WO2018003779A1 - ｍｉＲＮＡの発現に応答して蛋白質遺伝子を発現させる方法 - Google Patents

ｍｉＲＮＡの発現に応答して蛋白質遺伝子を発現させる方法 Download PDF

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mrna
cell
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博英 齊藤
祥彦 藤田
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国立大学法人京都大学
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids

Definitions

  • the present invention relates to a method for expressing a protein gene in response to miRNA expression.
  • miRNA controls and regulates gene expression by regulating the degradation of the corresponding mRNA.
  • the type is considered to be over 1800 in humans.
  • the expression level of miRNA varies from cell to cell, and it has been shown that it can be a parameter characterizing the cell type and cell state. Therefore, a switch that can detect the activity of miRNA in cells and turn on / off the expression of any gene accordingly becomes an intelligent gene expression system that responds to cell types and intracellular environment.
  • the miRNA-responsive OFF switch which is a switch that suppresses gene expression in response to miRNA, has been reported on a plasmid basis (for example, Non-Patent Document 1).
  • the present inventors have reported an expression system that depends on the activity of miRNA in cells by directly introducing an OFF switch composed of miRNA-responsive mRNA into cells, and succeeded in sorting cell types. (For example, Patent Document 1 and Non-Patent Document 2).
  • the special point of the OFF switch composed of miRNA-responsive mRNA is that, in principle, insertion into the genome does not occur. For this reason, it is thought that the said mRNA can be inject
  • mRNA-based switches are very useful, there is currently no switch that turns on gene expression in response to miRNA. Therefore, for example, an apoptotic gene cannot be expressed by targeting miRNA that is specifically activated by cancer cells, and cannot be killed specifically by cancer cells.
  • Presence of a specific miRNA by forming a circuit with an OFF switch consisting of a protein-responsive mRNA that responds to a specific protein (for example, L7Ae) and another OFF switch consisting of a miRNA-responsive mRNA that outputs that protein It is possible to create a pseudo ON switch that sometimes suppresses the expression of L7Ae and finally turns on the translation that was suppressed by L7Ae.
  • L7Ae protein-responsive mRNA that responds to a specific protein
  • another OFF switch consisting of a miRNA-responsive mRNA that outputs that protein
  • the inventors of the present invention designed an artificial mRNA in which the structure of the 3 ′ end of mRNA is modified, thereby completing an ON switch that turns on protein expression in response to miRNA, thereby completing the present invention. It was.
  • the present invention has the following features: [1] An artificial mRNA comprising a sequence encoding a protein gene, a miRNA target sequence linked to the 3 ′ side of the PolyA sequence, and a translational repressing sequence linked to the 3 ′ side of the miRNA target sequence.
  • the translation suppressing sequence is (I) 20 or more base sequences that specifically recognize the PolyA sequence,
  • the artificial mRNA according to [1] comprising (ii) a sequence specifically recognizing 5 ′ UTR, and (iii) a sequence selected from sequences of 100 bases or more.
  • a method for expressing a protein gene in response to miRNA expression the method comprising introducing the artificial mRNA according to [1] or [2] into a cell.
  • a method for discriminating a desired cell type from a group of cells containing two or more types of cells, using miRNA expression as an index including the following steps; (1) A sequence encoding the first marker gene, a target sequence of the first miRNA linked to the 3 ′ side of the PolyA sequence, and a translational suppression sequence linked to the 3 ′ side of the target sequence of the first miRNA And (2) a step of discriminating a cell type using the translation amount of the first marker gene as an index.
  • the translation suppressing sequence is (I) 20 or more base sequences that specifically recognize the PolyA sequence, The method according to [4], comprising (ii) a sequence specifically recognizing 5 ′ UTR, and (iii) a sequence selected from sequences of 100 bases or more.
  • the desired cell type is a cell type with a high expression level of the first miRNA
  • the step (2) is a step of discriminating a cell type with a high translation amount of the first marker gene.
  • the target sequence of the first miRNA includes a target sequence of miR-302a
  • the desired cell type is a pluripotent stem cell, any one of [4] to [6] the method of.
  • the target sequence of the second miRNA is a sequence specifically recognized by the same miRNA as the target sequence of the first miRNA;
  • the second marker gene is different from the first marker gene,
  • the method, wherein the second artificial mRNA is an artificial mRNA that reduces the translation amount of the second marker gene in response to the expression level of the miRNA.
  • a gene can be forcibly expressed in a cell having a high specific miRNA activity, and the gene can be expressed in a cell-specific manner.
  • an existing miRNA-responsive OFF switch is used, and if it is high, the ON switch of the present invention is used. Can be expressed.
  • the existing OFF switch and the current ON switch it is possible to provide a general-purpose method capable of controlling any gene in any direction (forced expression, suppression) with respect to any miRNA. Specific applications of this include cell separation, induction of differentiation of specific cells only, and removal of cancer cells by controlling cell death. As miRNA OFF switches do not insert into the genome, Is also considered applicable to medical treatment.
  • FIG. 1 is a diagram schematically showing the structure of mRNA that expresses a protein gene in response to miRNA expression according to the present invention.
  • FIG. 2 is a graph showing changes in the expression level of EGFP by polyU ligated downstream of polyA ⁇ with a complementary sequence (Tg21) mi or shuffled sequence (N) of miR-21, and the left column for each sequence is HeLa The right column is the result when 293FT is introduced into the cells.
  • FIG. 3 shows changes in the expression level of EGFP due to the difference in the sequence connected to the downstream of polyA in the complementary sequence (Tg21) mi or shuffled sequence (N) of miR-21, and red is the OFF switch created in the past , Green shows only EGFP-expressing mRNA, light blue shows shuffle sequence, and blue shows mRNA containing Tg21 sequence.
  • Panels (a) are 5 'UTR complementary sequences of 20 nt
  • (b) are 5' UTR complementary sequences of 40 nt
  • (c) are 20 nt + stem loop
  • (d) is about 120 nt added.
  • E) is an additional sequence of about 500 nt
  • (f) is an additional sequence of about 1250 nt.
  • FIG. 4 is a graph showing the change in the expression level of EGFP with respect to miRNA21 mimicin or inhibitor, where (a) shows miRNA21 target when miRNA21 inhibitor is added (+) and not ( ⁇ ) in Hela cells. (B) shows the expression level of EGFP of mRNA having miRNA21 target sequence when miRNA21 mimic is added (+) or not ( ⁇ ) in 293FT cells. Show.
  • FIG. 5 is a graph showing the improvement of fold change by the combination of ON switch and OFF switch, and shows the fluorescence ratio when mRNA having various miRNA21 target sequences is introduced into HeLa cells or 293F cells.
  • FIG. 6 is a diagram showing the identification result of iPS sputum cells by an ON switch having a miR-302a-5p target sequence, and (a) is an OFF switch having a miR-302a-5p target sequence and no target sequence.
  • (B) shows an OFF switch having a miR-302a-5p target sequence and an ON switch having a miR-302a-5p target sequence when HeLa cells and 293F cells are co-introduced into HeLa cells and 293F cells. The fluorescence ratio when co-introduced into 293F cells is shown, and (c) shows the result of calculating the fold change based on the median value of EGFP / iRFP670 in the part surrounded by the squares in (a) and (b). It is a graph.
  • the present invention provides a method for expressing a protein gene in response to miRNA expression, comprising a sequence encoding a protein gene and a target of the miRNA linked to the 3 ′ side of the PolyA sequence.
  • the present invention relates to a method comprising a step of introducing an artificial mRNA comprising a sequence and a translational repression sequence linked to the 3 ′ side of the target sequence of the miRNA into a cell.
  • an arbitrary protein is expressed in response to the expression of an arbitrary miRNA.
  • the artificial mRNA may be referred to as miRNA-responsive mRNA or miRNA-responsive ON-switch mRNA.
  • miRNA is also referred to as micro-RNA, and is RNA having a length of 18 to 25 bases existing in cells.
  • miRNA is one of the double-stranded RNAs produced by cleaving pre-miRNA, which is produced by partial cleavage of pri-mRNA, a single-stranded RNA transcribed from DNA, with a nuclear enzyme called Drosha. Means one strand of The number of bases of miRNA is, for example, 18 to 25, preferably 20 to 25, and more preferably 21 to 23.
  • a database storing about 1,000 miRNA information can be used (for example, miRBase, http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml).
  • miRNA expression means that in a cell into which mRNA according to the present invention is introduced, any one strand of the double-stranded RNA cleaved by the Dicer interacts with a predetermined plurality of proteins, and RNA- miRNA in the state of induced silencing complex (RISK) formation.
  • RISK state of induced silencing complex
  • the protein gene encoded by the mRNA can be forcibly expressed in a cell-specific manner.
  • the miRNA specifically expressed in a certain cell is known from the above-mentioned database and literature, and its elucidation is still ongoing. Therefore, when designing the above mRNA, it is preferable to extract and select miRNAs that are specifically expressed in cells in which it is desired to express the protein gene.
  • the cell in the present embodiment is any cell that desires to express a protein gene, and is not particularly limited.
  • pluripotent stem cells including induced pluripotent stem (iPS) cells, somatic cells differentiated from pluripotent stem cells, cells in the process of differentiation induction from pluripotent stem cells, or cancer cells
  • iPS induced pluripotent stem
  • cancer cells For example, but not limited to.
  • an mRNA that responds to miRNA specifically expressed in the pluripotent stem cell can be designed.
  • the miRNA specifically expressed in the pluripotent stem cell is not particularly limited as long as it is known to be specifically expressed in the pluripotent stem cell according to the literature, but for example, hsa-mir -302a, hsa-mir-302b, hsa-mir-302c, hsa-mir-302d, hsa-mir-367, hsa-5201, hsa-mir-92b, hsa-mir-106a, hsa-mir-18b, hsa -mir-20b, hsa-mir-19b-2, hsa-mir-92a-2, hsa-mir-363, hsa-mir-20a, hsa-mir-17, hsa-mir-18a, hsa-mir-19a , H
  • miRNA appropriately selected from miRNAs described in TobiasbiaS. Greve, veet al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2013.29: 213-239 are exemplified.
  • a preferred miRNA is either strand of has-mir-302a or hsa-mir-302b, more preferably hsa-miR-302b-3p.
  • the target sequence of miRNA that is specifically expressed in cells refers to a sequence that can specifically bind to the miRNA.
  • the miRNA target sequence is preferably a sequence complementary to, for example, miRNA that is specifically expressed in cells.
  • the miRNA target sequence may have a mismatch (mismatch) with a completely complementary sequence as long as it can be recognized in the miRNA.
  • the mismatch from the sequence that is completely complementary to the miRNA may be any mismatch that can be normally recognized by the miRNA in the desired cell, and the mismatch of about 40 to 50% in the original function in the cell in vivo. There is no problem.
  • mismatch is not particularly limited, but 1 base, 2 bases, 3 bases, 4 bases, 5 bases, 6 bases, 7 bases, 8 bases, 9 bases, or 10 bases or 1% of the total recognition sequence, 5% %, 10%, 20%, 30%, or 40% discrepancy.
  • the portion other than the seed region that is, the 5 ′ side in the target sequence corresponding to about 3 side of the 3 ′ side of the miRNA.
  • a region may contain a number of mismatches, and portions of the seed region may contain no mismatches, or may contain 1 base, 2 bases, or 3 bases mismatches.
  • the protein gene encoded by mRNA may be any protein gene, and the type thereof is not limited.
  • it may be a marker protein gene described in detail below, or may be an apoptosis-promoting protein gene, an apoptosis-inhibiting protein gene, or a cell surface protein gene.
  • the marker gene is an RNA sequence that is translated in a cell, functions as a marker, and encodes an arbitrary marker protein that enables extraction of differentiated cells, and can also be referred to as a sequence corresponding to the marker protein.
  • proteins that can be translated into cells and function as markers include, for example, proteins that can be visualized and quantified by assisting fluorescence, luminescence, coloration, or fluorescence, issuance, or coloration. It may be a membrane localized protein, a drug resistant protein, etc., but is not limited thereto.
  • fluorescent proteins blue fluorescent proteins such as Sirius and EBFP; cyan fluorescent proteins such as mTurquoise, TagCFP, AmCyan, mTFP1, MidoriishiCyan, and CFP; TurboGFP, AcGFP, TagGFP, Azami-Green (for example, hmAG1), ZsGreen, EmGFP, Green fluorescent proteins such as EGFP, GFP2, and HyPer; Yellow fluorescent proteins such as TagYFP, EYFP, Venus, YFP, PhiYFP, PhiYFP-m, TurboYFP, ZsYellow, and mBanana; Orange fluorescence such as KusabiraOrange (eg, hmKO2) Protein; Red fluorescent protein such as TurboRFP, DsRed-Express, DsRed2, TagRFP, DsRed-Monomer, AsRed2, mStrawberry, etc .; Although near infrared fluorescent proteins, such as these, are mentioned, It is not limited to these.
  • a photoprotein is aequorin, but is not limited thereto.
  • proteins that assist fluorescence, luminescence, or coloration include, but are not limited to, enzymes that decompose fluorescence, luminescence, or color precursors such as luciferase, phosphatase, peroxidase, and ⁇ -lactamase.
  • enzymes that decompose fluorescence, luminescence, or color precursors such as luciferase, phosphatase, peroxidase, and ⁇ -lactamase.
  • the corresponding precursor is brought into contact with the cell, or the corresponding precursor is introduced into the cell. Can be done by doing.
  • the membrane-localized protein is not particularly limited as long as it is a membrane-localized protein that is not endogenously expressed in pluripotent stem cells.
  • P-gp, MRP1, MRP2 (cMOAT), MRP3, MRP4, MRP5, MRP6, MDR2, and MDR3 proteins can be exemplified.
  • a membrane-localized protein translated from the introduced mRNA serves as an index, and therefore a membrane-localized protein that is not endogenously expressed in the target differentiated cell is more preferable.
