JP2005535348A - 細胞応答のリアルタイム測定 - Google Patents

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Abstract

生細胞が安定的に改変され、細胞質および細胞核から異なる色を放出することできることにより、該細胞状態および薬剤が該細胞に及ぼす効果の分析を、視覚的または機器の補助による観察により可能にしている。これらの観察は所望であればリアルタイムでなされてもよい。さらに増殖速度および薬剤感受性を、生体外においてリアルタイムで、単一の蛍光タンパク質を発現するよう改変された細胞の使用および蛍光強度を時間の関数として観察することにより判定することができる。

Description

本発明は、生体外における細胞増殖、薬剤感受性、細胞周期位置、その他の細胞応答のリアルタイム観察に関する。本発明は、マーカーとしての蛍光タンパク質の使用による細胞、特に生細胞の直接的観察に関する。細胞周期における細胞の状態は、細胞核および細胞質を別々に標識することによりモニターすることができる。
Aequorea victoria由来の緑色蛍光タンパク質(GFP)は1962年に見出された。GFPの構造、機構および応用に関する知識は、1992年のGFP遺伝子のクローニング以降非常に急速に発達した。他の生物におけるGFP遺伝子の異種発現の実証後、GFPは最も広く使用されるレポーター遺伝子の一つとなった。1999年に、Discosoma Red(DsRed)を始めとする蛍光タンパク質の別のファミリーが珊瑚からクローン化され、続いて2000年にAnemoniaのasRedおよび2001年にHcRedがクローン化された。これらのタンパク質の生物学的役割は、GFPにおける純粋なシグナル機能から、珊瑚から単離された新規タンパク質による共生光合成生物の光防護にまでわたっている。25〜27kDの分子量を有する着色水溶性タンパク質GFPおよびDsRedの2種類について、Ｘ線構造分析により相同的なβ‐バレル構造が証明されている。これらのタンパク質の一次構造の共通の特徴は、アミノ酸のチロシンとグリシン（GFPの位置66と67を占める）が保存されていて自己触媒的翻訳後修飾の間に発色団の形成に関与することである。
これらのタンパク質(野生型および突然変異体)は多色性レポーターとして使用することができる。これらの蛍光のスペクトル領域は、460nmの「青色」ピーク位置からスペクトルの赤色領域における640nmにまで広がりほぼ180nmにわたっている。GFPは細胞生物学(Gerdes, H.-H.,およびKaether, C., FEBS Letters (1996) 389:44-47)、免疫学(Kawakami, N.ら, Immunology Lett (1999) 70:165-171)、および感染症、例えばモデル動物における宿主病原体の相互作用の研究（Zhao, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. (2001) 98:9814-9818）において最も広く使用される遺伝子マーカーの一つである。GFPは腫瘍増殖、腫瘍転移および腫瘍脈管形成（Yang, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. (2002) 99:3824-3829; Yang, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:1206-1211;および Yang, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98:2616-2621）、遺伝子発現（Yang, M.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:12278-12282）ならびに細菌感染（Zhao, M.ら, supra）の全体像を描写するために用いられている。
これら全ての応用において、赤色発光は、FRET（蛍光共鳴エネルギー転移）分析のためだけでなく、バックグラウンド発光、生体内散乱の最小化という点で特に重要である。高減衰係数、高量子収率、および蛍光タンパク質のモノマー状態は、生体内での応用を含むレポーターとしてのこれらの使用についての非常に重要なパラメータである。二量体化する傾向をほんの少しだけ有するGFPとは対照的に、前記関連タンパク質はオリゴマー、例えばDsRedについて観察される四量体、またはさらなる高次会合物を形成する顕著な傾向を有する。減衰係数および量子収率も赤色タンパク質および新規に獲得されたDsRedモノマーについては比較的低い。
ヒトのヒストンH2B遺伝子は、Aequorea victoriaのGFPをコードする遺伝子と融合され、ヒト細胞にトランスフェクトされ、H2B‐GFPを構成的に発現する安定な系が作成されている。H2B‐GFP融合タンパク質は、細胞周期の進行に影響することなく、ヌクレオソーム内に組み込まれた。H2B‐GFPにより、有糸分裂期の染色体および間期のクロマチンの両方を含む核の高解像度の撮像が可能となり、後者では生細胞における様々なクロマチンの凝縮状態が明らかになった（Kanda, T.ら, Curr. Biol. (1998) 8:377-385）。
引用された文献の開示内容は参照により本明細書中に組み入れる。
これらの様々なタンパク質は、腫瘍転移をモニターするのに使用されており、また発現をモニターするためのレポーター遺伝子として使用されている。例えば、Kanda, T.ら, Curr. Biol. (1998) 8:377-385; Yang, M,ら, Clin. Exp. Metastasis (1999) 17:417-422; Yang, M,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2001) 98:2616-2621; および Yang, M,ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3824-3829を参照されたい。しかし、本出願人の知る限りにおいて、これらのタンパク質は生体外での細胞増殖、細胞周期状態、または細胞の薬剤感受性をモニターすることには使用されておらず、そして二重に標識された細胞(dual labeled cells)は生体内または生体外のいずれにおいても使用されていない。
