JPWO2016189628A1

JPWO2016189628A1 - 発光測定方法

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Publication number: JPWO2016189628A1
Application number: JP2017520102A
Authority: JP
Inventors: 竜太郎秋吉
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2015-05-25
Filing date: 2015-05-25
Publication date: 2018-03-08
Also published as: WO2016189628A1

Abstract

発光測定方法は、生体試料からの発光を測定する方法である。この発光測定方法は、発光色が互いに異なり且つ互いに細胞内の異所に局在するように標識された複数の発光遺伝子を含む１つの細胞を含む、前記生体試料を作製する作製工程と、前記発光色及び細胞内局在位置の両方の関係を各々の前記発光色毎に関連付けて、前記生体試料の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、各々の細胞内局在位置の前記発光色の前記発光強度を定量的に測定する測定工程と、を含む。

Description

本発明は、発光測定方法に関する。

発光タンパク質は、発光が生じる化学反応を触媒する。発光タンパク質は、しばしば定量的実験に使用される。例えば、あるプロモーターの下流に発光タンパク質遺伝子を配置し、このプロモーターの活性の程度、すなわちこの遺伝子の発現の程度を、発光タンパク質に由来して生じる発光量として測定することが可能となる。

時計遺伝子のリズムや薬剤に対する応答など、細胞が示す複数のシグナルを発光タンパク質による発光の観察によって捉える場合、発光色の異なる発光タンパク質による発光量として、同時に取得することが可能である。例えば、多色プロモーターアッセイでは、ある薬剤に対するＡ種の細胞における細胞応答を赤色発光チャンネル（以下、ｃｈと略記する）、Ｂ種の細胞における発光応答を緑色発光ｃｈとして観察を行うことができる。この場合、高効率で精度良く発光成分を分離定量することが必要となる。

そこで、特開２００４−３３３４５７号公報（以下、特許文献１と記す）では、Ｎ色の発光成分それぞれの光量を、Ｎ−１枚の透過波長帯域が広い高透過率のフィルターを利用し、各発光成分のフィルター透過率とフィルターを透過する全成分の光量の総和から行列式を利用して求める方法を提案している。

特開２００４−３３３４５７号公報

発光タンパク質であるルシフェラーゼは、発光スペクトルの半値幅が非常に大きい。そのため、多色プロモーターアッセイにおいて、上記特許文献１では、ある程度の色分離には対応できるが、使用する複数のルシフェラーゼで波長域の重複成分が多い場合には、十分な色分離が困難であった。

また、上記特許文献１で得られる発光量はウェルの中の細胞の総和であり、シングルセルレベルの発光強度測定を行うことはできなかった。

本発明は、上記の点に鑑みてなされたもので、正確な色分離をシングルセルレベルで実行し得る発光測定方法を提供することを目的とする。

本発明の一態様によれば、生体試料からの発光を測定する発光測定方法であって、発光色が互いに異なり且つ互いに細胞内の異所に局在するように標識された複数の発光遺伝子を含む１つの細胞を含む、前記生体試料を作製する作製工程と、前記発光色及び細胞内局在位置の両方の関係を各々の前記発光色毎に関連付けて、前記生体試料の発光画像を撮像する撮像工程と、前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、各々の細胞内局在位置の前記発光色の発光強度を定量的に測定する測定工程と、を含む発光測定方法が提供される。

本発明によれば、正確な色分離をシングルセルレベルで実行し得る発光測定方法を提供することができる。

図１は、一実施形態に係る発光測定方法の一例の概略を示す図である。図２は、発光色が互いに異なる複数の発光遺伝子の細胞内の局在の例を概略的に示す図である。図３は、一実施形態に係る発光測定を行うためのシステムの構成例の概略を示す図である。図４は、複数種の細胞における発光色が互いに異なる複数の発光遺伝子の細胞内の局在の例を概略的に示す図である。図５は、ＥＬｕｃルシフェラーゼとＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発光スペクトルを示す図である。図６は、ＢＰ４６０−５１０ＨＱフィルターを使用して取得した発光画像の例を示す図である。図７は、６１０ＡＬＰフィルターを使用して取得した発光画像の例を示す図である。図８は、緑色成分の色分離結果を示す図である。図９は、赤色成分の色分離結果を示す図である。図１０は、図６の発光画像に対する興味領域の指定例を示す図である。図１１は、図７の発光画像に対する興味領域の指定例を示す図である。図１２は、指定した興味領域の発光強度を各々の発光画像に基づいて測定した結果を示す図である。

