JP2023121261A - インプラント材料を評価するための改変骨芽細胞様細胞 - Google Patents
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Abstract
【課題】本発明は、インプラント材料の正確な評価のために、細胞カウントと生きた状態の細胞の観察とを両立することができる全く新しいインプラント材料の細胞適合性評価方法を確立することを目的とした。【解決手段】複数の異なる蛍光タンパク質を発現する骨芽細胞様細胞であって、少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核において発現し、前記蛍光タンパク質と異なる少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する、前記骨芽細胞様細胞によって上記課題は解決された。【選択図】図５
Description
本発明は、インプラント材料を評価するための改変骨芽細胞様細胞および該細胞を用いたインプラント材料の細胞適合性を評価する方法に関する。
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞は、新生児Ｃ５７ＢＬ／６マウス頭蓋冠から樹立された細胞株である。ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞は、増殖能力が高く、優れた石灰化能力を有していることから、歯科用チタンインプラントの表面粗さの骨形成能への影響の評価（非特許文献１）や、チタンおよびジルコニウムの硬組織適合性の類似性の確認（非特許文献２）などに用いられる。また、日本工業規格ＪＩＳ Ｔ０３０１：２０００（金属系インプラント材料の細胞適合性評価方法）においても、チタンやジルコニウムなどの金属系インプラント材料の細胞適合性の評価に用いられている。
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を改変した例として、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞に蛍光タンパク質を導入した例が知られている。例えば、非特許文献３においては、インプラント材料内に封入したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を可視化するために蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が導入されており、ペプチド両親媒性物質のナノファイバーマトリックスにより充填された多孔性のＴｉ－６Ａ－４Ｖフォームからなるハイブリッド骨インプラント材料の評価において用いられている。さらに、非特許文献４においては、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１に蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が導入されており、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１とＭＬＯ－Ｙ４との細胞間相互作用を調査する際に、ＭＬＯ－Ｙ４との共培養からのフローサイトメトリーによる単離のために用いられている。
また、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞株は、同じ親株から樹立したサブクローン、または細胞バンク（ＡＴＣＣ）により配布されているサブクローンにおいても、分化能を維持している株および分化能を維持していない株の両方が存在するという不安定性の問題が生じる場合があった（非特許文献５および６）。
従来、インプラント材料の細胞適合性評価として、ニュートラルレッド法、ＭＴＴ法などの細胞カウント方法が用いられていたが（例えば、ＪＩＳ Ｔ０３０１：２０００）、細胞数の測定の際に、細胞の固定や、呈色のための薬剤処理などの工程を要するものであった。
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Yoichi Nishikawa et al., Biochemical and Biophysical Research Communications 456 (2015) 1-6
本発明者らは、より正確なインプラント材料の評価のためには、従来実施されていた細胞接着や細胞増殖に関する評価に加えて、生きた状態の細胞を観察する必要があると考えた。しかしながら、従来のニュートラルレッド法やＭＴＴ法などの細胞カウント方法では、細胞の固定を行うことになり、１つのインプラント材料に対して細胞カウントと生きた状態の細胞の観察とを同時に行うことができないとの問題に直面した。本発明者らは、インプラント材料の正確な評価のために、細胞カウントと生きた状態の細胞の観察とを両立することができる全く新しいインプラント材料の細胞適合性評価方法を確立することを目的とした。
したがって本発明の課題は、従来不可能であったインプラント材料上で生きた状態の細胞を用いながらインプラント材料の細胞適合性をより正確に評価する方法を提供することである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究する中で、骨芽細胞様細胞の核および核以外の部分に、夫々、異なる蛍光色の蛍光タンパク質を発現させた改変骨芽細胞様細胞を用いることで、細胞を固定することなく、核において発現する蛍光タンパク質を観察することにより、細胞数を計測するのと同時に、核以外において発現する蛍光タンパク質を観察することにより、細胞の形態などの細胞の状態について同時に評価することができるとの知見を得た。かかる知見に基づき、さらに研究を進めた結果、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下に関する。
［１］骨芽細胞様細胞を改変して複数の異なる蛍光タンパク質を発現する改変骨芽細胞様細胞であって、少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核において発現し、前記蛍光タンパク質と異なる少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する、前記改変骨芽細胞様細胞。
［２］核において発現する少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する任意の蛍光タンパク質よりも強く発光する、前記［１］に記載の改変骨芽細胞様細胞。
［３］核において発現する少なくとも１つの蛍光タンパク質が、ｔｄＴＯＭＡＴＯであり、核以外で発現する蛍光タンパク質がＥＧＦＰである、前記［１］または［２］に記載の改変骨芽細胞様細胞。
［４］骨芽細胞様細胞が、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞である、前記［１］～［３］のいずれか１つに記載の改変骨芽細胞様細胞。
［５］細胞増殖率が、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の細胞増殖率の±６０％である、前記［１］～［４］のいずれか１つに記載の改変骨芽細胞様細胞。
［６］ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞よりも高い分化誘導能を有する、前記［１］～［５］のいずれか１つに記載の改変骨芽細胞様細胞。
［７］ＮＩＴＥ Ｐ－０３５８２（受託番号）で表される、改変骨芽細胞様細胞。
［１］骨芽細胞様細胞を改変して複数の異なる蛍光タンパク質を発現する改変骨芽細胞様細胞であって、少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核において発現し、前記蛍光タンパク質と異なる少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する、前記改変骨芽細胞様細胞。
［２］核において発現する少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する任意の蛍光タンパク質よりも強く発光する、前記［１］に記載の改変骨芽細胞様細胞。
［３］核において発現する少なくとも１つの蛍光タンパク質が、ｔｄＴＯＭＡＴＯであり、核以外で発現する蛍光タンパク質がＥＧＦＰである、前記［１］または［２］に記載の改変骨芽細胞様細胞。
［４］骨芽細胞様細胞が、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞である、前記［１］～［３］のいずれか１つに記載の改変骨芽細胞様細胞。
［５］細胞増殖率が、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の細胞増殖率の±６０％である、前記［１］～［４］のいずれか１つに記載の改変骨芽細胞様細胞。
［６］ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞よりも高い分化誘導能を有する、前記［１］～［５］のいずれか１つに記載の改変骨芽細胞様細胞。
［７］ＮＩＴＥ Ｐ－０３５８２（受託番号）で表される、改変骨芽細胞様細胞。
［８］蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞を用いることを含む、インプラント材料の細胞適合性を評価する方法。
