KR101142610B1 - 이중 색상 종양 모델로서의 면역저하된 설치 동물 - Google Patents
이중 색상 종양 모델로서의 면역저하된 설치 동물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 기본적으로 모든 조직에서 형광 단백질을 발현하도록 변형된 면역저하된 설치 동물에 관한 것이다. 상기의 설치 동물은 유전자 발현, 종양의 진행 및 혈관신생을 위한 모델로서 유용하다. 또한, 본 발명은 제1의 색상의 형광을 나타내는 이종의 조직이, 본질적으로 모든 조직에서 제2의 색상의 형광을 나타내도록 변형된 숙주 내로 이식된 모델계를 제공한다.
트랜스제닉, 형광, 설치동물, 종양
Description
관련 출원
본 출원은 2003년 2월 7일 출원된 미국 가출원 60/445,583호의 이익을 주장한다. 이 문서의 내용은 본 명세서에 참고적으로 포함되어 있다.
본 출원은 면역저하된 상태를 유지하면서, 다수의 조직에서 형광 단백질을 눈에 보이도록 발현하는 무흉선 누드 마우스를 포함하는 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물의 제조 및 그 이용에 관한 것이다. 이러한 설치 동물은 상기 설치 동물 내에 존재하는 종양과 전이의 영상화, 특히 다른 발광 스펙트럼의 형광 단백질을 나타내는 종양의 영상화를 포함하여, 세포와 조직의 전신 광학적 영상화를 위해 사용될 수 있다.
기질이 부재할 때 자극이 되는 조사가 존재하는 경우 발광하는 형광 단백질은 수년간 연구 수단이 되어 왔다. 가장 잘 알려지고 최초로 사용된 이러한 단백질은 애쿼리아 빅토리아(Aequorea victoria)에서 분리된 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein, GFP)이지만, 수많은 이러한 단백질들은 서로 다른 기원으로부터 분리되거나 합성되어왔으며, 넓은 범위의 발광 최대치를 나타내어, 역사적으로 GFP란 개념은 붉은색, 파란색 및 노랑색을 포함하는 전 스펙트럼에서 눈에 보이는 색상을 나타내는 단백질을 일컫는 말로 사용되어 왔다(Delagrave, S., et al., BioTechnology(1995) 13:151-154; Helm, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1994) 91:12501- 12504). 많은 개체들이 이러한 형광 단백질을 발현을 위해 성공적으로 변형되어왔다. 카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)(Chalfie, M., et al., Science(1994) 263:802-805), 드로소필라 멜라노가스터(Drosophila melanogaster)(Wang,S.,et al., Nature(1994) 369:400-403), 제브라피시(zebrafish)(Peters,K.G.,et al.,Dev. Biol.(1995) 171:252-257; Amsterdam,A.,et al., Dev. Biol.(1995) 171:123-129), 딕티오스테리움(Dictyostelium) 및 아라비돕시스 탈리아나(Arabidopsis thaliana)(Sheen, J., et al., Plant J.(1995) 8:777-784, Hu, W., FEBS Lett.(1995) 369:331-334)가 이것이다.
오카베 등(Okabe, et al., FEBS Lett.(1997) 407:313-319)은 야생형의 GFP를 pCAGGS(치킨 베타-액틴 프로모터 및 사이토메갈로바이러스 인핸서, 베타-액틴 인트론 및 보빈 글로빈 폴리아데닐레이션 시그날-Niwa, H., Gene (1991) 108:193-199)을 포함)에 삽입하여 트랜스제닉 마우스 세포주를 생산하였다(Ikawa, M., FEBS Lett. (1995) 375:125-128, 및 Ikawa, M., Dev. Growth Diff: (1995) 37:455-459). 비록 밝은 녹색 빛 발광이 이러한 트랜스제닉 마우스 세포주의 20개 이상의 근육과 췌장에서 관찰되었지만, GFP 발현은 어디에도 없었으며, 빛 파장은 다른 조직에서 육안으로 보이지 않았다. 그러나, 변형된 형태(EGFP)가 이러한 발현 조직에서 사용되었을 때, 트랜스제닉 마우스는 착상 전 배아에서부터 성숙 단계에까지 전 신체에서 EGFP 트랜스진을 발현한다.
녹색 수컷 정자로 수정된 야생형 난자는 2-세포 단계에서 녹색이 아니었지만, 배아 발생 단계를 거친 후에 녹색으로 변했다. 갓 태어난 새끼는 녹색 형광을 나타내었다. 혈관은 EGFP-함유 세포주에서 '밝은 색'으로 분류되었다. 이들 동물의 털은 녹색이 아니었다. 트랜스제닉 마우스는 털과 적혈구 세포를 제외하고는 일정하게 녹색을 나타내었다. 푸른색 여기 빛으로 조사하는 경우, 뇌, 간, 신장, 부신 및 고환, 폐, 근육, 심장, 장, 및 지방 조직, 흉선, 지라 및 고환 세포가 녹색 형광을 나타내었다.
트랜스제닉 마우스 세포주는 상당한 양의 EGFP의 발현에도 불구하고 정상이다; 따라서 EGFP는 무해하다.
본 발명에서 설명하고 있는 형광을 나타내는 면역저하된 설치 동물의 한 형태가 양 등의 논문에 보고되어 있다(Yang, M., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2003) 100:14259-14262 (11월 25일 발행).