増殖をモニターするための生体外技術のほとんどで、細胞の死滅を引き起こす観察技術を利用する。例えば、プラスチック表面に付着して増殖する細胞は、トリプシンなどの酵素によりプラスチックから剥がし、その後粒子計数機を用いてカウントすることができる。また、ミトコンドリアの酵素活性により生じる電子により還元され、細胞の生存性に否定的に影響するテトラゾリウム染料などの着色剤が共通して用いられる。さらに、lacZ遺伝子を細胞内に導入しマーカーとして用いることができるが、活性を視覚化するため、細胞を着色しなければならない。
このように、増殖をモニターする従来法は、正常の細胞代謝の破壊を伴い、細胞死さえも生じさせる。
本発明はリアルタイムで生体内または生体外における増殖その他の細胞活性を観察する機会を提供する。これらの観察は、様々なステージでの核/細胞質比の変化を利用することによって細胞周期の観察にまで拡大し得る。
本出願人の知る限りにおいて、GFPと融合されたH2B遺伝子が細胞核を標識するのに用いられて来ているとはいっても、異なる2種類の有色タンパク質を用いて生細胞の核および細胞質を別々に標識することの示唆がなされたことはない。本発明はそのような生細胞を観察するための可能性を提供する。
本発明は、生体外および生体内で、様々な化合物に対する細胞の増殖および感受性を観察する方法を対象とする。さらに、本発明は二重に標識された細胞、すなわち1つの色が核を標識するのに用いられ、そして異なる色が細胞質を標識するのに用いられている細胞を対象とする。
したがって一態様において、本発明は、生体外において細胞増殖を測定する方法を対象とし、該方法は、蛍光タンパク質により標識された細胞の培養中の蛍光強度の変化を時間の関数として観察する工程を含む。
別の態様において、本発明は、生体外において、試験化合物の存在および不在下の細胞培養により放出される蛍光を時間の関数として測定することにより、薬剤などの化合物に対する細胞の応答をモニターする方法であって、該培養細胞が蛍光タンパク質を発現するよう改変されている、上記方法を対象とする。
さらに別の態様において、本発明は、細胞質中に留まる第1の色の第1蛍光タンパク質のための発現系、および核標的タンパク質と結合した第2蛍光タンパク質のための発現系を有する細胞を提供することによって生細胞を標識する方法であって、該第1タンパク質および該第2融合タンパク質の発現により、該細胞の細胞核が1つの色で標識され、細胞質が別の色で標識される、上記方法を対象とする。
したがって別の態様において、本発明は第1蛍光タンパク質により細胞質中で安定的に標識され、そして第1と異なる色の第2蛍光タンパク質により細胞核中で安定的に標識されるように調製された細胞を対象とする。
別の態様において、本発明は培養株、生存植物あるいは生存動物のいずれかにおいて、本発明の方法により得られる2重に標識された生細胞を用いる方法を対象とする。様々な薬剤が細胞周期に及ぼす効果も、これらの細胞を同様に用いることにより決定され得る。
細胞の標識化により獲得できる情報は、細胞核および細胞質を別々に標識することによって増大させることができる。そのような二重の標識化によって、細胞増殖のモニタリングのみならず、細胞の生涯における事象のモニタリングも可能になる。細胞核が蛍光として放出される1つの色により標識され、細胞核が別の色で標識されるという本発明の標識は特に便利である。
また、本発明の一つの特徴は、生体外または生体内で、リアルタイムで単に蛍光をモニタリングすることにより細胞の増殖をモニターする方法である。二重標識化細胞をこの方法に用いてもよいが、厳密な意味で二重の標識化が必要であるというわけではない。単一の蛍光標識のみにより標識された細胞を使用することができ、その細胞を生かしたまま蛍光の強度を測定することができる。このようにして、薬剤または試薬が細胞増殖に及ぼす影響を確かめることによって、様々な処置または薬剤に対する応答もモニターすることができる。
本発明で使用するのに適した細胞は、酵母、真菌、植物、脊椎動物および無脊椎動物などヒト細胞を含むあらゆる真核生物の細胞である。単細胞生物、例えば酵母および、例えば糸状菌または真菌などの観察には、培養中の直接的な観察が好ましい。細胞培養中の観察はまた高等植物の細胞および動物細胞でも使用できる。適当な動物としては、通常、ラット、マウスその他の齧歯動物などの実験動物、家畜類、魚類などの家庭で飼育される動物、ならびにヒト細胞が含まれる。
細胞質および細胞核の二重の標識化を必要としない本発明の方法の場合、上述した真核生物に加えて原核細胞を使用することもできる。
本発明の方法においては蛍光タンパク質を用いて細胞を標識する。本明細書中で用いられる「蛍光タンパク質」は、適切な刺激により光を放出するタンパク質を指す。典型的な場合、蛍光タンパク質は、励起波長で照射されると可視領域、すなわち、約400nm〜800nmの範囲の光を放出する。計測器を使用すると、より幅広い領域を使用できる。蛍光を引き起こすための別の機構を用いることも可能である。都合の良い例は、シグナルを発生するのに代謝エネルギーが使用されるルシフェラーゼである。このように、「蛍光タンパク質」は、励起放射線、化学発光、または、光放出を起こすために必要なエネルギーを供給する他の機構のいずれかにより適当なエネルギーが供給されたときに「可視」領域で光を放出するタンパク質を指す。
本発明の多くの実施形態において、上述の背景技術の欄で記載したような蛍光タンパク質を使用する。明らかに、これらの蛍光タンパク質は様々な色で供給される。一部の表記法においては、緑色蛍光タンパク質についてのGFPおよび赤色蛍光タンパク質についてのRFPなどのように、その色をタンパク質の頭文字表記中に含める。しかし、元来単離された蛍光タンパク質は緑色であったため、場合によってはそれらの蛍光タンパク質を記載するのに、放出される波長に関わらず、一般的にGFPの略語が用いられる。したがって、ある意味では、GFPは、例えば黄色、赤色または青色の波長領域の光を放出することができる。GFPの一般的な意味が使用されているか、あるいはその放出が緑色波長であることが意図されているかどうかは文脈から明確である。例えば、具体的な実施形態においては、赤色蛍光タンパク質を細胞質を標識するのに用い、緑色蛍光タンパク質を細胞核を標識するのに用いる。これらの細胞を記載する際、GFPは現実に緑色波長の発光を、RFPは赤色波長の発光を意味する。
本発明は、放出される蛍光の強度を時間の関数として観察することによって、生体外または生体内における細胞の増殖を観察するための、および増殖速度を決定するための方法を提供する。クローンの不均一性もこの技術を用いて決定することができる。
蛍光タンパク質を産生する形質転換細胞を得るための方法は、現在当技術分野で周知である。多種多様な色の蛍光が利用可能であり、例えば参照により本明細書中に組み入れる米国特許第6,232,523号に記載されているように安定した細胞株が生産されている。本発明の一実施形態においては、これらの細胞を生体内で観察するのではなくて、生体外におけるリアルタイムアッセイに使用する。