［９］蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞が、少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核において発現し、前記蛍光タンパク質と異なる少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する改変骨芽細胞様細胞である、前記［８］に記載の方法。
［１０］インプラント材料の細胞適合性の評価が、インプラント材料の表面が及ぼす、細胞増殖、細胞の遊走、細胞の伸長および／または分化誘導能に対する影響を評価することである、前記［９］に記載の方法。
［１１］インプラント材料の細胞適合性が、経時的に評価される、前記［８］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］インプラント材料の表面が及ぼす、細胞増殖、細胞の遊走および／または細胞の伸長に対する影響を、分化誘導能に対する影響と同時に評価する、前記［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］インプラント材料が、光非透過性材料である、前記［８］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞が、前記［１］～［７］のいずれか１つに記載の改変骨芽細胞様細胞である、前記［８］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
［９］蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞が、少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核において発現し、前記蛍光タンパク質と異なる少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する改変骨芽細胞様細胞である、前記［８］に記載の方法。
［１０］インプラント材料の細胞適合性の評価が、インプラント材料の表面が及ぼす、細胞増殖、細胞の遊走、細胞の伸長および／または分化誘導能に対する影響を評価することである、前記［９］に記載の方法。
［１１］インプラント材料の細胞適合性が、経時的に評価される、前記［８］～［１０］のいずれか１つに記載の方法。
［１２］インプラント材料の表面が及ぼす、細胞増殖、細胞の遊走および／または細胞の伸長に対する影響を、分化誘導能に対する影響と同時に評価する、前記［１０］または［１１］に記載の方法。
［１３］インプラント材料が、光非透過性材料である、前記［８］～［１２］のいずれか１つに記載の方法。
［１４］蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞が、前記［１］～［７］のいずれか１つに記載の改変骨芽細胞様細胞である、前記［８］～［１３］のいずれか１つに記載の方法。
本発明は、細胞を固定することなく、細胞を生きた状態のままで容易に細胞数を計測することができる。さらに本発明は、細胞数の計測のために細胞を破壊や固定することがなく、細胞を生きた状態で維持できるため、同一インプラント材料上の同一細胞を繰り返し評価することができ、簡便に経時的な評価が可能である。
また本発明は、従来のニュートラルレッド法やＭＴＴ法などのように測定された吸光度の値から換算する必要がなく、細胞の核の数を直接計測できることから、より正確な細胞数を評価することができる。さらに本発明は、従来法のように、呈色のための薬剤処理をすることも、処理した細胞を数時間インキュベートすることも不要であるため、安価かつ簡便に、短時間で細胞数を計測することが可能である。
また本発明は、インプラント材料の生体適合性を評価するための細胞に対して、固定することも、呈色のための薬剤処理をすることも必要としない。さらに本発明は、インプラント材料において細胞を生存したまま維持することができるため、インプラント材料の表面が及ぼす、細胞増殖、細胞の遊走、細胞の伸長、細胞の分化誘導能に対する影響などについて、正確に評価することができる。また本発明は、細胞を生きた状態で維持しながらインプラント材料を評価できることから、複数のサンプルを用意する必要がなく、１つのサンプルに対して、細胞増殖、細胞の遊走、細胞の伸長、細胞の分化誘導能などの評価を行うことができる。
本発明は、少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核において発現し、前記蛍光タンパク質と異なる少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する、複数の異なる蛍光タンパク質を発現する骨芽細胞様細胞に関する。
本発明において用いることができる蛍光タンパク質は、とくに限定されないが、例えば、（ｉ）Ｓｉｒｉｕｓ、ＥＢＦＰなどの青色蛍光タンパク質、（ｉｉ）ＥＣＦＰ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、ＴａｇＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ、ｍＴＦＰ１、ＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉＣｙａｎ、ＣＦＰなどのシアン色蛍光タンパク質、（ｉｉｉ）ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＴａｇＧＦＰ、Ａｚａｍｉ－Ｇｒｅｅｎ、ＺｓＧｒｅｅｎ、ＥｍＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＧＦＰ２、ＨｙＰｅｒなどの緑色蛍光タンパク質、（ｉｖ）ＴａｇＹＦＰ、ＥＹＦＰ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ－ｍ、ＴｕｒｂｏＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ、ｍＢａｎａｎａなどの黄色蛍光タンパク質、（ｖ）ＫｕｓａｂｉｒａＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅなどの橙色蛍光タンパク質、（ｖｉ）ＴｕｒｂｏＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＴａｇＲＦＰ、ＤｓＲｅｄ－Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙなどの赤色蛍光タンパク質、（ｖｉｉ）ＴｕｒｂｏＦＰ６０２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ＫｉｌｌｅｒＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ＨｃＲｅｄ、ＫｅｉｍａＲｅｄ、ＦａｒＲｅｄ、ｍＲａｓｂｅｒｒｙ、ｍＰｌｕｍ、Ｅ２－Ｃｒｉｍｓｏｎなどの遠赤色蛍光タンパク質、（ｖｉｉｉ）ＰＳ－ＣＦＰ、Ｄｅｎｄｒａ２、Ｋａｅｄｅ、ＥｏｓＦＰ、ＫｉｋｕｍｅＧＲなどの光変換蛍光タンパク質などが挙げられる。
本発明において、核において発現する蛍光タンパク質と、核以外で発現する蛍光タンパク質との組合せは、例えば、上述した緑色蛍光タンパク質の群から選択されるものと赤色蛍光タンパク質の群から選択されるものとの組合せ、青色蛍光タンパク質の群から選択されるものと黄色蛍光タンパク質の群から選択されるものとの組合せ、青色蛍光タンパク質の群から選択されるものと赤色蛍光タンパク質の群から選択されるものとの組合せ、であってもよい。それぞれの蛍光波長で干渉が起こらず、かつ、検出機器の設定として標準で装備されていることが多い波長であるとの観点から、緑色蛍光タンパク質の群から選択されるものと赤色蛍光タンパク質の群から選択されるものとの組合せが好ましい。
本発明において、核において発現する蛍光タンパク質と、核以外で発現する蛍光タンパク質との具体的な組合せは、例えば、ｔｄＴｏｍａｔｏとＥＧＦＰ、ＡｓＲｅｄ２とＡｍＣｙａｎ、ＤｓＲｅｄ２とＡｃＧＦＰ、ＨｃＲｅｄとＺｓＧｒｅｅｎ、などが挙げられる。蛍光強度やタンパク質の安定性の観点から、ｔｄＴｏｍａｔｏとＥＧＦＰとの組合せが好ましい。とくに、動植物の持つ自家蛍光の影響を受けにくく蛍光強度が高いとの観点から、核において発現する蛍光タンパク質としてｔｄＴｏｍａｔｏを用い、核以外で発現する蛍光タンパク質としてＥＧＦＰを用いることが好ましい。
本発明において、核以外で発現する蛍光タンパク質の発現部位は、とくに限定されないが、例えば、細胞質、ミトコンドリア、ゴルジ体、小胞体、細胞膜、リソソーム、ペルオキシソーム、などが挙げられる。核以外の発現部位は、細胞の形態を観察できるとの観点から、細胞質であることが好ましい。
本発明において、核において発現する蛍光タンパク質と、核以外で発現する蛍光タンパク質との組合せは、夫々を識別可能な組合せであれば、とくに限定されない。蛍光タンパク質の識別には、蛍光の発光強度、蛍光の波長、減衰時間などを利用することができる。したがって、例えば、１つの蛍光タンパク質が、他の蛍光タンパク質よりも、強く発光する組合せや、蛍光の波長が異なる組合せ、減衰までの時間の差を用いることができる。
発する蛍光により細胞数を計測することが容易となることなどから、核において発現する蛍光タンパク質が、核以外で発現するいずれの蛍光タンパク質よりも強く発光することが好ましい。例えば、蛍光タンパク質の発光の強さが、その蛍光強度に依存する場合に、核において発現するタンパク質の蛍光強度は、核以外で発現する蛍光タンパク質の蛍光強度の１．１倍以上であればよい。核において発現するタンパク質の蛍光強度は、核以外で発現する蛍光タンパク質の蛍光強度に対して、１．１倍～１６０倍程度であればよく、好ましくは１．１倍～７０倍程度、さらに好ましくは１．５倍～５倍程度、とくに好ましくは２倍～４倍程度である。