이상 여러 논문들을 인용하였으나, 그렇다고 해서 이들 논문들을 본 발명의 적절한 종래 기술로서 인정하는 것은 아니다. 날짜에 대한 모든 언급 또는 논문의 내용에 대한 모든 설명은 출원인의 접근 가능한 정보를 근거로 한 것으로서, 이들 논문의 날짜와 내용의 정확성에 대해 어떠한 승인을 구성하지는 않는다.
명확하지 않은 이유로 인하여, 무흉선 nu/nu 마우스와 같은 트랜스제닉 면역저하된 설치 동물은 많지 않다. 본 발명은 이러한 면역저하된 설치동물에서 형광 단백질의 생산을 제공한다. 이러한 설치 동물은 생체 내에서 세포와 조직의 영상화, 특히, 종양과 같은 이식된 세포 또는 조직의 수용자로서 유용하게 사용될 수 있으며, 트랜스제닉 설치 동물의 GFP 발현 세포 및 조직의 배경과 대비하여 관찰할 수 있다. 따라서, 이식된 세포 또는 조직은 비제한적인 예로서, 또 다른 형광 단백질과 같은 눈에 보이는 표시자를 발현한다. 이식된 세포 또는 조직은 본 발명의 트랜스제닉 설치 동물의 GFP 발현 세포 및 조직 배경과 대조함으로써 관찰할 수 있다. 이식된 세포 또는 조직은 종양 세포 또는 관찰되는 세포의 성장 특성 및/또는 분포가 암성(cancerous)인 세포를 포함한다.
트랜스제닉 면역저하된 설치 동물은 또한, 숙주 설치 동물 조직과 이식된 세포 또는 조직 사이의 상호작용에 관련하는 다양한 약제의 효과를 검증하는데 사용될 수 있다. 이러한 약제의 예들은 숙주-이식 상호작용을 조절하거나, 이식된 세포 또는 조직의 성장 및 분포를 조절하는 약 또는 후보약물을 포함한다.
이러한 설치 동물은 또한, 연구 및/또는 다른 동물이나 배아로의 이식을 위하여 GFP 발현 세포 또는 조직의 공급처로서 사용될 수 있다. 때로는, 이러한 이식은 본질적으로 연속적이며, 일례로서 노화 연구에 이용될 수도 있다. 이식된 세포는 배아기 및 성인 줄기 세포를 포함할 수도 있다.
하나의 양태로서, GFP 발현 설치 동물은 nu/nu 마우스와 GFP 발현 마우스를 처음 교배하여 획득한 무흉선 nu/nu 마우스(athymic nu / nu mice)이다. 그 후, F1 세대를 수집하여 서로 교배시켜 GFP 발현 nu/nu 마우스를 포함하는 자손을 생산한다. F1× F1 교배부터 획득한 수컷 및 암컷 GFP 발현 nu/nu 마우스는 GFP 발현 nu/nu 마우스 자손을 생산하기 위해 사용된다. 이러한 결과로 생긴 마우스는 GFP 발현 nu/nu 마우스를 유지하기 위해 nu/nu 비-GFP 발현 nu/nu 마우스와 교배할 수 있다.
비슷한 방법이 면역저하된 래트(rat)와 같은 다른 면역저하된 설치 동물을 획득하기 위해 사용된다. 이 경우, 면역저하된 종은 형광 단백질을 발현하도록 변형된 정상 종과 교배된다.
그러므로, 하나의 양태로서, 본 발명은 면역저하된 표현형은 유지한 채로 본질적으로 모든 조직 내에서 제1의 형광 단백질을 발현하는 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물에 관한 것이다. 더 나아가서, 본 발명은 제1의 형광 단백질과 다른 발광 스펙트럼을 가지는 제2의 형광 단백질을 발현하도록 변형된 이종(heterologous) 조직이 이식된 상기의 설치 동물에 관한 것이다. 또 다른 양태로서, 본 발명은 본질적으로 모든 조직 내에서 제1의 형광 단백질을 코딩하는 유전자를 발현하고, 상기 제1의 형광 단백질과 다른 발광 스펙트럼을 가지는 제2의 형광 단백질을 발현하는 이종 조직이 이식된 트랜스제닉 설치 동물에 관한 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 제1의 형광 단백질을 발현하고, 다른 색상의 두번째 형광 단백질을 발현하는 종양 세포를 포함하는 설치 동물에 약제 또는 프로토콜을 접촉하는 단계 및 숙주 내의 종양 세포에 대한 이들의 효과를 관찰하는 단계를 포함하는, 종양 숙주 상호작용에 관여하는 약의 효능을 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 무흉선 nu/nu 마우스와 같은 GFP 발현 면역저하된 설치 동물, 이들의 제조 방법 및 이의 이용에 관한 것이다. 이러한 설치 동물은 본질적으로 모든 조직에서 GFP를 발현하고, 바람직하게는 육안으로 볼 수 있는 빛을 발광한다. 또 다른 한편으로, 이러한 설치 동물은 예를 들어 흉선이 없는 것처럼 면역저하되었으며, 예를 들어 인간 종양 조직의 이식 또는 다른 이종 이식을 받아들이는 숙주로서 사용될 수 있다.
본 발명에서 기재하고 있는 유사한 기술을 사용하여, 래트와 같은 GFP를 발현하는 다른 면역저하된 설치 동물을 얻을 수 있다.
"GFP"란 용어는 녹색을 나타내는 형광 단백질뿐 아니라, 일반적으로 흔히 있는 여기 방사에 반응하여 빛을 발광할 수 있는 어느 색의 형광 단백질의 두문자어로 편리하게 사용될 수 있다. GFP가 일반적인 의미로 사용되거나 실제로 녹색 형광 빛을 발산하는 단백질을 지칭하는 의미로 사용될 수 있음은 본 내용으로부터 명백할 것이다.
