNA的情况下，或者在使用miRNA响应型报告mRNA和用作为对照的mRNA(下文也被称为“对照mRNA”)的情况下，多个mRNA优选被共同导入到细胞组内。这是因为从由此被共同导入的两种以上的mRNA表达的标记蛋白的活性率在细胞群中是恒定的。这时，被导入的miRNA响应型报告mRNA的量是不同的，这取决于所述mRNA导入其中的细胞组的类型、被导入的mRNA的类型、导入所述mRNA的方法和导入试剂的类型。为了获得期望的翻译水平，本领域技术人员可适当选择这些条件。在本文中，术语“对照mRNA”用来意指mRNA，其不具有miRNA靶位点，并编码不同于由所述miRNA响应型报告mRNA编码的所述第一标记基因的标记基因。而且对于被导入的对照mRNA的量，本领域技术人员可适当选择前述条件，以获得期望的翻译水平。
当所述miRNA响应型报告mRNA被导入细胞时，可调控由所述miRNA响应型报告mRNA编码的第一标记基因的翻译水平，例如，如果在所述细胞中存在作为RISC的某种miRNA，则抑制所述翻译水平。根据miRNA活性，定量实施这样的翻译水平的调控。与此相反的是，如果在所述细胞中不存在有所述某种miRNA，或者如果所述某种miRNA不以RISC的形式存在，不抑制由所述miRNA响应型报告mRNA编码的第一标记基因的翻译水平。因此，其中存在作为RISC的所述某种miRNA的细胞和其中不存在所述某种miRNA的细胞之间所述第一标记基因的翻译水平不同。应注意的是，在本说明书中，其中所述某种miRNA作为RISC存在的情况也被称为“其中存在miRNA活性的情况”。另一方面，不管miRNA活性如何，对照mRNA表达标记蛋白。这是因为，即使所述对照mRNA被导入细胞，由于在其中并未存在有所述miRNA靶序列，因而并未根据miRNA的表达水平调控翻译。
随后，采用作为指示剂的所述第一标记基因的翻译水平，实施区分细胞的步骤(下文也被称为“测定步骤”)。在所述测定步骤中，基于前述的所述第一标记基因的翻译水平区分细胞。也就是说，该步骤可以是区分所述期望的细胞类型的步骤，所述期望的细胞类型是一种其中用作为指示剂的miRNA的表达水平低且所述第一标记基因的翻译水平高的细胞，和/或可以是一种区分期望的细胞类型的步骤，所述期望的细胞类型是一种其中用作为指示剂的miRNA的表达水平高且所述第一标记基因的翻译水平低的细胞。其中用作为指示剂的miRNA的表达水平低的这样的细胞，或者其中用作为指示剂的miRNA的表达水平高的这样的细胞，可通过获得在属于包含两种以上类型细胞的细胞组的细胞中所述第一标记基因的翻译水平的比例来进行区分。在本文中，当使用翻译调控因子作为第一标记基因时，基于第二标记基因的翻译水平区分细胞，所述第二标记基因已被同时导入所述细胞中。通过利用其翻译受到第一标记基因抑制的具有第二标记基因的前述mRNA，所述第二标记基因的翻译水平与用作为指示剂的miRNA的表达水平成正比。具体地，在其中期望的细胞类型是其中用作为指示剂的miRNA的表达水平低的细胞的情况下，区分其中第二标记基因的翻译水平低的细胞。另一方面，在其中期望的细胞类型是其中用作为指示剂的miRNA的表达水平高的细胞的情况下，区分其中第二标记基因的翻译水平高的细胞。因此，当细胞杀伤蛋白用作为第二标记基因时，例如，其中用作为指示剂的miRNA的表达水平高的细胞可被特异性诱导进行细胞死亡，并且可被消除。
具体地，可通过检测来自标记蛋白的信号，采用预定检测设备进行所述测定步骤。检测设备的实例包括流式细胞仪，成像细胞计数仪，荧光显微镜，发光显微镜，和CCD摄影机，但是实例不局限于此。本领域技术人员可根据标记蛋白和测定的方面，使用合适的设备作为所述检测设备。例如，当标记蛋白是荧光蛋白或发光蛋白时，可以使用诸如流式细胞仪、成像细胞计数仪、荧光显微镜或CCD摄影机之类的检测设备量化所述标记蛋白。当所述标记蛋白是支持荧光、发光或显色的蛋白时，可采用使用诸如发光显微镜、CCD摄影机或光度计之类的检测设备量化所述标记蛋白的方法。当所述标记蛋白是膜定位蛋白时，可采用使用对诸如抗体之类的细胞表面蛋白具有特异性的检测试剂以及前述检测设备量化所述标记蛋白的方法，以及还可采用未实施量化所述标记蛋白的工艺(诸如磁细胞分离装置(MACS)的分离细胞的方法。当所述标记蛋白是耐药基因时，可采用包括通过给予药物然后分离活细胞来检测所述第一标记基因的表达的方法。
在所述标记蛋白是荧光蛋白时采用的优选的检测方法的实例是流式细胞术。在流式细胞术中，从荧光蛋白(荧光素酶，在每一细胞中翻译的标记蛋白)发射的光的密度可提供作为用于测定的信息。下文中，将在一些例子中描述细胞类型的测定的方面，其中采用流式细胞术以及使用一或多种miRNA响应型报告mRNA。
[a.基于表达强度的分离，其中使用miRNA响应型报告mRNA]
根据本发明的一个方面，使用仅一种类型的miRNA响应型报告mRNA。例如，参见图1(a)，在将仅一种类型的miRNA响应型报告mRNA导入期望的细胞组的情况中获得荧光强度的值具有倒“V”形分布，如在纸上显示的，位于图形平面外边。这是因为被导入在靶细胞组中各个细胞中的mRNA的数量有变化。例如，当根据在期望的细胞中的miRNA活性抑制miRNA响应型报告mRNA的翻译时，期望细胞的所述倒“V”形分布被移动至左侧。当从期望的细胞组获得的荧光强度值的分布并未与从另一细胞组获得的荧光强度值的分布重叠时，可通过分离仅那些具有特异性荧光强度值的细胞组，使所述期望的细胞组与其它细胞组分离，从而，可区分期望的细胞组。另外，如在图1(a)的纸上显示的，即使所述荧光强度值的分布与另一分布重叠，也可区分在所述分布的无重叠的边缘上的区域，并且可分离细胞。
[b.一维分离，其中使用miRNA响应型报告mRNA和对照mRNA]
根据本发明的一个方面，使用仅一种类型的miRNA响应型报告mRNA，并且对照mRNA可被共同导入细胞中。可以说，根据细胞的类型，在对照mRNA中的第一标记基因的翻译是恒定的，而不会受到miRNA的影响。可以设计对照mRNA，并且可以与miRNA响应型报告mRNA相同的方法制备对照mRNA，只是对照mRNA不具有miRNA靶位点。在本申请说明书中，术语“维度”用来意指关于标记基因的翻译率的“维度”，尤其是测定的荧光强度值的比例。
在本发明中，当miRNA响应型报告mRNA和对照mRNA被共同导入时，发现从所述两种类型的mRNA表达的标记蛋白的活性在细胞群中是恒定，并具有微小变化。因此，通过获得从所述两种类型的mRNA表达的标记蛋白的荧光强度的比例，可获得在每一细胞中特异性mRNA的表达比例。
标记蛋白的表达比例在均一细胞中几乎是恒定的，但是有一定量的变化。这是由于以下原因造成的。
(1)即使在均一细胞中，miRNA表达水平也存在有轻微的变化。
(2)表达的miRNA与共同导入的mRNA的反应率也有变化。
(3)所述共同导入的两种mRNA的细胞导入比例也有变化。
因此，有这样一种情况，其中即使在均一细胞中，标记蛋白的表达水平有一定程度的差异。在采用流式细胞术的测定方法的情况下，所述均一细胞在点图中被分布成具有一定宽度的带状，所述点图中由miRNA响应型报告mRNA编码的标记蛋白的表达强度被设置在X-轴，而由对照mRNA编码的标记蛋白的表达强度被设置在Y-轴。该宽度是由前述变化所引起的。当出现对应于不同细胞类型的数量的多个带形图且这些细胞类型被分离时，可区分这些细胞。例如，在其中在所述测定步骤中采用流式细胞术进行所述测定方法的情况下，在其中由第一miRNA响应型报告mRNA编码的第一标记蛋白的表达强度被设置在X-轴上且由第二miRNA响应型报告mRNA编码的第二标记蛋白的表达强度被设置在Y-轴的点图中，所述均一细胞在被分布成具有一定宽度的带状。这样的方面被示意性显示于图1(a)中。在图1(a)中，存在有三个带形图组。在纸上，在左上角和右下角中的带形图指示两种不同类型的细胞组，其已通过共同导入两种类型的miRNA响应型报告mRNA在点图平面上被区分。在中心的带形图示意性地显示当仅对照mRNA被导入与上述对照实验相同的细胞组中时标记蛋白的表达强度，并且在所述点图平面上不能区分两种不同类型的细胞组。
在图1(a)中显示的分离中，将描述其中使用靶向miRNA(a)的第一miRNA响应型报告mRNA和靶向miRNA(b)的第二miRNA响应型报告mRNA作为示例的情况。当使用这些mRNA分类细胞A和细胞B时，如果miRNA(a)在所述细胞A中高度表达(高活性)且miRNA(b)在所述细胞B中高度表达(高活性)，则分离能力提高。换言之，如果响应miRNA(a)的mRNA的翻译在所述细胞A中受到抑制以及响应miRNA(b)的mRNA的翻译在所述细胞B中受到抑制，分离能力提高。在图1(a)中，在该图中沿着所述X-轴从右到左的箭头和在所述纸上沿着所述Y-轴从上到下的箭头分别指示在不同方向上的翻译抑制。当假设对于所述第一miRNA响应型报告mRNA，所述细胞A的翻译抑制比所述细胞B强α-倍(α＞1)，并且对于所述第二miRNA响应型报告mRNA，所述细胞B的翻译抑制比所述细胞A强β-倍(β＞1)时，如果α×β为大约1.9-倍或以上，则在流式细胞仪的点图上可将所述细胞A与所述细胞B区分开。如果其优选是2-倍或以上，且更优选是2.5-倍或以上，所述细胞A可被更清楚地与所述细胞B区分开。在另一方面，可通过基于从两种mRNA获得的两种荧光值的比例绘制柱状图(例如，图1(a)的左下角柱状图)来实施测定。通过使用这样的比例执行测定，可消除在细胞中mRNA导入效率的差异。