本発明において用い得る骨芽細胞様細胞は、インプラント材料の評価に用いることができるものであれば、とくに限定されない。かかる細胞として、例えば、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞、ＳａＯＳ－２、Ｈｓ－Ｏｓ－１、ＲＯＳ１７／２．８、ＨＯＳ、ＭＧ６３などが挙げられる。これらの骨芽細胞様細胞のうち、細胞の性質が詳細に明らかになっており、ＪＩＳ Ｔ０３０１：２０００などにおいて指標となる細胞株として用いられているなどの観点から、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞が好ましい。
本発明の改変骨芽細胞様細胞は、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞と同程度の細胞増殖能を有することが望ましい。細胞増殖能は、夫々の細胞を培養した際、一定間隔で細胞数を計測して算出される細胞増殖率などにより確認できる。
一態様において、本発明の改変骨芽細胞様細胞の細胞増殖率は、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の細胞増殖率の、±６０％程度、好ましくは±３０％程度、とくに好ましくは±１５％程度である。
一態様において、本発明の改変骨芽細胞様細胞の細胞増殖率は、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の細胞増殖率の、±６０％程度、好ましくは±３０％程度、とくに好ましくは±１５％程度である。
本発明の改変骨芽細胞様細胞は、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞と比較して、高い分化誘導能を有する。
骨芽細胞様細胞の分化誘導能は、例えば、石灰化誘導能である。石灰化誘導能は、例えば、夫々の細胞に対して、石灰化を誘導したのちのアリザリン染色による呈色により確認できる。または石灰化誘導能は、骨分化マーカー遺伝子の発現レベルによっても確認できる。骨分化マーカー遺伝子に関して、石灰化しやすい細胞株において骨後期分化マーカーである、ＩｂｓｐおよびＢｇｌａｐの発現量が多く、in vivoでの骨化と相関することは当業者に周知である（例えば、DIAN WANG et al., JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESERCH, Volume 14, Number 6, 1999: 893-903を参照する）。
骨芽細胞様細胞の分化誘導能は、例えば、石灰化誘導能である。石灰化誘導能は、例えば、夫々の細胞に対して、石灰化を誘導したのちのアリザリン染色による呈色により確認できる。または石灰化誘導能は、骨分化マーカー遺伝子の発現レベルによっても確認できる。骨分化マーカー遺伝子に関して、石灰化しやすい細胞株において骨後期分化マーカーである、ＩｂｓｐおよびＢｇｌａｐの発現量が多く、in vivoでの骨化と相関することは当業者に周知である（例えば、DIAN WANG et al., JOURNAL OF BONE AND MINERAL RESERCH, Volume 14, Number 6, 1999: 893-903を参照する）。
本発明の改変骨芽細胞様細胞は、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞よりも、高いレベルで骨後期分化マーカーを発現する。本発明の改変骨芽細胞様細胞は、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞よりも、好ましくは８倍以上、より好ましくは９倍以上の高いレベルで骨後期分化マーカーを発現する。
本発明の改変骨芽細胞様細胞の調製は、一般的な遺伝子導入方法を用いて行うことができる。例えば、目的の蛍光タンパク質遺伝子（核において発現する蛍光タンパク質に関しては、核移行シグナルを付した遺伝子）を組み込んだ遺伝子発現ベクターとポリエチレンイミンなどのトランスフェクション試薬を用いることにより行うことができる。ベクターとしては、pCAGGSベクター（RIKEN BRC DNA BANK）のクローニングサイトにオリゴリンカーを導入し、クローニングに用いることができる制限酵素サイトを増やしたベクター、ピューロマイシンなどの薬剤耐性遺伝子を挿入したpPB-CAG.EBNXN（Wellcome Trust Sanger Institute）ベクター、などが用いられ得る。遺伝子発現ベクターにピューロマイシンなどの抗生物質の耐性遺伝子などを併せて組み込むことで、発現する抗生物質耐性により遺伝子導入された細胞を選択してもよい。
一態様において、本発明の改変骨芽細胞様細胞は、本出願人らによって、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞に、ｔｄＴｏｍａｏ遺伝子（addgeneから入手）およびＥＧＦＰ遺伝子（GenBank: U55761.1参照）を導入された改変骨芽細胞様細胞（改変ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞）である。かかる細胞は、本発明者らにより、令和４年（２０２２年）１月５日付けにて、独立行政法人製品評価技術基盤機構 特許微生物センターに寄託され、受託番号「ＮＩＴＥ Ｐ－０３５８２」が付されている。また、かかる細胞は、継代培養の後も十分な分化能を維持しており、インプラント材料の評価方法に用いる細胞株として十分な安定性を備えていた。
本発明は、別の側面において、蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞を用いることを含む、インプラント材料の細胞適合性を評価する方法に関する。
本発明において、インプラント材料の細胞適合性は、インプラント材料の表面が及ぼす、細胞増殖、細胞の遊走、細胞の伸長、分化誘導能などに対する影響により評価することができる。
本発明において、インプラント材料の細胞適合性は、インプラント材料の表面が及ぼす、細胞増殖、細胞の遊走、細胞の伸長、分化誘導能などに対する影響により評価することができる。
一態様において、本発明の方法に用いられる蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞は、少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核において発現し、前記蛍光タンパク質と異なる少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する骨芽細胞様細胞である。一態様において、本発明に用いられる、蛍光タンパク質によって標識された骨芽細胞様細胞は、本明細書に記載の改変骨芽細胞様細胞または受託番号：ＮＩＴＥ Ｐ－０３５８２として寄託された上記の改変ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞である。
本発明においては、細胞を、破壊や固定することなしに細胞数の計測や細胞形態の観察することができる。観察は、断続的または連続的に行うことができる。経時的な観察により、インプラント材料の細胞適合性をより詳細に評価することができる。
一態様において、インプラント材料の細胞適合性は、細胞増殖により評価される。細胞増殖は、例えば、評価したいインプラント材料上と陰性対照（細胞に対する悪影響がないことが既知であるインプラント材料または培養シャーレなど）上で同一条件にて一定期間培養した際の、陰性対照での細胞数に対する評価したいインプラント材料での細胞数の比により評価することができる。かかる場合においては、算出された比が１より小さくなるにつれて評価したいインプラント材料の細胞増殖阻害作用が強いといえる。
一態様において、インプラント材料の細胞適合性は、細胞の遊走により評価される。細胞の遊走は、評価したいインプラント材料上に播種した、同一の細胞を経時的に観察し続けることによって確認することができる。
一態様において、インプラント材料の細胞適合性は、細胞の伸長により評価される。細胞の伸長は、評価したいインプラント材料上に播種した、同一の細胞を経時的に観察し続けることによって確認することができる。
一態様において、インプラント材料の細胞適合性は、分化誘導能、例えば、石灰化誘導能を測定することにより評価される。石灰化誘導能は、評価したいインプラント材料上に播種した細胞に対して、石灰化を誘導し、かかる細胞をアリザリン染色することによって確認することができる。
本発明の評価方法の対象となるインプラント材料は、皮下、筋肉、骨組織内などの生体内に埋め込まれて、生体組織と直接接触して使用されるものであれば特に限定されない。本発明の評価方法は、インプラント材料の候補となる材料に対して広く用いることができる。例えば、従来、骨芽細胞様細胞を用いて評価されているインプラント材料を再評価することも可能である。
本発明の評価方法の対象となるインプラント材料の用途は、とくに限定されないが、例えば、歯科用、脊椎用、関節用などが挙げられる。本発明の評価方法では、骨芽細胞に接触する、または骨芽細胞に近接して用いられるインプラント材料のように、骨芽細胞様細胞を用いて評価し得る材料を対象とすることが好ましい。
さらに本発明の評価方法では、蛍光を用いて観察することが適したインプラント材料を評価するのに有効である。本発明の評価方法の対象となるインプラント材料としては、光非透過性材料であっても、光透過性材料であってもよい。本発明の評価方法は、従来、評価が困難であった光非透過性材料において、インプラント材料としての評価が可能である。