  • drug resistant proteins examples include antibiotic resistance such as kanamycin resistance protein, ampicillin resistance protein, puromycin resistance protein, blasticidin resistance protein, gentamicin resistance protein, kanamycin resistance protein, tetracycline resistance protein, chloramphenicol resistance protein, etc. Although protein can be illustrated, it is not limited to these.
  • apoptosis-promoting protein genes include Bim-EL, Bax, FADD, and Caspase.
  • Specific examples of the apoptosis inhibitor protein gene include Bcl-xL and Bcl-2.
  • Specific examples of cell surface protein genes include biotin-added peptides to which IgG leader sequence and PDGFR transmembrane domain are added.
  • the protein gene encoded by mRNA is not limited to these.
  • the mRNA preferably comprises a Cap structure (7-methylguanosine 5 ′ phosphate), an open reading frame encoding a desired protein gene, and a Poly A sequence in the 5 ′ to 3 ′ direction from the 5 ′ end, It comprises a miRNA target sequence linked to the 3 ′ side of the Poly A sequence and a translational repression sequence linked to the 3 ′ side of the miRNA target sequence.
  • the 5′UTR structure is not particularly limited in terms of the number of bases and the sequence as long as it has a Cap structure at the 5 ′ end and does not have a miRNA target sequence.
  • the structure of 5'UTR is 20 bases or more, and is composed of, for example, 40 to 150 bases, preferably about 40 to 100 bases. It is difficult to form an RNA structure such as Stem-loop and includes an initiation codon. But not limited to a specific sequence.
  • the polyA sequence has no particular upper limit, but may be a sequence consisting of A of 50 to 300 bases, preferably 100 to 150 bases, for example.
  • the number of miRNA target sequences linked to the 3 ′ side of the Poly A sequence is preferably one. This is because if the sequence remains on the 3 ′ side of Poly A after cleavage of the target sequence by miRNA, it will be difficult to recognize as Poly A, and gene expression may not start (expression suppression cannot be released). However, a plurality of miRNA target sequences may be provided if expression suppression can be released after cleavage of the target sequence by miRNA. “The miRNA target sequence linked to the 3 ′ side of the Poly A sequence” may be a poly A sequence and the miRNA target sequence directly linked, and a sequence that does not affect the function between these, for example, It means that a sequence of about 1 to 5 bases may be provided.
  • a translational repressing sequence is linked to the 3 ′ side of the miRNA target sequence.
  • “Translation repressing sequence linked to the 3 ′ side of the miRNA target sequence” means not only when the miRNA target sequence and the translation repressing sequence are directly linked, but also other sequences between them. It means good. For example, an adapter sequence of 20 to 100 bases may be included between the miRNA target sequence and the translation inhibitory sequence.
  • the 3 ′ side of the miRNA target sequence means the 3 ′ end side of the miRNA target sequence located on the most 3 ′ side.
  • the translation inhibitory sequence may be a sequence capable of preventing the action involved in the translation of the Poly A sequence, and preferably (i) 20 or more base sequences that specifically recognize the PolyA sequence, (ii) 5 'Includes a sequence that specifically recognizes UTR, and (iii) a base sequence selected from a sequence of 100 bases or more.
  • Examples of the 20 or more base sequences that specifically recognize the PolyA sequence include PolyU sequences that are completely complementary to the PolyA sequence. For example, from 20 or more, 40 or more, 60 or more, or 80 or more uridines PolyU sequences are, but not limited to: A mismatch may exist as long as the PolyA sequence can be specifically recognized. Moreover, as long as it contains 20 or more base sequences that specifically recognize the PolyA sequence, it may further contain an arbitrary sequence on its 3 ′ side and / or 5 ′ side. As long as the PolyA sequence can be specifically recognized and the translation can be suppressed, the sequence may be 5 or more, 10 or more, or 15 or more bases, not necessarily 20 or more.
  • the sequence that specifically recognizes 5′UTR is preferably a sequence that is completely complementary to 5′UTR. However, as long as 5′UTR can be specifically recognized, it may have a mismatch (mismatch) with a completely complementary sequence. Further, if it contains a sequence that specifically recognizes 5′UTR, it may further contain an arbitrary sequence on its 3 ′ side and / or 5 ′ side.
  • the sequence of 100 bases or more may be a long sequence capable of suppressing translation regardless of the type of base and the base sequence. It may be 100 bases or more, preferably 300 bases or more, 500 bases or more, 1000 bases or more, 1500 bases or more.
  • the base constituting the miRNA-responsive mRNA preferably contains a modified base such as pseudouridine or 5-methylcytidine instead of ordinary uridine and cytidine. This is to reduce cytotoxicity.
  • the positions of the modified bases can be all or part of the uridine and cytidine independently, and if they are part of the base, they can be random positions at an arbitrary ratio.
  • MiRNA-responsive mRNA having such structural features can conceal the polyA sequence from the intracellular translation system and inhibit translation.
  • the miRNA-responsive mRNA can be synthesized by those skilled in the art by any method known in genetic engineering if the sequence is determined according to the above. In particular, it can be obtained by an in vitro synthesis method using a template DNA containing a promoter sequence as a template. It is one advantage of the present invention that mRNA as designed can be obtained by a simple method.
  • the miRNA-responsive mRNA to be introduced into the cell may be only one type, and two or more types, for example, 3, 4, 5, 6, 7 types. Alternatively, eight or more kinds may be used.
  • the number of types of miRNA-responsive mRNA to be introduced and the design of each structure can be appropriately designed by those skilled in the art according to the purpose of expressing the protein gene in a predetermined cell. For example, a plurality of miRNA-responsive mRNAs having different miRNA target sites and the same protein gene can be designed. Alternatively, a plurality of miRNA-responsive mRNAs having different miRNA target sites and different protein genes can be designed.
  • the translation inhibitory sequences may be the same or different as long as each miRNA-responsive mRNA has a necessary degree of translation inhibitory function.
  • the process of introducing miRNA-responsive mRNA into a cell is one or more miRNA responses using the lipofection method, liposome method, electroporation method, calcium phosphate coprecipitation method, DEAE dextran method, microinjection method, gene gun method, etc.
  • Sex mRNA is introduced directly into the cell population.
  • miRNA-responsive mRNA can also be introduced in the form of DNA such as a vector, and in this case, the same method as described above can be used.
  • a plurality of mRNAs can be co-introduced into the cell or can be introduced separately.
  • the introduction amount at this time varies depending on the type of cells to be introduced, the mRNA to be introduced, the introduction method and the introduction reagent, and those skilled in the art can appropriately select these in order to obtain a desired translation amount.
  • miRNA-responsive mRNA The action when miRNA-responsive mRNA is introduced into cells will be described.
  • miRNA-responsive mRNA When miRNA-responsive mRNA is introduced into one cell and miRNA that specifically binds to the miRNA target site exists in the cell, miRNA binds to the miRNA-responsive mRNA, and the PolyA sequence, miRNA target site and MRNA is cleaved between.
  • miRNA-responsive mRNA that has been temporarily inactivated and translation-suppressed becomes translatable, and expression of the protein gene is initiated and promoted.
  • the protein is a quantifiable marker protein, it can be clearly confirmed that the expression level of the protein shows a correlation with intracellular miRNA. Further, depending on the characteristics of the expressed protein, it may cause cell death or exert a predetermined function on the cell.
  • miRNA-responsive mRNA in which a plurality of miRNA target sites that bind to different miRNAs are provided in one mRNA is introduced into the cell, even if one type of miRNA binds to any of the plurality of miRNA target sites. If it is expressed within, the translation-suppressed state can be canceled to make it translatable.
  • the miRNA-responsive mRNA remains in a state where translation is suppressed without being affected. Therefore, the protein encoded by the miRNA-responsive mRNA is not expressed, and substantially no action occurs, and the miRNA-responsive mRNA is degraded.
  • miRNA-responsive mRNA when miRNA-responsive mRNA is introduced into a cell population in which cells with different characteristics coexist, the same action as described above causes the protein to be expressed only in cells that contain miRNA that specifically binds to the miRNA target site. To express. Therefore, it becomes possible to discriminate, isolate, and characterize cells that express a given miRNA based on the expression of the protein. Discrimination of cells using such miRNA-responsive mRNA will be described in the second embodiment.
  • the present invention relates to a method for discriminating a desired cell type from a group of cells including two or more types of cells, using miRNA expression as an index, including the following steps. (1) A sequence encoding the first marker gene, a target sequence of the first miRNA linked to the 3 ′ side of the PolyA sequence, and a translational suppression sequence linked to the 3 ′ side of the target sequence of the first miRNA And (2) a step of discriminating a cell type using the translation amount of the first marker gene as an index.
  • the target cell group is a cell group including two or more types of cells, and may be a cell group collected from a multicellular species, and the isolated cells are cultured.
  • the cell group obtained by this may be sufficient.
  • the cell group is particularly a cell group containing two or more types of somatic cells collected from mammals (eg, humans, mice, monkeys, pigs, rats, etc.), or cells or mammalian cells isolated from mammals A cell group obtained by culturing a strain.
  • somatic cells include keratinized epithelial cells (eg, keratinized epidermal cells), mucosal epithelial cells (eg, epithelial cells of the tongue surface), exocrine glandular epithelial cells (eg, mammary cells), hormone-secreting cells (eg, , Adrenal medullary cells), metabolism / storage cells (eg, hepatocytes), luminal epithelial cells that make up the interface (eg, type I alveolar cells), luminal epithelial cells of the inner chain (eg, blood vessels) Endothelial cells), ciliated cells with transport ability (eg, airway epithelial cells), cells for extracellular matrix secretion (eg, fibroblasts), contractile cells (eg, smooth muscle cells), blood and immune system Cells (eg, T lymphocytes), sensory cells (eg, sputum cells), autonomic nervous system neurons (eg, cholinergic neurons), sensory organs and peripheral neuron support cells
  • undifferentiated progenitor cells including somatic stem cells
  • terminally differentiated mature cells It can be used as the source of somatic cells in the invention.
  • undifferentiated progenitor cells include tissue stem cells (somatic stem cells) such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • tissue stem cells such as neural stem cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, and dental pulp stem cells.
  • the mammal individual from which somatic cells are collected is not particularly limited, but is preferably a human.
  • a preferable cell group is a cell group that has been subjected to artificial manipulation after collecting somatic cells, and is a cell group that may contain undesired cells.
  • a cell group comprising iPS cells prepared from the somatic cells, or a cell group obtained after differentiating pluripotent stem cells exemplified by ES sputum cells and iPS cells, and the desired cells It is a cell group which can contain the differentiated cell besides.
  • the cell group to be discriminated is in a living state.
  • the cell being in a viable state means a cell in a state where metabolic capacity is maintained.
  • the present invention can be used for the subsequent use while the cells are subjected to the method of the present invention and remain in a viable state, particularly while maintaining their division ability, without losing their natural characteristics even after completion of the discrimination method. This is advantageous.
  • the “desired cell type” is a group of cells classified as other cell types using miRNA expression as an index. In particular, it refers to a group of cells with common characteristics for miRNA activity, which will be described in detail later.
  • a group of cells classified as other cell types using such miRNA as an index is also referred to as “same type of cells”.
  • the desired cell type discriminated by the method of the present invention may be one or more, for example, three, four, five, six, seven, or eight or more. Also good.
  • the cell types that can be discriminated are not limited. According to the present invention, 100 or more cell types can be discriminated simultaneously.
  • “discriminating a desired cell type” means that a desired specific one or more cell types can be detected differently from other cell types from a group of cells including two or more types of cells.
  • the visually recognizable information is not limited to emitting a signal that can be directly recognized by the cell, but visually recognizes the signal emitted by the cell by a numerical value, a chart, an image, or the like. Information that has been converted into possible information and that can be visually recognized by those skilled in the art.
  • the term “discriminate” includes the recognition of a desired cell type, the identification of the desired cell type, the identification of the desired cell type, the classification of the desired cell type, and the desired cell type. Isolated cell types, removing unwanted cell types, determining the viability of the desired cell type, detecting or quantifying specific biological signals of the desired cell type, It may include fractionation based on a physical or chemical signal.
  • One aspect of discriminating a desired cell type in the present invention is that a cell group that is unknown to contain two or more types of cells is discriminated as a different cell type by using the method of the present invention. Eggplant.
  • the first artificial mRNA used in step (1) according to this embodiment is the miRNA-responsive ON-switch mRNA described in the first embodiment, and the protein is a miRNA-responsive ON-switch mRNA whose marker protein is the protein. is there.