一実施形態においては、GFPなどのような蛍光タンパク質を安定的に発現しているがん細胞株を96ウェルシャーレに塗布する。周期的時点において、Molecular Devices Geminiなどのような蛍光プレートリーダーで、プレートの各ウェルの蛍光を測定する。個々のウェルで細胞増殖につれて蛍光の強度が増大する。こうして増殖速度は、蛍光強度のデータを時間に対してプロットその他の操作をすることにより直接的に読み取ることができる。
様々な薬剤が細胞の増殖に及ぼす効果を試験するのに使用するには、プレートのウェルにマークをして、ウェルの1セットがコントロールとして機能し、別のセットが対象の薬剤と共にインキュベートされるようにする。適当な時間間隔、典型的には毎日または二日おきのいずれかで、プレートの各ウェルにおける蛍光強度を読み取り、コントロールおよび薬剤処理ウェルの成長曲線を得る。培養はこれらの測定について処理および付加を要しない。GFPは死にかけているアポトーシス細胞および壊死細胞中で加水分解された後は蛍光を発しないため、GFPは細胞生存の即時のマーカーである。各ウェルにおける全蛍光は生細胞の存在数と相関しており、定量化が可能である。したがって、試験化合物が増殖を阻害または促進する能力を容易に決定することができる。
以上の手法の１つの応用においては、各ウェルに腫瘍に由来する最小数の細胞またはわずかに単一細胞を供給することができる。このようにして、本発明の方法を使用することにより腫瘍の不均一性を明らかにすることができる。不均一性は、腫瘍から得られた１または少量の細胞の増殖を示す各ウェル間で得られる相違によって観察される。
本発明は、細胞質および細胞核についてのマーカーを発現する安定に形質転換された細胞も提供する。核の標的シグナルを欠く１の蛍光タンパク質についての発現系と、異なる色の第二蛍光タンパク質が核標的配列に結合してなる融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターとを生細胞に供給することによって、細胞核と細胞質の両方が顕微鏡観察下で別々に視覚化される。このように細胞を二重に標識することにより、細胞周期における事象を都合よくモニターすることができ、そして様々な薬剤が細胞周期に及ぼす効果を評価することもできる。細胞は、培養中に顕微鏡下で直接観察してもよいし、また完全な動物、生存動物においてさえ観察することができる。
放出される光の「色」とは、その光が放出される波長を意味する。細胞核および細胞質は、別々に判定され得る異なる波長で光を放出する必要があり、したがって「異なる色」として示される。色の差は肉眼で検知される必要性は要求されない。波長においてこのレベルの差が存在することが好ましいが、異なる波長感度を有するフィルターおよび/または検出器を使用することによって、適切なソフトウェアの助けにより、波長におけるなおも小さな差異を観察することも可能である。すなわち、例えば参照により本明細書中に組み入れる米国特許6,444,992などに記載されているような広視野顕微鏡の使用により、非常に近接した異なる波長を使用することもできる。
しかし、色の差異が目で検知され得る蛍光タンパク質を用いることにより観察を単純化することは好ましい。波長の違いが視覚的判別を可能とするのに十分である場合、計測も単純化される。
細胞は2種類の蛍光タンパク質を産生するよう安定的に形質転換されているので、これらが生存および様々な細胞周期のステージを経ている間、これらを観察することができる。細胞は培養中に観察することができ、またはこれらが生存生物中に存在しているうちに観察することができる。例えば緑色蛍光タンパク質により安定的に形質転換された細胞を用いた生存動物のリアルタイムにおける全身観察（whole body observation）が、参照により本明細書中に組み入れる米国特許6,251,384、6,235,968および6,235,967に記載されている。完全な生物（whole organisms）における使用の場合、蛍光性の高いタンパク質が好ましく、したがって、全身観察が用いられる場合にはルシフェラーゼなどのわずか中程度の蛍光性のタンパク質は実用的でない。
もちろん、外来の細胞を実験動物内に注入する場合、これらの動物は該細胞が拒絶されないように十分に免疫弱体化する必要がある。多様な動物を免疫弱体化するための技術は業界で既知であり、すでに免疫弱体化されている好都合な対象としては、ヌードマウスまたはSCIDマウスおよび同様に改変されたラットなどの別の齧歯動物がある。
蛍光タンパク質は、本明細書中の前記背景技術の欄に記載されているものなどのように当業界で一般的に利用されているあらゆる蛍光タンパク質のいずれかである。最初に単離されたA.victoriaの緑色蛍光タンパク質の多様な改変により、多様な色を有するタンパク質、および多種多様な細胞型において容易に発現されるタンパク質が得られている。様々な放出波長の蛍光タンパク質の選択肢は多様かつよく知られている。
発現系を含ませるよう研究されている細胞を改変するあらゆる方法が適当である。形質転換の方法は細胞の性質に依存し、そして例えば非限定的な列挙としてリポフェクション、エレクトロポレーション、およびウイルス感染を含む。植物細胞の場合、プロトプラストの改変のみならず、アグロバクテリウム仲介性形質転換も使用され得る。このタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含んでなる発現系のための制御配列の選択も変更することができ、そして適当な制御配列およびベクターの選択は、細胞の性質および細胞改変の態様に依存する。
適切ないかなる細胞核標的シグナルも使用することができ、ヒストンH2Bが下記に例示されるが、別の細胞核標的配列も知られており、これに代用することができる。
このように、改変される細胞は、各蛍光タンパク質のための発現系を含んでなる適当なベクターによりトランスフェクトされる。ここで蛍光タンパク質のわずかに１つのみが細胞核を標的とする付加的アミノ酸配列と結合している。形質転換に使用されるベクターは、細胞質に向かう蛍光性タンパク質および細胞核へ向かう異なる色の蛍光性タンパク質のための別々のベクターでもよく、あるいは両方の発現系を同じ発現ベクターに含ませることもできる。核標的配列を最初に使用し、続いてこの細胞が細胞質を標識する蛍光タンパク質のための発現系を含むようにトランスフェックションしてもよく、こうすると安定性を保証するためにトランスフェクション事象間での細胞株の安定性を確実にするので好ましい。トランスフェクションの順序は逆にすることもでき、細胞質タンパク質のための発現系を最初に投与することもできる。あるいは、双方の発現ベクターを同時に細胞と接触させてもよく、好ましくは共トランスフェクションを保障するために異なる選択マーカーを用いる。両タンパク質についてバイシストロニックな発現系（bicistronic expression system）を使用することも可能であろう。