将进一步描述在这样方面的细胞类型的分辨能力。图2是示意性显示本发明的原理的视图，根据本发明的原理以高分辨能力将所述细胞类型A与所述细胞类型B区分开。在前述图1(a)中，当在多个不同的miRNA响应型报告mRNA中观察到荧光强度时，观察到的那些荧光强度为在流式细胞仪的点图上的分隔开的带形式。这证明了多个荧光强度值的比例(图1(a)的左下角)产生更好的分离。也就是说，当导入两种类型的mRNA时，可测定两种类型的荧光强度值，并且可获得一种类型的荧光强度比例。因此，所述靶细胞呈一维分布(在荧光强度比例的数线之上)且被分离。图2(a)是显示当miRNA响应型报告mRNA和对照mRNA分别被导入两种不同细胞组A和B中时获得的信号率。在本文中，假设了一种情况，其中荧光强度比例的分布，即在点图上显示的带宽度是4-倍。参考图2(a)，已发现如果在细胞A和细胞B之间有4-倍的差异，根据作为标记蛋白的定量比值的miRNA响应型报告mRNA的翻译效率(即，miRNA的活性)，可在所述柱状图上将两种类型的细胞组彼此分离开。
[c.使用两种类型的miRNA响应型报告mRNA进行一维分离]
在本发明的另一方面，优选将两种以上类型的miRNA响应型报告mRNA共同导入细胞中。这是由于所述细胞的分离能力可通过使用两种以上类型的miRNA响应型报告mRNA得到增强所导致的。图2(b)是描述本实施方式的示意图，其即使在其中翻译效率仅有微小差异的情况中也能实现高分辨能力。也就是说，其证明了，即使它们是第一miRNA响应型报告mRNA(由流式细胞术获得的荧光强度FL1)和第二miRNA响应型报告mRNA(由流式细胞术获得的荧光强度FL2)，其中所述第一miRNA响应型报告mRNA在其被导入所述细胞A中时仅有相比于对照mRNA相差大约2-倍的翻译效率的差异以及所述第二miRNA响应型报告mRNA在其被导入所述细胞B中时仅有相比于对照mRNA相差大约2-倍的翻译效率的差异，也能通过使用这两种miRNA响应型报告mRNA充分地将所述细胞彼此分离开。在本文中，当假设对于所述第一miRNA响应型报告mRNA，所述细胞A的翻译抑制比所述细胞B强α-倍(α＞1)，并且对于所述第二miRNA响应型报告mRNA，所述细胞B的翻译抑制比所述细胞A强β-倍(β＞1)时，如果α×β的乘积值(integrated value)大于比图2(在该图中，示例为4-倍)中显示的某种细胞类型的分布宽度，则可认为可将所述细胞A与所述细胞B区分开。示例的4-倍宽度被认为是其中可产生相对宽的宽度的例子，即高难度水平的例子。
参考图2(b)，在α＞1和β＜1的情况中，细胞群在相同的方向上移动。在该图中，对应于右箭头的β(β＞1)在β＜1的情况中面向左侧。例如，在该图中，即使所述细胞A向左移动8-倍至α＝8并且所述细胞B向左移动2-倍至β＝0.5，在所述细胞之间也保持4-倍的宽度(乘积值:8×0.5)，因此，可将两种细胞彼此分离开。在这种情况下，然而，不是在使用所述第二miRNA响应型报告mRNA，而是在使用不miRNA响应型报告mRNA(β＝1)(乘积值:8×1)时，所述分离会更好。
在另一方面，在考虑使用比例柱状图分离细胞(图2)时，如果使用某种miRNA响应型mRNA，细胞群的峰不仅向右侧和左侧移动，而且所述细胞群的宽度也发生变化。对于细胞的分离，细胞的整个分布向右和向左移动，直至其超过“细胞分布的宽度”。然而，通过αβ的乘积值区分整个分布的位移量(差值)。同时，还通过将两种类型的miRNA响应型mRNA组合使细胞分布的所述宽度变宽或变窄(参见实施例10和图15)。正因为如此，假设有一种情况，其中使所述分布宽度变窄同时牺牲整个位移量有利于分离细胞。
在根据现有技术使用两种类型的结合至不同的荧光染料和细胞表面抗原的抗体分离细胞时，如果以上述相同的方式通过流式细胞仪测定荧光强度，获得如在图1(c)中示意性显示的点图。也就是说，在所述细胞A和细胞B之间有多个重叠的部分，因此，不可能以高精度将这些细胞彼此分离开。与此相反的是，通过使用miRNA响应型报告mRNA，和进一步通过使用两种以上类型的miRNA响应型mRNA的组合，使得如上所述的，可使翻译效率在上述细胞中得到相对抑制，并可在其它细胞中得到相对增强，分辨能力可得到增强。
[d.使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA进行二维分离]
而且，通过使用三种以上类型的miRNA响应型报告mRNA以及将它们共同导入多个细胞，基于与上述相同的原理可进一步增强分离能力。例如，通过导入三种类型mRNA，可测量三种类型的荧光强度，并可获得两种类型的荧光强度比例。因此，靶细胞是二维分布(在荧光强度比例的平面上)并被分离开。将描述将靶向miRNA(a)的第一miRNA响应型报告mRNA、靶向miRNA(b)的第二miRNA响应型报告mRNA和靶向miRNA(c)的第三miRNA响应型报告mRNA共同导入两种不同类型的细胞A和细胞B的情况作为示例。通过流式细胞仪测定的由所述第一miRNA响应型报告mRNA编码的第一标记蛋白的表达强度被定义为FL1；通过流式细胞仪测定的由所述第二miRNA响应型报告mRNA编码的第二标记蛋白的表达强度被定义为FL2；以及通过流式细胞仪测定的由所述第三miRNA响应型报告mRNA编码的第三标记蛋白的表达强度被定义为FL3。当FL1/FL3和FL2/FL3分别被设置在所述X-轴和Y-轴，产生点图时，均一细胞并未呈现出带状形状，而是呈现出团块的形状。在图1(b)中示意性显示了所述方面。在图1(b)中的纸上在从左上角到右下角的虚线上的两个团块指示是通过不是使用第三miRNA响应型报告mRNA，而是使用不响应任何miRNA的对照mRNA观察到的点图团块。也可以说，这指示了通过用在所述纸上从左上角到右下角的大箭头切割图1(a)的平面获得的部分。与此相反的是，发现由于第三miRNA响应型报告mRNA的共同导入以及随后的根据miRNA(c)的活性差异在另一不同方向上进行的翻译调控，存在所述虚线上的两个团块在每一不同方向(在所述纸上的右上角和左下角)上受到翻译调控，因此，在所述点图平面上可更清楚地将细胞A与细胞B分离开。另外，当使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA进行二维分离时，尽管在前述计算中所有所述三种类型的miRNA响应型报告mRNA的荧光强度都被设置在FL3，仍可获得相同的分离结果。
根据使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA的二维分离，可能区分和分离25种类型至60种类型或以上的不同细胞，其中miRNA活动状态差别是2-倍单位。如上所述的，这是由于如果在两种细胞中两种类型的miRNA响应型报告mRNA的翻译效率的乘积值是1.9-倍或以上，那么理论上在流式细胞仪的点图上就可将两种细胞彼此区分。因此，使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA的二维分离可实际上用于细胞类型的测定。例如，如果有一种细胞，其中某种miRNA的活性状态具有5个阶段的差异(2-倍)，可认为两种类型的miRNA响应型mRNA和一种类型的对照mRNA同时被导入所述细胞中，使得5×5＝25种类型的细胞可彼此被分离开。使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA，通过计算，可使5×5×5＝125种类型的细胞彼此分离开。然而，实际上，由于存在有重叠，大约61种类型的细胞可被分离开。这显示在实施例2和图4(f)中。
[e.使用四种类型的miRNA响应型报告mRNA进行三维分离]
在与上述方面d相同的方法中，还可使用四种类型的miRNA响应型报告mRNA进行三维分离。也就是说，如果四种类型的mRNA被导入细胞中，可测定四种类型的荧光强度值，以及可获得三种类型的荧光强度比例。因此，靶细胞是三维分布(在所述荧光强度比例的空间中)，并且彼此分离开。将描述以下情况作为示例，其中靶向miRNA(a)的第一miRNA响应型报告mRNA、靶向miRNA(b)的第二miRNA响应型报告mRNA、靶向miRNA(c)的第三miRNA响应型报告mRNA和靶向miRNA(d)的第四miRNA响应型报告mRNA被共同导入两种不同类型的细胞A和细胞B中。通过流式细胞仪测定的由所述第一miRNA响应型报告mRNA编码的第一标记蛋白的表达强度被定义为FL1；通过流式细胞仪测定的由所述第二miRNA响应型报告mRNA编码的第二标记蛋白的表达强度被定义为FL2；通过流式细胞仪测定的由所述第三miRNA响应型报告mRNA编码的第三标记蛋白的表达强度被定义为FL3；以及通过流式细胞仪测定的由所述第四miRNA响应型报告mRNA编码的第四标记蛋白的表达强度被定义为FL4。当FL1/FL4、FL2/FL4和FL3/FL4分别被设置在所述X-轴、Y-轴和Z-轴，产生点图时，均一细胞分别在三维空间以团块形式分布。