本発明の一実施形態について図面を参照して説明する。本実施形態は、生体試料からの発光を測定する発光測定方法に関する。本実施形態に係る方法の概略を図１に示す。

ステップＳ１に示すように、本方法は、発光色が互いに異なり且つ互いに細胞内の異所に局在するように標識された複数の発光遺伝子を含む１つの細胞を含む、生体試料を作製する作製工程を含む。

細胞は、測定の対象となる細胞である。細胞の種類は、動物細胞、植物細胞および微生物細胞等、あらゆるものであってよい。また、細胞は、培養細胞、組織に含まれる細胞の１つ、または個体に含まれる細胞の１つであってよい。

細胞は、例えば、発現の状態を調べようとする遺伝子の発現制御領域の下流に、発光タンパク質の遺伝子が配置された組み替え遺伝子が導入されることで得られる。こうすることで、発光タンパク質の遺伝子は、対象遺伝子のための発現制御領域の作用により、対象遺伝子の発現パターンと同様のパターンで発現することになる。

なお、発光タンパク質とは、発光が生じる化学反応を触媒する酵素を意味する。発光タンパク質は、十分量の基質の存在下において発光反応を触媒させた場合に、時間の経過に伴い発光量が変動するという特性を有する発光タンパク質であって良い。このような変動とは、例えば、発光量の減少である。このような発光タンパク質では、基質は十分に存在するにもかかわらず、時間の経過に従って発光量が減少する。また、このような変動とは、例えば、発光量の増大である。

発光量が減少するという特性を示す発光タンパク質の例は、ホタルルシフェラーゼなどの甲虫由来のルシフェラーゼである。ホタルルシフェラーゼは、ホタルルシフェリンを発光基質とする。また、そのような発光タンパク質の別の例は、イミダゾピラジン骨格を有する化合物を発光基質とする、海洋生物に由来するルシフェラーゼである。

また、ルシフェラーゼは、その種類により、同一の基質に対して異なる発光色の発光反応を触媒する。本方法では、発光色が互いに異なる２種類のルシフェラーゼを用い、それら２種類のルシフェラーゼを１つの細胞内において異所に局在させる。例えば、赤色発光反応を触媒するルシフェラーゼと緑色発光反応を触媒するルシフェラーゼに局在配列を付与し、図２に示すように、赤色発光反応を触媒するルシフェラーゼを細胞１の核２に局在させ、緑色発光反応を触媒するルシフェラーゼを細胞１の細胞質３に局在させる。なお、本方法は、赤色と緑色に限定するものではなく、互いのピーク波長が２０ｎｍ程度以上離れている任意の２色を採用し得る。しかし、異なる発光色を得るのに複数種類の基質が必要なる場合も有り、赤色と緑色の場合には１種類の基質だけで良いので、好ましい。また、図２とは逆に、赤色発光反応を触媒するルシフェラーゼを細胞質３に局在させ、緑色発光反応を触媒するルシフェラーゼを核２に局在させるようにしても良い。

なお、遺伝子発現の観察手法として、発光タンパク質を用いた発光観察以外にも蛍光タンパク質を用いた蛍光観察が知られている。しかし、発光観察は以下の点で蛍光観察よりも優れている。
・蛍光観察を行うには、励起光を細胞に照射する必要があり、この励起光が細胞にダメージを与えるおそれがある。
・蛍光観察では、細胞からの自家蛍光も観察されてしまうが、発光観察ではこの問題が無いため、定量性が高い。
・遺伝子発現から蛍光が発せられるまでのタイムラグに比較して、遺伝子発現から発光までのタイムラグの方が短い。
・蛍光タンパク質の方が発光タンパク質よりも細胞内での半減期が長いため、遺伝子の発現量の増加に応じて増加した蛍光量が長時間維持され、減少シグナルを正確に測定することができない。

ステップＳ２に示すように、本方法は、生体試料に対し、当該生体試料外から所定の刺激を与える刺激工程を更に含む。

刺激は、ルシフェラーゼに応じた発光基質を培養液に投与することを含む。発光基質は、任意のタイミングで培養液に投与することができる。例えば、細胞を観察する直前に投与しても良い。あるいは、培養液を作製する段階において発光基質を投与しても良い。