본 발명에서 사용되는 "GFP"는 발전된("enhanced") GFP 형태 및 애쿼리아 빅토리아 녹색 형광 단백질뿐 아니라, 발광하는 모든 파장의 형광 단백질을 일컫는다. 형광 염색 및 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 기술처럼, 눈에 보이는 표시자로 표지된 이식된 세포 또는 조직은 숙주 세포에서 발현하는 형광 단백질과는 다른 색상의 형광 단백질이 사용될 수 있도록 선택된다. 비제한적인 예로서, 만약 녹색 GFP가 본 발명의 트랜스제닉 설치 동물에서 발현된다면, 이식된 세포 또는 조직은 적색 형광 단백질(RFP)을 나타낼 수 있다.
또한, 복수개의 세포나 조직을 이식하는 경우, 본 발명에 의해 상이한 색상들로 표지시킴으로써 이들 세포 또는 조직을 가시화시키고/시키거나 동시에 추적할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 다른 형광 색은 노랑, 파랑 및 원적색(far-red)를 포함한다. 다른 형광 표시자의 발현은 선택적으로 개체의 세포 종류, 유전자 또는 과정에 특이적이다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 이러한 특이성을 제공하는 방법은 세포에 형광 표시자를 코딩하는 서열을 작동가능하게 연결하는 것을 포함하며, 이로써 세포 특이적인 프로모터, 특정 활성 반응에 반응하는 프로모터, 목적으로 하는 특정 유전자의 발현을 조절하는 프로모터 및 목적으로 하는 세포 진행에 포함되는 유전자 생성물의 발현을 조절하는 포로모터의 조절하에 있게 된다.
면역저하된 설치 동물은 또한, GFP를 발현하는 세포 및/또는 조직의 공급원로 사용될 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 이러한 조직은 배아 또는 배아 조직; 줄기 세포, 및 뇌, 간, 신장, 부신, 고환(고환 세포를 포함), 폐, 근육, 심장, 장, 난소, 지라, 지방 조직의 세포 또는 조직을 포함한다.
숙주 세포의 형광과 다른 발광 스펙트럼을 가지는 형광 단백질을 포함하도록 변형된 조직의 제한적이기는 하지만, 면역적격(immunocompetent) 개체에 대해서도 실행될 수 있다. 면역적격 개체 내에서 이를 수행하기 위해서, 이식된 조직은 공통 유전자(syngeneic)이거나, 검사는 이식 거부를 포함한, 면역 반응 또는 다른 반응의 단기간 검사에 제한되어야한다.
본 발명의 트랜스제닉, GFP-발현, 면역저하된 설치 동물로 돌아가서, 이들은 양 등에 의한 방법으로 유전자 발현을 시각화할 수 있도록 사용될 수 있다("Visualizing Gene Expression by Whole-Body Fluorescence Imaging." Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000)97:12278-12282). 이는 비침습성 기술에 의한 손상되지 않은 동물에서의 트랜스유전자(transgene) 발현의 시각화를 설명하고 있다. 이 시스템은 손상되지 않은 살아있는 마우스의 주요 기관 내에서 트랜스유전자 발현을 신속, 간편하고 효과적으로 시각화할 수 있게 한다. GFP 트랜스제닉의 배경에 비교하여, 다른 색상을 나타내는 형광 단백질은 뇌, 간, 췌장, 전립선, 및 뼈와 같은 세포에서 발현되고, 이러한 형광은 전신 광학 이미지로 암호화된다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 고-배율 영상화는 투조된 에피플루오르신 해부용 현미경(trans-illuminated epifluorescence dissecting microscope)을 사용함으로써 가능하고, 반면, 저-배율 영상화는 형광 빛 박스 상단을 이용하거나, 열전기적으로 냉각된 색 전하-연결 장치 카메라(thermoelectrically cooled color charge-coupled device camera)로 직접 보거나, 심플러 LED-베이스 장치(simpler LED-based devices)를 이용함으로써 가능하다.
형광 트랜스제닉 설치 동물은 형광 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터를 뇌, 간, 췌장, 전립선, 또는 골수에 직접 주입함으로써 테스트되는 발현 시스템(이에 한정되는 것은 아니지만, 20-100㎕ PSB 와 10% 글리세롤에서 형광 단백질을 코딩하는 아데노바이러스의 발현 시스템 8×1010 군집 형성 유닛/ml)을 이용하여 생산할 수 있다. 주입 후 5 내지 8시간 내에, 뇌와 같은 조직 내에서 발현된 GFP의 형광은 눈으로 볼 수 있으며, 전신 이미지는 비디오 레이트로 기록된다. GFP 형광은 최소 12시간 동안 증가하고, 4개월까지는 간과 같은 조직 내에서 관찰될 수 있다. 실시간 레코딩은 외인성의 대조 물질(GFP를 코딩하는 벡터는 설치 동물 조직에서 발현하는 GFP와는 같지 않다), 방사성의 기질, 또는 긴 조작 시간없이 수행될 수 있다. 이러한 방법은 단지 발현된 코딩 서열 또는 테스트된 프로모터가 융합되거나 GFP 포함 벡터에 작동적으로 연결되는 것을 필요로 하며, 이는 상대적으로 불투명한 기관, 또는 형광 설치 동물 내에서 적절하게 표지된 유전자의 치료 및 진단 가능성의 연구를 가능하게 한다.