関連発現系がゲノムに組み込まれ得る例を含めて安定的な改変を保証するため、細胞を選択圧にさらす。適当な選択マーカーは細胞の性質に依存する。G418またはハイグロマイシン耐性は多種多様な細胞についての慣用的なマーカーである。別の代替的な選択方法としては、DHFRに基く系に対するメトトレキサートなどのトキシンの使用がある。当業者は使用すべき選択の種類を理解するであろう。
例えば、1つの方法において、核標的シグナルをコードするアミノ酸配列と融合させた青色光を放出する蛍光タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む発現系を含んでなるレトロウイルスベクターを用いて適切な細胞株を感染させる。ウイルスベクターは選択可能なマーカーとしてハイグロマイシン耐性をさらに含んでいる。処理した細胞をは、その後ハイグロマイシン存在下で選択圧にさらし、数ラウンドの選択の後、安定な形質転換体を得る。安定な形質転換細胞はその後、エレクトロポレーションを用いてDNAにより処理する。ここでベクターはDHFRと結合した緑色放出性蛍光タンパク質を含んでいる。細胞をその後、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートの両方を用いた一連の選択にさらし、細胞核が青色に、細胞質が緑色に染色された細胞株を得る。
本発明の方法により得ることができる差異的な染色は、細胞周期の様々な部分が、細胞核および細胞質から放出される放射線の異なる分布および/または強度を生じるという事実に照らして有用である。したがって、例えば、強度の比により細胞周期位置の判定が可能である。さらに、細胞核の形態はアポトーシスが生じる際に変化し、これは容易に検出することができる。様々な小分子の薬剤、タンパク質、アンチセンスまたはトリプレックス形成性核酸あるいはRNA阻害剤を始めとする様々な薬剤の効果は、これらの薬剤が細胞周期または形態に及ぼす効果を観察することにより試験することができる。細胞質または細胞核に対する様々な薬剤の差異的なターゲティングも、本発明の方法を用いることによって観察することができる。評価することが可能な細胞の特性は、休眠、アポトーシス、細胞周期のステージ、標的薬剤の位置、および当業者に精通しているであろう他の様々な特性を含む。必要に応じて、細胞を処理するために使用される薬剤は、それら自体が標識されてもよい。
例えば、細胞が顕微鏡を介して培養中に観察する場合には、薬剤は培養物に直接加えてもよい。細胞が生存動物または植物中で観察される場合には、薬剤は通常動物または植物に直接投与される。
一実施形態においては、がん細胞を、細胞核中でのみ発現されるヒストンH2B-GFPおよび単に細胞質中で発現されるレトロウイルスベクターにより導入されたDsRed-2によって二重に標識する。こうすると、赤色蛍光に対する緑色蛍光の比により、細胞核−細胞質の比を決定することが可能になる。このような測定により、細胞周期の増殖状態における相対的な細胞数を決定することが可能になる。S期およびG2期は、細胞倍化過程の間の細胞核におけるDNA合成に起因する、非増殖細胞における比よりも高い核‐細胞質比またはより高い赤色蛍光に対する緑色蛍光の比により判定される。二色細胞（dual-color cells）を96ウェルシャーレに塗布し、赤色蛍光と緑色蛍光の強度と比を様々な時間で判定する。この比により、細胞周期における位置が判定され得る。
増殖それ自体の観察と同じく、アッセイは、様々な化合物でそれらの細胞を処理することによる結果を試験することに応用することができる。この応用においては、コントロール細胞を１セットのウェルに塗布し、そして別のセットに試験薬剤を塗布する。プレートをその後、二重の波長の測定が可能な蛍光リーダー中に入れ、緑色蛍光と赤色蛍光およびそれらの比における相対的上昇を測定する。これにより、細胞周期位置やそれらの過程に及ぼす薬剤の効果のみならず、相対的な増殖速度の決定も可能になる。
細胞の起源となった組織の不均一性も、ウェル毎に最小数の細胞を利用することにより本発明の方法で明らかにすることができる。
以下の実施例は本発明を非限定的に説明することを意図する。全ての場合において、像はHamamatsu C5810 3CCDカメラ（Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ）によって直接記録した。マクロ撮像については、蛍光ライトボックス（Lightools Research, Encinitas, CA）を用いた。ミクロ撮像については、Leica蛍光ステレオ顕微鏡モデルLZ12をCCDカメラと結合した。この顕微鏡はGFPフィルターセットおよび50W電力供給の水銀灯を備えていた。像はコントラストおよび輝度について加工し、Image ProPlus 3.1ソフトウェアの使用により分析した。1024×724ピクセルの高解像度像はIBM PC40上で直接記録した。
調製A
RFPレトロウイルスの製造
RFPレトロウイルス製造のため、全長の赤色蛍光タンパク質のcDNAを含むpDsRed2由来のHind III/Not I断片（CLONTECH Laboratories, Inc., Palo Alto, CA）を、ネオマイシン耐性遺伝子を有するpLNCX2（Clontech）のHind III/Not I部位に挿入し、プラスミドpLNCX2-DsRed2を確立した。10AIウイルスエンベロープを発現するNIH3T3由来のパッケージング細胞株PT67は、CLONTECH Laboratories, Incから購入した。PT67細胞を、10％の熱不活型の牛胎児血清（FBS）（Gemini Bio-products, Calabasas, CA）により補足したDME培地（Irvine Scientific, Santa Ana, CA）中で培養した。ベクターの製造のため、PT67細胞を70％のコンフルエンスで、LipofectAMINETM 試薬（Life Technologies, Grand Island, NY）および飽和量のプラスミドpLNCX2-DsRed2の沈殿混合物とともに18時間インキュベートした。この時に新鮮な培地を補充した。細胞を形質導入の48時間後に蛍光顕微鏡により検査した。RFPレトロウイルスベクター（PT67-DsRed2）を高量で産生しているクローンの選別のため、細胞を200〜1000μg/mlのG418（Life Technologies）の存在下で7日間培養した。一部のケースにおいて、薬剤選別の15日後に、生存コロニーを蛍光顕微鏡下でチェックし、GFPまたはRFPのポジティブコロニーを単離した。いくつかのコロニーを選別し、そして3T3細胞株の使用によるウイルスタイター試験の後、細胞株に広げた。