また、刺激は、このような薬剤の投与に限らず、ガス雰囲気中に配置すること、振動を与えること、電気的な刺激を与えること、なども含む。

ステップＳ３に示すように、本方法は、発光色及び細胞内局在位置の両方の関係を各々の発光色毎に関連付けて、生体試料の発光画像を撮像する撮像工程を更に含む。

これは、生体試料から放射される発光を、それぞれ異なる波長帯域（発光波長Ｃｈ）で撮影することで、複数の発光画像を取得することを含む。

発光画像とは、細胞１からの発光を撮像することにより得られる画像である。発光画像は、例えば、発光に応じた特定の波長を有した光のみを主に透過させるフィルターと、光を電気信号に変換する撮像素子と、電気信号から発光画像を作り出す画像処理手段とを含む装置を用いて取得することができる。発光画像を取得するための装置の例は、発光顕微鏡、発光イメージングシステム等である。発光イメージングシステムの具体例は、発光イメージングシステムＬＶ２００（オリンパス株式会社製）を含む。

このような、発光イメージングシステムの概略を図３に示す。図３に示すように、この発光イメージングシステム１０は、図示しないハウジングに遮光状態で格納された顕微鏡２０と、例えばパーソナルコンピュータといった各種演算を行うことができる演算装置３０と、例えばキーボードやマウスといった演算装置３０にユーザによる指示を入力するための入力部４０と、を備える。

顕微鏡２０には、光学系２１と光源２２と撮像装置２３とが設けられている。光学系２１は、種々のレンズやミラーを含む。また、光学系２１は、選択的に光路に挿入し得る複数のフィルターＦ１，Ｆ２を含む。複数のフィルターＦ１，Ｆ２は、互いに透過波長が異なっている。ただし、完全に異なっている必要は無く、互いに重複しない波長帯域を備え、その重複しない波長帯域が、上記ルシフェラーゼが触媒する発光色の発光波長ｃｈに対応していれば良い。光源２２は、明視野画像を得るために必要な任意の照明光（例えば白色光）を射出し、この光源２２から射出された光は、光学系２１を介して、細胞１を含む生体試料５０に照射される。この生体試料５０は、好ましくは所定の培養環境により細胞１が生存可能に維持されるよう、培養チャンバ内に収容されている。撮像装置２３は、例えば冷却ＣＣＤ等による撮像素子を含み、光学系２１を介して生体試料５０の顕微鏡画像に係る画像信号を生成する。

演算装置３０は、撮影制御部３１と、画像取得部３２と、光源制御部３３と、光学系制御部３４と、記録部３５と、画像解析部３６と、を備える。撮影制御部３１は、撮像装置２３の動作を制御する。画像取得部３２は、撮像装置２３から画像を取得し、必要な画像処理等を行う画像処理手段である。

光源制御部３３は、光源２２の動作を制御する。光学系制御部３４は、光学系２１を制御する。例えば、明視野画像が取得されるときは、光源２２から射出された照明光は、光学系２１を介して生体試料５０に照射される。また、明視野画像が取得されるときは、露光時間は比較的短くされる。一方、発光画像が取得されるときは、光源２２から射出された照明光は遮断され、生体試料５０は照明されない。また、発光画像が取得されるときは、露光時間は比較的長く設定される。光学系制御部３４は、また、発光画像が取得されるときは、複数のフィルターＦ１，Ｆ２の光路への選択的な挿入を制御する。

記録部３５は、明視野画像と各フィルター挿入時に取得された発光画像とを記録する。画像解析部３６は、記録部３５に記録された複数の発光画像から、細胞１からの発光強度を定量的に測定する等の処理を行う。なお、記録部３５は、この画像解析部３６の処理結果も記録することができる。

すなわち、ステップＳ４に示すように、本方法は、ステップＳ３で撮像した発光画像に基づいて、各々の細胞内局在位置の発光色の発光強度を定量的に測定する測定工程を更に含む。

例えば、画像解析部３６は、各発光成分のフィルターＦ１，Ｆ２の透過率とフィルターＦ１，Ｆ２を透過する全成分の光量の総和から行列式を利用して各色成分の発光強度を求める操作を行う。緑色成分の発光強度ＧＲＥＥＮ及び赤色成分の発光強度ＲＥＤは、以下の（１）式に示すように、フィルターＦ１使用時の発光画像から得られるフィルターＦ１を透過する緑色成分の発光強度Ｆｇｒｅｅｎ及びフィルターＦ２使用時の発光画像から得られるフィルターＦ２を透過する赤色成分の発光強度Ｆｒｅｄと、予め測定されているフィルターＦ１，Ｆ２の透過率に係わる逆行列と、から算出することができる。