  • any mRNA that functions so that a protein gene is forcibly expressed in response to miRNA is referred to as a first artificial mRNA.
  • the first artificial mRNA it is possible to extract a miRNA specifically expressed in a target cell that is desired to be expressed and discriminate a marker gene, and to select a miRNA target site suitable for this.
  • a marker gene suitable for a desired discrimination mode can be selected.
  • the type of marker gene can be selected from those described in detail in the first embodiment.
  • Preferred marker genes include fluorescent protein genes that can be quantitatively distinguished, but are not limited to specific marker genes.
  • only one type of first artificial mRNA can be used, or two or more types of first artificial mRNA can be used. In the latter case, the plurality of first artificial mRNAs may be different in both the miRNA target site and the marker protein, or in some cases, either one may be the same.
  • the first artificial mRNA can be appropriately designed by those skilled in the art depending on the mode of discrimination.
  • the first artificial mRNA designed and prepared by a genetic engineering technique can be introduced into a cell group by the method described in the first embodiment.
  • the first artificial mRNA and a reference mRNA (hereinafter also referred to as a reference mRNA) can be introduced into the cell group.
  • the reference mRNA is an mRNA that can be used to increase the resolution (fold ⁇ ⁇ change) in the discrimination method of the present embodiment, and is specific to miRNA expression or non-specifically. It is mRNA that behaves differently from switch mRNA.
  • the reference mRNA may be, for example, a second artificial mRNA containing a second marker gene operably linked to the target sequence of the second miRNA.
  • the second artificial mRNA is an artificial mRNA that reduces the translation amount of the second marker gene in response to the expression level of the miRNA, and is miRNA-responsive OFF-switch mRNA disclosed in Patent Document 1 or the like. It is.
  • the target sequence of the second miRNA is a sequence that is specifically recognized by the same miRNA as the target sequence of the first miRNA. Therefore, the target sequence of the first miRNA and the target sequence of the second miRNA are not necessarily the same sequence, but can respond to the same miRNA.
  • the second marker gene is different from the first marker gene, and signals expressed by these marker genes can be separated and identified.
  • the reference mRNA may be the third artificial mRNA that does not include the target sequence of miRNA but includes the third marker gene.
  • the third artificial mRNA is an artificial mRNA that translates the third marker gene without being affected by the expression level of miRNA, and is a control mRNA disclosed in Patent Document 1 and the like.
  • the third marker gene is different from the first marker gene.
  • the third marker gene is also different from the second marker gene.
  • the discriminating method according to the present embodiment can be performed using only the first artificial mRNA, or the first and second artificial mRNAs can be used in combination. All of the first, second and third artificial mRNAs can also be used. Furthermore, a plurality of types of the first, second, and third artificial mRNAs can be used.
  • step (1) when two or more types of first artificial mRNA are used and / or when the first artificial mRNA and reference mRNA are used, it is preferable to co-introduce a plurality of mRNAs into a cell group. . This is because the activity ratio of marker proteins expressed from two or more co-introduced mRNAs is constant within the cell population.
  • the introduction amount at this time varies depending on the cell group to be introduced, the mRNA to be introduced, the introduction method and the kind of the introduction reagent, and those skilled in the art can appropriately select these in order to obtain a desired translation amount.
  • the amount of reference mRNA introduced can also be appropriately selected by those skilled in the art in order to obtain a desired translation amount.
  • the first artificial mRNA When the first artificial mRNA is introduced into the cell, translation of the marker gene encoded by the first artificial mRNA is started in the cell when a predetermined miRNA exists as RISK in the cell.
  • the translation amount is quantitatively controlled according to the miRNA activity.
  • the predetermined miRNA does not exist in the cell, or when the predetermined miRNA does not exist as RISK, the marker gene encoded by the first artificial mRNA is not translated. Therefore, the translation amount of the marker gene differs between a cell in which a predetermined miRNA is present as RISK and a cell in which it does not exist.
  • the case where a predetermined miRNA is present as RISK is also referred to as “when miRNA activity is present”.
  • the third artificial mRNA expresses a marker protein regardless of the miRNA activity. Even if BR> ⁇ B is introduced, the MIRNA target sequence does not exist, so translation is controlled according to the expression level of MIRNA. This is because there is nothing to do. Furthermore, the second artificial MRNA, that is, the MIRNA-responsive OFF-SWITCH MRNA, suppresses translation of the marker gene when a predetermined MIRNA is present as RISK in the cell.
  • step (2) a step of discriminating cells is performed using the translation amount of the marker gene as an index.
  • cells are discriminated from the translation amount of the marker gene as described above. That is, the step of discriminating a cell in which the desired cell type is a cell with a low expression level of miRNA serving as an indicator and the translation amount of the marker gene is low, and / or the desired cell type is a miRNA of the indicator miRNA
  • This can be a step of discriminating cells that have a high expression level and a high translation level of the marker gene.
  • Cells with a low or high expression level of miRNA serving as an indicator can be determined by obtaining the ratio of the translation amount of the marker gene between cells belonging to a cell group containing two or more types of cells. .
  • the discrimination step can be performed by detecting a signal from the marker protein using a predetermined detection device.
  • the detection device include, but are not limited to, a flow cytometer, an imaging cytometer, a fluorescence microscope, a light emission microscope, and a CCD camera.
  • a detection apparatus those suitable for those skilled in the art can be used depending on the marker protein and the mode of discrimination.
  • the marker protein when the marker protein is a fluorescent protein or a luminescent protein, the marker protein can be quantified using a detection device such as a flow cytometer, an imaging cytometer, a fluorescence microscope, or a CCD camera.
  • a marker protein quantification method using a detection device such as a luminescence microscope, a CCD camera, or a luminometer is possible.
  • a detection device such as a luminescence microscope, a CCD camera, or a luminometer
  • the marker protein is a membrane-localized protein
  • cell surface protein-specific detection reagents such as antibodies and marker protein quantification methods using the above detection devices
  • cells that have not undergone the marker protein quantification process such as magnetic cell separator (MACS) Isolation method is possible, and when the marker protein is a drug resistance gene, the expression of the marker gene is detected by drug administration.
  • MCS magnetic cell separator
  • Flow cytometry can provide the intensity of light emitted from fluorescent proteins and luminescent enzymes, which are marker proteins translated in individual cells, as discrimination information.
  • the first artificial mRNA can be designed to have, for example, a miRNA target sequence that is expressed specifically in a pluripotent stem cell.
  • the first artificial mRNA is introduced into the cell population, in the pluripotent stem cells, the translation inhibitory sequence is cleaved by the expression of the miRNA. Then, the first marker gene is expressed and can be discriminated.
  • pluripotent stem cells since miRNA specifically expressed in pluripotent stem cells does not exist as RISK, the translational repressing sequence is not cut off and translation of the first marker gene does not occur. That is, translation of the marker gene is performed only in pluripotent stem cells. Therefore, in one embodiment of the present invention, by extracting cells in which the marker gene is translated, only pluripotent stem cells are selectively selected from a cell population in which undifferentiated cells after differentiation induction are mixed from pluripotent stem cells. Can be extracted.
  • the cells in which the marker gene is translated and the expression of the marker protein is confirmed are extracted as pluripotent stem cells as described above.
  • the extraction step can be performed by detecting a signal from the marker protein using a predetermined detection device. Detection of the signal from the marker protein may be performed by digitizing the signal and quantifying it, or detecting only the presence or absence of the signal. Examples of the detection device include, but are not limited to, a flow cytometer, an imaging cytometer, a fluorescence microscope, a light emission microscope, and a CCD camera. As such a detection apparatus, those suitable for those skilled in the art can be used depending on the marker protein.
  • the marker protein is a fluorescent protein or a luminescent protein
  • the presence or absence of marker protein can be confirmed and / or quantified using a detection device such as a flow cytometer, imaging cytometer, fluorescence microscope, or CCD camera. It is.
  • a detection device such as a flow cytometer, imaging cytometer, fluorescence microscope, or CCD camera. It is.
  • the marker protein is a protein that assists fluorescence, luminescence, or coloration
  • the presence or absence of marker protein expression and / or a quantification method using a detection device such as a luminescence microscope, a CCD camera, or a luminometer is possible. is there.
  • the marker protein is a membrane-localized protein
  • a cell surface protein-specific detection reagent such as an antibody
  • the presence / absence of marker protein expression can be confirmed and / or quantified using the above detection apparatus.
  • a method for isolating cells that does not undergo the marker protein quantification process such as a magnetic cell separator (MACS)
  • a method of isolating a living cell by detecting the expression of the marker protein by drug administration is possible.
  • the first and second artificial mRNAs can be designed to have miRNA target sequences that are expressed specifically in pluripotent stem cells.
  • the first artificial mRNA introduced into the cell population shows the same behavior as in the first embodiment.
  • the expression of the second marker gene is suppressed by the expression of the miRNA in the pluripotent stem cell, and the second marker gene is expressed in the differentiated cell. Is expressed. Therefore, cells expressing the first marker gene can be isolated as pluripotent stem cells and cells expressing the second marker gene as undifferentiated cells.
  • PCR product with EGFP sequence The sequence of EGFP was obtained by PCR using two synthetic oligo DNAs TAPEGFPIVTfwd and TAP IVTrev from the plasmid in which EGFP was cloned, and then digesting the plasmid with DpnI.
  • the 5′UTR sequence was prepared by hybridizing a synthetic oligo DNA of IVT 5prime UTR and Rev5UTR and then extending it.
  • the 3′UTR sequence was prepared by hybridizing two synthetic oligo DNAs of IVT 3prime UTR and Rev3UTR2T20 and then extending them.
  • PCR was performed using the primers shown in Table 2 below, which have complementary sequences of TAP T7 G3C fwd and miRNA, and after adding complementary sequences of polyA ⁇ ⁇ and miRNA, Dpn I
  • the plasmid was digested.
  • a sequence that is not complementary to the sequence of the other region consisting of GAAUUCUCGCAGCCCGAAGA is added to the 3 'end.
  • RNA sequence of the long RNA (about 500,1200 nt) added are shown in the table below.
  • the pGEM-T easy vector region amplified with the following primers was ligated by fusion PCR.
  • the dotted line underlined is the adapter sequence.
  • RNA sequence of Table 6 shows the addition of 5 'UTR complementary sequences.
  • the dotted line underlined is the adapter sequence
  • the bold body is the complementary sequence to 5 'UTR
  • the underlined portion is the stem loop
  • the 3' end does not complement the sequence of other regions Is an array.
  • the reaction was performed by adding 4 ⁇ L of 10 ⁇ rAPid alkaline phosphatase buffer, 1 ⁇ L of rAPid alkaline phosphatase, 0.5 ⁇ L of Turbo DNase I, and 40 ⁇ L of H 2 O to 10 ⁇ L of the transcription reaction solution, and incubating at 37 ° C. for 30 minutes.
  • RNA is then purified using RNAeasy MiniElute column (QIAgen) or FavorPrep Blood / Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech), eluted with H 2 O, and after concentration measurement, it is finally adjusted to 100 ng / ⁇ L. After storage at -20 ° C.
  • RNA into cells was performed using a Stemfect RNA Transfection kit (Stemgent) according to the attached protocol. The amount of RNA used was 1 ⁇ L of Stemfect for 100 ng of the internal control iRFP670 mRNA and 100 ng of the ON switch RNA expressing EGFP. 12-24 hours after introduction, the sample was observed with a fluorescence microscope.
  • the cells were detached from the plate with Trypsin-EDTA or AccuMax, suspended well, and passed through a mesh to remove large lumps. Then, using Accuri C6, the fluorescence of iRFP670 and EGFP was quantified, and finally quantified by the ratio of EGFP / iRFP670.
  • [result] [1. Changes in EGFP expression in HeLa cells or 293FT cells when poly U is linked with the complementary sequence of miR-21] Introduce mRNA with polyU added into HeLa cells, sandwiching miR-21 complementary sequence (Tg21) or shuffled miR-21 complementary sequence (Tg21) on the 3 'side of polyA of EGFP, and using Flowcytometer The fluorescence of EGFP and the fluorescence of iRFP670 as a reference were measured, and the ratio was calculated (FIG. 2).
  • Fig. 3 shows the results of two-dimensional plots of EGFP and iRFP670 expression levels when 5R UTR-complementary mRNA is transfected into iRFP670 mRNA into HeLa cells with high miR-21 expression. Show.
  • the cell populations of 293FT cells and iPS cells overlap, but when using an ON switch with miR-302a-5p complementary sequences, iPS cells Increased fluorescence and 293FT cells and population separated.
  • the median value of iPS cells was confirmed to be about 4 times greater than that of 293FT cells, and it became clear that the population with a specific miRNA could be specifically identified using the ON switch. .