調製B
ヒストンH2B-GFPベクターの製造
ヒストンH2B-GFPレトロウイルスの製造に関して、ヒストンH2B遺伝子はGeoff Wahl教授（Salk Institute）から好意的に提供された。この遺伝子は終止コドンを有さず、H2B遺伝子とAequoria victoriaのEGFP遺伝子（Clontech）24）の5'コード領域との結合が可能である。その後このヒストンH2B-GFP融合遺伝子を、ハイグロマイシン耐性遺伝子を有するpLHCX (Clontech)のHind III/Cal I部位に挿入した。ヒストンH2B-GFPレトロウイルスベクターを高い量で産生するクローンを確立するため、pLHCXヒストンH2B-GFPプラスミドをPT67-DsRed2と同様の方法によりPT67細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を200〜400μg/mlのハイグロマイシン（Life Technologies）の存在下で15日間培養し、最終的にPT67-ヒストンH2B-GFP細胞を確立した。一部のケースにおいて、薬剤選別の15日後に、生存コロニーを蛍光顕微鏡下でチェックし、GFPまたはRFPのポジティブコロニーを単離した。いくつかのコロニーを選別し、3T3細胞株の使用によるウイルスタイター試験の後、細胞株に広げた。
実施例１
細胞核中でヒストンH2B-GFPを発現し、細胞質中でpLNC DsRedを発現しているヒト前立腺がん細胞
GFPのヒストンH2B(21)との融合に起因して専ら細胞核中でGFPを発現し、専ら細胞質中でRFPを発現する、2色PC-3細胞（dual color PC-3 cells）を単離した。これらの細胞は、生存前立腺がん細胞の2色像の撮像可能性を示す。
工程I：DsRed発現細胞の調製
PC-3細胞をPT67パッケージング細胞から生産されたpLNC DsRed-2で形質転換した。PC-3細胞におけるDsRed-2の発現を蛍光顕微鏡下でモニターした。選別はG418の量を増大させながら行った。
工程II：二重標識化(dual labeled)H2B GFPおよびDsRed-2細胞の調製
DsRed-2 PC-3細胞を、LipofectAMINE PlusTMを用いてpLHC H2B-GFP DNAでトランスフェクトした。24時間のインキュベーション後、H2B GFPおよびDsRed-2発現細胞をハイグロマイシンおよびG418の両方によりその量を増大させながら選別した。
生存細胞における細胞周期位置は、赤色細胞質に対する緑色細胞核の面積比により分析した。アポトーシスは、生細胞における核の形態により判定した。
実施例2
RFPおよびヒストンH2B-GFP遺伝子の繊維肉腫細胞への形質導入
RFPおよびヒストンH2B-GFP遺伝子の形質導入のため、70％コンフルエントのヒト繊維肉腫に由来するHT-1080細胞を、American Type Culture Collection（Rockville, ML）から購入した。二色細胞を確立するため、細胞質中でRFPを発現するHT-1080のクローン（HT-1080-RFP）を最初に確立した。簡潔にいうと、HT-1080細胞を、PT67-RFP細胞のレトロウイルス上清と10％のウシ胎児血清を含むRPMI 1640（Mediatech, Inc., Herndon, VA）との1：1沈殿混合液とともに72時間インキュベートした。この時新鮮な培地を補充した。細胞を形質導入の72時間後にトリプシン/EDTAにより回収し、200μg/mlのG418を含む選択培地中に1：15の比率で二次培養した。G418レベルは800μg/mlまで段階的に増加させた。HT-1080-RFPを、トリプシン/EDTAを用いてクローニングシリンダー（Bel-Art Products, Pequannock, NJ）を用いて単離し、慣用の培養方法により増幅した。
二種類のクローン化サブライン（HT-1080-dual-1およびHT-1080-dual-6）は、細胞核においてGFPを、そして細胞質においてRFPを安定的に発現した。RFPまたはGFPのみを含む追加のクローンをコントロール（HT-1080-RFP, HT-1080-GFP）として得た。
実施例３
親HT-1080-RFPおよびHT-1080-Dualクローンの細胞増殖速度
蛍光標識された各HT-1080クローン（HT-1080-RFP, HT-1080-dual-1 またはHT-1080-dual-6）および親クローン（HT-1080）を、RPMIと10％のFBS培地を入れた100mmシャーレ中に、1×103細胞/ディッシュの濃度で接種した（1日目）。シャーレを、インキュベーター中で37℃および5％のCO2で維持した。一日おきに（2〜7日目）、各クローンの3シャーレを、細胞カウントに用いた。簡潔にいうと、トリプシン処理後に集めて再懸濁した細胞をトリパンブルー（Sigma）により染色した。その後生存細胞数のみを血球計測器（Reichert Scientific Instruments, Buffalo, NY）を用いてカウントした。
図1は生体外で鮮やかなGFPおよびRFP蛍光を有する選別されたHT-1080二色細胞を示す。緑色蛍光は細胞核中に十分に局在化されている。集団中の全ての細胞はGFPおよびRFPを発現しており、導入遺伝子の安定性を示していた。図2は、単層培養において決定された親HT-1080、HT-1080-RFP、HT-1080-dual-1またはHT-1080-dual-6クローンの増殖速度に違いがないことを示す。
HT-1080-dual-1細胞を、RPMI 1640培地と10％のFBSを入れた150mmのシャーレ中で培養した。5〜30分毎に、シャーレを蛍光ステレオ顕微鏡下に置き、経時像を同一の生存細胞から記録した。
図３Aは、5分間隔での、有糸分裂中のHT-1080-dual-1の連続した経時像を示す。図３Bは、30分間隔での有糸分裂細胞を示し、有糸分裂細胞が巨大な集団中で位置を変えても容易に追跡することができた。
実施例4
生体外におけるアポトーシス過程のリアルタイム観察
アポトーシス過程のリアルタイム像を記録するために、HT-1080-dual-6クローンを用いた。DMSO中に溶解し−80℃で保存しておいたスタウロスポリン（Alexis, San Diego, CA）をアポトーシスの誘導に用いた。3ｘ105の細胞を、RPMI 1640と10％のFBSを入れた25cm2フラスコ中に接種した。スタウロスポリンを翌日2μMの濃度で加えた。2時間毎に、フラスコを蛍光ステレオ顕微鏡下に置き、リアルタイム像を各時点で記録した。