또 다른 양태로서, 트랜스제닉 설치동물은 또한, 전신 광학 영상화 시스템을 설명하고 있는 양 등에 의한 방법("Whole-Body Optical Imaging of Green Fluorescent Protein-Expressing Tumors and Metastases," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2000) 97:1206-1211)을 통해 영상화되고 이용될 수 있다. 이러한 시스템은 세포의 성장 및 분포의 새로운 연속적인 모니터링을 가능하게 하며, 이는 이식된(선택적으로 암성인) 세포 또는 조직에 의한 발현을 포함하고, 이 때, 손상되지 않은 동물 내에서 다른 색상으로 발현된 GFP로 표지화된다.
본 발명의 바람직한 양태로서, 형광 설치 동물은 살아있는 설치 동물 내에서 이식된 형광 종양의 성장 및 전이를 포함한다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 이러한 종양 세포는 양 등에 의해 기술된 바와 안정적으로 고 농도의 GFP를 발현하는 인간 또는 설치 동물의 종양을 포함한다. 설치 동물 숙주에서 발현되는 GFP와 다른 GFP를 발현하는 종양이 사용된다. 상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 면역저하된 형광 설치 동물은 이러한 방법을 사용하기에 유리하며, 그 결과 장시간에 걸쳐 유지될 수 있는 이중 표지된 숙주가 생산된다; 그러나, 단기간 연구 또는 설치 동물 종양을 설치 동물 내로 이식시키는 공통 유전자 종양을 이용하는 연구에 대해서도 면역적격 트랜스제닉 형광 설치 동물은 사용될 수 있다.
한정되지 않는 실시예로서, B16F0-GFP 마우스 악성 흑생종 세포는 6주령 형광 면역저하된 설치 동물의 꼬리 정맥 또는 문맥 내로 주입된다. 전신 광학 영상은 뇌, 간 및 뼈 내에서 발생하는 전이 병소를 나타내기 위해 사용된다. B16F0-GFP 세포는 즉시 실시간으로 시각화되어, 상기의 각 기관 내에서의 종양 성장의 정량적 측정을 가능하게 한다.
또 다른 한정되지 않는 실시예로서, AC3448-GFP 인간 결장 종양은 같은 조직 내로 외과적으로 이식될 수 있다. 전신 광학 영상은 실시간으로, 초기의 결장 종양의 성장 및 간 및 골격 내로의 이의 전이 병소를 확인하기 위해 사용된다.
본 발명은 또한, 암의 성장 조절자를 확인하고 스크리닝하기 위한 형광, 면역저하된 설치 동물의 사용 방법을 제공한다. 하나의 양태로서, 이러한 방법은 후보 화학요법제의 억제능을 확인하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 형광 면역저하된 설치 동물 내의 종양 진행 모델은 트랜스제닉 숙주의 배경과는 다른 파장을 발광하는 형광 단백질을 발현하는 암 세포 또는 종양의 손상되지 않은 부분의 이식, 바람직하게 동소 이식으로 제작될 수 있다. 모델이 제작되면, 후보 화학요법제 또는 프로토콜을 숙주에게 투여한 후, 종양의 진행 및 전이에 대한 효과를 직접 관찰할 수 있다.
면역저하된 형광 설치 동물은 또한, 양 등에 의한 방법으로 혈관신생을 영상화하는데 사용될 수 있다("Whole-Body and Intravital Optical Imaging of Angiogenesis in Orthotopically Implanted Tumors," Proc. Natl, Acad. Sci. USA (2001) 98:2616-2621). 따라서, 본 발명은 또한 종양-유래 혈관신생을 분석하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 혈관신생을 측정하기 위하여 형광 설치 동물 내로의 GFP 표지된 종양을 이식한 동소 이식 모델에 적용한다. 숙주 GFP-발현 모세혈관의 색상과 다른 색상을 나타내는 GFP 사용은 실시간으로 생체 또는 전신적으로 검사하고자 하는 종양 형광을 선명하게 나타내게 한다. 바람직하게 인간 종양을 사용할 수 있으며, 이는 동소 이식된 인간 췌장 종양의 생체 영상이 본 발명의 면역저하된 표지 숙주 내에서 초기 및 전이된 부위에서 혈관신생 모세혈관을 나타내게 한다. 혈관신생 시간의 정량 분석은 19일 이상의 단일 설치 동물에서 간헐적으로 영상화된 동소에서 성장하는 인간 전립선 종양을 측정함으로 확인할 수 있다.
종양 혈관신생의 전신 광학 영상화는 예를 들어, 형광 루이스 폐 암종을 발바닥의 피하조직으로 주입함으로써 검증될 수 있다. 발바닥은 상대적으로 투명하며, 혈관이 비교적 거의 없으므로 조작되지 않은 개체에서 (모세혈관의 밀도의 증가를 측정하는 것과 같이) 종양 혈관신생의 정량적 영상화가 가능하다.
또 다른 양태로서, GFP 발현 인간 유방 종양 MDA-MB-435는 지방 패드에 동소 이식될 수 있으며, 20주 또는 그 이상과 같은 장기간에 걸친 혈관 밀도의 변화, 특히 증가를 확인하기 위해 영상화된다. 이러한 강력하고 임상적으로 의미 있는 혈관 신생 누드 마우스 모델은 생리학적 미소 서식 환경 내에서 종양 혈관신생을 억제하거나 증강시키는 약제를 생체 내에서 실시간 평가하기 위해 사용될 수 있으며, 이는 앞서 설명한 바와 같이 혈관신생에 관련된 약제의 효능을 확인함으로써 가능하다.