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Abstract

miRNAに応答して蛋白質遺伝子を強制発現させるmRNA及び強制発現させる方法を提供する。蛋白質遺伝子をコードする配列と、PolyA配列の3'側に連結したmiRNA標的配列と、前記miRNA標的配列の3'側に連結した翻訳抑制配列とを含む人工mRNA、並びに当該人工mRNAを細胞に導入する工程を含む、miRNAの発現に応答して、蛋白質遺伝子を発現させる方法。

Description

ｍｉＲＮＡの発現に応答して蛋白質遺伝子を発現させる方法
　本発明は、miRNAの発現に応答して、蛋白質遺伝子を発現させる方法に関する。
　細胞内ではmiRNAが、対応するmRNAの分解を調節することで遺伝子の発現を制御制御している。その種類はヒトで1800種類以上と考えられている。近年のマイクロアレイ解析などによると、細胞ごとにmiRNAの発現量が異なっており、細胞種や細胞の状態を特徴付けるパラメータになりうることが示されつつある。そのため、細胞内のmiRNAの活性を検出し、それに応じて任意の遺伝子の発現をON/OFFできるスイッチは、細胞種や細胞内環境に応答するインテリジェントな遺伝子発現システムとなる。
　miRNAに応答して遺伝子発現が抑制されるスイッチである、miRNA応答性OFF スイッチは、プラスミドベースで報告がなされていた（例えば、非特許文献１）。本発明者らは、近年、miRNA応答性mRNAにより構成されたOFF スイッチを細胞に直接導入することで、細胞のmiRNAの活性に依存した発現システムを報告し、細胞種の分別に成功している（例えば、特許文献１、非特許文献２）。
　miRNA応答性mRNAにより構成されたOFFスイッチの特筆すべき点は、原理的にゲノムへの挿入が起こらない点である。このため、当該mRNAを生体に注入したり、分離した細胞をそのまま移植したりすることができると考えられ、医療への応用が期待される。また、一般的なPCRと転写ができれば誰でも設計、作製が可能であるといった利便性や、入力のmiRNAと出力の遺伝子を交換することができる有用性がある。このように、miRNA応答性mRNAにより構成されたOFFスイッチは、高い汎用性と応用可能性を持つ優れたツールである。
国際公開公報 WO 2015/105172
Rinaudo et al., Nat Biotechnol 2007;25:795-801. Miki, K. et al., Cell Stem Cell 16, 699-711 (2015)
　mRNAをベースとしたスイッチは大変有用性が高いが、現在のところmiRNAに応答して遺伝子の発現がONになるスイッチは存在していない。そのため、例えば、がん細胞特異的に活性化するmiRNAを標的にしてアポトーシス遺伝子を発現させ、がん細胞特異的に死滅させることはできない。特定の蛋白質（例えば、L7Ae）に応答する蛋白質応答性mRNAからなるOFFスイッチと、当該蛋白質を出力とするmiRNA応答性mRNAからなる他のOFF スイッチとで回路を形成させることで、特定のmiRNA存在時にL7Aeの発現を抑制し、L7Ae によって抑制されていた翻訳を最終的にONにする、擬似的なONスイッチの作製は可能である。しかし、構成要素が多くシステムが複雑化すること、外来蛋白質の発現が必要なこと、コンポーネントが増え不確定要素が増えること、複数のONスイッチを同時に使用することができないことなど、問題が多い。
　miRNAに応答して発現がONになる、mRNAをベースとしたONスイッチを開発することが望まれている。
　本発明者らは、mRNAの3'末端の構造を改変した人工mRNAを設計し、これにより、miRNAに応答して蛋白質の発現がONになるONスイッチを完成し、本発明を完成するに至った。
　すなわち、本発明は以下の特徴を有する：
　［１］　蛋白質遺伝子をコードする配列と、PolyA配列の3'側に連結したmiRNA標的配列と、前記miRNA標的配列の3'側に連結した翻訳抑制配列とを含む人工mRNA。
　［２］　前記翻訳抑制配列が、
（ｉ）PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列、
（ｉｉ）5'UTRを特異的に認識する配列、及び
（ｉｉｉ）１００塩基以上の配列
から選択される配列を含む、［１］に記載の人工mRNA。
　［３］　miRNAの発現に応答して、蛋白質遺伝子を発現させる方法であって、［１］または［２］に記載の人工mRNAを細胞に導入する工程を含む、方法。
　［４］　以下の工程を含む、２種以上の細胞を含む細胞群からmiRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法；
（１）第１のマーカー遺伝子をコードする配列と、PolyA配列の3'側に連結した第１のmiRNAの標的配列と、前記第１のmiRNAの標的配列の3'側に連結した翻訳抑制配列とを含む第１の人工mRNAを細胞群に導入する工程、および
（２）当該第１のマーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞種を判別する工程。
　［５］　前記翻訳抑制配列が、
（ｉ）PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列、
（ｉｉ）5'UTRを特異的に認識する配列、及び
（ｉｉｉ）１００塩基以上の配列
から選択される配列を含む、［４］に記載の方法。
　［６］　前記所望の細胞種が、第１のmiRNAの発現量が多い細胞種であり、前記工程（２）が、前記第１のマーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞種を判別する工程である、［５］に記載の方法。
　［７］　前記第１のmiRNAの標的配列が、miR-302ａの標的配列を含み、前記所望の細胞種が、多能性幹細胞である、［４］～［６］のいずれか１項に記載の方法。
　［８］（３）第２のmiRNAの標的配列と機能的に連結した第２のマーカー遺伝子を含む第２の人工mRNAを導入する工程をさらに含む、［４］～［７］のいずれか１項に記載の方法であって、
　当該第２のmiRNAの標的配列が、前記第１のmiRNAの標的配列と同一のmiRNAにより特異的に認識される配列であり、
　当該第２のマーカー遺伝子が、前記第１のマーカー遺伝子と異なり、
　当該第２の人工mRNAが、前記miRNAの発現量に応答して、前記第２のマーカー遺伝子の翻訳量を低減させる人工mRNAである、方法。
　［９］（４）miRNAの標的配列を含まず、第３のマーカー遺伝子を含む第３の人工mRNAを導入する工程をさらに含む、［４］～［８］のいずれか１項に記載の方法であって、
　当該第３のマーカー遺伝子が、前記第１及び第２のマーカー遺伝子と異なり、　当該第３の人工mRNAが、前記miRNAの発現量による影響を受けることなく、前記第３のマーカー遺伝子を翻訳する、方法。
　本発明によれば、特定のmiRNAの活性が高い細胞で遺伝子の強制発現が可能となり、細胞特異的に遺伝子を発現させることができる。また、特定の細胞でmiRNAの活性が低ければ既存のmiRNA応答性のOFFスイッチを用い、高ければ本発明のONスイッチを使用することで、miRNAの活性の違いにより特定の細胞でのみ任意の遺伝子を発現させることができるようになる。既存のOFFスイッチと今回のONスイッチが揃うことで、任意のmiRNAに対して任意の遺伝子を任意の方向に(強制発現、抑制) 制御できる汎用的な手法が提供できる。これによる具体的な応用としては、細胞分離、特定細胞のみの分化誘導、細胞死制御によるがん細胞の除去などが挙げられ、miRNAのOFFスイッチと同様にゲノムへの挿入が起こらないため、いずれも医療へ適用可能であると考えられる。
図１は、本発明によるmiRNAの発現に応答して蛋白質遺伝子を発現させるmRNAの構成を模式的に示す図である。 図２は、miR-21の相補配列(Tg21) またはシャッフルした配列(N)でpolyA 下流に連結されたpolyUによる、EGFPの発現量の変化を示すグラフであり、それぞれの配列について左側カラムはHeLa細胞に、右側カラムは293FTに導入した場合の結果である。 図３は、miR-21の相補配列(Tg21) またはシャッフルした配列(N)でpolyA 下流に連結された配列の違いによる、EGFPの発現量の変化を表し、赤は過去に作成されたOFF スイッチ、緑はただのEGFP発現mRNA、水色はシャッフル配列、青はTg21 配列が含まれるmRNAの結果を示す。下流に連結された配列はパネル（ａ）が5'UTRの相補配列20nt、（ｂ）が5'UTRの相補配列40nt、（ｃ）が20nt+stem loop、（ｄ）が120 nt程度の付加配列、（ｅ）が500 nt程度の付加配列、（ｆ）が1250 nt程度の付加配列である。 図４は、miRNA21 mimic またはinhibitor に対するEGFPの発現量の変化を示すグラフであって、（ａ）は、Hela細胞においてmiRNA21 inhibitorを加えた場合（＋）、加えない場合（－）における、miRNA21標的配列を有するmRNAのEGFPの発現量を示し、（ｂ）は、293FT細胞においてmiRNA21 mimicを加えた場合（＋）、加えない場合（－）における、miRNA21標的配列を有するmRNAのEGFPの発現量を示す。 図５は、ONスイッチとOFF スイッチとの組み合わせによるfold change の改善を示すグラフであり、各種のmiRNA21標的配列を有するmRNAをHeLa細胞または293F細胞に導入した場合の蛍光比を示す。 図６は、miR-302a-5p標的配列を有するONスイッチによる、iPS 細胞の識別結果を示す図であり、（ａ）はmiR-302a-5p標的配列を有するOFFスイッチと、標的配列を持たないControl mRNAをHeLa細胞及び293F細胞に共導入した場合の蛍光比を示し、（ｂ）はmiR-302a-5p標的配列を有するOFFスイッチ及びmiR-302a-5p標的配列を有するONスイッチをHeLa細胞及び293F細胞に共導入した場合の蛍光比を示し、（ｃ）は、（ａ）及び（ｂ）の四角で囲まれた部分のEGFP/iRFP670の中央値を元にfold changeを計算した結果を示すグラフである。
　以下に、本発明を、実施形態を挙げて詳細に説明する。以下の実施形態は本発明を限定するものではない。
　［第１実施形態］
　本発明は、第１実施形態によれば、miRNAの発現に応答して、蛋白質遺伝子を発現させる方法であって、蛋白質遺伝子をコードする配列と、PolyA配列の3'側に連結したmiRNAの標的配列と、前記miRNAの標的配列の3'側に連結した翻訳抑制配列とを含む人工mRNAを細胞に導入する工程を含む方法に関する。
　本実施形態においては、以下に詳述するように人工mRNAを設計し、調製することで、当該人工mRNAを導入した細胞において、任意のmiRNAの発現に応答して、任意の蛋白質を発現させることができる。当該人工mRNAを、本明細書において、miRNA応答性mRNA、あるいは、miRNA応答性ON-switch mRNAと指称する場合がある。
　本発明においてmiRNAとは、micro-RNAとも称し、細胞内に存在する長さ１８から２５塩基ほどのRNAである。miRNAは、ＤＮＡから転写された一本鎖ＲＮＡであるpri-mRNAをDroshaと呼ばれる核内酵素により部分切断することによって生じるpre-miRNAを、Dicerによって切断することによって生じる二本鎖RNAのいずれかの一方の鎖を意味する。miRNAの塩基数は、例えば18～25、好ましくは20～25、さらに好ましくは21～23である。約1,000個程度のmiRNA情報を格納したデータベースを利用することができる（例えば、miRBase、http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/index.shtml）。当業者はこのデータベースから任意のmiRNA情報を引き出すことができ、本発明の方法を用いて蛋白質遺伝子を発現させる細胞に特異的に発現しているmiRNAを、容易に抽出することが可能である。なお、miRNAの発現とは、本発明に係るmRNAを導入する細胞において、上記Dicerによって切断された二本鎖RNAのいずれか一方の鎖が、所定の複数の蛋白質と相互作用して、RNA-induced silencing complex（RISK）を形成した状態にあるmiRNAをいうものとする。