而且，如果使用(n+1)种类型的不同的miRNA响应型报告mRNA，可测定(n+1)种类型的荧光强度值，以及可获得n种类型的荧光强度比例，则理论上更高维度的分离是可能的。因此，可能在n-维空间使多种类型的细胞彼此分离开。也在这种情况下，必要的是miRNA靶序列和第一标记基因在(n+1)种类型的miRNA响应型报告mRNA中是不同的。尤其是，在使用荧光强度分离的情况下，n种类型的标记蛋白需要具有检测上不同的波长区域。
在本发明的测定步骤中采用的另一种检测方法的实例是成像细胞计数法(imaging cytometry)。可使用图像分析仪来进行所述成像细胞计数法。所述图像分析仪能获得关于在细胞中第一标记基因的翻译水平随时间的变化的信息，并且在成像和可视化方面是优异的，以及也能改善每单位时间的分析量。此外，所述图像分析仪有利的是可用于包括细胞的形态学或位置信息以及细胞的鉴定的分析，所述分析靶向粘附至培养容器的细胞或以平面或立体方式组织的细胞组。
即使在使用所述图像分析仪的情况下，从两种以上类型的miRNA响应型报告mRNA获得的荧光强度比例以在平面上的点图的形式被显示，以至于不同细胞类型可彼此分离开，并且可实施上述的方面a至d。
进一步地，通过图像处理，细胞的荧光强度比例被转化成颜色信息，以至于可创建更可视化使用的测定步骤。具体地，设计多种miRNA响应型报告mRNA，使得它们包含编码核定位信号的序列，例如M9。因此，翻译了标记蛋白，使得其与细胞中的核定位信号融合，并且所述标记蛋白定位于细胞的核中，以至于可获得更清晰的荧光图像。
本发明的方法优选包含作为可选的预步骤的筛选用作为指示剂的miRNA的步骤。在所述筛选步骤中，选择在多种类型的细胞中具有不同活性的一或多种miRNA，其被包含或者预期被包含在作为测定靶标的“包含两种以上细胞的细胞组”中。这是由于获得前述期望的分辨能力所导致的。尤其是，当已经在一定程度上知道在细胞组中包含的细胞类型时，选择一种在细胞A中高度表达(高活性)并在另一种细胞B中以低水平表达的miRNA。当选择用作为指示剂的两种以上类型的miRNA时，选择一种miRNA的组合，即在细胞A中高水平表达(高活性)且在另一细胞B中低水平表达(低活性)的miRNA(a)和在细胞A中低水平表达(低活性)且在另一细胞B中高水平表达(高活性)的miRNA(b)的组合。基于在所述步骤中区分的一种或两种或以上的miRNA，在miRNA响应型报告mRNA中区分miRNA靶序列。
当在细胞组中包含的细胞各作为分离的细胞(例如，细胞A和细胞B)存在时，可通过包含以下三个步骤的方法实施所述筛选步骤。也就是说，在第一步骤中，筛选从miRNA库选择的多种类型的miRNA。例如，对于60-70种类型的miRNA，制备靶向每一种miRNA并编码相同荧光蛋白的miRNA响应型报告mRNA。随后，每一种miRNA响应型报告mRNA和编码另一种荧光蛋白的对照mRNA被共同导入每一种现有的细胞A和B，然后测定翻译效率(从所述对照mRNA翻译的标记蛋白/从所述miRNA响应型报告mRNA翻译的标记蛋白)。
在第二步骤中，根据在所述第一步骤中测定的翻译效率的值，两种类型、三种类型或四种类型彼此组合，并且从那些数值构建的矢量被定义为细胞A和细胞B的每一个坐标矢量(例如，XY坐标，XYZ坐标，或者任意给定n-维坐标(其中n表示整数4以上))，以及随后计算在坐标(ordinate)中所述细胞之间的距离。当包含三种以上类型的现有细胞时，计算在包含的所有类型的两种细胞之间的距离中最短的距离。
在第三步骤，增加已在所述第二步骤中计算的细胞之间的距离的两种类型、三种类型或四种类型的miRNA被定义为靶序列，以及制备各自编码不同荧光蛋白基因的一组miRNA响应型报告mRNA。所述一组miRNA响应型报告mRNA被共同导入每一种细胞A和B中或者导入三种以上类型的细胞中，然后测试分离能力。在多个组中，那些已获得各个细胞的荧光比例分布已出现在每一个不同区域以及在所述分布中存在有小重叠的测试结果的组优选用于后续的导入步骤和测定步骤中。
另一方面，在对于一种细胞组已知不同于本发明的分离方法的情况下，还需要以下的操作：在所述筛选步骤的第一步骤中同时实施根据不同方法的分离，以及测定每一种分离的细胞的翻译效率，即miRNA活性的值。与本发明不同的所述分离方法的实例包括：一种方法，其包括在分离后固定细胞，进行膜渗透，以及使用抗体检测细胞内因子，以及一种方法，其包括预先修饰基因，即使其是活细胞，以及使用用于所述筛选步骤目的的细胞(报告细胞株等)。然而，与本发明不同的分离方法的实例不局限于此。可以与上述那些相同的方式进行第二步骤和第三步骤。在实施例9中将证实本筛选方法。
当包含在所述“包含两种以上类型细胞的细胞组”中作为测定靶标的多种类型的细胞是未知时，前述筛选步骤可被转变成包括以下第一至第四步骤的筛选步骤。在第一步骤中，测定在所述细胞组中的miRNA活性值，以及同时获得在所述细胞组中各个细胞的miRNA活性的分布。因此，选择展现宽分布的miRNA活性的多种类型的miRNA。例如，优选选择6-10种类型的miRNA。
在第二步骤中，从在所述第一步骤中选择的所述miRNA制备两种类型、三种类型、或四种类型的miRNA的组合组。在第二步骤中，制备一组miRNA响应型报告mRNA，其靶向包含在所述一组中的作为靶序列的两种类型、三种类型、或四种类型的miRNA，并且编码不同的荧光蛋白基因。
在第三步骤中，将由在第二步骤中制备的两种类型、三种类型、或四种类型的miRNA响应型报告mRNA构成的一组miRNA响应型报告mRNA共同导入细胞组，然后分析在所述细胞组中miRNA活性中的相关性。
在第四步骤中，基于在第三步骤中分析的miRNA活性的相关性再次制备由两种类型、三种类型、或四种类型的miRNA响应型报告mRNA构成的一组miRNA响应型报告mRNA，然后将所述mRNA共同导入所述细胞组以测试分离能力。在多个组中，那些已获得在所述细胞组中的荧光比例的分布已被分成两种类型、三种类型、四种类型或更多种类型的群的测试结果的组优选用于后续的导入步骤和测定步骤中。当包含在所述“包含两种以上类型细胞的细胞组”中的所述多种类型的细胞是未知时，可以说本发明的所述测定方法是赋予新细胞类型定义的方法。将在实施例10和11中证明本发明筛选方法。
作为另一种可选的预步骤，本发明方法可包括合成miRNA响应型报告mRNA的步骤。在这样的合成步骤中，在所述筛选步骤中已区分用作为指示剂的miRNA或所述miRNA的组合之后，合成miRNA响应型报告mRNA或miRNA响应型报告mRNA的组合，其包括靶向它们的miRNA靶序列。
此外，作为进一步的可选步骤，本发明方法可包括在完成所述测定步骤之后分离细胞的步骤。
在前面提及的描述内容中，作为区分细胞的特定实例，已描述了多种情况，在每一种情况中在测定步骤中采用流式细胞术或成像细胞计数方法。然而，本发明不局限于前述的方面，并且理论上在各方面可实施测定。
根据另一方面，本发明涉及用于区分细胞类型的试剂盒，其包括至少一种类型的miRNA响应型报告mRNA或两种以上miRNA响应型报告mRNA的组合，以及进一步包括可选选择的对照mRNA。可通过将上述miRNA响应型报告mRNA或两种以上miRNA响应型报告mRNA的组合封装在可保存的容器等中来制备所述试剂盒。而且，本发明的试剂盒可包括关于其使用方法的说明书。
[实施例]
在下文中，将在以下实施例中更详细描述本发明。然而，这些实施例并未旨在限制本发明的范围。
[质粒的构建]
使用引物组T7Fwd5UTR和Rev120A，根据PCR从质粒pSRT-tagRFP扩增用于对照tagRFP mRNA(SEQ ID NO:24)的IVT模板(用于合成mRNA的模板DNA)。首先，使用引物组，FwdMCS和RevMCS，根据基于PCR的定位突变方法修饰pGEM T-easy(Promega)的多克隆位点，以获得pAM空载体。随后，通过使得用NheI和AgeI消化pCDFDuet-1(Novagen)制备的DNA片段平端化，然后将得到的片段插入到用DraI消化pAM制备的DNA片段以制备pSM空载体。随后，为了制备pSRT空载体，对寡DNA对，Code5UTR和Comp5UTR，进行退火处理，然后将得到的产物插入EcoRI-NcoI位点。然后，将退火的Code3UTR和Comp3UTR插入XbaI-HindIII位点(或“片段”)。最后，使用合适的引物组根据PCR扩增tagRFP的编码序列，然后用NcoI和BglII消化，接着插入到pSRT的NcoI和BglII位点，以获得pSRT-tagRFP。