또 다른 양태로서, 본 발명의 설치 동물들은 양 등이 기술한 것("Direct External Imaging of Nascent Cancer, Tumor Progression, Angiogenesis, and Metastasis on Internal Organs in the Fluorescent Orthotopic Model," Proc. Natl. Acad. Sci. USA (2002) 99:3824-3829)과 유사한 방법으로 중간 조직, 특히 피부에 의한 빛 산란으로 인한 외부 이미지 감도의 한계를 극복하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 빛의 경로 내에서 피부 판(skin flap)을 열어 시그날 약화를 감소시키고 검출 감도를 수배 증가시킬 수 있다. 조직의 관찰 가능한 깊이가 크게 증대되고, 이전에 감춰져 있던 많은 종양이 뚜렷하게 관찰될 수 있다.
피부 판은 가역적으로 열리고 닫힐 수 있다. 일반적으로 동물을 마취시킨 후에, 피부와 피하 연결 조직에서 아치형의 절개로 피부 판을 분리한다. 판은 봉합으로 닫힐 수 있다. 따라서, 본 발명은 종양 모델 시스템의 내부 기관에서 관찰을 가능하게 한다.
열려진 피부 판을 통해 직접적으로, 표지된 종양 세포를 관찰하는 것은 본 발명의 모델 시스템의 감도 및 해상도를 크게 증가시킨다. 모델은 상태의 진행을 모니터링하는데 간단하게 이용되거나, 전혀 치료효과가 없는 것보다 더욱 불리한 결과를 발생하는 효과를 측정하는 것뿐 아니라, 후보 치료제를 평가하는 수단으로서 사용된다. 이때, 화합물 및/또는 프로토콜은 테스트 동물에게 공급되고, 화합물 및/또는 프로토콜이 존재하지 않는 대조군과 비교된다. 이러한 실험 조건하에서의 종양 진행, 혈관신생 및/또는 전이의 증가는 화합물 및/또는 프로토콜이 개체에 해롭다는 것을 나타내며; 유사하게, 상기 형상의 억제는 화합물 및/또는 프로토콜이 후보 치료제임을 나타낸다.
하나의 양태로서, 단일 종양 세포, 발현 형광 단백질은 두피 피부 판을 통해 뇌 영상에 도입된다. 수개의 세포에 상당하는 폐 종양 미소병소는 흉벽에 걸친 피부판을 통해 보여지는 반면, 반대쪽 미소전이는 대응하는 피부 판을 통해 보여진다. 췌장 종양과 이의 혈관신생 미소혈관은 복막 벽 피부 판을 통해 보여진다. 간에 걸친 피부판은 동소 이식된 종양에서 기원하는 생리적으로 의미있는 미소전이의 영상화를 가능하게 한다. 간문맥 주입에 의해 발생한 간의 단일 종양 세포도 또한 관찰 가능하다. 숙주 조직 대 이식 조직 또는 두 개의 이식된 조직과 같이, 두 개의 다른 GFP를 발현하는 세포 또는 조직은 또한, 피부 판의 사용에 의해 보여질 수 있다. 전립선 조직 또는 그 주변조직을 보기 위해서는 하-복부 피부 판을 사용하는 것이 보다 바람직하다.
GFP를 가지는 이식용 세포 또는 조직을 생산하는 방법은 알려져 있다. 종양 세포는 표준 기술을 이용하여 하나 또는 그 이상의 형광 단백질을 위한 발현 시스템을 이용하여 제작될 수 있다. 세포는 시험관 내로 도입되고, 시험관 내 또는 생체 내에서 종양으로 자라나고, 자라난 종양은 모델 개체 내로 이식된다. 이러한 세포는 주사되거나 또는 외과적으로 이식될 수 있다. 외과적 동소 이식은 종양 진행 모델이 요구될 때 더욱 바람직하다. 그러나, 형광 단백질을 안정하게 발현하는 조절된 종양 세포를 모델에게 도입하는 다른 방법도 사용될 수 있다. 게다가, 내재적 종양 또는 도입된 종양을 가지고 있는 본 발명의 설치 동물은, 동물 내에 이미 존재하는 종양을 감염함으로써 숙주와는 다른 GFP 단백질의 발현을 위한 바이러스성 벡터, 특히 레트로바이러스 벡터가 제공될 수 있다. 이는 미국 특허 US 4,736,866에서 개시하고 있는 "온코마우스(oncomouse)"와 같은 종양이 생기기 쉬운 포유동물을 위한 모델에 대해서는 특히 적절하다. 이러한 벡터는 이미 존재하고 있는 종양에 국소적, 직접적으로 도입되는 것이 바람직하다.
일반적으로, 형광의 발광을 관찰함으로써 확인하는 종양의 진행, 혈관신생 및/또는 전이의 어떠한 모델이라도 본 발명의 형광 설치 동물 및 방법을 사용할 수 있다.
많은 경우, 단일 종양의 전이를 관찰하기 위해서는 단일 색상이 사용된다. 그러나, 본 발명의 방법은 다른 색상의 형광 단백질로 각각 표지된 두 개 또는 그 이상의 종양을 동시에 관찰하는 것을 포함한다. 이러한 방법을 사용함으로써, 다수의 종양 진행을 관찰할 수 있을 뿐 아니라, 다른 종양에 대한 각 종양의 영향 또는 효과도 직접적으로 관찰가능하다.