　本発明においては、例えば、細胞特異的に上記mRNAがコードする蛋白質遺伝子を強制発現させることができる。ある細胞において特異的に発現しているmiRNAは、上記データベースや文献等により知られており、現在もその解明が続いている。したがって、上記mRNAを設計する際には、蛋白質遺伝子を発現させることを所望する細胞において、特異的に発現するmiRNAを抽出し、選択することが好ましい。
　本実施形態における細胞は、蛋白質遺伝子を発現させることを所望する任意の細胞であって、特には限定されるものではない。例えば、人工多能性幹(iPS)細胞を含む多能性幹細胞、多能性幹細胞から分化誘導された体細胞、多能性幹細胞から分化誘導される過程にある細胞、あるいは、がん細胞が挙げられるが、これらには限定されない。
　mRNAを導入する細胞が、例えば多能性幹細胞である場合には、多能性幹細胞に特異的に発現しているmiRNAに応答するmRNAを設計することができる。多能性幹細胞に特異的に発現しているmiRNAは、文献等により多能性幹細胞に特異的に発現していることが知られているmiRNAであれば特に限定されないが、例えば、hsa-mir-302a、hsa-mir-302b、hsa-mir-302c、hsa-mir-302d、hsa-mir-367、hsa-5201、hsa-mir-92b、hsa-mir-106a、hsa-mir-18b、hsa-mir-20b、hsa-mir-19b-2、hsa-mir-92a-2、hsa-mir-363、hsa-mir-20a、hsa-mir-17、hsa-mir-18a、hsa-mir-19a、hsa-mir-19b-1、hsa-mir-373、hsa-mir-330、hsa-mir-520c、hsa-mir-182、hsa-mir-183、hsa-mir-96、hsa-mir-92a-1、hsa-mir-92a-2、hsa-mir-141、hsa-mir-200c、hsa-mir-27a、hsa-mir-7-1、hsa-mir-7-2、hsa-mir-7-3、hsa-mir-374a、hsa-mir-106b、hsa-mir-93、hsa-mir-25、hsa-mir-584、hsa-mir-374b、hsa-mir-21、hsa-mir-212、hsa-mir-371a、hsa-mir-371b、hsa-mir-372、hsa-mir-200b、hsa-mir-200a、hsa-mir-429のいずれか一方の鎖が挙げられる。この他にも、例えば、Tobias S. Greve, et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2013.29:213-239に記載されているmiRNAから適宜選択されたmiRNAが例示される。好ましいmiRNAは、has-mir-302aまたはhsa-mir-302bのいずれか一方の鎖であり、さらに好ましくは、hsa-miR-302b-3pである。
　本発明において、細胞に特異的に発現するmiRNAの標的配列とは、当該miRNAに特異的に結合可能な配列をいう。miRNA標的配列は、例えば、細胞に特異的に発現するmiRNAに相補的な配列であることが好ましい。あるいは、当該miRNA標的配列は、miRNAにおいて認識され得る限り、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。当該miRNAに完全に相補的な配列からの不一致は、所望の細胞において、通常にmiRNAが認識し得る不一致であれば良く、生体内における細胞内の本来の機能では、４０～５０％ 程度の不一致があっても良いとされている。このような不一致は、特に限定されないが、１塩基、２塩基、３塩基、４塩基、５塩基、６塩基、７塩基、８塩基、９塩基、若しくは１０塩基又は全認識配列の１％、５％、１０％、２０％、３０％、若しくは４０％の不一致が例示される。また、特には、細胞が備えているmRNAのmiRNA標的配列のように、特に、シード領域以外の部分に、すなわちmiRNAの3'側の16 塩基程度に対応する、標的配列内の5'側の領域に、多数の不一致を含んでもよく、シード領域の部分は、不一致を含まないか、１塩基、２塩基、若しくは３塩基の不一致を含んでもよい。
　本発明において、mRNAがコードする蛋白質遺伝子は、任意の蛋白質遺伝子であってよく、その種類は限定されるものではない。例えば、以下に詳述するマーカー蛋白質遺伝子であってもよく、アポトーシス促進蛋白質遺伝子、アポトーシス抑制蛋白質遺伝子、細胞表面蛋白質遺伝子であってもよい。
　マーカー遺伝子は、細胞内で翻訳されて、マーカーとして機能し、分化細胞の抽出を可能にする任意のマーカー蛋白質をコードするRNA配列であり、マーカー蛋白質に対応する配列ともいうことができる。細胞内で翻訳されてマーカーとして機能しうる蛋白質としては、一例としては、蛍光、発光、呈色、若しくは蛍光、発行又は呈色を補助することなどにより、視覚化し、定量化することができる蛋白質、膜局在蛋白質、薬剤耐性蛋白質等であってよいが、これらには限定されない。
　蛍光蛋白質としては、Sirius、EBFPなどの青色蛍光蛋白質；mTurquoise、TagCFP、AmCyan、mTFP1、MidoriishiCyan、CFPなどのシアン蛍光蛋白質；TurboGFP、AcGFP、TagGFP、Azami-Green (例えば、hmAG1)、ZsGreen、EmGFP、EGFP、GFP2、HyPer、などの緑色蛍光蛋白質；TagYFP、EYFP、Venus、YFP、PhiYFP、PhiYFP-m、TurboYFP、ZsYellow、mBananaなどの黄色蛍光蛋白質；、KusabiraOrange (例えば、hmKO2)、mOrangeなどの橙色蛍光蛋白質；TurboRFP、DsRed-Express、DsRed2、TagRFP、DsRed-Monomer、AsRed2、mStrawberry、などの赤色蛍光蛋白質；TurboFP602、mRFP1、JRed、KillerRed、mCherry、HcRed、KeimaRed（例えば、hdKeimaRed）、mRasberry、mPlum、iRFP670などの近赤外蛍光蛋白質が挙げられるが、これらには限定されない。
　発光蛋白質としては、イクオリンを例示することができるが、これに限定されない。また、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質として、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、βラクタマーゼなどの蛍光、発光又は呈色前駆物質を分解する酵素を例示することができるが、これらには限定されない。ここで本発明において、蛍光、発光又は呈色を補助する物質をマーカーとして使用する場合、分化細胞の抽出において、対応する前駆物質と細胞を接触させること、又は細胞内に対応する前駆物質を導入することによって行われ得る。
　膜局在蛋白質としては、多能性幹細胞で内在的に発現していない膜局在蛋白質であれば特に限定されないが、例えば、Ｐ－ｇｐ、ＭＲＰ１、ＭＲＰ２（ｃＭＯＡＴ）、ＭＲＰ３、ＭＲＰ４、ＭＲＰ５，ＭＲＰ６、ＭＤＲ２，およびＭＤＲ３蛋白質を例示することができる。本発明では、導入したmRNAから翻訳された膜局在蛋白質が指標となることから、対象となる分化細胞において内在的に発現していない膜局在蛋白質がより好ましい。薬剤耐性蛋白質としては、例えば、カナマイシン耐性蛋白質、アンピシリン耐性蛋白質、ピューロマイシン耐性蛋白質、ブラストサイジン耐性蛋白質、ゲンタマイシン耐性蛋白質、カナマイシン耐性蛋白質、テトラサイクリン耐性蛋白質、クロラムフェニコール耐性蛋白質などの抗生物質耐性蛋白質を例示することができるが、これらには限定されない。
　アポトーシス促進蛋白質遺伝子の具体例としては、Bim-EL、Bax、FADD、Caspase等を挙げることができる。アポトーシス抑制蛋白質遺伝子の具体例としては、Bcl-xL、Bcl-2等を挙げることができる。細胞表面蛋白質遺伝子の具体例としては、IgG leader sequenceとPDGFR transmembraneドメインを付加したビオチン付加ペプチドが挙げられる。しかし、mRNAがコードする蛋白質遺伝子はこれらには限定されない。
　mRNAは、好ましくは、5'末端から、5'から3'の向きに、Cap構造（７メチルグアノシン5'リン酸）、所望の蛋白質遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム並びに、Poly A配列を備え、Poly A配列の3'側に連結するmiRNA標的配列、及びmiRNA標的配列の3'側に連結する翻訳抑制配列を備えている。
　5'UTRの構造は、5'末端にCap構造を備え、miRNA標的配列を備えていないものであれば、塩基数についても、配列についても特に限定されるものではない。一例として、5'UTRの構造は２０塩基以上であって、例えば、４０～１５０塩基、好ましくは４０～１００塩基程度で構成され、Stem-loopなどのRNAの構造をとりにくく、開始コドンを含まない配列とすることができるが、特定の配列には限定されない。Poly A配列は、特に長さの上限はないが、例えば５０～３００塩基、好ましくは、１００～１５０塩基のAからなる配列であってよい。
　Poly A配列の3'側に連結するmiRNA標的配列の数は、１つであることが好ましい。これは、miRNAによる標的配列の切断後にPoly Aの3'側に配列が残ると、Poly Aとして認識されにくくなり、遺伝子の発現が開始しない（発現抑制を解除できない）場合があるためである。しかしながら、miRNAによる標的配列の切断後に、発現抑制を解除することができる場合には、複数のmiRNA標的配列を備えていてもよい。「Poly A配列の3'側に連結するmiRNA標的配列」とは、Poly A配列とmiRNA標的配列とが直接連結されていてもよく、これらの間に機能に影響を及ぼさない程度の配列、例えば１～５塩基程度の配列を備えてもよいことをいう。
　miRNA標的配列の3'側には、翻訳抑制配列を連結する。「miRNAの標的配列の3'側に連結した翻訳抑制配列」とは、miRNA標的配列と翻訳抑制配列とが直接連結される場合のみならず、これらの間に、他の配列が存在していてもよいことをいうものとする。例えば、miRNA標的配列と翻訳抑制配列との間には、２０～１００塩基のアダプター配列を含んでもよい。また、２つ以上のmiRNA標的配列を備える場合、miRNA標的配列の3'側とは、最も3’側に位置するmiRNA標的配列の3'末端側をいうものとする。
　翻訳抑制配列は、Poly A配列の翻訳に関与する作用を妨げることが可能な配列であってよく、好ましくは、（ｉ）PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列、（ｉｉ）5'UTRを特異的に認識する配列、及び（ｉｉｉ）１００塩基以上の配列から選択される塩基配列を含む。
　（ｉ）PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列としては、PolyA配列に完全に相補的なPolyU配列が挙げられ、例えば、20以上、40以上、60以上、または80以上のウリジンからなるPolyU配列が挙げられるが、これらには限定されない。また、PolyA配列を特異的に認識することができれば、ミスマッチが存在してもよい。また、PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列を含んでいれば、その3'側及び／または5'側に、任意の配列をさらに含んでいてもよい。なお、PolyA配列を特異的に認識し、翻訳抑制することができれば、必ずしも２０以上でなくとも、５以上、１０以上、あるいは１５以上の塩基からなる配列であってもよい。