2μMのスタウロスポリンによりHT-1080-dual-6細胞中でアポトーシスが誘導された（図4Aおよび4B）。細胞核の連続的な断片化を2時間毎に観察することができた。
実施例５
生体内における二重標識化細胞（Dual-Labeled Cells）のリアルタイム観察
全ての動物の研究をNational Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals（ナンバーA3871-1の保障下）に概説されている原理および手順に従って実施した。動物をＨＥＰＡ濾過下のバリヤー設備内に維持した。マウスに圧力殺菌した実験齧歯類の食餌（Teckland LM-485, Western Research Products, Orange, CA）を与えた。
総頚動脈における細胞注射のため、ヌードマウスを皮下注射を介してケタミン混合液（ケタミンHCl 10μl、キシラジン7.6μl、アセプロマジンマレアート2.4μl、H2O 10μl）により麻酔した。第1に、頸を縦皮膚切開した。顎下腺の検出後、中央部で切断し、各側へ収縮させた。右胸骨舌骨筋と右胸骨甲状筋および結合組織を鈍器で切り離した。右総頚動脈の検出後、動脈を穏やかに周囲の結合組織から解放した。軽い張力(light tension)をブラントエンドフック（Fine Science Tools, Inc., Foster City, CA）を用いて動脈の近位の部位にかけた。2ｘ105のHT-1080-dual-1細胞を含む合計200μlの培地を33G針（Fine Science Tools）を用いて動脈内に注射した。注射後すぐに、出血または注射したがん細胞の漏出を防ぐため、しばらくの間注射部位を布で圧迫した。出血阻止の確認後、皮膚を6−0縫合糸を用いて閉じた。上述した操作の全ての手順は、７X解剖顕微鏡（MZ6, Leica, Deerfield, IL）を用いて行った。
HT-1080-dual-1の総頚動脈注射後、脳の微小動脈中の塞栓性細胞をスカルプフラップにより頭蓋骨を通して視覚化された（図5Aおよび5B）。マウスの頭蓋骨は比較的透明である。がん細胞は、白血球と同様に微小血管に順応するように細長くなっているのが観察された。腫瘍細胞の細胞核は、血管中で視覚化された腫瘍細胞において非常に細長かった。
実施例6
生体内における腫瘍細胞の細胞核-細胞質ダイナミクスの視覚化
生体内における腫瘍細胞の細胞核-細胞質ダイナミクスを視覚化するため、マウスをケタミン混合液を用いて麻酔した。耳の表面を蛍光ステレオ顕微鏡により青色光下で直接観察した。
肺転移における細胞核-細胞質ダイナミクスを観察するため、6個体のヌードマウスを、1x106のHT-1080-dual-1細胞を300μl量で尾静脈中に注射した。様々な時点で、マウスを犠牲にし、肺を取り出した。肺における転移性コロニーを青色光下で直接視覚化した。組織学的分析のため、切除された肺を組織凍結培地（Triangle Biomedical Sciences, Durham NC）で包埋し、−80℃で保存した。凍結切片は、低温維持装置LEICAモデルCM-1850により、４μmの厚さで調製した。調製された切片をGFPフィルターセットを備えた蛍光ステレオ顕微鏡下で直接観察した。
切除された肺における微小癌組織の転移を、互いに接している各細胞核を用いて視覚化した（データは示さない）。細胞は細胞核間で接触することができるよう変形されているように見える。
この研究は、生体外のみならず生体内においても、がん細胞のアポトーシス過程を含む細胞核-細胞質ダイナミクスの細胞レベルでのリアルタイム観察の可能性を切り開く。有糸分裂細胞は生存マウスにおけるマウスの耳に注射後、容易に視覚化された。尾静脈への注射後、二色性（dual-color）微小癌組織の転移は切断した肺において視覚化された。
実施例7
全身性の光学的蛍光像
有糸分裂細胞のリアルタイム像は、HT-1080-dual-1の注射後12時間の生存マウスにおいて記録することができた（図6Aおよび6B）。示された細胞は溢出しているようにみえ、丸みが現れ、培養株における分裂細胞に似ていた。各細胞核の状態および細胞の境界は、生存動物中で何らの固定または染色なしに視覚化された。
実施例8
二色化ヒト前立腺がん細胞株の調製
PC-3細胞を、10％のFCSで補足されたRPMI 1640培地中で増殖した。指数関数的増殖細胞（10cmのディッシュ中）を、PT67/pLHCX H2B-EGFP由来のウイルス性の上清とともに、8μg ml-1のポリブレンの存在下でインキュベートした。一晩のインキュベーション後、培地を交換し、感染細胞を段階的ハイグロマイシン選択に展開した。薬剤選別の15日後、生存コロニーを蛍光顕微鏡下で視覚化し、GFPポジティブのコロニーを単離した。H2B-EGFPを高レベル発現する均一な1クローンを選別した。
指数関数的増殖のH2B-EGFP発現細胞をその後、PT67/pLNCX DeRed-2由来のウイルス含有上清とともに、8μg/mlのポリブレンの存在下でインキュベートした。一晩のインキュベーション後、培地を交換し、感染の48時間後に感染細胞を段階的G418選択に展開した。薬剤選別の15日後、生存コロニーを蛍光顕微鏡下で視覚化し、RFPポジティブのコロニーを単離した。H2B-EGFPおよびRFP(PC3-dual)を高レベルで発現する均一な1クローンを選別した。
増殖速度決定のため、1×105の細胞を60mmのペトリ皿で培養し、1週間の間毎日カウントした。生存細胞/ウェルの数を、トリパンブルー染色により死亡細胞を除いて、指示時点で三重に決定した。
この細胞株におけるH2B-EGFPおよび細胞質RFPの高発現は、ハイグロマイシンBおよびG418選択培地の不在下で3ヶ月以上安定であった。二色化細胞の増殖速度は、生体外においてその親細胞であるPC-3と同じである。これらの結果は、二色化PC-3は生体内および生体外研究についての有用なモデルであり得ることを示唆する。
実施例9
細胞周期およびアポトーシスの観察
二色細胞（dual-color cells）は、生存細胞において観察される「細胞核-細胞質」比により、容易にそれらの細胞周期位置について見分けることができた。これらの細胞の蛍光顕微鏡観察のため、50W電力供給の水銀灯を搭載したLeica蛍光ステレオ顕微鏡モデルLZ12を用いた。GFPとRFP蛍光の両方を同時に視覚化するため、励起をD425/60帯域通過フィルター、470 DCXRダイクロイックミラーを介して引き起こし、放出された蛍光をロングパスフィルターGG475（Chroma Technology, Brattleboro, VT）を介して選別した。