为了使作为核定位信号的M9与荧光蛋白融合，使用合适的引物组扩增hmAG1、hmKO2和tagBFP的编码区域，然后替代pSRT-tagRFP的tagRFP区域。随后，使用引物组，FwdM9和RevSV40，从p4LambdaN22-3mEGFP-M9扩增M9序列(参考文献[4])，然后用BamHI和BglII消化，并插入所述BglII位点。在下表1中显示了引物和寡核苷酸的序列。
[表1A]
[表1B]
[IVT模板DNA的构建]
根据PCR使用合适的引物组从质粒或寡DNA扩增荧光蛋白的蛋白编码区域和对照5'UTR和3'UTR序列。从质粒产生一些5'UTR片段。在表2中显示的DNA片段对进行退火，然后插入18nt-2xFr15-ECFP的BamHI-AgeI位点(参考文献[3])。随后，使用引物组，T7FwdA和Rev5UTR，扩增5'UTR。
[表2]
[表3]
[表4]
为了产生IVT模板，使用在表2中示出的引物组T7FwdA和Rev120A，根据PCR扩增5'-UTR片段和3'-UTR片段(各自为10pmol)和50ng的报告蛋白的蛋白编码区域，然后将它们彼此连接。从寡DNA合成在表3中显示的其它5'-UTR片段，将合成得到的片段加入到第二次PCR，而不是在所述PCR中生产的所述5'-UTR片段。为了制备对照mRNA或筛选库，在所述第二次PCR中使用T7Fwd5UTR或T7FwdB而不是T7FwdA。作为在3'-UTR中包含4个拷贝的miRNA靶序列的mRNA的IVT模板，使用在表4中显示的寡DNA而不是所述3'-UTR的PCR片段，以及使用Rev120A-2而不是Rev120A，根据PCR扩增所述片段，然后将它们彼此连接。使用MinElutePCR纯化试剂盒(QIAGEN)根据生产商的说明书提纯所述PCR产物。在所述纯化之前，从所述质粒扩增的所述PCR产物用Dpn I(Toyobo)在37℃消化30分钟。在表1中显示了引物的序列。
[mRNA的合成和产生]
使用MegaScript T7试剂盒(Ambion)根据修改的实验方法制备miRNA响应型报告mRNA(参见如下文所描述的参考文献[1])。在该反应中，分别使用假尿苷-5'-三磷酸和5-甲基胞苷-5'-三磷酸(TriLink BioTechnologies)，而不是尿苷三磷酸和胞苷三磷酸。在所述IVT反应(mRNA的合成)之前，用Anti Reverse Cap Analog(New England Biolabs)将鸟苷-5'-三磷酸稀释5-倍。反应混合物在37℃孵化4小时，然后将TURBO DNase(Ambion)添加至得到的产物。随后，将所述获得的混合物在37℃再孵化30分钟。随后，用FavorPrep血液/培养的细胞总RNA提取柱(Favorgen Biotech)提纯所述获得的mRNA，然后使用AntarcticPhosphatase(New England Biolabs)使产物在37℃孵化30分钟。然后，使用RNeasyMiniElute Cleanup试剂盒(QIAGEN)进一步提纯所述产物。
[筛选miRNA响应型mRNA]
通过三个步骤实施miRNA响应型mRNA的筛选。在第一步骤中，将miRNA响应型报告hmAG1mRNA和对照hmKO2mRNA共同导入，并选择其活性因所述细胞的类型的不同而有很大程度上的不同的八种miRNA。在第二步骤中，产生四种miRNA响应型报告mRNA的组合表，然后测试。在该组合表中，可包括所有类型的两种组合，使得从所述八种miRNA选择的任意两种miRNA对可从四种类型的标记荧光蛋白中选择。在第三步骤中，四种miRNA响应型报告mRNA彼此进行新的组合，然后测试若干组。
[细胞培养]
HeLa细胞和MCF-7细胞分别培养于包含10％胎牛血清(FBS)和1％抗生素抗真菌溶液(Sigma)的达尔伯克氏改良伊格尔培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)-F12以及培养于RPMI1640中。293FT细胞(Invitrogen)被允许在添加了10％FBS、2mML-谷氨酰胺(Invitrogen)、0.1mM非必需氨基酸(Invitrogen)、1mM丙酮酸钠(Sgima)和0.5％青霉素-链霉素(Invitrogen)的DMEM中生长。在混合了细胞的实验中，在与HeLa细胞相同的培养基中制备各个类型的细胞，并将相同数量的细胞与另一种细胞混合，并接种。
IMR-90细胞(ATCC)在明胶包被的板上的添加了10％FBS和1％青霉素-链霉素-谷氨酰胺(Gibco)的伊格尔基础培养液中。根据生产商的说明书培养正常人肺成纤维细胞(NHLF；Lonza)。采用在20代内的IMR-90和在10代内的NHLF。为了使IMR-90细胞能在体外分化，这些细胞在低血清培养基(0.01％FBS)中保持饥饿状态持续48小时，然后在所述低血清培养基在含有或缺无10ng/mL人TGF-β1(衍生自哺乳动物；PeproTech)下刺激24小时。随后，用上面设计并制备的miRNA响应型报告mRNA转染所述得到的细胞。转染之后4小时，所述培养基与在转染中使用的培养基交换。
[用miRNA响应型报告mRNA进行的转染]
将培养的细胞(HeLa,293FT,MCF-7,和IMR-90)接种在24-孔板上，第二天，将所述合成的mRNA导入其中。NHLF接种在24-孔板上，在同一天内，将所述合成的mRNA导入其中。根据生产商的说明书使用1μL的StemFect(Stemgent)实施所述导入。为了测量翻译效率，将对每一种不同类型的miRNA相应的报告EGFP mRNA和对照tagRFP(Evrogen)mRNA(各100ng)共同导入每一细胞中。然而，在涉及mRNA的设计的比较的实验中(实施例3和图6)，在2pmol的mirVana miRNA抑制剂(Applied Biosciences)的存在下区分翻译效率。
在抑制剂分析中，将0.1至1pmol的miRNA抑制剂，或者25至200ng的报告mRNA(包含在ORF中的叩头虫荧光素酶CBRluc(Promega)并具有与报告EGFP相同的5'-UTR)与两种报告mRNA共同导入。导入之后24小时，用Accuri C6(BD Biosciences)通过流式细胞术测定所述细胞。计算在每种细胞中两种类型的报告蛋白的荧光强度比例，然后绘图。通过对miRNA响应的EGFP的平均强度除以由流式细胞仪测定的对照tagRFP的平均强度，区分所述翻译效率。
为了使用两种miRNA响应型报告mRNA分离细胞，将100ng的表达EGFP的报告mRNA和125ng的表达hmKO2的报告mRNA(Amalgaam)共同导入细胞或其混合物中。在第一次筛选IMR-90细胞中，用50ng的报告hmAG1(Amalgaam)mRNA和80ng的对照hmKO2mRNA转染所述细胞。对于分化的IMR-90细胞和NHLF细胞，使用2-倍的hmAG1mRNA和hmKO2mRNA。在共同导入三种mRNA的情况下，使用40ng的hmAG1mRNA、10ng的hmKO2mRNA和200ng的tagBFP(Evrogen)mRNA。在共同导入四种mRNA的情况下，使用250ng的hdKeimaRed(Amalgaam)mRNA以及前述的三种mRNA。CBG68luc mRNA(SEQ ID NO:31)用来稀释hmAG1mRNA、hmKO2mRNA和tagBFP mRNA。在转染之后4小时，替换所述培养基。
[流式细胞术]
在转染之后24小时，从培养皿分离所述细胞，然后使它们通过一筛网，并通过流式细胞仪进行分析。为了分析两种mRNA的共同导入，采用配备有FL1(530/30nm)和FL2(585/40nm)过滤器的Accuri C6(BD Biosciences)。为了分析三种mRNA或四种mRNA的共同导入，采用FACSAria(BD Biosciences)。用包含FITC过滤器(530/30nm)的蓝光激光器(488nm)检测hmAG1、hmKO2、tagBFP和hdKeimaRed，并分别用包含PE过滤器(585/42nm)的绿光激光器(561nm)、包含Pacific Blue过滤器(450/40nm)的紫光激光器(405nm)以及包含Qdot 605过滤器(610/20nm)的紫光激光器进行分析。通过前向和侧向光散射信号移除死亡细胞和碎片。在翻译效率的测定中，基于从转染EGFP或tagRFP的细胞的数据集获得的谱矩阵来校正EGFP的强度和tagRFP的强度(参考文献[5])。所述翻译效率被定义为通过校正的EGFP信号的平均强度除以校正的tagRFP信号的平均强度获得的数值。
[成像细胞计数分析法]
所述报告荧光蛋白在其C-末端融合核定位信号M9，以便明确所述共同导入的细胞。在导入三种mRNA之后24小时，使用IN Cell Analyzer 6000(GE Healthcare)，获得所述细胞的亮域图像和荧光图像。使用包含FITC过滤器的蓝光激光器、包含DsRed过滤器的绿光激光器和包含DAPI过滤器的UV激光器分别测定hmAG1,hmKO2和tagBFP的荧光信号。使用Cell Profiler分析所述获得的图像(参考文献[2])。首先，在三种荧光通道的平均图像中鉴定所述核。随后，与流式细胞术一样，在每一个像素中，hmKO2信号和tagBFP信号除以hmAG1信号。然后，获得在每个核中的几何平均率。使用ImageJ(由The NationalInstitutes of Health(NIH)制造)编辑所述图像。