　（ｉｉ）5'UTRを特異的に認識する配列としては、5'UTRに完全に相補的な配列であることが好ましい。しかしながら、5'UTRを特異的に認識することができれば、完全に相補的な配列との不一致（ミスマッチ）を有していても良い。また、5'UTRを特異的に認識する配列を含んでいれば、その3'側及び／または5'側に、任意の配列をさらに含んでいてもよい。
　（ｉｉｉ）100塩基以上の配列としては、塩基の種類及びおよび塩基の配列は問わず、翻訳抑制が可能な程度の長い配列であればよい。100塩基以上、好ましくは300塩基以上、500塩基以上、1000塩基以上、1500塩基以上であってもよい。
　miRNA応答性mRNAを構成する塩基としては、通常のウリジン、シチジンに替えて、シュードウリジン、５－メチルシチジンなどの修飾塩基を含んでいることが好ましい。細胞毒性を低減させるためである。修飾塩基の位置は、ウリジン、シチジンいずれの場合も、独立に、全てあるいは一部とすることができ、一部である場合には、任意の割合でランダムな位置とすることができる。
　このような構造的特徴を備えるmiRNA応答性mRNAは、細胞内の翻訳システムからpoly A配列を隠し、翻訳を阻害することができる。mRNAは細胞の中で、5'末端に存在するCAP構造と3'末端に存在するpolyA配列により認識、翻訳の活性化が起こるとされているところ、上記のように設計された人工的なmiRNA応答性mRNAは、一時的に不活性化されているといえる。
　miRNA応答性mRNAは、上記に従って配列が決定されれば、遺伝子工学的に既知の任意の方法により当業者が合成することができる。特には、プロモーター配列を含むテンプレートDNAを鋳型として用いたin vitro合成法により、得ることができる。設計どおりのmRNAを簡便な方法で得ることができることは本発明の１つの利点である。
　本発明に係る蛋白質遺伝子を発現させる方法において、細胞に導入するmiRNA応答性mRNAは、１種のみであってよく、２種以上、例えば、３種、４種、５種、６種、７種、または８種以上用いてもよい。導入するmiRNA応答性mRNAの種類数およびそれぞれの構造の設計は、所定の細胞において、蛋白質遺伝子を発現させる目的に応じて、当業者が適宜、設計することができる。例えば、miRNA標的部位が異なり、蛋白質遺伝子が同一の複数のmiRNA応答性mRNAを設計することができる。あるいは、miRNA標的部位が異なり、蛋白質遺伝子も異なる複数のmiRNA応答性mRNAを設計することもできる。翻訳抑制配列については、各miRNA応答性mRNAにおいて、必要な程度の翻訳抑制機能を備える限り、同一であっても異なっていてもよい。
　miRNA応答性mRNAを細胞に導入する工程は、リポフェクション法、リポソーム法、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム共沈殿法、DEAEデキストラン法、マイクロインジェクション法、遺伝子銃法などを用いて、１種以上のmiRNA応答性mRNAを直接、細胞集に導入する。miRNA応答性mRNAをベクターなどのDNAの形態で導入することもでき、その場合も上記同様の方法を用いることができる。異なる２種以上のmiRNA応答性mRNAを導入する場合には、複数のmRNAを細胞に共導入することもできるし、別個に導入することもできる。この時の導入量は、導入される細胞、導入するmRNA、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
　miRNA応答性mRNAが、細胞に導入された場合の作用について説明する。miRNA応答性mRNAがある１つの細胞に導入され、その細胞内にmiRNA標的部位に特異的に結合するmiRNAが存在する場合、miRNA応答性mRNAにmiRNAが結合し、PolyA配列と、miRNA標的部位との間でmRNAが切断される。それにより、一時的に不活性化され、翻訳抑制されていたmiRNA応答性mRNAが、翻訳可能な状態となり、蛋白質遺伝子の発現が開始され、促進される。蛋白質が、例えば、定量可能なマーカー蛋白質である場合、蛋白質の発現量は、細胞内のmiRNAと相関関係を示すことが明確に確認できる。また、発現される蛋白質の特性によっては、細胞死を引き起こしたり、所定の機能を細胞に及ぼしたりし得る。なお、それぞれが異なるmiRNAに結合する複数のmiRNA標的部位を１つのmRNAに設けたmiRNA応答性mRNAを細胞に導入した場合は、複数のmiRNA標的部位のいずれかに結合するmiRNAが１種類でも細胞内に発現していれば、翻訳抑制状態を解除して、翻訳可能な状態とすることができる。一方、その細胞内にmiRNA標的部位に特異的に結合するmiRNAが存在しない場合、miRNA応答性mRNAは、作用を受けることなく、翻訳抑制されたままの状態となる。したがって、miRNA応答性mRNAがコードする蛋白質が発現されず、実質的に何の作用も生じず、miRNA応答性mRNAが分解されることとなる。
　また、miRNA応答性mRNAが、異なる特性を持つ細胞が混在した細胞集団に導入された場合、上記と同様の作用により、miRNA標的部位に特異的に結合するmiRNAが存在する細胞においてのみ、蛋白質が発現する。したがって、所定のmiRNAを発現する細胞を、蛋白質の発現に基づき判別し、分離し、特徴づけることが可能となる。このようなmiRNA応答性mRNAを用いた細胞の判別については、第２実施形態において説明する。
　［第２実施形態］
　本発明は第２実施形態によれば、以下の工程を含む、２種以上の細胞を含む細胞群からmiRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法に関する。
（１）第１のマーカー遺伝子をコードする配列と、PolyA配列の3'側に連結した第１のmiRNAの標的配列と、前記第１のmiRNAの標的配列の3'側に連結した翻訳抑制配列とを含む第１の人工mRNAを細胞群に導入する工程、および
（２）当該第１のマーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞種を判別する工程。
　本実施形態による判別方法において、対象となる細胞群は、２種以上の細胞を含む細胞群であり、多細胞生物種から採取した細胞群であってもよく、単離された細胞を培養することによって得られる細胞群であってもよい。当該細胞群は、特には、哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、サル、ブタ、ラット等）採取した２種以上の体細胞を含む細胞群、若しくは哺乳動物より単離された細胞又は哺乳動物細胞株を培養することによって得られる細胞群である。体細胞としては、例えば、角質化する上皮細胞（例、角質化表皮細胞）、粘膜上皮細胞（例、舌表層の上皮細胞）、外分泌腺上皮細胞（例、乳腺細胞）、ホルモン分泌細胞（例、副腎髄質細胞）、代謝・貯蔵用の細胞（例、肝細胞）、境界面を構成する内腔上皮細胞（例、I型肺胞細胞）、内鎖管の内腔上皮細胞（例、血管内皮細胞）、運搬能をもつ繊毛のある細胞（例、気道上皮細胞）、細胞外マトリックス分泌用細胞（例、線維芽細胞）、収縮性細胞（例、平滑筋細胞）、血液と免疫系の細胞（例、Ｔリンパ球）、感覚に関する細胞（例、桿細胞）、自律神経系ニューロン（例、コリン作動性ニューロン）、感覚器と末梢ニューロンの支持細胞（例、随伴細胞）、中枢神経系の神経細胞とグリア細胞（例、星状グリア細胞）、色素細胞（例、網膜色素上皮細胞）、およびそれらの前駆細胞 (組織前駆細胞) 等が挙げられる。細胞の分化の程度や細胞を採取する動物の齢などに特に制限はなく、未分化な前駆細胞 (体性幹細胞も含む) であっても、最終分化した成熟細胞であっても、同様に本発明における体細胞の起源として使用することができる。ここで未分化な前駆細胞としては、たとえば神経幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、歯髄幹細胞等の組織幹細胞（体性幹細胞）が挙げられる。本発明において、体細胞を採取する由来となる哺乳動物個体は特に制限されないが、好ましくはヒトである。また、好ましい細胞群は、前期体細胞を採取後に人為的な操作を加えた細胞群であり、所望しない細胞を含む可能性がある細胞群である。例えば、前記体細胞から調製したｉＰＳ細胞を含んでなる細胞群であり、あるいはES 細胞やｉＰＳ細胞などによって例示される多能性幹細胞を分化させた後に得られる細胞群であって、所望する細胞以外に分化された細胞を含み得る細胞群である。本実施形態において、判別対象の細胞群は、生存状態にあることが好ましい。本発明において、細胞が生存状態にあるとは、代謝能を維持した状態の細胞を意味する。本発明は、細胞を本発明の方法に供し、判別方法の終了後においても、その生来の特性を失うことなく、生存状態のまま、特に分裂能を維持したまま、続く用途に用いることができる点で有利である。
　本発明の方法において、判別される「所望の細胞種」とは、miRNAの発現を指標として、他の細胞種と分類されるある一群の細胞をいう。特には、後に詳述するmiRNA活性について共通する特性を備えるある一群の細胞をいう。本発明においては、このようなmiRNAを指標として、他の細胞種と分類されるある一群の細胞を「同種の細胞」とも指称する。本発明の方法で判別される所望の細胞種は、１種であっても良く、２種以上、例えば、３種、４種、５種、６種、７種、または８種以上であってもよい。理論上、判別可能な細胞種は限定されるものではなく、本発明によれば、同時に１００種以上の細胞種を判別することもできる。
　本発明において、「所望の細胞種を判別する」とは、２種以上の細胞を含む細胞群の中から、所望の、特定の１以上の細胞種について、他の細胞種と異なる検出可能な信号情報を提示することをいい、特には、視覚的に認識可能な情報を提示することをいうものとする。なお、視覚的に認識可能な情報とは、細胞が直接的に視認しうる信号を発することに限定されるものではなく、細胞が発した信号を、数値、図表又は画像等によって視覚的に認識可能な情報に変換された情報であり、当業者が視覚的に認識可能な情報をいう。本明細書において、判別するという文言には、当該判別の後に、所望の細胞種を認識し、所望の細胞種を識別し、所望の細胞種を同定し、所望の細胞種を分類し、所望の細胞種を単離し、所望しない細胞種を除去し、所望の細胞種の生死を判定し、所望の細胞種の特定の生物学的な信号を検出あるいは定量し、所望の細胞種の特定の物理的あるいは化学的な信号に基づいて分画することを含んでも良い。２種以上の細胞を含むことが未知であった細胞群が、本発明の方法を用いることによって異なる細胞種として判別することも、本発明において、所望の細胞種を判別することの一態様をなす。
　本実施形態による工程（１）において用いる、第１の人工mRNAは、第１実施形態において説明したmiRNA応答性ON-switch mRNAであって、蛋白質がマーカー蛋白質であるmiRNA応答性ON-switch mRNAである。本実施形態においては、miRNAに応答して蛋白質遺伝子が強制発現されるように機能する任意のmRNAを第１の人工mRNAと指称する。
　第１の人工mRNAの設計においては、マーカー遺伝子を発現させ、判別することを所望する対象細胞において特異的に発現するmiRNAを抽出し、これに適合するmiRNA標的部位を選択することができる。また、所望の判別の態様に適合するマーカー遺伝子を選択することができる。マーカー遺伝子の種類については、第１実施形態において詳述したものから選択することができる。好ましいマーカー遺伝子としては、定量的な判別が可能な蛍光蛋白質遺伝子が挙げられるが、特定のマーカー遺伝子には限定されない。本工程では、１種類の第１の人工mRNAのみを用いることもできるし、２種類以上の第１の人工mRNAを用いることもできる。後者の場合、複数の第１の人工mRNAは、miRNA標的部位、マーカー蛋白質ともに異なっていてもよいし、場合により、いずれかが同一であってもよい。第１の人工mRNAは、判別の態様により、当業者が適宜設計することができる。