図7A〜7Dは細胞周期段階を示し、図7Eはアポトーシスを示す。
細胞質に対して大きい細胞核サイズにより、細胞核-細胞質の比がずっと小さいG1期細胞と比べてG2期細胞が容易に同定された。S期の細胞はG1より大きいがG2より小さい細胞核-細胞質の比率を有した。まさに有糸分裂に突入しようとしている前期の細胞は、染色体の凝縮により同定された。赤道面に並んだ中期細胞は容易に観察され、細胞が後期に突入する際に視覚化することができた。アポトーシス細胞は、断片化を含む異常な核の形態により同定された。
このように、個々の細胞の一連の細胞周期進行は、わずかな間隔で撮られた顕微鏡写真によりリアルタイムで追跡することができた。
実施例10
薬剤により誘導されたアポトーシスのリアルタイムでの視覚化
PC-3二色細胞をTaxolTM(0.8μg/ml)、チミジン(2mM)、およびビンブラスチン(60nM)で処理した。リアルタイム撮像は0時間、12時間、24時間、36時間および48時間で行った。細胞を、DNA抽出およびアガロースゲル電気泳動(1.8％)分析のために集めた。Paclitaxel(TaxolTM)(0.8μg/ml)は、細胞核に非常に特異的な効果を有し、細胞核に核膜へのクロマチンの付着に明確に起因する環状構造を形成させる。図8は、環状構造が、RFPが標識された細胞質のバックグラウンドに対して、GFPが標識された細胞核とともに容易に可視化することを示している。細胞核環状構造は24時間まで目に見えた。48時間までに、細胞がとても異常な細胞核構造および断片化とともにアポトーシスに突入することを確かめることができた。
図9は、最初の処理の24時間後に観察されるTaxolTMによって誘導される環状構造が、DNA断片化を生じる前であること、およびゲル電気泳動により観察することができることを示す。48時間まで、細胞がアポトーシスにかなり進行した時、DNA断片化を観察することができた。
別のチューブリン薬剤であるビンブラスチン(60nM)は、TaxolTMと比較して異なる細胞核への効果を有し、その効果により細胞核はより凝縮し、かつ細胞質は図10に示されるように膨張しているように見えた。
実施例11
生体内観察
全ての動物の研究を、National Institutes of Health (NIH) Guide for the care and use of animals（ナンバーA3871-1のNIH保障下）に概説される原理および手順に従って実施した。生後5〜6週間の雄のヌードマウス（NCr-nu）を、ＨＥＰＡフィルターラックに備えられたバリヤー設備内に維持した。二色化（dual colored）PC-3ヒト前立腺がん細胞を、ヌードマウスのフットパッドに注射した（2ｘ106）。20日後にマウスを安楽死させた。腫瘍、リンパ節および肺を蛍光顕微鏡のために加工した。
図11は、蛍光顕微鏡下で、二色(dual-color)PC-3有糸分裂細胞がリンパ節において観察されたことを示す。
図1は、生体外において安定的にGFPおよびRFPを高発現しているヒト繊維肉腫細胞（HT-1080-dual-1）を示す。ヒト繊維肉腫細胞（HT-1080）にRFPおよびネオマイシン耐性遺伝子、レトロウイルスベクター中のヒストンH2B-GFPおよびハイグロマイシン耐性遺伝子を形質導入した。二重形質転換体をG418およびハイグロマイシンで選別し、安定したクローンを確立した。図中の棒は50μm。 図2は、親クローンおよび蛍光タンパク質を発現するクローンの細胞増殖速度の比較である。各クローン（親HT-1080、HT-1080-RFP、HT-1080-dual-1およびHT-1080-dual-6）について３つのシャーレを使用し、1週間にわたり各時点で細胞数をカウントした。細胞をトリプシン処理し、トリパンブルーにより染色し、血球計数機でカウントした。塗りつぶした円は各群について平均した細胞数を示す。 図3Aは、蛍光標識された細胞を用いた生体外における細胞増殖過程の経時観察を示す。HT-1080-dual-1細胞を10％FBSが補足されたPRMI 1640中で培養し、様々な時点での経時像を、蛍光顕微鏡下で同一の生細胞から記録した。図3Aは5分間隔で撮られたものである。a : 0分. b : 5分. c : 10分. d : 15分. e : 20分. f : 25分. g : 30分。図中の白線は20μｍ。 図3Bは、蛍光標識された細胞を用いた生体外における細胞増殖過程の時間経過観察を示す。HT-1080-dual-1細胞を10％FBSが補足されたPRMI 1640中で培養し、様々な時点での時間経過像を、蛍光顕微鏡下で同一の生細胞から記録した。図3Bは30分間隔で撮られたものである。a : 0分. b : 30分. c : 60分. d : 90分. e : 120分。図中の白線は75μｍ。緑色と白色の円は、増殖細胞が観察された代表的な領域を示す。有糸分裂細胞がそれらの相対位置を変えた場合でも、それらは容易に視覚化された。 図4Aは、スタウロスポリン（staurosporine）により誘導されたHT-1080-dual-6のアポトーシスの像を示す。HT-1080-dual-6細胞をアポトーシスの誘発のため、2μMのスタウロスポリンとともにインキュベートした。細胞を青色光下で視覚化し、像をCCDカメラと蛍光顕微鏡を用いて記録した。図4Aは、2μＭのスタウロスポリン処理の12時間後の像を示す。アポトーシスはHT-1080-dual細胞に対して高い率で十分に誘発された。図中の白線は50μm。 図4Bは、スタウロスポリン（staurosporine）により誘導されたHT-1080-dual-6のアポトーシスの像を示す。HT-1080-dual-6細胞をアポトーシスの誘発のため、2μMのスタウロスポリンとともにインキュベートした。細胞を青色光下で視覚化し、像をCCDカメラと蛍光顕微鏡を用いて記録した。図4Bは、2μＭのスタウロスポリンにより誘発した、HT-1080-dual-6細胞のアポトーシス過程の以下の時点におけるリアルタイム高倍率像を示す。a : 未処理. b : スタウロスポリン処理後2時間. c : 4時間. d : 6時間. e : 8時間. f : 10時間. g : 12時間。細胞質および細胞核の凝縮ならびに細胞核の断片化が十分に視覚化された。図中の白線は10μｍ。 図5は、HT-1080-dual-1細胞を総頚動脈に注射した直後の実験的脳転移を示す。微小動脈中の2重にコードされた細胞（dual-coded cell）の塞栓を、スキンフラップウィンドウ（skin flap window）を用いて、頭蓋骨を通して単一細胞レベルで観察した。細胞の形態および各細胞の細胞核の形態が視覚化される。図5Aは低倍率像である。図中の白線は400μmで、白四角は、その高倍率像が図5Bに示される領域を示す。図5Bは高倍率像を示す。図中の白線は100μｍ。 図6は、生存マウスにおける腫瘍細胞増殖のリアルタイム像を示す。生存マウスにおける有糸分裂腫瘍細胞のリアルタイム像を、細胞注射の12時間後に記録した。図6Aは高倍率像を示す。図中の白線は50μｍ。図6Bは図6Aの概要(schema)である。 図7A〜7Dは、二重標識化PC-3ヒト前立腺がん細胞の細胞周期像を示し、これにはＧ１期、Ｓ期、Ｇ２期およびＭ期が含まれている。図7Eは、アポトーシスを経ているPC-3二重標識化細胞を示す。 図8は、PC-3二重標識化細胞に及ぼすTaxolTMの効果の時間的経過を示す。 図9は、ゲル電気泳動により示される結果を含む、TaxolTMの効果の代替的な像を示す。 図10は、二重標識化PC-3細胞に及ぼすビンブラスチン処理の効果を示す。 図11は、二重標識化PC-3のアポトーシス細胞の生体内における像を示す。