[实施例1：使用miRNA响应型报告mRNA对现有细胞系进行一维分离]
使用一或两种类型的miRNA响应型报告mRNA对现有细胞系进行一维分离。结果显示于图3中。图3(a)是显示在本实施例中使用的体外合成的miRNA响应型报告mRNA的示意图。在所述纸上从左侧的5'-末端到右侧的3'-末端的方向上，ARCA(间隙结构类似物)、miRNA靶序列、编码荧光蛋白的基因和多聚(A)尾巴被定位。设计所述ARCA、所述miRNA靶序列和起始密码子，使得ARCA能与所述miRNA靶序列分隔大约20个核苷酸，并且所述miRNA靶序列也能与起始密码子分隔大约20个核苷酸。
图3(b)是显示当三种类型的miRNA响应型报告mRNA分别被导入三种类型的细胞系中时翻译效率的比较的图。在所有例子中，使用编码EGFP的基因作为标记基因，并且分别使用miR-21-5p、miR-24-3p和miR-203a作为miRNA靶序列。对于三种类型的miRNA响应型报告mRNA(α(miR-21-5p)-EGFP(SEQ ID NO:1)、α(miR-24-3p)-EGFP(SEQ ID NO:3)和α(miR-203a)-EGFP(SEQ ID NO:5))，将100ng的每种mRNA连同100ng的对照tagRFP mRNA(SEQ IDNO:24)直接共同导入HeLa、293FT和MCF-7细胞中。根据在所述共同导入之后24小时的流式细胞术测量，通过EGFP的平均强度除以tagRFP的平均强度来区分翻译效率。在每一图柱的上部分中的数值指示在各个细胞系中翻译效率的放大倍数。误差棒(error bar)指示平均值±标准偏差(n＝3)。
图3(c)是显示在将miR-21-5p-响应型EGFP mRNA和对照hmKO2mRNA(SEQ ID NO:22)共同导入HeLa细胞和293FT细胞中的每一种之后24小时获得的测定结果的点图。另一方面，图3(f)是显示在将与上述那些相同的mRNA共同导入HeLa细胞和293FT细胞的混合物之后24小时获得的测定结果的点图。使用Accuri C6流式细胞仪进行所述测定，所述测试独立地进行三次。代表性结果显示于图中。从反映miRNA活性中的差异的荧光强度比例，发现所述两种类型的细胞系很明显彼此分离开。
图3(d)是显示在将miR-24-3p-响应型EGFP mRNA和miR-203a-响应型hmKO2mRNA(SEQ ID NO:6)共同导入HeLa细胞和MFC-7细胞中的每一种之后24小时获得的测定结果的点图。另一方面，图3(h)是显示在将与上述那些相同的mRNA共同导入HeLa细胞和MFC-7细胞的混合物之后24小时获得的测定结果的点图。参见图3(b)，发现在所述两种细胞系中，这些miRNA的活性相对地略微不同。参见图3(d)和(h)，发现利用在所述活性中的所述略微差别，所述两种类型的细胞系可清楚地彼此分离开。
图3(e)包括显示两种荧光信号比例的柱状图。将在每一个柱状图中显示的一组miRNA响应型报告mRNA/对照mRNA(EGFP mRNA(SEQ ID NO:19)或hmKO2mRNA(SEQ ID NO:22))共同导入HeLa细胞、MCF-7细胞，及其混合物中。在最低的柱中显示了已导入两种类型的miRNA响应型报告mRNA的细胞的荧光比例的累积频率。此外，图3(g)包括显示在图3(c)和图3(f)的每一个中显示的点图中的两种荧光信号的比例的柱状图。
[实施例2：在较高维度空间中的细胞分离]
使用三种类型或四种类型的miRNA响应型报告mRNA进行细胞分离。首先，测定三种类型的miRNA响应型报告mRNA，α(miR-24-3p)-EGFP、α(miR-127-3p)-EGFP(SEQ ID NO:7)、α(miR-17-5p)-EGFP(SEQ ID NO:9)和α(miR-92a-3p)-EGFP(SEQ ID NO:15)，它们在HeLa、293FT和MCF-7细胞中的翻译效率。结果显示于图4(a)和图4(d)中。每一柱顶部的数值指示三种类型的细胞系中两种类型的翻译效率比例。每一个误差棒指示平均值±标准偏差(n＝3)。
通过使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA(α(miR-24-3p)-hmAG1(SEQ ID NO:4)、α(miR-127-3p)-hmKO2(SEQ ID NO:8)和α(miR-17-5p)-tagBFP(SEQ ID NO:13))实施二维分离获得的结果显示于图4(b)中。将三种类型的miRNA响应型报告mRNA分别独立地共同导入三种类型的细胞系中，并在24小时后用FACSAria分析所述结果。对关于两种比例的流式细胞仪的数据绘图。所述两种比例指示通过将hmKO2强度除以hmAG1强度获得的数值，以及通过将tagBFP强度除以hmAG1强度获得的数值。在所述mRNA的共同导入中涉及的HeLa细胞、293FT细胞和MCF-7细胞的密度被绘制在平面图上。对于着色密度图，HeLa细胞、293FT细胞和MCF-7细胞的密度分别用红色、绿色和蓝色通道表示，然后将得到的图像重叠，所述着色密度图被生成为其负像。
通过使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA，对通过混合三种类型的细胞制备得到的样本进行二维分离获得的结果显示于图4(c)中。对关于两种比例的流式细胞仪的数据绘图。
使用四种类型的miRNA响应型报告mRNA实施三维分离。将四种类型的对照mRNA，hmAG1mRNA(SEQ ID NO:21)、hmKO2mRNA(SEQ ID NO:22)、tagBFP mRNA(SEQ ID NO:20)和hdKeimaRed mRNA(SEQ ID NO:23)共同导入HeLa、293FT、MCF-7及其混合物的每一种中。另一方面，将四种类型的miRNA响应型报告mRNA，α(miR-24-3p)-hmAG1、α(miR-127-3p)-hmKO2、α(miR-92-3p)-tagBFP(SEQ ID NO:17)和α(miR-17-5p)-hdKeimaRed(SEQ ID NO:14)共同导入HeLa、293FT、MCF-7及其混合物的每一种中。在导入之后24小时，进行流式细胞术分析。使用四种类型的miRNA响应型报告mRNA进行三维分离获得的结果显示于图4(e)中。在完成流式细胞仪进行的测定之后，计算三种比例的几何平均值(即，hmKO2强度除以hmAG1强度得到的数值，tagBFP强度除以hmAG1强度得到的数值，和hdKeimaRed强度除以hmAG1强度得到的数值)，然后绘图。误差棒指示在每一轴中的几何平均值±几何标准偏差(n＝5900至7300)。
在垂直于三个轴的三个平面上对细胞密度绘图，并且hmKO2、tagBFP和hdKeimaRed的荧光强度分别除以hmAG1的荧光强度。所述密度绘图显示于图5中。图5显示了从三个独立实验获得的代表性结果。从图5A(a)和(b)，发现即使参考任意平面图，已共同导入四种类型的对照mRNA的所述三种类型的细胞系不能彼此分离开。另一方面，从图5(c)，发现已共同导入四种类型的miRNA响应型报告mRNA的所述三种类型的细胞系在所有的平面点图中可明显彼此分离开。而且，从图5(d)，还可以通过目测法在三种类型的细胞系的混合物中确认细胞分离。也就是说，可能实施能将细胞系混合物分离成三种类型细胞系的测定。
将不具有miRNA靶序列的对照mRNA(即hmAG1mRNA,hmKO2mRNA,和tagBFP mRNA)各稀释为5个梯度的2-倍稀释液，这些稀释液随后以各种方式组合，然后被共同导入至HeLa细胞。从46种类型的独立导入结果获得的密度绘图显示于图4(f)中。组A是包含从4个梯度的2-倍稀释液获得的点图的组，组B是包含从5个梯度的2-倍稀释液获得的点图的组。详细的导入条件显示于表5A和表5B中。其中多种对照mRNA被稀释至各种浓度的该实验证明了在细胞中可通过miRNA活性产生的各种miRNA响应型报告mRNA。也就是说，其建议，理论上，重点研究三种类型的miRNA，当每一种miRNA的活性被假设相差4个梯度的2-倍(其中假设最大43＝64种细胞类型)时，所述细胞可通过使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA被分离成最大37种类型。此外，还建议了即使在其中miRNA的活性相差5个梯度(2-倍)的情况下(在该情况中，可假设最大53＝125种细胞类型，并且所述细胞可使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA被分离成最大61种类型)，细胞通过与上面描述相同的方法可被分离开。