　設計し、遺伝子工学的手法により調製された第１の人工mRNAは、第１実施形態において記載した方法にて、細胞群に導入することができる。このとき、第１の人工mRNAとレファレンスとなるmRNA（以下、レファレンスmRNAとも指称する）とを細胞群に導入することができる。レファレンスmRNAは、本実施形態の判別方法において、分離能（fold change）を上げるために用いることができるmRNAであって、miRNAの発現に特異的に、あるいは非特異的に、miRNA応答性ON-switch mRNAとは異なる挙動をするmRNAである。
　レファレンスmRNAは、例えば、第２のmiRNAの標的配列と機能的に連結した第２のマーカー遺伝子を含む第２の人工mRNAであってよい。第２の人工mRNAは、miRNAの発現量に応答して、前記第２のマーカー遺伝子の翻訳量を低減させる人工mRNAであって、特許文献１などに開示された、miRNA応答性OFF-switch mRNAである。この第２の人工mRNAにおいては、第２のmiRNAの標的配列が、前記第１のmiRNAの標的配列と同一のmiRNAにより特異的に認識される配列である。したがって、第１のmiRNAの標的配列と第２のmiRNAの標的配列とが必ずしも同じ配列である必要はないが、同一のmiRNAに応答することができる。また、第２のマーカー遺伝子は、前記第１のマーカー遺伝子と異なっており、これらのマーカー遺伝子が発現する信号は、分離、識別可能である。
　レファレンスmRNAは、他には、miRNAの標的配列を含まず、第３のマーカー遺伝子を含む第３の人工mRNAであってよい。第３の人工mRNAは、miRNAの発現量による影響を受けることなく、前記第３のマーカー遺伝子を翻訳する人工mRNAであって、特許文献１などに開示された、コントロールmRNAである。この第３の人工mRNAにおいては、第３のマーカー遺伝子が第１のマーカー遺伝子と異なっている。また、第３のマーカー遺伝子は、第２のマーカー遺伝子とも異なっている。
　本実施形態による判別方法は、第１の人工mRNAのみによって実施することもできるし、第１及び２の人工mRNAを併用することもできる。第１、第２及び第３の人工mRNAをすべて使用することもできる。さらには、第１、第２及び第３の人工mRNAを、それぞれ、複数種類ずつ使用することもできる。
　工程（１）において、2種類以上の第１の人工mRNAを用いる場合、及び／または第１の人工mRNAとレファレンスmRNAとを用いる場合には、複数のmRNAを細胞群に共導入することが好ましい。共導入した２以上のmRNAから発現するマーカー蛋白質の活性比は、細胞集団内において一定であるためである。この時の導入量は、導入される細胞群、導入するmRNA、導入方法および導入試薬の種類により異なり、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。レファレンスmRNAの導入量もまた、所望の翻訳量を得るために当業者は適宜これらを選択することができる。
　第１の人工mRNAが細胞に導入されると、細胞内では、細胞に所定のmiRNAがRISKとして存在する場合、第１の人工mRNAがコードするマーカー遺伝子の翻訳が開始される。そして、翻訳量の制御は、miRNA活性に応じて定量的になされる。一方、細胞に所定のmiRNAが存在しない場合、もしくは所定のmiRNAがRISKとして存在しない場合、第１の人工mRNAがコードするマーカー遺伝子は翻訳されない。したがって、所定のmiRNAがRISKとして存在する細胞と、存在しない細胞との間で、マーカー遺伝子の翻訳量が異なる。なお、本明細書において、所定のmiRNAがRISKとして存在する場合を、「miRNA活性が存在する場合」とも指称する。一方、第３の人工mRNA、すなわちコントロールmRNAは、miRNA活性に関係なくマーカー蛋白質を発現す・BR>驕B導入されても、MIRNA標的配列が存在しないため、MIRNA発現量に応じて翻訳制御されることがないためである。さらに、第２の人工MRNA、すなわちMIRNA応答性OFF-SWITCH MRNAは、細胞に所定のMIRNAがRISKとして存在する場合、マーカー遺伝子の翻訳が抑制される。
　次いで、工程（２）マーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞を判別する工程を実施する。この工程では、上記のようなマーカー遺伝子の翻訳量から、細胞を判別する。すなわち、所望の細胞種が、指標となるmiRNAの発現量が少ない細胞であり、マーカー遺伝子の翻訳量が少ない細胞を判別する工程、及び／または、前記所望の細胞種が、指標となるmiRNAの発現量が多い細胞であり、当該マーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞を判別する工程とすることができる。このような指標となるmiRNAの発現量が少ない細胞、あるいは多い細胞は、２種以上の細胞を含む細胞群に属する細胞間で、マーカー遺伝子の翻訳量の比率を得ることにより決定することができる。
　具体的には、判別工程は、所定の検出装置を用いて、マーカー蛋白質からの信号を検出することにより実施することができる。検出装置としては、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、CCDカメラ等が挙げられるが、これらには限定されない。このような検出装置は、マーカー蛋白質及び判別の態様により、当業者が適したものを用いることができる。例えば、マーカー蛋白質が、蛍光蛋白質又は発光蛋白質の場合には、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、CCDカメラといった検出装置を用いてマーカー蛋白質の定量が可能であり、マーカー蛋白質が、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質の場合には、発光顕微鏡、CCDカメラ、ルミノメーターといった検出装置を用いたマーカー蛋白質の定量方法が可能であり、マーカー蛋白質が、膜局在蛋白質の場合には、抗体などの細胞表面蛋白質特異的な検出試薬と、上記の検出装置を用いたマーカー蛋白質の定量方法が可能である他、磁気細胞分離装置(MACS)といった、マーカー蛋白質の定量過程を経ない細胞の単離方法が可能であり、マーカー蛋白質が薬剤耐性遺伝子の場合、薬剤投与によりマーカー遺伝子の発現を検出して、生細胞を単離する方法が可能である。
　マーカー蛋白質が蛍光蛋白質の場合の好ましい検出方法の一例として、フローサイトメトリーが挙げられる。フローサイトメトリーは、個々の細胞において翻訳されたマーカー蛋白質である、蛍光蛋白質、発光酵素が発する光の強度を、判別の情報として提供することができる。
　本発明の第２実施形態の第１態様において、多能性幹細胞から分化誘導後の未分化細胞が混在する細胞集団における、所定の細胞群の分離、抽出について説明する。このとき、第１の人工mRNAは、例えば、多能性幹細胞特異的に発現するmiRNA標的配列を持つように設計することができる。細胞集団に当該第１の人工mRNAが導入されると、多能性幹細胞においては、当該miRNAの発現により、翻訳抑制配列が切断される。そして、第１のマーカー遺伝子が発現され、判別可能になる。一方、分化細胞内では、多能性幹細胞に特異的に発現するmiRNAがRISKとして存在しないので、翻訳抑制配列が切り離されることはなく、第１のマーカー遺伝子の翻訳は生じない。つまり、当該マーカー遺伝子の翻訳は、多能性幹細胞内のみにおいて行われる。従って、本願発明の一実施態様において、当該マーカー遺伝子が翻訳された細胞を抽出することで、多能性幹細胞から分化誘導後の未分化細胞が混在する細胞集団から多能性幹細胞のみを選択的に抽出することが可能となる。
　任意選択的に行ってもよい、当該マーカー遺伝子が翻訳された細胞を抽出する工程では、上記のような、マーカー遺伝子が翻訳され、マーカー蛋白質の発現が確認された細胞を多能性幹細胞として抽出する。具体的には、抽出工程は、所定の検出装置を用いて、マーカー蛋白質からの信号を検出することにより実施することができる。マーカー蛋白質からの信号の検出は、信号を数値化して定量してもよいし、信号の有無のみの検出でもよい。検出装置としては、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、発光顕微鏡、CCDカメラ等が挙げられるが、これらには限定されない。このような検出装置は、マーカー蛋白質により、当業者が適したものを用いることができる。例えば、マーカー蛋白質が、蛍光蛋白質又は発光蛋白質の場合には、フローサイトメーター、イメージングサイトメーター、蛍光顕微鏡、CCDカメラといった検出装置を用いてマーカー蛋白質の発現の有無の確認、及び／または定量が可能である。マーカー蛋白質が、蛍光、発光又は呈色を補助する蛋白質の場合には、発光顕微鏡、CCDカメラ、ルミノメーターといった検出装置を用いたマーカー蛋白質の発現の有無の確認、及び／または定量方法が可能である。マーカー蛋白質が、膜局在蛋白質の場合には、抗体などの細胞表面蛋白質特異的な検出試薬と、上記の検出装置を用いたマーカー蛋白質の発現の有無の確認、及び／または定量方法が可能である他、磁気細胞分離装置(MACS)といった、マーカー蛋白質の定量過程を経ない細胞の単離方法が可能である。マーカー蛋白質が薬剤耐性蛋白質の場合、薬剤投与によりマーカー蛋白質の発現を検出して、生細胞を単離する方法が可能である。
　第２実施形態の第２態様によれば、多能性幹細胞から分化誘導後の未分化細胞が混在する細胞集団における、所定の細胞群の分離、抽出において、第１の人工mRNAと、第２の人工mRNAとを細胞集団に導入することができる。第１、及び第２の人工mRNAは、多能性幹細胞特異的に発現するmiRNA標的配列を持つように設計することができる。細胞集団に導入された第１の人工mRNAは、先の第１態様と同様の挙動を示す。一方、第２の人工mRNAが細胞集団に導入されると、多能性幹細胞においては、当該miRNAの発現により、第２のマーカー遺伝子の発現が抑制され、分化細胞においては、第２のマーカー遺伝子が発現される。したがって、第１のマーカー遺伝子を発現する細胞を多能性幹細胞、第２のマーカー遺伝子を発現する細胞を未分化細胞として、分離することができる。
　以下に、本発明を、実施例を用いてより詳細に説明する。以下の実施例は本発明を限定するものではない。
［実験］
［１．EGFPの配列をもつPCR産物の作製］
　EGFPの配列は、EGFPをクローニングしたプラスミドからTAPEGFPIVTfwd, TAP IVTrevの2つの合成オリゴDNAでPCRしたのち、DpnI でプラスミドを分解処理することで取得した。5'UTRの配列はIVT 5prime UTR, Rev5UTRの合成オリゴDNAをハイブリダイズしたのち伸長させて作製した。3'UTRの配列はIVT 3prime UTR,Rev3UTR2T20 の2 本の合成オリゴDNAをハイブリダイズしたのち伸長させて作製した。作製したEGFPORF と5'UTR, 3'UTRを精製した後、混合してリン酸化処理を行ったTAP T7 G3C fwd,Rev3UTR2でPCRを行うことで連結し、PCR産物をpUC19 ベクターへクローニングし、UTRを含むEGFPを作製した(pUC19-EGFPfull)。以後、EGFPの配列はこのプラスミドからPCRすることで取得した。以下の表１に使用した合成オリゴDNAの配列を示す。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
  