본 발명의 방법은 몇가지 장점을 갖는다. 첫 번째, 감도의 증가로 인해 형광 숙주 세포 및 조직의 배경에 대비한 단일 또는 두 개의 이식된 세포의 관찰이 가능하다. 두 번째, 혈관신생을 직접적으로 관찰 가능하며, 이는 제안된 화합물 및 프로토콜의 치료적 유용성을 평가하는데 아주 중요하다. 세 번째, (종양과 같은)다수의 이식 조직을 동시에 관찰할 수 있다. 이는 이종의 조직 또는 종양 간에 일어나는 간섭 현상 때문에 아주 중요하다. 다수의 다른 색상이 사용되기 때문에, 이격된 조직 또는 종양의 상호작용을 직접적으로 관찰할 수 있다. 네 번째, 면역저하된 형광 설치 동물에서 상당한 기간 동안 관찰이 가능하기 때문에, 활동적으로 증식하는 세포와 휴면 상태의 세포 사이의 구별이 가능하다. 따라서, 휴면 상태의 세포의 존재는 본 발명의 방법을 통해서 확인할 수 있다.
더 나아가서, 형광 숙주는 누드 마우스 조직의 GFP 배경에 대비한 영상을 나타내기 위해, 관찰 가능한, 특히 눈에 보이는 화합물을 주입할 수 있다. 이에 한정되는 것은 아니지만, 염료와 같은 눈에 보이는 표지는 순환 기관의 전체 또는 일부분을 시각화하기 위해서 본 발명의 마우스의 혈류 내로 주입될 수 있다. 이는 특히 설치 동물의 적혈구 세포가 눈에 보이는 GFP를 발현할 수 없기 때문에, 혈류는 식별가능한 빛 방사가 없기에 특히 적당하다.
도 1은 면역저하된 마우스내로 이식한 후, 같은 자리에서 자라나는 인간 결장 암의 전신 사진이다. 숙주는 녹색 빛을 발광하는 형광 단백질을 몸 전체에서 나타내는 반면, 종양은 적색 형광 단백질을 나타낸다.
도 2A 내지 2D는 숙주는 녹색 형광 단백질로 표지되고, 암 세포는 적색 형광으로 표지된 면역저하된 숙주 내에서의 마크로파지의 실시간 상호작용을 나타낸다. 도면은 초기 접촉(도 2A), 탐식(도 2B), 마크로파지 내에서 탐식된 암세포(도 2C) 및 마크로파지에 의해서 분해된 암세포(도 2D)를 나타낸다.
도 3은 비-트랜스제닉 누드 마우스와 비교한 본 발명의 트랜스제닉 마우스를 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명을 설명하는 것이며 이를 한정하는 것은 아니다.
실시예
1:
GFP
발현 누드 마우스의 제조
C-57/B-6 GFP 마우스(Okabe, M., et al., FEBS Lett(1997) 467:313-319)는 nu/nu 마우스와 교배시켰다. C-57/B-6 GFP 마우스는 오사카 대학의 미생물 질환 연구소에서 분양받았다. 상기의 마우스는 치킨 베타-액틴 프로모터와 GMV 인핸서 조절하에서 애쿼리아 빅토리아(A. victoria)GFP를 발현시켰다. 적혈구와 털을 제외한 모든 조직에서 여기 빛에서 녹색 형광을 나타내었다.
F1 세대를 수집하고 서로 교배시켰다. 수컷 및 암컷의 두 마리의 뛰어난 GFP nu/nu 마우스를 획득하였다. GFP nu/nu 수컷과 GFP nu/nu 암컷을 서로 교배시킨 후, 한 배에서 태어난 6 마리의 GFP nu/nu 마우스를 얻었다.
수컷 GFP nu/nu 마우스를 암컷 nu/nu 비-GFP 마우스와 교배시켰다. 9마리의 누드 nu/nu 자손을 얻었다. 모두 조직에서 일반적으로 형광을 나타내었다. 도 3은 GFP nu/nu 마우스와 비-GFP nu/nu 마우스를 비교한 그림이다.
실시예
2: 적색 형광 단백질을 가지는 종양의 제작
적색 형광 단백질(RFP), DsRed2(Clontech)를 pLNCX2 (Clontech)내로 EglⅠ 및 NotⅠ 부위에 삽입시켰다.
상기 제작한 백터, pLNCX2 -DsRed2의 포화 용량을 DOTAP 시약(Boehringer Mannheim) 및 PT67 패킹 세포의 침전 혼합물과 함께 70% 컨플루언스(confluence)로 18시간 동안 배양시켰다. PT67 세포는 10 A1 바이러스 외피를 발현하는 NIH 3T3-유래 패킹 세포주이며, 이를 10% 열-비활성화된 FPS가 보충된 DMEM(Irvine Scientific)에서 배양하였다. 이 시점에서, 새로운 배지를 보충하고, 트랜스펙션 48시간 후 형광 현미경 세포를 확인하였다. 고-역가 레트로바이러스 상청액을 생산하는 선명한 형광 세포를 선별하기 위해서, RFP-발현 패킹 세포는 계단식 방식(Life Technologies, Grand Island, NY)으로 증가된 500-2,000㎍/ml G418 존재하에 7일 동안 배양하였다.
소망하는 종양 세포주를 20%로 PT67 세포의 레트로바이러스 상청액과 RPMI 1640 또는 10% FBS(Gemini Biological Products)를 포함하는 다른 배양 매질(GIBCO)의 1 대 1 침전 혼합액 내에서 72시간 배양하였다. 이 시점에서, 새로운 배지를 보충하였다. 종양 세포는 trypsin/EDTA로 획득하고, 50㎍/ml G418을 포함하는 선택 매질 내로 1 대 15의 비율로 2차 배양하였다. 선명한 형광 세포를 선별하기 위해서, G418의 농도를 점진적으로 800㎍/ml로 증가시켰다. RFP를 발현하는 클론을 trypsin/EDTA에 의해 클로닝 실린더(Bel-Art Products)로 분리하고, 선택 시약 없이, 통상적인 배양법에 따라 증폭 및 이행시켰다.