[表5A]
[表5B]
＊平均值:几何平均值
＊90％区间:倍数改变
[实施例3：miRNA靶序列的插入和翻译效率]
考察在报告miRNA响应型报告mRNA中miRNA靶序列的位置。也就是说，制备miRNA响应型报告mRNA(α(miR-21-5p)-EGFP(SEQ ID NO:1))，其中作为miR-21-5p的靶位点的miR-21-5p的一种完全互补序列存在于5'UTR中，以及制备miRNA响应型报告mRNA(EGFP-4xα(4xmiR-21-5p)(SEQ ID NO:2))，其中miR-21-5p的四种完全互补序列存在于3'UTR中。考察由此制备的mRNA的翻译效率。同样地，制备miRNA响应型报告mRNA(α(miR-17-5p)-EGFP(SEQID NO:9))，其中作为miR17-5p的靶位点的miR17-5p的一种完全互补序列存在于5'UTR中，以及制备miRNA响应型报告mRNA(EGFP-4xα(4xmiR-17-5p)(SEQ ID NO:10))，其中miR-17-5p的四种完全互补序列存在于3'UTR中。考察由此制备的mRNA的翻译效率。在针对所述报告mRNA响应的miRNA的抑制药剂(抑制剂)的存在下，测量每一种报告mRNA的翻译效率。针对miR-1的抑制剂用作为阴性对照。所述抑制剂的浓度设置为2pmol。误差棒分别指示平均值±标准偏差(n＝2)。所述结果显示于图6中。
[实施例4:作为miRNA抑制剂的miRNA响应型报告mRNA的活性]
开展实验证明在商购的miRNA抑制剂和miRNA响应型报告mRNA之间的差别。在商购的miRNA抑制剂或miR-17-5p响应型报告mRNA(α(miR-17-5p)-CBRLuc(SEQ ID NO:33)；由于其是荧光素酶基因，因而其不显示荧光)的存在下，测定在HeLa细胞中对相同的miR-17-5p响应的α(miR-17-5p)-EGFP的翻译效率。使用针对miR-1的抑制剂和miR-1响应的荧光素酶mRNA(α(miR-1)-CBRLuc(SEQ ID NO:32))作为阴性对照。结果显示于图7(a)中。误差棒分别指示平均值±标准偏差(n＝3)。从这些结果，发现miRNA响应型报告mRNA难以起到miRNA抑制剂的作用。
经证实，对六种其它类型的miRNA(即,α(miR-21-5p)-CBRluc:SEQ ID NO:34,α(miR-92a-3p)-CBRluc:SEQ ID NO:35,α(miR-24-3p)-CBRluc:SEQ ID NO:36,α(miR-127b-3p)-CBRluc:SEQ ID NO:37,α(miR-16-5p)-CBRluc:SEQ ID NO:38,和α(miR-203a)-CBRluc:SEQ ID NO:39)响应的报告mRNA(荧光素酶)不起miRNA抑制剂的作用。
使用对所述miRNA响应的EGFP报告mRNA测定每一种miRNA的活性。此时，将miR-1(阴性对照)或对相同的miRNA响应的荧光素酶报告mRNA导入。从3次测试获得的结果显示于图7(b)中。
[实施例5：在三种类型的细胞系中的miRNA响应型报告mRNA的翻译效率]
将20种类型的miRNA响应型报告mRNA导入三种类型的细胞系的每一种，然后考察翻译效率比例。图8包括显示在所述三种类型的细胞系中这些20种类型的miRNA响应型报告mRNA的翻译效率的图。图8(a)显示在HeLa和293FT之间的比较，图8(b)显示了在293FT和MCF-7之间的比较，图8(c)显示了在MCF-7和HeLa之间的比较。误差棒分别指示平均值±标准偏差(n＝3)。使用从本发明的结果获得的翻译效率的数值，用该数值构建矢量。在这种情况下，计算在可能的坐标中的细胞之间的距离，选择在其它实施例中使用的miRNA响应型报告mRNA的组合。
[实施例6：使用两种类型的miRNA响应型报告mRNA进行一维分离]
基于两种类型的细胞系的荧光强度比例，以与实施例1相同的方法，使用两种类型的miRNA响应型报告mRNA进行细胞的一维分离。一系列结果显示于图9中。所述结果表明即使在两种类型的细胞系中，其中某种miRNA响应型报告mRNA的转录效率(即miRNA活性)是2-倍以下，293FT可与HeLa分离开，或者293FT可与MCF-7分离开。误差棒分别指示平均值±标准偏差(n＝3)。
为了考察在293FT细胞和HeLa细胞中的miR-24-3p和miR-17-5p的活性，测定翻译效率。采用α(miR-24-3p)-EGFP和α(miR-17-5p)-EGFP用于所述测定。结果显示于图9(a)中。在每一柱的顶部的数值指示翻译效率的比率。将α(miR-24-3p)-EGFP和α(miR-17-5p)-hmKO2(SEQ ID NO:12)共同导入293FT细胞、HeLa细胞及其混合物中，并在所述导入之后24小时，进行流式细胞术分析。使用EGFP和hmKO2作为对照mRNA。图9(b)显示了点绘图的结果。从所述图，发现293FT细胞与所述HeLa细胞可以作为不同的带状图区分开。而且，对于293FT和HeLa细胞的混合物，图9(g)显示了与上述相同的点绘图。从这些结果，可以发现即使测量的是这些细胞的混合物，也可以观察到两种类型细胞分离开。图9(c)显示了关于信号比率的柱状图。将如在每一柱状图中显示的一组miRNA响应型报告mRNA/对照mRNA共同导入每一种细胞系中。计算通过流式细胞仪测量的两种类型荧光信号的比率，然后绘图。导入两种类型miRNA响应型报告mRNA的细胞的累积频率显示在图9(c)的最低柱中。
同样地，为了考察在293FT细胞和MCF-7细胞中miR-17-5p和miR-127-3p的活性，测量翻译效率。采用α(miR-17-5p)-EGFP和α(miR-127-3p)-EGFP用于所述测定。结果显示于图9(d)中。在每一柱的顶部的数值指示翻译效率的比率。将α(miR-17-5p)-EGFP和α(miR-127-3p)-hmKO2共同导入293FT细胞、MCF-7细胞及其混合物中，并在所述导入之后24小时，进行流式细胞术分析。使用EGFP和hmKO2作为对照mRNA。图9(e)显示了点绘图的结果。发现由于不同的带状图，293FT细胞可以与所述MCF-7细胞区分开。而且，对于293FT和MCF-7细胞的混合物，图9(h)显示了与上述相同的点绘图。从这些结果，可以发现即使测量的是这些细胞的混合物，也可以观察到两种类型细胞分离开。图9(f)显示了关于信号比率的柱状图。将如在每一柱状图中显示的一组miRNA响应型报告mRNA/对照mRNA共同导入每一种细胞系中。计算通过流式细胞仪测量的两种类型荧光信号的比率，然后绘图。导入两种类型的miRNA响应型报告mRNA的细胞的累积频率显示在图9(f)的最低柱中。
[实施例7：三种类型的miRNA响应型报告mRNA的共同导入，其中报告荧光蛋白连接至核定位信号]
将表达核定位荧光蛋白的三种类型的miRNA响应型报告mRNA，即40ng的α(miR-24-3p)-hmAG1-M9(SEQ ID NO:25)、10ng的α(miR-127-3p)-hmKO2-M9(SEQ ID NO:26)和200ng的α(miR-17-5p)-tagBFP-M9(SEQ ID NO:27)，共同导入HeLa、293FT和MCF-7细胞中。在所述导入之后24小时，进行成像细胞计数分析。图10(a)显示了导入的细胞的荧光图像。在该图中，...指示100μm。分别用红色、绿色和蓝色通道指示hmKO2、hmAG1和tagBFP。从图10(a)，发现根据核的不同，在强度方面存在有变化。图10(b)显示了通过使与在图10(a)中相同的靶标的测定数据进行使用两种比率的伪彩色处理获得的结果。从涉及共同导入的细胞除去所述核，然后分析在每一像素中的荧光强度。通过hmKO2的荧光信号除以hmAG1的荧光信号获得的比率，以及通过tagBFP的荧光信号除以hmAG1的荧光信号获得的比率，被分别从10-0.25至100.75和10-0.5至100.5的范围归一化至0-1，然后分别用紫色和绿色指示所述比率。图10(c)显示这些比率的密度绘图。
[实施例8：使用三种类型的miRNA响应型报告mRNA、通过流式细胞术和成像细胞计数法进行二维分离]
将三种类型的对照mRNA(hmAG1,hmKO2和tagBFP)共同导入HeLa、293FT、MCF-7及其混合物中的每一种。此外，将三种类型的对照mRNA，其中报告荧光蛋白连接至核定位信号，即hmAG1-M9(SEQ ID NO:28)、hmKO2-M9(SEQ ID NO:29)和tagBFP-M9(SEQ ID NO:30)，共同导入HeLa、293FT、MCF-7及其混合物中的每一种。同样地，将三种类型的miRNA响应型报告mRNA(α(miR-24-3p)-hmAG1,α(miR-127-3p)-hmKO2和α(miR-92-3p)-tagBFP)共同导入HeLa、293FT、MCF-7及其混合物中的每一种。并且，将三种类型的miRNA响应型报告mRNA(其中报告荧光蛋白连接至核定位信号，即α(miR-24-3p)-hmAG1-M9、α(miR-127-3p)-hmKO2-M9和α(miR-92-3p)-tagBFP-M9)共同导入HeLa、293FT、MCF-7及其混合物中的每一种。在这些导入之后24小时，进行流式细胞术分析和成像细胞计数分析。从三个独立实验获得的代表性结果显示于图11中。