Claims (27)

  1. 細胞核に局在化された第1蛍光タンパク質及び細胞質に局在化された第2蛍光タンパク質を含んでおり、該第1及び第2蛍光タンパク質が異なる波長の光を放出する生細胞を調製する方法であって、該方法が、
    (a) 該第1蛍光タンパク質がアミノ酸配列に融合しており、該アミノ酸配列が該融合タンパク質を細胞核に対する標的とする、該第1蛍光タンパク質の発現のための第1発現系、および細胞核標的配列を欠く第2蛍光タンパク質の発現のための第2発現系；あるいは
    (b) 前記第1蛍光タンパク質及び第2蛍光タンパク質の両方を発現する発現系；
    のいずれか一方を含むように生細胞を改変すること、ならびに
    該改変細胞から安定的に改変されている細胞を選択すること、
    を含む上記方法。
  2. 工程(a)において、まず前記細胞を前記第1発現系により改変し、その後前記第2発現系により改変する、またはこの逆を行う、請求項1に記載の方法。
  3. 工程(a)において、前記細胞を両方の発現系で同時に改変する、請求項1に記載の方法。
  4. 抗生物質またはトキシンの存在下で培養することによって前記選択を行う、請求項1に記載の方法。
  5. 細胞核を標的とするアミノ酸配列と融合した第1蛍光タンパク質、および細胞核を標的とするアミノ酸配列を欠く第2蛍光タンパク質を産生するように安定的に改変された生細胞であって、該第1および第2蛍光タンパク質が異なる波長で可視光を放出する、上記生細胞。
  6. 細胞核に局在化された第1蛍光タンパク質及び細胞質に局在化された第2蛍光タンパク質を含むように改変された生細胞であって、該第1蛍光タンパク質及び第2蛍光タンパク質が異なる色である、上記生細胞。
  7. 前記第1蛍光タンパク質が緑色で、前記第2蛍光タンパク質が赤色である、請求項6に記載の細胞。
  8. 前記細胞核を標的とするアミノ酸配列がヒストンH2Bである、請求項5に記載の細胞。
  9. 請求項6に記載の細胞の細胞質領域に対する細胞核領域の比を評価することを含む、生細胞の細胞周期位置を決定する方法。
  10. 前記評価を、時間の関数として行う、請求項9に記載の方法。
  11. 前記細胞を生存動物中で観察する、請求項9に記載の方法。
  12. 薬剤が細胞に及ぼす効果を判定する方法であって、請求項6に記載の細胞の第1サンプルを該薬剤により処理し、そして該細胞から放出される放射線の分布および/または強度に与える該処理の効果を観察すること、を含む上記方法。
  13. 前記薬剤で処理されてない前記細胞から放出される放射線の分布および/または強度を観察すること、および第1サンプルにおいて生じた観察結果を第2サンプルから得られたものと比較することをさらに含む、請求項12に記載の方法。
  14. 前記分布および/または強度が休眠の指標である、請求項12に記載の方法。
  15. 前記分布および/または強度がアポトーシスの指標である、請求項12に記載の方法。
  16. 前記分布および/または強度が細胞周期におけるステージの指標である、請求項12に記載の方法。
  17. 薬剤の標的位置を決定する方法であって、請求項6に記載の細胞を該薬剤で処理すること、および該細胞から放出される放射線の分布および/または強度を観察することを含む、上記方法。
  18. 前記薬剤自体を標識し、そして該方法が標識の位置を直接観察することをさらに含む、請求項17に記載の方法。
  19. 細胞培養の増殖速度を決定する方法であって、蛍光タンパク質を含むように改変されている細胞を培養すること、および該細胞によって放出される蛍光を時間の関数として測定することによって該細胞の増殖速度を決定することを含む、上記方法。
  20. 前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（GFP）または赤色蛍光タンパク質（RFP）である、請求項19に記載の方法。
  21. 前記培養が単一細胞から増殖される、請求項19に記載の方法。
  22. 試験化合物が細胞増殖に及ぼす効果を判定する方法であって、該方法が、
    蛍光タンパク質を含むように改変されている細胞を、該試験化合物の存在および不存在下で培養すること；
    該化合物の存在および不存在下における蛍光の強度を時間の関数として測定し、該化合物の存在および不存在下における増殖速度を決定すること；ならびに
    該化合物の存在および不存在下における増殖速度を比較すること；
    を含み、該化合物の不存在下に対する存在下における増殖速度の変化により、該化合物を細胞増殖のモジュレーターとして同定する、上記方法。
  23. 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（GFP）または赤色蛍光タンパク質（RFP）である、請求項22に記載の方法。
  24. 前記培養が単一細胞から開始される、請求項22に記載の方法。
  25. 腫瘍の不均一性を判定する方法であって、
    該腫瘍に含まれる個々の細胞または個々の細胞群から多数のコロニーを培養すること、ならびに
    該細胞培養の増殖速度を決定すること、
    を含み、異なる増殖速度を示す培養が該腫瘍の不均一性を示す、上記方法。
  26. 前記細胞が蛍光タンパク質を含むよう改変されており、そして放出された蛍光の強度を時間の関数として測定することにより増殖の速度を決定する、請求項25に記載の方法。
  27. 前記細胞が、細胞核に局在化された第1蛍光タンパク質および細胞質に局在化された第2蛍光タンパク質を含むように改変されており、該第1蛍光タンパク質および第2蛍光タンパク質が異なる色のものである、請求項25に記載の方法。
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