적색 형광 세포로서 수득된 종양세포는 다음을 포함하였다:
설치 동물 B16F0 흑색종 세포;
마우스 MMT060562 유방암 세포;
마우스 더닝 전립선암종 세포;
인간 PC-3 전립선암종 세포; 및
인간 HCT-116 결장암 세포.
실시예
3: 종양 진행 이중
표지된
모델
적색 형광 단백질로 표지된 인간 결장암 세포, HCT-116-RFP 는 트립신으로 획득후, 차가운 무혈청 매질로 3번 세척하고, 무혈청 RPMI 매질 1640으로 다시 보관하였다. 세포는 획득 후, 실시예 1에서 제작한 6주령의 트랜스제닉 암컷 GFP 누드 마우스 내로 왼쪽 하복부를 절개를 통한 결장 노출에 의해 40분 내로 주입하였다. 50㎕의 106 HCT-116-RFP 세포는 25㎕ 주사기를 사용하여 하결장 장막 아래로 주사하였다. 복막 절개는 6-0 외과적 봉합으로 봉합하였다. 수술하는 동안 동물은 케타민으로 마취시켰다.
전신 영상화는 470nm(Lightools Research, Encinitas, CA)에서 광섬유 조명에 의해 발광하는 형광 박스 내에서 실시하였다. 발광하는 형광은 Hamamatsu C5810 three-chip cooled color CCD 카메라(Hamamatsu Photonics, Bridgewater, NJ.)의 롱-패스 필터 GG475(Chroma Technology, Brattleboro, VT)로 수집하였다. 1,024/724 픽셀의 고-해상 영상 IBM PC로 직접 캡쳐되었으며, 영상은 명암 및 밝기의 조정 후, Image Pro Plus 3.1 소프트웨어(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)를 이용하여 분석하였다.
도 1은 이식 후 10주에 같은 자리에서 자라나고 있는 HCT-116-RFP 인간 결장암 세포의 전신 영상을 나타낸다. 이 영상은 CCD 카메라가 있는 형광 박스에서 획득하였다. 보는 바와 같이, 이러한 시스템은 숙주와 종양을 즉시 구별하게 한다.
실시예
4: 전립선 종양과
마크로파지의
상호작용
적색 형광 단백질로 표지된 인간 전립선 종양 세포, PC-3-RFP는 트립신으로 획득 후, 혈청을 포함하는 차가운 매질로 3번 세척하고, 얼음 위에 보관하였다. 40분 내에 30㎕내에 106 개의 세포를 실시예 1에서 제작한 면역저하된 마우스의 방광 및 전립선 내로 다음과 같은 방법으로 주입하였다: 방광 및 전립선은 중간 하복부 절개 후에 노출키고; 주입한 후, 절개를 6-0 외과용 봉합사로 봉합하였으며, 동물은 이소플루란으로 마취시켰다.
관찰을 위하여, 신선한 조직을 약 1mm3 피스로 절단하고, 형광 현미경을 관찰하기 위해 슬라이드 위에 압착하였다. 현미경 관찰에는, 100-W 수은 램프 전원 공급이 구비된 올림푸스 BH 2-RFCA 형광 현미경을 GFP 및 RFP 형광을 동시에 보기 위하여 사용하였다. 여기 광선은 D425/60 바인드 패스 필터, 470 DCXR 이색성 거울을 통해 발산시켰다. 발광된 형광 빛은 롱-패스 필터 GG475(Chroma Technology)로 수집하였다. 1,024/724 픽셀의 고-해상 영상은 Hamamatsu C5810 three-chip cooled color CCD 카메라(Hamamatsu Photonics)에 캡쳐되어 IBM PC에 저장되었다, 영상은 명암 및 밝기를 조정하고, Image Pro Plus 3.1 소프트웨어(Media Cybernetics)를 이용하여 분석하였다.
트랜스제닉 누드 마우스에 의해 녹색 형광을 나타내는 마크로파지와 종양 세포와의 상호 작용을 도 2에 도시하였다. 이는 이식 후 35일 후에 찍은 사진이다. 패널 A는 RFP 종양 세포를 접촉한 숙주 GFP 마크로파지를 나타내며; 패널 B는 RFP 종양 세포를 탐식하는 GFP 마크로파지를 나타내며; 패널 C는 GFP 마트로파지에 의해 탐식된 RFP 종양 세포를 나타내며 패널 D는 마크로파지에 의한 RFP 종양의 분해를 나타낸다.
실시예 5: 형광 면역적격 마우스의 연구
이중-색상 이미지를 사용하는 단기간 연구는 외과적으로 이식이 일어난 면역적격 개체를 이용할 수 있다. 오카베에 의해 설명된 쥐과 동물에서, C57/B6-GFP 마우스가 생산되었다. 연구는 106 RFP 발현 마우스 B16F0 흑색종 세포, 106 RFP 발현 마우스 MMT060562 유방암 세포 및 106 RFP 발현 더닝(Dunning)(래트) 전립선암종 세포를 이용하였다. 이러한 기술을 이용함으로써, B16F10-RFP 흑색종 세포를 주입한지 3주 후에 살아있는 종양 조직 내에서 혈관신생이 관찰되었으며, 새로운 종양 조직의 종양 세포와 숙주의 수지상 세포 사이의 상호 작용 역시 관찰되었다. 림프구 침윤이 유방암 모델에서 관찰되었다.