导入三种类型的对照mRNA的HeLa细胞、293FT细胞和MCF-7细胞及其混合物的流式细胞分析结果显示于图11(a)中，以及其成像细胞计数分析显示于图11(c)中。而且，共同导入三种类型的对照mRNA的其中报告荧光蛋白连接至核定位信号的HeLa细胞、293FT细胞和MCF-7细胞及其混合物的流式细胞分析结果显示于图11(e)中，并且其图像细胞计数结果显示于图11(g)中。从所有这些结果，发现细胞不能彼此分离开。
导入三种类型的对照mRNA的HeLa细胞、293FT细胞和MCF-7细胞及其混合物的流式细胞分析结果显示于图11(b)中，并且其成像细胞计数结果显示于图11(d)中。而且，共同导入三种类型的miRNA响应型报告mRNA的其中报告荧光蛋白连接至核定位信号的HeLa细胞、293FT细胞和MCF-7细胞及其混合物的流式细胞分析结果显示于图11(f)中，以及其成像细胞计数结果显示于图11(h)中。当三种类型的miRNA响应型报告mRNA被导入三种类型的细胞中时，通过流式细胞术或成像细胞计数法，所述细胞可彼此分离。由于即使在细胞的混合物中可观察到独立的图组，因此发现可将三种类型的细胞彼此分离。而且，即使在其中采用三种类型的miRNA响应型报告mRNA(其中报告荧光蛋白连接至核定位信号)的情况下，也可获得与上述相同的结果。
[实施例9：使用miRNA响应型报告mRNA对成纤维细胞系进行分离]
开展实验以区分不同来源的细胞系以及区分在同一细胞系的条件中的差异。在本文中，重点研究作为代表性正常人细胞的IMR-90细胞。已知在静息状态下的IMR-90通过接受TGF刺激往往会分化成平滑肌。选择已经证实在IMR-90中表达并且不包含CAU的67种类型的miRNA，然后产生表达作为报告蛋白的hmAG1的miRNA响应型报告mRNA的库(SEQ ID NO:77-143)。每一种mRNA，连同对照hmKO2mRNA，被导入IMR-90中，然后进行流式细胞术分析。
随后，进行第一次筛选，得到在IMR-90中活化的26种miRNA响应型mRNA。所述结果显示于图12A(a)中。在图12A(a)中，具有0.199以上的平均荧光比率(FL2/FL1)的mRNA被区分为具有活性(然而，在不对对照miRNA响应的mRNA的情况下，其为0.198)。从所述26种miRNA，忽略彼此具有高相似性的两种类型的mRNA，并且提取剩余的24种miRNA响应型mRNA。
进一步地，产生对与肌肉分化高度相关的两种miRNA响应的miRNA响应型报告mRNA(SEQ ID NO:144和145)。使上述提取的24种mRNA和未在上面部分观察到其活性的并对与TGF信号或肌肉分化相关的miRNA响应的6种mRNA与这两种mRNA聚集，并且使总共32种mRNA进行第二次筛选，用于筛选其活性在用TGF-β1刺激IMR-90之前和之后发生变化的miRNA。使IMR-90在饥饿状态保持2天，然后用10ng/mL的TGF-β1刺激。第二天，将mRNA导入所述细胞，且进一步地在导入后第一天，进行流式细胞术分析。通过探索总共32种类型的miRNA获得的结果显示于图12A(b)中。在图12A(b)中具有最高活性的miRNA响应型mRNA(α(miR-145-5p)-hmAG1)(SEQ ID NO:117)用于后续实验。
根据以下实施成像细胞计数法。具有或不具有TGF刺激的IMR-90同时用miRNA响应型mRNA(一对α(miR-145-5p)-hmAG1和hmKO2)和抗-αSMA抗体染色。
通过以下方法实施在mRNA导入之后IMR-90的分化诱导和免疫染色。在共同导入mRNA之后第一天，将培养基和与所述培养基等量的Cytofix固定缓冲液(BD Biosciences)添加至所述细胞，随后在37℃放置10分钟，使得所述细胞被固定。随后，用Pharmingen染色缓冲液(FBS,BD Biosciences)冲洗所述得到的细胞，然后在冰上的Phosflow Perm缓冲液III(BD Biosciences)中放置30分钟，使得进行对所述细胞膜的渗透处理。在冲洗之后，得到的细胞在冰上的封闭液(Blocking One)(Nakalai Tesque,Inc.)中静止30分钟。之后，用已用包含10％封闭液的Pharmingen染色缓冲液(FBS)稀释200倍的抗-αSMA抗体在室温下染色所述细胞，保持30分钟。在冲洗之后，得到的细胞用Hoechist 33342(LifeTechnologies)染色。由此染色的细胞使用IN Cell Analyzer 6000进行分析。
根据以下对细胞内因子实施流式细胞术。在完成分化诱导和导入mRNA之后，从培养板上剥离IMR-90。根据说明书手册，使用前述的Cytofix固定缓冲液和Phosflow Perm缓冲液III，使所述细胞固定，然后接受膜渗透处理。
在完成所述膜渗透处理之后，用封闭液封闭所述细胞，然后以与上述相同的方法，用稀释100-倍的抗-αSMA抗体在室温下染色30分钟。在完成染色之后，冲洗所述细胞，然后接受流式细胞术分析。
流式细胞术分析的结果以密度图的形式显示于图12A(c)中。从在图12A(c)中显示的结果，可以通过使用α(145-5p)-hmAG1，区分相同类型的细胞的分化条件中的差异。图12B(d)以柱状图的形式显示了与上面描述的那些相同的实验结果。在本文中，用实线和虚线显示通过导入一对对照mRNA获得的结果。在采用现有技术的抗体染色方法的情况下，细胞需要被固定，并且如在柱状图中显示的，分布的宽度是宽的，并且有许多重叠部分。另一方面，在采用本发明的所述方法的情况下，证明了可直接使用活细胞，因此，分布的宽度是窄的，并且可进行充分的测定。
使用核定位报告蛋白进行相似的实验，然后进行成像细胞计数分析。结果显示于图12C(f)中。在本文中，进行图像分析，然后计算每像素的荧光比率(hmKO2/hmAG1)，然后其在所述图中以绿色表示。来自所述抗体的荧光强度以品红色表示。与上述那些相同的实验结果以柱状图的形式显示于图12B(e)中。而且，在本文中，用实线和虚线显示通过导入一对对照mRNA获得的结果。
在图12B(e)和图12C(f)中显示的结果证明了当使用本发明的所述mRNA时，在存在有TGF-β1刺激的情况和不存在有这样的刺激的情况之间，核定位蛋白的定量比值是不同的。还发现了这些结果与显示于图12B(d)中的通过流式细胞术分析获得的结果高度匹配。
另外，改变miRNA响应型mRNA的报告蛋白的组合，使用一对α(miR-145-5p)-hmKO2和hmAG1进行与上述相同的分析。成像细胞计数分析的结果显示于图17(a)中，流式细胞术分析的结果显示于图17(b)中。因此，可确认的是通过添加TGF-β1，通过肌肉分化，提高了miR-145-5p在SMA-阳性细胞中的表达，这与在使用前述一对α(miR-145-5p)-hmAG1和hmKO2的情况一致，并且对应的报告蛋白的表达减少。
如上所述，已证实本发明能不依赖于报告蛋白的类型辨别活细胞。
[实施例10：使用miRNA响应型报告mRNA辨别原代培养的细胞群(NHLF)]
使用与上述相同的67种miRNA库，考察人正常肺成纤维细胞的原代培养细胞群(NHLF)的miRNA活性，而不是考察所述构建的细胞的miRNA活性。图13(a)显示了探索用于选择细胞(用于明确细胞的混合状态)的mRNA的策略。在第一次筛选中，检测miRNA的活性，从所述67种miRNA中选择8种miRNA。在第二次筛选中，将所述8种miRNA与报告蛋白组合，并探索56组报告mRNA。
使用与IMR-90相同的67种类型的miRNA响应型报告mRNA的库，调查在人正常肺成纤维细胞的原代培养细胞(NHLF)中的miRNA的活性。结果显示于图13A(b)中。在本文中，尤其是，分析了导入mRNA的细胞群所产生的荧光比率的峰宽度(90％区间)，并选择具有大的峰宽度的8种miRNA(即miR-16-5p,miR-17-5p,miR-21-5p,miR-27a-3p,miR-20a-5p,miR-106a-5p,miR-143-3p,和let-7i-5p)。
图14(a)和14(b)显示了通过对所述细胞系(IMR-90)和原代培养细胞(NHLF)之间的第一次筛选结果进行比较获得的结果。图14(a)和14(b)都显示了关于67种类型的miRNA响应型报告mRNA的结果。也就是说，图14(a)显示了荧光比率的比较，即峰位置de比较，而图14(b)显示了90％区间的比较，即，峰宽度的比较。在两个图中，从实施两次的筛选实验得到的平均值和标准偏差被表示为误差棒。从图14(a)和14(b)，证实了miRNA与构建的IMR-90的活性平均值相同，但是在所述细胞群中miRNA活性分布更宽，因此，其是较不均一群体。