本発明の評価方法は、とくに金属系インプラント材料を評価するのに好適に用いることができる。評価対象となる金属系インプラント材料には、純チタン、チタン合金（例として、チタン合金α＋β型Ｔｉ－６Ａ－４Ｖ）、Ｃｏ－Ｃｒ合金、ステンレス（３１６）などが含まれ得る。
本発明の評価方法は、金属系インプラント材料以外のインプラント材料を評価するのにもまた用いることができる。かかるインプラント材料には、樹脂材料（例として、ＰＥＥＫ、ＰＴＦＥ、ＵＨＭＷＰＥ）などが含まれ得る。
本発明の評価方法の対象となるインプラント材料の用途は、とくに限定されないが、例えば、歯科用、脊椎用、関節用などが挙げられる。本発明の評価方法では、骨芽細胞に接触する、または骨芽細胞に近接して用いられるインプラント材料のように、骨芽細胞様細胞を用いて評価し得る材料を対象とすることが好ましい。
さらに本発明の評価方法では、蛍光を用いて観察することが適したインプラント材料を評価するのに有効である。本発明の評価方法の対象となるインプラント材料としては、光非透過性材料であっても、光透過性材料であってもよい。本発明の評価方法は、従来、評価が困難であった光非透過性材料において、インプラント材料としての評価が可能である。
本発明の評価方法は、とくに金属系インプラント材料を評価するのに好適に用いることができる。評価対象となる金属系インプラント材料には、純チタン、チタン合金（例として、チタン合金α＋β型Ｔｉ－６Ａ－４Ｖ）、Ｃｏ－Ｃｒ合金、ステンレス（３１６）などが含まれ得る。
本発明の評価方法は、金属系インプラント材料以外のインプラント材料を評価するのにもまた用いることができる。かかるインプラント材料には、樹脂材料（例として、ＰＥＥＫ、ＰＴＦＥ、ＵＨＭＷＰＥ）などが含まれ得る。
以下、本発明について実施例に基づいてさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないことは言うまでもない。
培地
以下の実施例において、培地は次の組成のものを使用した。
増殖培地：α－ＭＥＭ（ナカライテスク、型番２１４４４－０５）に、ＦＢＳ（Gibco、型番１０４３７）を１０％となるように、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１０，０００Ｕ／ｍＬ）（Gibco、型番１５１４０－１２２）を１％となるように添加したもの。
石灰化培地：増殖培地に１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸、０．５Ｍβグリセロリン酸を１／１００量添加したもの。
以下の実施例において、培地は次の組成のものを使用した。
増殖培地：α－ＭＥＭ（ナカライテスク、型番２１４４４－０５）に、ＦＢＳ（Gibco、型番１０４３７）を１０％となるように、およびＰｅｎｉｃｉｌｌｉｎ－Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（１０，０００Ｕ／ｍＬ）（Gibco、型番１５１４０－１２２）を１％となるように添加したもの。
石灰化培地：増殖培地に１０ｍｇ／ｍＬアスコルビン酸、０．５Ｍβグリセロリン酸を１／１００量添加したもの。
器具・機器
以下の実施例において、使用された器具および機器を次に列挙する。
・１０ｃｍディッシュ（Thermo Fisher Scientific、型番１３０１８２）
・９６ウェルプレート（FALCON、型番３５３０７２）
・４８ウェルプレート（FALCON、型番３５３０７８）
・２４ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific、型番９３０１８６）
・１２ウェルプレート（TrueLine、型番ＴＲ５００１）
・正立蛍光顕微鏡（Leica DM5000 B）
・超微量分光光度計NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific）
・QuantStudio 3 リアルタイムＰＣＲシステム（Thermo Fisher Scientific）
以下の実施例において、使用された器具および機器を次に列挙する。
・１０ｃｍディッシュ（Thermo Fisher Scientific、型番１３０１８２）
・９６ウェルプレート（FALCON、型番３５３０７２）
・４８ウェルプレート（FALCON、型番３５３０７８）
・２４ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific、型番９３０１８６）
・１２ウェルプレート（TrueLine、型番ＴＲ５００１）
・正立蛍光顕微鏡（Leica DM5000 B）
・超微量分光光度計NanoDrop One（Thermo Fisher Scientific）
・QuantStudio 3 リアルタイムＰＣＲシステム（Thermo Fisher Scientific）
例１．蛍光タンパク質発現ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の作製
（１）ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞への蛍光タンパク質の導入
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（RIKEN BRC、細胞番号：ＲＣＢ１１２６）を１０ｃｍディッシュに２～４×１０５細胞／１０ｃｍディッシュとなるように播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培地として増殖培地を用いた。
・培養２日目に、８００μＬのα－ＭＥＭ（ナカライテスク、型番２１４４４－０５）にＤＮＡ（pCAG-hyPBase ８μｇ、pPB-CAG-EGFP-puro ４μｇ、およびpPB-CAG-nls-tdTOMATO-puro ４μｇ）を加えたＡ液と８００μＬのα－ＭＥＭに４８μＬのポリエチレンイミン（Polysciences、型番２４７６５）を加えたＢ液とを混合した。この混合液を、室温で１５分間静置した後、８００μＬを培地に添加した。
・培養４日目に、ピューロマイシンを６μｇ／ｍＬとなるように添加した。
・培養１１日目に細胞を回収し細胞のクローン化を実施した。
用いたpCAG-hyPBase、pPB-CAG-EGFP-puro、およびpPB-CAG-nls-tdTOMATO-puroの概略図を夫々図１～図３に示す。
なお、図中の記号は、以下の意味を示す。
［図１］
HyPBase：hyperactive piggyBacトランスポザーゼ
pCAG-1：マルチクローニングサイトを付加したpCAGGSベクター
［図２］
ｐＢ５’ＴＲ：5’ piggyBacトランスポゾン特異性末端逆位配列
ＣＡＧ：ＣＡＧプロモーター
ＥＧＦＰ：ＥＧＦＰ遺伝子
rabbit βglobin pA：ウサギβグロビンのポリＡ付加シグナル
puromycin：ピューロマイシン耐性遺伝子
ｐＢ３’ＴＲ：3’ piggyBacトランスポゾン特異性末端逆位配列
pPB-CAG.EBNXN-puro：ピューロマイシン耐性遺伝子を有するPiggyBacトランスポゾンベクター
［図３］
ｐＢ５’ＴＲ：5’ piggyBacトランスポゾン特異性末端逆位配列
ＣＡＧ：ＣＡＧプロモーター
Ｎｌｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏ：核局在化シグナルを付加したｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子
rabbit βglobin pA：ウサギβグロビンのポリＡ付加シグナル
puromycin：ピューロマイシン耐性遺伝子
ｐＢ３’ＴＲ：3’ piggyBacトランスポゾン特異性末端逆位配列
pPB-CAG.EBNXN-puro：ピューロマイシン耐性遺伝子を有するPiggyBacトランスポゾンベクター
pCAG-hyPBase、pPB-CAG-EGFP-puroおよびpPB-CAG-nls-tdTOMATO-puroは、以下のように調製することが可能である。
（ａ）pCAG-hyPBaseの調製
pCMV-hyPBase(Wellcome Trust Sanger Institute)からKpnI-XhoIを用いてHyPBaseを切り出し、pCAG-1の同サイトにクローニングした。
（ｂ）pPB-CAG-EGFP-puroの調製
pPB-CAG.EBNXN(Wellcome Trust Sanger Institute)のBamHIサイトにピューロマイシン耐性遺伝子を挿入し、BglII-XhoIサイトに５’側にKpnIサイトを付加したＥＧＦＰ遺伝子を挿入した。
（ｃ）pPB-CAG-nls-tdTOMATO-puroの調製
pPB-CAG-EGFP-puroにおいてＥＧＦＰをKpnI-XhoIを用いて取り除き、代わりにＮｌｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏを挿入した。Ｎｌｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏは、pCAG-tdTOMATO（addgene、型番：８３０２９）からＰＣＲにより増幅したｔｄＴｏｍａｔｏに核局在化シグナルを付加して調製した。
（１）ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞への蛍光タンパク質の導入
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞（RIKEN BRC、細胞番号：ＲＣＢ１１２６）を１０ｃｍディッシュに２～４×１０５細胞／１０ｃｍディッシュとなるように播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培地として増殖培地を用いた。