이와 같이, 면역계와 이식된 종양 간의 상호작용뿐 아니라, 종양 혈관신생 초기단계의 이중 색상 영상도 관찰할 수 있다.
Claims (23)
- 털과 적혈구 세포를 제외한 모든 조직에서 제1 형광 단백질을 발현하기 위한 이형접합체이고 면역저하된 표현형을 유지하며,상기 제1 형광 단백질과 다른 파장의 빛을 방출하는 제2 형광 단백질을 발현하기 위한 종양을 포함하는 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물.
- 제1항에 있어서, 상기 설치 동물은 마우스인 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물.
- 제2항에 있어서, 상기 마우스는 nu/nu 마우스인 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 제1 형광 단백질은 녹색이고, 상기 제2 형광 단백질은 적색인 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 종양은 상기 설치 동물에 동소 이식되는 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물.
- 삭제
- 종양-숙주 상호작용에 대한 약제의 효능을 분석하는 방법으로서,상기의 약제를 제1항의 설치 동물과 접촉시키는 단계;상기 제1 및 제2 형광 단백질의 발광을 관찰함으로써 종양-숙주 세포 상호작용을 영상화하는 단계; 및상기 얻어진 영상을 상기 약제와 접촉하지 않은 설치 동물과 비교하는 단계를 포함하는,종양-숙주 상호작용에 관련된 약제의 효능을 분석하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 관찰은 살아있는 손상되지 않은 동물의 전신 영상화에 의해 실시되는 종양-숙주 상호작용에 관련된 약제의 효능을 분석하는 방법.
- 삭제
- 삭제
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- 삭제
- 제1항의 설치 동물로부터 조직을 분리하는 단계; 및상기 조직을 다른 동물 또는 배아로 이식하는 단계를 포함하는,제1 형광 단백질 및 제2 형광 단백질을 발현하는 세포 또는 조직의 증식 방법.
- 제19항에 있어서, 조직의 연속적인 재분리 및 다른 동물 또는 배아로의 재이식을 실시하는 단계를 더 포함하는 세포 또는 조직의 증식 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물은상기 제1 형광 단백질을 발현하고 면역저하되지 않은 제1 설치 동물-상기 제1 설치 동물은 모든 조직에서 발현되는데 영향을 미치는 프로모터에 작동가능하게 연결된 상기 제1 형광 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 트랜스제닉 발현 시스템에서 제공된 수정란으로부터의 유래에 의해 상기 제1 형광 단백질을 발현함-과, 형광 단백질을 발현하지 않고 면역저하된 제2 설치 동물을 제1 교배하여 F1 자손들을 생산하는 단계;털과 적혈구 세포를 제외한 모든 조직에서 상기 제1 형광 단백질을 발현하는 상기 F1 자손들을 제2 교배하여 상기 제1 형광 단백질을 발현하고 면역저하된 F2 자손들을 생산하는 단계;털과 적혈구 세포를 제외한 모든 조직에서 상기 제1 형광 단백질을 발현하고 면역저하된 상기 F2 자손들을 상기 제1 형광단백질을 발현하지 않고 면역저하된 제3 설치 동물과 제3 교배하여, 상기 제1 형광 단백질을 발현하기 위한 이형접합체이고 면역저하된 F3 자손들을 생산하는 단계; 및상기 F3 자손들이 상기 제1 형광 단백질과 다른 파장의 빛을 방출하는 제2 형광 단백질을 발현하는 종양을 포함하도록 변형하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생산되는 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물.
- 제21항에 있어서, 상기 설치 동물은 마우스인 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물.
- 제22항에 있어서, 상기 마우스는 nu/nu 마우스인 면역저하된 트랜스제닉 설치 동물.
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|---|---|---|---|---|
| US20090088341A1 (en) * | 2007-10-01 | 2009-04-02 | The Government Of The Usa As Represented By The Secretary Of The Dept. Of Health & Human Services | Multiplex assay method for mixed cell populations |
| US8679836B2 (en) * | 2007-10-01 | 2014-03-25 | The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services | Methods of monitoring angiogenesis and metastasis in three dimensional co-cultures |
| WO2010096044A1 (en) * | 2008-10-30 | 2010-08-26 | Albert Einstein College Of Medicine Of Yeshiva University | In vivo quantitative screening test for anti-metastasis treatment efficacy |
| CN110547249A (zh) * | 2019-09-11 | 2019-12-10 | 苏州大学 | 一种升主动脉瘤动物模型的制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002028188A1 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Derivation of human tumor cell lines using passage in transgenic mice having selectable markers |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6251384B1 (en) * | 1997-04-28 | 2001-06-26 | Anticancer, Inc. | Metastasis models using green fluorescent protein (GFP) as a marker |
| US20020120946A1 (en) | 2000-12-22 | 2002-08-29 | Michael Breindl | Transgenic constructs for studying fibrotic diseases and uses thereof |
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2004
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2002028188A1 (en) * | 2000-10-06 | 2002-04-11 | Johns Hopkins University School Of Medicine | Derivation of human tumor cell lines using passage in transgenic mice having selectable markers |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| FEBS Lett., Vol.407(3) pp.313-319(1997.05.05) * |
| FEBS Lett., Vol.407(3) pp.313-319(1997.05.05)* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2004212465B2 (en) | 2009-09-10 |
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