各発光画像に対して、各ルシフェラーゼに付与した局在配列に合わせて興味領域（以下、ＲＯＩと記す）を入力部４０により設定することで、ＲＯＩ毎の発光強度を定量的に測定するようにしても良い。

なお、特に図１には示していないが、その後、観察終了するまで、所定時間経過する毎に、上記ステップＳ３とステップＳ４の工程を繰り返す、すなわち、所定時間毎のタイムラプス撮影と発光量の算出とを繰り返すようにしても良い。また、ステップＳ４の工程は、タイムラプス撮影終了後に、記録部３５に記録した各回の発光画像毎に、纏めて実施するようにしても良いことは勿論である。

本実施形態による発光測定方法によれば、複数のルシフェラーゼの発光成分の色分離を行う場合に、発光色の異なるルシフェラーゼを細胞内の異所に局在させることで、各細胞内局在部位における他色成分の混入を減少させることができる。さらに、この細胞に対してフィルターによる分光を行った上で画像化する操作と、各発光成分のフィルター透過率とフィルターを透過する全成分の光量の総和から行列式を利用して各成分の光量を求める操作を行うことで、さらに他色成分の混入を減少させた正確な色分離をシングルセルレベルで実行できる。

また、同一細胞内の異所で色分離できるので、多色が混在することによる影響を最小限にすることができる。

さらに、薬剤、電気、ガス等の刺激後に発生する複数の細胞内変化をルシフェラーゼの発光を指標として検出できる。

なお、一方の発光色の発光強度を内部標準として使用して、他方の発光色の発光強度を補正するようにしても良い。

また、生体試料５０には、図４に示すように、異種の細胞１Ａ，１Ｂを含めるようにしても良い。この場合、一方の細胞１Ａは、赤色発光反応を触媒するルシフェラーゼを核２に局在させ、緑色発光反応を触媒するルシフェラーゼを細胞質３に局在させ、他方の細胞１Ｂは、赤色発光反応を触媒するルシフェラーゼを細胞質３に局在させ、緑色発光反応を触媒するルシフェラーゼを核２に局在させる。このように、一方の細胞１Ａにおける複数の発光遺伝子と他方の細胞１Ｂにおける複数の発光遺伝子とは同じであるが、一方の細胞１Ａと他方の細胞１Ｂとで細胞内の局在関係が互いに異なるようにすることで、細胞の区別と色分離とを同時に実行できるようになる。

なお、本実施形態は、プロモーターアッセイに用いる場合を例に説明したが、例えば核に局在するタンパクにルシフェラーゼを融合させ、タンパク質の量の解析に用いたり、核移行の解析に用いたりすることができる。

また、発光色の異なるルシフェラーゼを細胞内の核と細胞質に局在させる代わりに、ＤＡＰＩといった核を標識する蛍光物質で細胞を染色し、核の領域を確認しながら観察を行う、発光と蛍光の組合せとしても良い。

［ＨｅＬａ細胞における多色発光イメージングを用いたプロモーター活性の検出］
本実施例では、ＳＶ４０プロモーター制御下におかれ、ペルオキシソーム局在シグナルを付与した緑色発光を呈するルシフェラーゼ（ＥｍｅｒａｌｄＬｕｃ，東洋紡）と、ＣＭＶプロモーター制御下に置かれ、核局在シグナルを付与した赤色発光を呈するルシフェラーゼ（ＳｆＲＥ１）の発光イメージングを行うことで、同一の生細胞における２種類のプロモーター活性を検出した。