・培養２日目に、８００μＬのα－ＭＥＭ（ナカライテスク、型番２１４４４－０５）にＤＮＡ（pCAG-hyPBase ８μｇ、pPB-CAG-EGFP-puro ４μｇ、およびpPB-CAG-nls-tdTOMATO-puro ４μｇ）を加えたＡ液と８００μＬのα－ＭＥＭに４８μＬのポリエチレンイミン（Polysciences、型番２４７６５）を加えたＢ液とを混合した。この混合液を、室温で１５分間静置した後、８００μＬを培地に添加した。
・培養４日目に、ピューロマイシンを６μｇ／ｍＬとなるように添加した。
・培養１１日目に細胞を回収し細胞のクローン化を実施した。
用いたpCAG-hyPBase、pPB-CAG-EGFP-puro、およびpPB-CAG-nls-tdTOMATO-puroの概略図を夫々図１～図３に示す。
なお、図中の記号は、以下の意味を示す。
［図１］
HyPBase：hyperactive piggyBacトランスポザーゼ
pCAG-1：マルチクローニングサイトを付加したpCAGGSベクター
［図２］
ｐＢ５’ＴＲ：5’ piggyBacトランスポゾン特異性末端逆位配列
ＣＡＧ：ＣＡＧプロモーター
ＥＧＦＰ：ＥＧＦＰ遺伝子
rabbit βglobin pA：ウサギβグロビンのポリＡ付加シグナル
puromycin：ピューロマイシン耐性遺伝子
ｐＢ３’ＴＲ：3’ piggyBacトランスポゾン特異性末端逆位配列
pPB-CAG.EBNXN-puro：ピューロマイシン耐性遺伝子を有するPiggyBacトランスポゾンベクター
［図３］
ｐＢ５’ＴＲ：5’ piggyBacトランスポゾン特異性末端逆位配列
ＣＡＧ：ＣＡＧプロモーター
Ｎｌｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏ：核局在化シグナルを付加したｔｄＴｏｍａｔｏ遺伝子
rabbit βglobin pA：ウサギβグロビンのポリＡ付加シグナル
puromycin：ピューロマイシン耐性遺伝子
ｐＢ３’ＴＲ：3’ piggyBacトランスポゾン特異性末端逆位配列
pPB-CAG.EBNXN-puro：ピューロマイシン耐性遺伝子を有するPiggyBacトランスポゾンベクター
pCAG-hyPBase、pPB-CAG-EGFP-puroおよびpPB-CAG-nls-tdTOMATO-puroは、以下のように調製することが可能である。
（ａ）pCAG-hyPBaseの調製
pCMV-hyPBase(Wellcome Trust Sanger Institute)からKpnI-XhoIを用いてHyPBaseを切り出し、pCAG-1の同サイトにクローニングした。
（ｂ）pPB-CAG-EGFP-puroの調製
pPB-CAG.EBNXN(Wellcome Trust Sanger Institute)のBamHIサイトにピューロマイシン耐性遺伝子を挿入し、BglII-XhoIサイトに５’側にKpnIサイトを付加したＥＧＦＰ遺伝子を挿入した。
（ｃ）pPB-CAG-nls-tdTOMATO-puroの調製
pPB-CAG-EGFP-puroにおいてＥＧＦＰをKpnI-XhoIを用いて取り除き、代わりにＮｌｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏを挿入した。Ｎｌｓ－ｔｄＴｏｍａｔｏは、pCAG-tdTOMATO（addgene、型番：８３０２９）からＰＣＲにより増幅したｔｄＴｏｍａｔｏに核局在化シグナルを付加して調製した。
（２）クローン化
（１）において蛍光タンパク質を導入したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Gibco、型番２５２００）を用いて剥離し、２細胞／ｍＬとなるように増殖培地で懸濁した。この懸濁液を９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。
培養後、各ウェルの観察を行い、細胞のコロニーが出現したウェルから細胞を剥離して、１２ウェルプレートに全量継代した。
同様に、１２ウェルプレートでの培養後、各ウェルの観察を行い、蛍光タンパク質を強く発現しているクローンを６個選択し、それらを直径６ｃｍのディッシュに全量継代した。そこからさらに強く蛍光タンパク質を発現しているクローンを３個選択し、最終的に直径１０ｃｍのディッシュに全量継代した。
直径６ｃｍのディッシュに継代された６個のクローンから取得した蛍光顕微鏡画像を図４に示す（左から順にＣｌｏｎｅ１～６と称する）。上段の蛍光（緑）が細胞質を、下段の蛍光（赤）が細胞の核を示す。これら６個のクローンのうちＣｌｏｎｅ１、２および４が蛍光タンパク質を強く発現していた。Ｃｌｏｎｅ１、２および４を直径１０ｃｍのディッシュに継代した後に取得した蛍光顕微鏡画像を、夫々図５Ａ～Ｃに示す。
（１）において蛍光タンパク質を導入したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡ（Gibco、型番２５２００）を用いて剥離し、２細胞／ｍＬとなるように増殖培地で懸濁した。この懸濁液を９６ウェルプレートに１００μＬずつ播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。
培養後、各ウェルの観察を行い、細胞のコロニーが出現したウェルから細胞を剥離して、１２ウェルプレートに全量継代した。
同様に、１２ウェルプレートでの培養後、各ウェルの観察を行い、蛍光タンパク質を強く発現しているクローンを６個選択し、それらを直径６ｃｍのディッシュに全量継代した。そこからさらに強く蛍光タンパク質を発現しているクローンを３個選択し、最終的に直径１０ｃｍのディッシュに全量継代した。
直径６ｃｍのディッシュに継代された６個のクローンから取得した蛍光顕微鏡画像を図４に示す（左から順にＣｌｏｎｅ１～６と称する）。上段の蛍光（緑）が細胞質を、下段の蛍光（赤）が細胞の核を示す。これら６個のクローンのうちＣｌｏｎｅ１、２および４が蛍光タンパク質を強く発現していた。Ｃｌｏｎｅ１、２および４を直径１０ｃｍのディッシュに継代した後に取得した蛍光顕微鏡画像を、夫々図５Ａ～Ｃに示す。
例２．セルカウント試験
例１において取得したＣｌｏｎｅ１、２および４の細胞夫々について、細胞の接着能力および増殖能力について確認した。対照として、野生型のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を用いた。夫々の細胞を、１２ウェルプレートに５０００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培地として、増殖培地を用いた。播種後１日目、２日目および３日目に顕微鏡写真および細胞の蛍光を確認する画像を取得した。さらに、播種後１日目および３日目には、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。結果を図６～図９に示す。
図６は、播種後１日目、２日目および３日目の夫々に各Ｃｌｏｎｅについて取得した顕微鏡写真である。写真より各Ｃｌｏｎｅの細胞が、野生型細胞と同等の接着能力を有することが確認された。図７は、播種後１日目、２日目および３日目の夫々に各Ｃｌｏｎｅについて取得した蛍光顕微鏡画像であり、図８Ａ～Ｃは、各Ｃｌｏｎｅについて播種後３日目に取得した蛍光顕微鏡画像である。夫々の日数、Ｃｌｏｎｅの画像において、左側の蛍光（緑）が細胞質を、右側の蛍光（赤）が細胞の核を示す。図９は、各Ｃｌｏｎｅおよび対照における播種後１日目の細胞数に対する播種後３日目の細胞数の比を算出したグラフである。これらにより、３つのクローン全てにおいて細胞が、対照と同等かまたはそれ以上の増殖能力を有することが確認された。
例１において取得したＣｌｏｎｅ１、２および４の細胞夫々について、細胞の接着能力および増殖能力について確認した。対照として、野生型のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を用いた。夫々の細胞を、１２ウェルプレートに５０００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培地として、増殖培地を用いた。播種後１日目、２日目および３日目に顕微鏡写真および細胞の蛍光を確認する画像を取得した。さらに、播種後１日目および３日目には、０．２５％Ｔｒｙｐｓｉｎ－ＥＤＴＡを用いて細胞を剥離し、血球計算盤を用いて細胞数を計測した。結果を図６～図９に示す。
図６は、播種後１日目、２日目および３日目の夫々に各Ｃｌｏｎｅについて取得した顕微鏡写真である。写真より各Ｃｌｏｎｅの細胞が、野生型細胞と同等の接着能力を有することが確認された。図７は、播種後１日目、２日目および３日目の夫々に各Ｃｌｏｎｅについて取得した蛍光顕微鏡画像であり、図８Ａ～Ｃは、各Ｃｌｏｎｅについて播種後３日目に取得した蛍光顕微鏡画像である。夫々の日数、Ｃｌｏｎｅの画像において、左側の蛍光（緑）が細胞質を、右側の蛍光（赤）が細胞の核を示す。図９は、各Ｃｌｏｎｅおよび対照における播種後１日目の細胞数に対する播種後３日目の細胞数の比を算出したグラフである。これらにより、３つのクローン全てにおいて細胞が、対照と同等かまたはそれ以上の増殖能力を有することが確認された。
例３．石灰化試験
例１において取得したＣｌｏｎｅ１、２および４の細胞について、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１が有する石灰化能力を維持しているかを確認した。対照として、野生型のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を用いた。