图13(c)显示了用于第二次筛选的组合表格。数字1-8表示8种类型的miRNA，且在该实验中，数字1-8依次表示miR-16-5p,miR-17-5p,miR-21-5p,miR-27a-3p,miR-20a-5p,miR-106a-5p,miR-143-3p,和let-7i-5p。在该表格中，在每一方格中的行(h)、列(i)和两位数(j,k)分别表示hmAG1、hmKO2、tagBFP和hdKeimaRed对其响应的miRNA数量。根据该表格，发现关于任意两种miRNA的组合，可包括报告蛋白的所有组合。
随后，获得这些miRNA活性的相关性。关于每一种miRNA的组合，将一对miRNA响应型报告mRNA(SEQ ID NOS:114,81,115,102,80,111,83,116,和157至181)导入NHLF中，然后分析由所述细胞群产生的荧光比率的峰宽度(90％区间)。获得从以下6种类型的组合得到的数值的平均值。例如，在miR-143-3p和miR-21-5p的情况下，所述组合为如下：
(A)α(miR-143-3p)-hmAG1(SEQ ID NO:114)+α(miR-21-5p)-hmKO2(SEQ ID NO:159),
(B)α(miR-143-3p)-hmAG1+α(miR-21-5p)-tagBFP(SEQ ID NO:168),
(C)α(miR-143-3p)-hmAG1+α(miR-21-5p)-hdKeimaRed(SEQ ID NO:176),
(D)α(miR-21-5p)-hmAG1(SEQ ID NO:81)+α(miR-143-3p)-hmKO2(SEQ ID NO:163),
(E)α(miR-21-5p)-hmAG1+α(miR-143-3p)-tagBFP(SEQ ID NO:172),和
(F)α(miR-21-5p)-hmAG1+α(miR-143-3p)-hdKeimaRed(SEQ ID NO:180)。
该峰宽度显示于下表6中，其作为当对照mRNA已被导入细胞时通过相同分析获得的峰宽度的相对值。
[表6]
相对90％区间
从该表格，发现在靶细胞群中的miRNA之间可发现函数关系。例如，在具有大数值的miRNA(例如miR-143-3p和miR-21-5p)的函数之间存在负相关。也就是说，在该种情况下，在miR-143-3p的活性高的细胞中miR-21-5p的活性是低的，以及在miR-143-3p的活性低的细胞中miR-21-5p的活性是高的。另一方面，在具有小数值的miRNA的函数之间存在正相关。已证实，事实上，构成miR-17前体家族的miR-17、miR-20a和miR-106在活性方面显示高度正相关。
将使用图15描述阐明miRNA活性方面的关系的理由。图15是示意性显示当某一细胞组整合等量的mRNA并且在所述细胞组中存在有两种miRNA活性的分布时得到的假设结果的视图。图15(a)显示了当两种miRNA活性是彼此正相关时所述荧光比率的峰变窄。图15(b)显示当两种miRNA活性是彼此负相关时所述荧光比率的峰变宽。图15(c)显示当两种miRNA活性是彼此不相关时可形成中等宽度的峰。
图13(d)显示了使用响应三种miRNA的报告mRNA(α(miR-106a-5p)-hmAG1(SEQ IDNO:116),α(miR-21-5p)-hmKO2(SEQ ID NO:159),和α(miR-143-3p)-tagBFP)，在NHLF上进行分离分析所得到的结果，其中所述响应三种miRNA的报告mRNA在miRNA活性方面是彼此负相关的，或者是彼此不相关的。以所述荧光比率的密度分布的形式显示已导入所述mRNA的细胞群。
图13(e)显示了使用响应三种miRNA的报告mRNA(α(miR-20a-5p)-hmAG1(SEQ IDNO:111),α(miR-17-5p)-hmKO2(SEQ ID NO:12),和α(miR-106a-5p)-tagBFP(SEQ ID NO:171))，在NHLF上进行分离分析所得到的结果，其中所述响应三种miRNA的报告mRNA在miRNA活性方面是彼此正相关的。以所述荧光比率的密度分布的形式显示已导入所述mRNA的细胞群。
如在图13(d)和(e)中证明的，即使在其中所述靶标是同一细胞群的情况下，如果使用用于具有高度正相关的所述miRNA的mRNA组，则所述细胞被表示为非常均一的细胞群(f)。与此相反的是，如果使用另一miRNA组，观察到所述细胞的不均一性(e)。因此，根据区分期望的细胞的目的，可选择待使用的miRNA响应型mRNA。例如，在该种情况下，在其中NHLF被认为是期望的细胞且从其它细胞区分NHLF的情况下，通过使用用于具有高度正相关的miRNA的mRNA组，可使期望的细胞缩小至具有窄的宽度的细胞群(特异性细胞群)。当多种NHLF细胞被认为是包含期望的细胞的细胞群且从所述细胞群分离并分级所述期望的细胞时，通过使用用于具有高度负相关的miRNA的mRNA组，可从宽分布的细胞收集期望的部分。
[实施例11：使用miRNA响应型报告mRNA对IMR-90的细胞群进行测定]
对构建的成纤维细胞IMR-90实施与用于NHLF的相同的第二次筛选。在该实验中，数值1-8显示了在图13(C)中显示的miRNA，其依次表示miR-16-5p,miR-17-5p,miR-125b-5p,miR-93-5p,miR-20a-5p,miR-106a-5p,miR-145-5p,和miR-26a-5p。关于每一miRNA组合，将一对miRNA响应型报告mRNA(SEQ ID NO:117,100,125,80,157,166,174,83,167,158,175,111,161,170,178,110,116,162,171,179,和146至156)导入IMR-90，并分析由所述细胞群产生的荧光比率的峰宽度(90％区间)。在下表7中显示了该峰宽度，其作为当对照mRNA已被导入细胞时通过相同分析获得的峰宽度的相对值。
[表7]
相对90％区间
图16显示了通过基于所述第二次筛选的结果选择四种类型的miRNA响应型mRNA(α(miR-16-5p)-hmAG1(SEQ ID NO:80),α(miR-26a-5p)-hmKO2(SEQ ID NO:148),α(miR-17-5p)-tagBFP(SEQ ID NO:167),和α(miR-125b-5p)-hdKeimaRed(SEQ ID NO:153)，然后将所述四种类型的miRNA响应型mRNA共同导入IMR-90，由此获得以三维密度图的形式显示的结果。如在所述图中显示的箭头A和B所表示的，已发现所述IMR-90被分成两种细胞组。
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Claims (9)
1.一种利用作为指示剂的miRNA的表达从包含两种以上类型细胞的细胞组区分期望的细胞类型的方法，其中所述方法包括以下步骤：
(1)将包含标记基因的mRNA导入细胞组的步骤，所述标记基因可操作地连接至用作为指示剂的miRNA的靶序列；以及
(2)利用作为指示剂的所述标记基因的翻译水平区分细胞类型的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤(1)是将用作为指示剂的miRNA的所述靶序列和包含不同标记基因的两种以上mRNA同时导入细胞的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述期望的细胞类型是其中用作为指示剂的miRNA表达水平低的细胞类型，以及所述步骤(2)是区分其中所述标记基因的翻译水平高的细胞类型的步骤。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述期望的细胞类型是其中用作为指示剂的miRNA表达水平高的细胞类型，以及所述步骤(2)是区分其中所述标记基因的翻译水平低的细胞类型的步骤。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述miRNA的所述靶序列连接至所述标记基因的5'-末端。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中使用流式细胞仪实施测定。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中使用图像分析仪实施测定。
8.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其还包含在所述步骤(1)之前筛选用作为指示剂的miRNA的步骤。
9.用于区分细胞的试剂盒，其包括包含标记基因的mRNA，所述标记基因可操作地连接至用作为指示剂的miRNA的所述靶序列。
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