本実施例における実験の手順について、以下に説明する。

（１）発光色の異なるルシフェラーゼを異所に局在させた細胞の作製
ｐＥＬｕｃｔｅｓｔベクター（東洋紡社製）のＭＣＳにＸｈｏＩ、ＥｃｏＲＩで以下のＳＶ４０プロモーター配列を挿入し、ＳＶ４０プロモーター：：ＥＬｕｃ発現ベクター（ＳＶ４０：：ＥＬｕｃ）を作成した。以下に示すように本ベクターＥＬｕｃルシフェラーゼのＣ末には、以下のようなペルオキシソーム局在配列が付与されている。
ＳＶ４０プロモーター配列：ｇｃｇｃａｇｃａｃｃａｔｇｇｃｃｔｇａａａｔａａｃｃｔｃｔｇａａａｇａｇｇａａｃｔｔｇｇｔｔａｇｇｔａｃｃｔｔｃｔｇａｇｇｃｇｇａａａｇａａｃｃａｇｃｔｇｔｇｇａａｔｇｔｇｔｇｔｃａｇｔｔａｇｇｇｔｇｔｇｇａａａｇｔｃｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｃａｇｇｃａｇａａｇｔａｔｇｃａａａｇｃａｔｇｃａｔｃｔｃａａｔｔａｇｔｃａｇｃａａｃｃａｇｇｔｇｔｇｇａａａｇｔｃｃｃｃａｇｇｃｔｃｃｃｃａｇｃａｇｇｃａｇａａｇｔａｔｇｃａａａｇｃａｔｇｃａｔｃｔｃａａｔｔａｇｔｃａｇｃａａｃｃａｔａｇｔｃｃｃｇｃｃｃｃｔａａｃｔｃｃｇｃｃｃａｔｃｃｃｇｃｃｃｃｔａａｃｔｃｃｇｃｃｃａｇｔｔｃｃｇｃｃｃａｔｔｃｔｃｃｇｃｃｃｃａｔｇｇｃｔｇａｃｔａａｔｔｔｔｔｔｔｔａｔｔｔａｔｇｃａｇａｇｇｃｃｇａｇｇｃｃｇｃｃｔｃｇｇｃｃｔｃｔｇａｇｃｔａｔｔｃｃａｇａａｇｔａｇｔｇａｇｇａｇｇｃｔｔｔｔｔｔｇｇａｇｇｃｃｔａｇｇｃｔｔｔｔｇｃａａ（配列番号１）。
ＥＬｕｃルシフェラーゼ：ＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＣＣＣＧＡＧＣＣＣＡＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＧＧＧＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＧＣＡＣＴＣＣＣＡＣＡＴＣＣＣＣＣＡＧＧＣＣＡＴＣＣＴＧＧＡＣＧＴＧＡＴＧＧＧＣＡＡＣＧＡＧＴＣＣＣＴＴＴＣＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣＡＣＴＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＡＣＡＡＧＡＴＧＡＡＣＧＡＴＧＴＣＧＴＧＴＣＧＡＴＣＴＧＴＧＣＡＧＡＧＡＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＴＴＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＧＣＣＴＧＧＴＡＣＡＴＣＧＧＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＴＡＴＡＴＣＣＣＡＧＡＣＧＡＧＣＴＧＴＧＴＡＡＡＧＴＧＡＣＣＧＧＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＣＣＧＡＴＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＴＡＧＧＡＡＧＡＴＣＣＴＧＣＣＴＡＡＧＧＴＴＴＴＧＧＡＧＧＴＴＡＡＡＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＡＣＴＡＣＡＴＡＡＡＧＡＧＧＡＴＣＡＴＣＡＴＡＣＴＧＧＡＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＧＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣＴＴＣＡＴＧＴＣＣＡＧＧＴＡＣＴＣＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＣＡＴＴＣＡＡＧＣＣＴＣＴＧＣＡＣＴＡＣＧＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＣＣＡＧＧＴＡＧＣＣＧＣＣＡＴＣＣＴＧＴＧＣＴＣＣＴＣＣＧＧＣＡＣＡＡＣＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＡＡＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＡＧＡＣＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＡＴＣＴＧＴＧＴＧＡＧＡＣＴＣＡＣＡＣＡＣＧＣＡＴＣＴＧＡＣＣＣＣＡＧＡＧＴＧＧＧＴＡＣＡＣＡＡＣＴＣＡＴＣＣＣＣＧＧＣＧＴＡＴＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＡＣＣＴＧＣＣＡＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＣＣＴＴＣＧＧＣＴＴＣＡＧＴＡＴＣＡＡＣＣＴＧＧＧＣＴＡＴＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＧＣＣＴＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＴＧＣＴＣＣＧＡＡＧＧＴＴＴＡＡＣＣＡＧＧＡＧＧＴＧＴＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＡＣＴＡＣＧＡＧＧＴＧＡＧＧＡＧＣＧＴＧＡＴＣＡＡＣＧＴＴＣＣＣＴＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＴＴＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＡＧＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＧＴＡＣＧＡＣＣＴＡＴＣＣＡＣＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＧＣＣＧＣＴＣＣＴＣＴＧＧＣＧＡＡＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＡＴＣＧＣＣＧＴＧＡＡＧＡＧＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＣＡＧＧＧＡＴＡＣＧＧＴＧＴＧＧＣＴＡＣＧＧＴＣＴＡＡＣＡＧＡＧＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＣＣＡＡＣＡＴＣＣＡＴＡＣＴＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＣＣＧＧＣＴＣＣＣＴＧＧＧＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＣＣＴＴＡＣＡＴＧＧＣＣＧＣＣＡＡＧＡＴＣＡＴＣＧＡＣＡＧＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＧＴＣＣＡＡＡＣＣＡＧＧＴＧＧＧＣＧＡＧＣＴＧＴＧＣＡＴＣＴＧＧＧＧＡＣＣＴＡＴＧＧＴＡＡＣＡＡＡＡＧＧＣＴＡＴＧＴＧＡＡＣＡＡＣＣＣＡＣＡＧＧＣＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＴＣＧＡＣＧＡＣＧＡＣＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＣＴＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＡＧＴＡＴＴＴＣＴＡＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＣＧＧＴＡＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＡＴＡＣＡＡＧＧＧＣＴＡＴＣＡＧＧＴＣＧＣＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＡＧＣＡＣＣＣＡＧＧＣＡＴＣＡＧＧＧＡＣＧＴＧＧＣＣＧＴＣＧＴＧＧＧＴＡＴＣＣＣＴＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＧＡＧＣＴＧＣＣＡＧＣＣＧＧＣＴＴＣＧＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＧＣＣＣＡＡＣＴＣＡＣＣＧＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＧＴＡＣＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＧＴＧＴＣＴＣＡＣＴＣＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＡＧＧＧＧＣＧＧＣＧＴＡＡＧＧＴＴＣＧＴＧＧＡＣＴＣＴＡＴＣＣＣＣＡＧＧＡＡＣＧＴＧＡＣＡＧＧＣＡＡＧＡＴＴＡＧＴＣＧＡＡＡＡＧＡＧＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴＴＣＴＡＡＧＣＴＧＴＡＡ（配列番号２）。
ペルオキシソーム局在配列：ＴＣＴＡＡＧＣＴＧ（配列番号３）。