  
　作製したpUC19-EGFPfullをテンプレートにして、TAP T7 G3C fwd とmiRNAの相補配列をもつ以下の表２に示すプライマーを使用してPCR を行い、polyA とmiRNAの相補配列を付加した後、Dpn Iでプラスミドを消化した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
  
　［２．3' に付加配列を融合したDNAテンプレートの作製］
　poly A 配列以下に付加することで翻訳を阻害する配列を探索するため、以下の配列を付加した。上記１．で作製したmiRNA応答配列をもつEGFPをテンプレートとして、最終的に3' 末端がM13 配列またはプラスミド上に相補配列のないRn2 配列のいずれかに統一するために、以下の表３に示す合成オリゴDNA をアダプターとして使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
  
　M13配列、またはRn2配列を繋ぎ目（アダプター配列）として、上記１．で作製したEGFPの配列をもつPCR産物と上記の合成オリゴDNA、様々な配列の合成オリゴDNAを混合し、PCRを行うことで様々な3'付加配列をもつ転写用のテンプレートを作製した。以下、作製に用いた3'付加配列の合成オリゴDNAと最終生成物（RNA）をpoly A 配列より下流のみ記載する。poly Uの長さは、下記表４には80のものを具体的に示すが、他に、poly Uの長さが20, 40, 60を作製した。点線の下線部はアダプターを示している。M13 を用いた場合はCAUGGUCAUAGCUGUUUCCUG、M13RV を用いた場合はCCGCUCACAAUUCCACA、Rn2 を用いた場合はGTTACATTGTGCCACGGAGTCGATC となる。テンプレート作製時に非特異的な副産物を防ぐために、3’末端に、GAAUUCUCGCAGCCCGAAGAからなる他の領域の配列と相補しない配列を付加している。
　poly U 配列 を付加したものを、下記の表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
  
　長鎖RNA(500,1200nt 程度) を付加したもののpoly A 配列より下流の配列のみを、下記の表に示す。pGEM-T easy ベクターの領域を下記プライマーで増幅したものをfusion PCR で結合した。表５のRNA配列中、点線の下線部はアダプター配列である。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
  
 
　5'UTRの相補配列を付加したものを、下記の表６に示す。表６のRNA配列中、点線の下線部はアダプター配列であり、ボールド体は5'UTRとの相補配列であり、下線部はstem loopであり、３’末端は他の領域の配列と相補しない配列である。
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
  
　［３．転写］
　転写はMEGA shortscript TM T7 Transcription Kit(Thermo Fisher Scientific) を用いて添付のマニュアルに従って行った。ただし、CAP アナログのARCA をGTP に対し4:1 で加え、CTP, UTP の代わりに5-methyl-cytocine, psuedo-uridine を用い、転写スケールは10μL で行った。転写後、RNA は、DNase I (Thermo FisherScientific) および、rAPid alkaline phosphatase (Roche) を用いてテンプレートDNA の分解と脱リン酸化を行った。反応は、転写反応液10μL に対し、10 x rAPid alkaline phosphatase buffer 4μL, rAPid alkaline phosphatase1μL, Turbo DNase I 0.5μL, H2O 40μL を加え、30 分間37℃でインキュベートすることで行った。 その後、RNA はRNAeasy MiniElute column (QIAgen) またはFavorPrep Blood/Cultured Cells total RNA extraction column (Favorgen Biotech) を用いて精製し、H2Oで溶出し、濃度測定後、最終的に100 ng/μL に調整後-20℃で保存した。
　［４．細胞内導入及び、蛍光の定量］
　24 well プレートへ細胞を播種し(HeLa 0.5 x 105, 293FT1 x 105, iPSC (201B7) 1 x 105)、1日後、トランスフェクション前にメディウムを交換した。細胞内へのRNAのトランスフェクションはStemfect RNA Transfection kit(Stemgent)を用いて、添付のプロトコルに従って行った。使用したRNA量は、内部コントロールであるiRFP670のmRNA 100 ng、EGFPを発現するON switchのRNA 100 ng に対し、1μLのStemfect を用いた。導入から12-24 時間後、蛍光顕微鏡で観察した。その後、Trypsin-EDTA またはAccuMaxで細胞をプレートから剥がしてよく懸濁しメッシュに通して大きな塊を除去した。次いで、Accuri C6を用いて、iRFP670とEGFPの蛍光を定量し、最終的にEGFP/iRFP670の比で定量した。
　実験に用いたmiRNA応答性ON-switch mRNA (第１の人工mRNA)、miRNA応答性OFF-switch mRNA (第２の人工mRNA)、コントロールmRNA (第３の人工mRNA)の配列の名称及び配列番号を下記表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
  
　［結果］
　［１．poly U をmiR-21の相補配列で連結した場合のHeLa細胞または293FT細胞でのEGFPの発現の変化］
　EGFPのpolyA の3'側にmiR-21の相補配列(Tg21)、またはmiR-21の相補配列をシャッフルした配列(N)を挟んで、polyU を付加したmRNAをHeLa細胞へ導入し、FlowcytometerでEGFPの蛍光とリファレンスであるiRFP670の蛍光を測定し、比を計算した（図２）。その結果、シャッフル配列を用いた場合は293FTとHeLa細胞で比の変化はほとんど見られなかったがmiR-21相補配列を用いた場合はHeLa細胞でのみEGFPの蛍光の増大が観察され、miR-21に応答して翻訳がONになることが示された。
　［２．5'UTR の相補配列をmiR-21の相補配列で連結した場合のHeLa細胞でのEGFPの発現量の変化］
　EGFPのpoly A の3' 側にmiR-21の相補配列(Tg21)、またはmiR-21の相補配列をシャッフルした配列(N)を挟んで、pGEM-T easy 由来の配列を付加した場合、または5'UTRの相補配列を付加したmRNAを、iRFP670のmRNAとともに、miR-21が高発現しているHeLa細胞にトランスフェクションした場合のEGFPとiRFP670の発現量を2次元プロットした結果を図３に示す。この結果からN配列を用いた場合に比べ、miR-21の相補配列を含む場合、EGFPの発現量が上昇することが確認された。特に5'UTRの相補配列を付加した場合と、500ntの長い配列を付加した場合でNとTg21での差が大きくなり、集団が明瞭に分離されることが確認された。
　［３．HeLa細胞または293FT細胞内における、miR-21のmimic またはinhibitor に対する応答］
　miR-21が高発現しているHeLa細胞と、発現していない293FT細胞を用いて、Tg21 配列を含むmRNAの応答を確認した。この際、HeLa細胞にはinhibitorを2pmol加えた場合と、inhibitor を加えない場合についてそれぞれ実験を行った。293FT細胞にはmimic を2pmol加えた場合とmimicを加えない場合について、それぞれ実験を行った。結果は、HeLa細胞についてはinhibitorを加えた場合と加えない場合と比較して示した(図４（ａ）)。293FTについては mimicを加えた場合と加えない場合と比較して示した(図４（ｂ）)。その結果、Tg21配列が存在するmRNAは、HeLa細胞ではinhibitorを加えると発現が減少し、293FTではmimicを加えると発現量が増加し、いずれの場合も、miRNAに応答して発現量が増加することが確認された。
　［４．ONスイッチのリファレンスを利用した分離の改善］
　miR-21のOFFスイッチのリファレンスとして使用しているiRFP670のmRNAの代わりにmiR-21応答型のiRFP670のONスイッチをリファレンスとして用いた。これにより、miR-21非存在下ではiRFP670の発現が抑制されるためEGFP/iRFP670の値が大きくなるため、miR-21発現細胞と非発現細胞の集団がより分離すると考えられる。２．で使用した5'UTRの相補配列を同様の方法でiRFP670 のmRNAに付加し、このmRNAとEGFPのmiR-21応答型OFF スイッチとをHeLa細胞、または293FT細胞へトランスフェクションした。結果を図５に示す。EGFPのmiR-21応答型OFF スイッチ単独に比べ、5'UTRの20ntまたは40ntの相補配列をもつiRFP670のmiR-21応答型ONスイッチを用いた場合、ON(HeLa細胞)とOFF(293FT細胞)でより差が開くことを確認した。
　［５．miR-302a-5pの相補配列を挿入したONスイッチによるiPS細胞の識別］
　miR-21の相補配列をmiR-302a-5pの相補配列に交換することで、miR-302a-5pに応答してEGFPの発現が増加するmRNAを作製した。これを293FT細胞とiPS 細胞(201B7)へリファレンスのiRFP670のmRNAと共に導入し、蛍光の発現量をFlowcytometryで解析した。結果を図６に示す。miR-302a-5p の相補配列を含まないEGFPのcontrol mRNAでは293FT細胞とiPS細胞(201B7) の細胞集団が重なるが、miR-302a-5pの相補配列をもつONスイッチを使用した場合、iPS細胞で蛍光の増大が観察され293FT細胞と集団が分離した。 また、中央値でも293FT細胞に比べiPS細胞の方が、4倍程度値が大きくなることが確認され、ONスイッチを用いることで特定のmiRNAをもつ集団を特異的に識別できることが明らかとなった。

Claims (9)

  1. 　蛋白質遺伝子をコードする配列と、PolyA配列の3'側に連結したmiRNA標的配列と、前記miRNA標的配列の3'側に連結した翻訳抑制配列とを含む人工mRNA。
  2. 　前記翻訳抑制配列が、
    （ｉ）PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列、
    （ｉｉ）5'UTRを特異的に認識する配列、及び
    （ｉｉｉ）１００塩基以上の配列
    から選択される配列を含む、請求項１に記載の人工mRNA。
  3. 　miRNAの発現に応答して、蛋白質遺伝子を発現させる方法であって、請求項１または２に記載の人工mRNAを細胞に導入する工程を含む、方法。
  4. 　以下の工程を含む、２種以上の細胞を含む細胞群からmiRNAの発現を指標として所望の細胞種を判別する方法；
    （１）第１のマーカー遺伝子をコードする配列と、PolyA配列の3'側に連結した第１のmiRNAの標的配列と、前記第１のmiRNAの標的配列の3'側に連結した翻訳抑制配列とを含む第１の人工mRNAを細胞群に導入する工程、および
    （２）当該第１のマーカー遺伝子の翻訳量を指標として、細胞種を判別する工程。
  5. 　前記翻訳抑制配列が、
    （ｉ）PolyA配列を特異的に認識する２０以上の塩基配列、
    （ｉｉ）5'UTRを特異的に認識する配列、及び
    （ｉｉｉ）１００塩基以上の配列から選択される配列を含む、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記所望の細胞種が、第１のmiRNAの発現量が多い細胞種であり、前記工程（２）が、
    前記第１のマーカー遺伝子の翻訳量が多い細胞種を判別する工程である、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記第１のmiRNAの標的配列が、miR-302ａの標的配列を含み、前記所望の細胞種が、多能性幹細胞である、請求項４～６のいずれか１項に記載の方法。
  8. （３）第２のmiRNAの標的配列と機能的に連結した第２のマーカー遺伝子を含む第２の人工mRNAを導入する工程をさらに含む、請求項４～７のいずれか１項に記載の方法であって、
    　当該第２のmiRNAの標的配列が、前記第１のmiRNAの標的配列と同一のmiRNAにより特異的に認識される配列であり、
    　当該第２のマーカー遺伝子が、前記第１のマーカー遺伝子と異なり、
    　当該第２の人工mRNAが、前記miRNAの発現量に応答して、前記第２のマーカー遺伝子の翻訳量を低減させる人工mRNAである、方法。
  9. （４）miRNAの標的配列を含まず、第３のマーカー遺伝子を含む第３の人工mRNAを導入する工程をさらに含む、請求項４～８のいずれか１項に記載の方法であって、
    　当該第３のマーカー遺伝子が、前記第１及び第２のマーカー遺伝子と異なり、
    　当該第３の人工mRNAが、前記miRNAの発現量による影響を受けることなく、前記第３のマーカー遺伝子を翻訳する、方法。
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