各細胞を、４８ウェルプレートに５０００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培地として増殖培地を用いた。各細胞株につき、６ウェル播種し、そのうち３ウェルを石灰化誘導サンプルとし、残り３ウェルを非誘導サンプルとした。
例１において取得したＣｌｏｎｅ１、２および４の細胞について、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１が有する石灰化能力を維持しているかを確認した。対照として、野生型のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を用いた。
各細胞を、４８ウェルプレートに５０００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培地として増殖培地を用いた。各細胞株につき、６ウェル播種し、そのうち３ウェルを石灰化誘導サンプルとし、残り３ウェルを非誘導サンプルとした。
播種後１日目に、石灰化誘導サンプルについては、石灰化培地への半量の培地交換を実施した。非誘導サンプルについては、増殖培地への半量の培地交換を実施した。以後２日おきに、同様に半量ずつ培地交換を実施した。
播種後３０日目に培地を除去し、石灰化染色キット（コスモバイオ、型番ＡＫ２１）を用いて石灰化した骨結節のアリザリン染色を実施し、各細胞株について染色強度を目視で確認した。結果を図１０～図１３に示す。
播種後３０日目に培地を除去し、石灰化染色キット（コスモバイオ、型番ＡＫ２１）を用いて石灰化した骨結節のアリザリン染色を実施し、各細胞株について染色強度を目視で確認した。結果を図１０～図１３に示す。
図１０～図１３は、播種後３０日目に夫々のＣｌｏｎｅについてアリザリン染色した染色図を示す。各図において、上段は石灰化誘導サンプルを、下段は非誘導サンプルを示す。Ｃｌｏｎｅ１は、ウェル全体が濃く染まり、およびＣｌｏｎｅ２は、不均一に部分的に濃く染まった。対照は点状に薄く染まったのみであり、Ｃｌｏｎｅ１および２の両方とも対照よりも濃く染まったことが確認された。Ｃｌｏｎｅ４は染まらなかった。
以上より、Ｃｌｏｎｅ１は、石灰化能力を強く発現していることが示唆される。
以上より、Ｃｌｏｎｅ１は、石灰化能力を強く発現していることが示唆される。
例４．材料上での観察
例３において高い石灰化能力を有することが示唆されたＣｌｏｎｅ１の細胞を用いて、材料上での観察方法を検討した。評価用の材料として、純チタン試験片（直径１４ｍｍ）を用いた。
２４ウェルプレートの各ウェル内に純チタン試験片を配置し、その上に細胞を３００００細胞／ｃｍ２で播種した。培地として増殖培地を用いた。純チタン試験片およびウェルの内容物を播種翌日に、３５ｍｍディッシュに移し、細胞を観察した。結果を図１４に示す。
図１４は、純チタン試験片上の細胞について取得した蛍光顕微鏡画像である。図１４Ａ～Ｃは、夫々２０倍、４０倍および６０倍の対物レンズを用いた異なる倍率での図を示す。各図中の左側の蛍光（緑）が細胞質を、右側の蛍光（赤）が細胞の核を示す。これらの図により、材料から細胞を剥離させることなく、材料上において細胞を、発現した蛍光タンパク質を利用することにより観察できることが確認された。
例３において高い石灰化能力を有することが示唆されたＣｌｏｎｅ１の細胞を用いて、材料上での観察方法を検討した。評価用の材料として、純チタン試験片（直径１４ｍｍ）を用いた。
２４ウェルプレートの各ウェル内に純チタン試験片を配置し、その上に細胞を３００００細胞／ｃｍ２で播種した。培地として増殖培地を用いた。純チタン試験片およびウェルの内容物を播種翌日に、３５ｍｍディッシュに移し、細胞を観察した。結果を図１４に示す。
図１４は、純チタン試験片上の細胞について取得した蛍光顕微鏡画像である。図１４Ａ～Ｃは、夫々２０倍、４０倍および６０倍の対物レンズを用いた異なる倍率での図を示す。各図中の左側の蛍光（緑）が細胞質を、右側の蛍光（赤）が細胞の核を示す。これらの図により、材料から細胞を剥離させることなく、材料上において細胞を、発現した蛍光タンパク質を利用することにより観察できることが確認された。
例５．播種密度３条件によるセルカウント
５０００細胞／ｃｍ２、１００００細胞／ｃｍ２、および２００００細胞／ｃｍ２の３条件の細胞播種密度での細胞数の上昇率について確認した。細胞は、例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を用いた。
２４ウェルプレートの各ウェル内に純チタン試験片を配置し、その上に細胞を５０００細胞／ｃｍ２、１００００細胞／ｃｍ２、および２００００細胞／ｃｍ２で播種した（各播種密度につきｎ＝３）。培地として増殖培地を用いた。純チタン試験片およびウェルの内容物を播種翌日に、３５ｍｍディッシュに移し、細胞を３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養１日目から４日目の各日において、純チタン試験片上の蛍光により細胞の核を示す画像を夫々の播種密度につき４つの視野について、正立蛍光顕微鏡を用いて取得した。取得した画像を、画像解析ソフトImageJ（National Institute of Health Sciences）の「Analyze Particles」解析により、細胞の核の数を計測した。および画像あたりの細胞の個数を計測した。結果を図１５～図２１に示す。
５０００細胞／ｃｍ２、１００００細胞／ｃｍ２、および２００００細胞／ｃｍ２の３条件の細胞播種密度での細胞数の上昇率について確認した。細胞は、例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を用いた。
２４ウェルプレートの各ウェル内に純チタン試験片を配置し、その上に細胞を５０００細胞／ｃｍ２、１００００細胞／ｃｍ２、および２００００細胞／ｃｍ２で播種した（各播種密度につきｎ＝３）。培地として増殖培地を用いた。純チタン試験片およびウェルの内容物を播種翌日に、３５ｍｍディッシュに移し、細胞を３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培養１日目から４日目の各日において、純チタン試験片上の蛍光により細胞の核を示す画像を夫々の播種密度につき４つの視野について、正立蛍光顕微鏡を用いて取得した。取得した画像を、画像解析ソフトImageJ（National Institute of Health Sciences）の「Analyze Particles」解析により、細胞の核の数を計測した。および画像あたりの細胞の個数を計測した。結果を図１５～図２１に示す。
図１５～図１７は、培養１日目における各播種密度（ｎ＝３）の４つの異なる視野において取得した蛍光顕微鏡画像、および各画像における細胞の計測数を示す。図１８～図２０は、培養４日目における各播種密度（ｎ＝３）の４つの異なる視野において取得した蛍光顕微鏡画像、および各画像における細胞の計測数を示す。各図中の蛍光（赤）は、細胞の核を示す。図２１は、培養１日目～４日目までの各日における細胞の核の数を示すグラフである。
これらの結果から、初期播種密度を１００００細胞／ｃｍ２、または２００００細胞／ｃｍ２とした場合、培養３日目から４日目における細胞数の上昇率が低くなっている傾向が確認された。一方で、初期播種密度を５０００細胞／ｃｍ２とした場合は細胞数の上昇率が一定となっていることが確認された。これらの結果から、画像によるセルカウントを実施するための初期播種密度は５０００細胞／ｃｍ２が適切であると考えられる。
これらの結果から、初期播種密度を１００００細胞／ｃｍ２、または２００００細胞／ｃｍ２とした場合、培養３日目から４日目における細胞数の上昇率が低くなっている傾向が確認された。一方で、初期播種密度を５０００細胞／ｃｍ２とした場合は細胞数の上昇率が一定となっていることが確認された。これらの結果から、画像によるセルカウントを実施するための初期播種密度は５０００細胞／ｃｍ２が適切であると考えられる。
例６．３種類の金属試験片上での細胞観察
例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を用いて、３種類の金属試験片上での細胞接着・伸展について確認した。金属試験片として、純チタン、チタン合金α＋β型Ｔｉ－６Ａ－４Ｖ、およびＣｏ－Ｃｒ合金を選択した（いずれも直径１４ｍｍ）。
２４ウェルプレートの各ウェル内に各金属試験片を配置し、その上に細胞を５０００細胞／ｃｍ２で播種した（各金属試験片につきｎ＝５）。培地として増殖培地を用いた。播種後１時間、６時間、２４時間、４８時間、および７２時間に、各金属試験片上の蛍光により細胞質を示す画像を、正立蛍光顕微鏡を用いて取得した。結果を図２２～図２８に示す。
図２２～図２６は、夫々の時間において各金属試験片上の細胞について取得された蛍光顕微鏡画像である。各図中の蛍光（緑）は細胞質を示す。図２７は、純チタン試験片上の細胞について、播種後時間毎に並べた画像である。図２８は、播種後９６時間でのチタン合金試験片上での異なる視野における蛍光により細胞質を示す画像である。いずれの金属試験片上においても細胞は、経時的に増加し、金属試験片に接着し、伸展していることが確認された。また、純チタン試験片上では、純チタン試験片の表面加工の溝に沿って細胞が並ぶ様子が確認された。チタン合金試験片上では細胞の広がりにむらがあることが確認された。
例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を用いて、３種類の金属試験片上での細胞接着・伸展について確認した。金属試験片として、純チタン、チタン合金α＋β型Ｔｉ－６Ａ－４Ｖ、およびＣｏ－Ｃｒ合金を選択した（いずれも直径１４ｍｍ）。
２４ウェルプレートの各ウェル内に各金属試験片を配置し、その上に細胞を５０００細胞／ｃｍ２で播種した（各金属試験片につきｎ＝５）。培地として増殖培地を用いた。播種後１時間、６時間、２４時間、４８時間、および７２時間に、各金属試験片上の蛍光により細胞質を示す画像を、正立蛍光顕微鏡を用いて取得した。結果を図２２～図２８に示す。
図２２～図２６は、夫々の時間において各金属試験片上の細胞について取得された蛍光顕微鏡画像である。各図中の蛍光（緑）は細胞質を示す。図２７は、純チタン試験片上の細胞について、播種後時間毎に並べた画像である。図２８は、播種後９６時間でのチタン合金試験片上での異なる視野における蛍光により細胞質を示す画像である。いずれの金属試験片上においても細胞は、経時的に増加し、金属試験片に接着し、伸展していることが確認された。また、純チタン試験片上では、純チタン試験片の表面加工の溝に沿って細胞が並ぶ様子が確認された。チタン合金試験片上では細胞の広がりにむらがあることが確認された。
例７．３種類の金属試験片上でのセルカウント
例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を用いて、３種類の金属試験片上での細胞増殖率について確認した。金属試験片として、純チタン、チタン合金α＋β型Ｔｉ－６Ａ－４Ｖ、およびＣｏ－Ｃｒ合金を選択した（いずれも直径１４ｍｍ）。
２４ウェルプレートの各ウェル内に各金属試験片を配置し、その上に細胞を５０００細胞／ｃｍ２で播種した（各金属試験片につきｎ＝５）。培地として増殖培地を用いた。播種後１時間、２４時間、４８時間、および７２時間に、各金属試験片上の蛍光により細胞の核を示す画像を、正立蛍光顕微鏡を用いて取得した。取得した画像を、画像解析ソフトImageJ（National Institute of Health Sciences）の「Analyze Particles」解析により、細胞の核の数を計測した。結果を図２９～図３２に示す。
図２９は、播種後７２時間における純チタン試験片（ｎ＝５）上の４つの異なる視野において取得した蛍光顕微鏡画像である。図３０は、播種後７２時間におけるチタン合金試験片（ｎ＝５）上の４つの異なる視野において取得した蛍光顕微鏡画像である。図３１は、播種後７２時間におけるＣｏ－Ｃｒ合金試験片（ｎ＝５）上の４つの異なる視野において取得した蛍光顕微鏡画像である。各図中の蛍光（赤）は、細胞の核を示す。図３２は、夫々の時間における各金属試験片上の細胞数を示すグラフである。以上より、播種後１時間および２４時間における細胞数は、純チタン試験片上が最も多く、その後播種後７２時間の間の細胞増殖率は、Ｃｏ－Ｃｒ合金試験片上が最も高い結果であることが確認された。チタン合金試験片については、同一試験片上においても細胞密度にむらが生じており、このことが細胞増殖率に影響していることが考えられる。
例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を用いて、３種類の金属試験片上での細胞増殖率について確認した。金属試験片として、純チタン、チタン合金α＋β型Ｔｉ－６Ａ－４Ｖ、およびＣｏ－Ｃｒ合金を選択した（いずれも直径１４ｍｍ）。
２４ウェルプレートの各ウェル内に各金属試験片を配置し、その上に細胞を５０００細胞／ｃｍ２で播種した（各金属試験片につきｎ＝５）。培地として増殖培地を用いた。播種後１時間、２４時間、４８時間、および７２時間に、各金属試験片上の蛍光により細胞の核を示す画像を、正立蛍光顕微鏡を用いて取得した。取得した画像を、画像解析ソフトImageJ（National Institute of Health Sciences）の「Analyze Particles」解析により、細胞の核の数を計測した。結果を図２９～図３２に示す。
図２９は、播種後７２時間における純チタン試験片（ｎ＝５）上の４つの異なる視野において取得した蛍光顕微鏡画像である。図３０は、播種後７２時間におけるチタン合金試験片（ｎ＝５）上の４つの異なる視野において取得した蛍光顕微鏡画像である。図３１は、播種後７２時間におけるＣｏ－Ｃｒ合金試験片（ｎ＝５）上の４つの異なる視野において取得した蛍光顕微鏡画像である。各図中の蛍光（赤）は、細胞の核を示す。図３２は、夫々の時間における各金属試験片上の細胞数を示すグラフである。以上より、播種後１時間および２４時間における細胞数は、純チタン試験片上が最も多く、その後播種後７２時間の間の細胞増殖率は、Ｃｏ－Ｃｒ合金試験片上が最も高い結果であることが確認された。チタン合金試験片については、同一試験片上においても細胞密度にむらが生じており、このことが細胞増殖率に影響していることが考えられる。
例８．タイムラプスでの観察
例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を用いて、材料上での細胞の遊走および増殖の様子をタイムラプスで観察した。材料として、純チタン試験片（直径１４ｍｍ）を選択した。
２４ウェルプレートの各ウェル内に純チタン試験片を配置し、その上に細胞を１００００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培地として、増殖培地を用いた。細胞を、播種後１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、および２４時間で正立蛍光顕微鏡を用いて試験片上の同一位置について画像を取得し、それらをつなぎ合わせてタイムラプス画像を作成した。同様に、播種後３時間、７時間、１２時間、２４時間、３６時間、および４８時間で正立蛍光顕微鏡を用いて試験片上の同一位置について画像を取得し、それらをつなぎ合わせてタイムラプス画像を作成した。結果を図３３および図３４に示す。
図３３は、播種後１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、および２４時間において同一視野から取得した蛍光顕微鏡画像である。図中の蛍光（緑）は、細胞質を示す。三角の矢印は、夫々の時間における同一の細胞を示す。これらの画像により、純チタン試験片上で細胞が遊走することが確認された。また、図３４は、播種後３時間、７時間、１２時間、２４時間、３６時間、および４８時間において同一視野から取得した蛍光顕微鏡画像である。図中の蛍光（緑）は、細胞質を示す。これらの画像により、細胞が、純チタン試験片の表面加工の溝に沿って伸長することが確認された。
例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を用いて、材料上での細胞の遊走および増殖の様子をタイムラプスで観察した。材料として、純チタン試験片（直径１４ｍｍ）を選択した。
２４ウェルプレートの各ウェル内に純チタン試験片を配置し、その上に細胞を１００００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。培地として、増殖培地を用いた。細胞を、播種後１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、および２４時間で正立蛍光顕微鏡を用いて試験片上の同一位置について画像を取得し、それらをつなぎ合わせてタイムラプス画像を作成した。同様に、播種後３時間、７時間、１２時間、２４時間、３６時間、および４８時間で正立蛍光顕微鏡を用いて試験片上の同一位置について画像を取得し、それらをつなぎ合わせてタイムラプス画像を作成した。結果を図３３および図３４に示す。
図３３は、播種後１２時間、１５時間、１８時間、２１時間、および２４時間において同一視野から取得した蛍光顕微鏡画像である。図中の蛍光（緑）は、細胞質を示す。三角の矢印は、夫々の時間における同一の細胞を示す。これらの画像により、純チタン試験片上で細胞が遊走することが確認された。また、図３４は、播種後３時間、７時間、１２時間、２４時間、３６時間、および４８時間において同一視野から取得した蛍光顕微鏡画像である。図中の蛍光（緑）は、細胞質を示す。これらの画像により、細胞が、純チタン試験片の表面加工の溝に沿って伸長することが確認された。
例９．遺伝子発現解析
例１において作製した蛍光タンパク質発現ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞が骨関連遺伝子を発現していることについて確認した。
例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を、２４ウェルプレートに５０００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。対照として、野生型のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を同様に播種し、培養した。各細胞株について１６ウェルに播種し、夫々４ウェルずつ、播種後１日目サンプル、播種後１０日目サンプル、播種後２０日目サンプル、および播種後３０日目サンプルとした。
培養１日目に、各細胞株について培養１日目サンプルに、TRIzol Reagent（Thermo Fisher Scientific、型番１５５９６０２６）を２５０μＬずつ添加し、細胞を懸濁して、セルライセートとした後－３０℃で保存した。播種後１０日目サンプル、播種後２０日目サンプル、および播種後３０日目サンプルについては、石灰化培地への半量の培地交換を実施した。以後２日おきに同様の培地交換を実施した。
播種後１０日目、２０日目、および３０日目において、各細胞株について播種後１０日目サンプル、播種後２０日目サンプル、および播種後３０日目サンプルの夫々に、TRIzol Reagent（Thermo Fisher Scientific、型番１５５９６０２６）を２５０μＬずつ添加し、細胞を懸濁して、セルライセートとした後－３０℃で保存した。
例１において作製した蛍光タンパク質発現ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞が骨関連遺伝子を発現していることについて確認した。
例１において取得したＣｌｏｎｅ１の細胞を、２４ウェルプレートに５０００細胞／ｃｍ２で播種し、３７℃でＣＯ２インキュベーターにて培養した。対照として、野生型のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を同様に播種し、培養した。各細胞株について１６ウェルに播種し、夫々４ウェルずつ、播種後１日目サンプル、播種後１０日目サンプル、播種後２０日目サンプル、および播種後３０日目サンプルとした。
培養１日目に、各細胞株について培養１日目サンプルに、TRIzol Reagent（Thermo Fisher Scientific、型番１５５９６０２６）を２５０μＬずつ添加し、細胞を懸濁して、セルライセートとした後－３０℃で保存した。播種後１０日目サンプル、播種後２０日目サンプル、および播種後３０日目サンプルについては、石灰化培地への半量の培地交換を実施した。以後２日おきに同様の培地交換を実施した。
播種後１０日目、２０日目、および３０日目において、各細胞株について播種後１０日目サンプル、播種後２０日目サンプル、および播種後３０日目サンプルの夫々に、TRIzol Reagent（Thermo Fisher Scientific、型番１５５９６０２６）を２５０μＬずつ添加し、細胞を懸濁して、セルライセートとした後－３０℃で保存した。
－３０℃で保存された各セルライセートを解凍して、PureLink RNA Miniキット（Thermo Fisher Scientific、型番１２１８３０２０）を用いてＲＮＡを精製した。精製したＲＮＡは超微量分光光度計NanoDrop Oneを使用して、２６０ｎｍ、２３０ｎｍ、および２８０ｎｍの吸光度を測定し、ＲＮＡ濃度と精製度を確認した。次いで、精製したＲＮＡを鋳型として、SuperScript IV VILO Master Mix（Thermo Fisher Scientific、型番１１７５６０５０）を用いて逆転写反応を行い、ｃＤＮＡを得た。
・次に、１０μＬのTaqMan Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific、型番４４４４５５７）と、１μＬのTaqMan Gene Expression AssayにｃＤＮＡを１０～１００ｎｇ加え、さらに精製水で総液量が２０μＬとなるように調製し、QuantStudio 3 リアルタイムＰＣＲシステムを使用してＰＣＲ反応を行い、各サンプルのＣＴ値を得た。尚、骨分化マーカーの検出に用いたTaqMan Gene Expression Assay（FAM）（Thermo Fisher Scientific、型番４３３１１８２）の遺伝子ごとのＩＤは以下の通りである。
・Ｒｕｎｘ２（Assay ID Mm00501583_m1）
・Ａｌｐｌ（Assay ID Mm00475834_m1）
・Ｉｂｓｐ（Assay ID Mm00492555_m1）
・Ｃｏｌ１ａ１（Assay ID Mm00801666_g1）
・Ｂｇｌａｐ（Assay ID Mm03413826_mH）
・また、内在性コントロールコントロールにはTaqMan Gene Expression Assay（ＶＩＣ）（Thermo Fisher Scientific、型番４４４８４８９）およびＧａｐｄｈ（Assay ID Mm99999915_g1）を用いた。
・得られたＣＴ値からΔΔＣＴ値を計算し、各遺伝子の発現量をタイムポイントごとに評価した。
・次に、１０μＬのTaqMan Fast Advanced Master Mix（Thermo Fisher Scientific、型番４４４４５５７）と、１μＬのTaqMan Gene Expression AssayにｃＤＮＡを１０～１００ｎｇ加え、さらに精製水で総液量が２０μＬとなるように調製し、QuantStudio 3 リアルタイムＰＣＲシステムを使用してＰＣＲ反応を行い、各サンプルのＣＴ値を得た。尚、骨分化マーカーの検出に用いたTaqMan Gene Expression Assay（FAM）（Thermo Fisher Scientific、型番４３３１１８２）の遺伝子ごとのＩＤは以下の通りである。
・Ｒｕｎｘ２（Assay ID Mm00501583_m1）
・Ａｌｐｌ（Assay ID Mm00475834_m1）
・Ｉｂｓｐ（Assay ID Mm00492555_m1）
・Ｃｏｌ１ａ１（Assay ID Mm00801666_g1）
・Ｂｇｌａｐ（Assay ID Mm03413826_mH）
・また、内在性コントロールコントロールにはTaqMan Gene Expression Assay（ＶＩＣ）（Thermo Fisher Scientific、型番４４４８４８９）およびＧａｐｄｈ（Assay ID Mm99999915_g1）を用いた。
・得られたＣＴ値からΔΔＣＴ値を計算し、各遺伝子の発現量をタイムポイントごとに評価した。
培養スキームを図３５に、夫々の細胞における細胞を溶解させた時点での遺伝子発現レベルを図３６および図３７に示す。
いずれの遺伝子においても、野生型の細胞よりも、Ｃｌｏｎｅ３の細胞の方が高いレベルで発現していることが確認された。さらにＣｌｏｎｅ３の細胞は、野生型の細胞と比べて、後期骨分化マーカーとして知られるＢｇｌａｐおよびＩｂｓｐの発現量が顕著に多いことが確認された。
いずれの遺伝子においても、野生型の細胞よりも、Ｃｌｏｎｅ３の細胞の方が高いレベルで発現していることが確認された。さらにＣｌｏｎｅ３の細胞は、野生型の細胞と比べて、後期骨分化マーカーとして知られるＢｇｌａｐおよびＩｂｓｐの発現量が顕著に多いことが確認された。
Claims (14)
- 骨芽細胞様細胞を改変して複数の異なる蛍光タンパク質を発現する改変骨芽細胞様細胞であって、少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核において発現し、前記蛍光タンパク質と異なる少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する、前記改変骨芽細胞様細胞。
- 核において発現する少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する任意の蛍光タンパク質よりも強く発光する、請求項１に記載の改変骨芽細胞様細胞。
- 核において発現する少なくとも１つの蛍光タンパク質が、ｔｄＴＯＭＡＴＯであり、核以外で発現する蛍光タンパク質がＥＧＦＰである、請求項１または２に記載の改変骨芽細胞様細胞。
- 骨芽細胞様細胞が、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞である、請求項１～３のいずれか一項に記載の改変骨芽細胞様細胞。
- 細胞増殖率が、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞の細胞増殖率の±６０％である、請求項１～４のいずれか一項に記載の改変骨芽細胞様細胞。
- ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞よりも高い分化誘導能を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の改変骨芽細胞様細胞。
- ＮＩＴＥ Ｐ－０３５８２（受託番号）で表される、改変骨芽細胞様細胞。
- 蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞を用いることを含む、インプラント材料の細胞適合性を評価する方法。
- 蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞が、少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核において発現し、前記蛍光タンパク質と異なる少なくとも１つの蛍光タンパク質が、核以外で発現する改変骨芽細胞様細胞である、請求項８に記載の方法。
- インプラント材料の細胞適合性の評価が、インプラント材料の表面が及ぼす、細胞増殖、細胞の遊走、細胞の伸長および／または分化誘導能に対する影響を評価することである、請求項９に記載の方法。
- インプラント材料の細胞適合性が、経時的に評価される、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
- インプラント材料の表面が及ぼす、細胞増殖、細胞の遊走および／または細胞の伸長に対する影響を、分化誘導能に対する影響と同時に評価する、請求項１０または１１に記載の方法。
- インプラント材料が、光非透過性材料である、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 蛍光タンパク質によって標識された改変骨芽細胞様細胞が、請求項１～７のいずれか一項に記載の改変骨芽細胞様細胞である、請求項８～１３のいずれか一項に記載の方法。
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| JP2022024501A JP2023121261A (ja) | 2022-02-21 | 2022-02-21 | インプラント材料を評価するための改変骨芽細胞様細胞 |
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2022
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