次に、ＣＭＶプロモーターの活性をモニターするレポーターとして、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＭＣＳサイトにＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩで以下のＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ遺伝子を挿入し、ＣＭＶ：：ＳｆＲＥ１発現ベクター（ＣＭＶ：：ＳｆＲＥ１）を作製した。なお、ＳｆＲＥ１遺伝子のＣ末には、以下の核局在シグナルを付与した。
ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼ遺伝子：ＡＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＡＴＧＡＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＡＧＡＡＣＧＴＧＧＴＧＣＡＣＧＧＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＴＡＣＴＡＣＣＴＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＧＣＡＡＴＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＣＣＡＴＣＣＴＧＡＧＡＴＡＣＧＣＣＣＡＧＣＴＧＣＣＣＧＡＣＡＣＡＡＴＣＧＣＣＴＴＣＡＣＣＧＡＣＧＧＣＣＡＣＡＣＣＡＡＧＣＧＧＧＡＴＧＴＧＡＣＣＴＡＣＧＣＣＣＡＣＴＡＣＴＴＣＧＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧＣＣＧＡＧＡＧＣＣＴＧＡＡＧＡＧＡＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＧＧＡＴＣＧＣＣＧＴＧＴＧＣＡＧＣＧＡＧＡＡＣＡＡＣＧＴＧＧＡＡＴＴＴＴＴＣＡＴＣＣＣＣＧＴＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＴＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＣＣＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＡＴＣＴＡＣＡＡＣＧＡＧＡＣＡＧＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＧＴＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＡＡＧＡＧＧＡＣＴＴＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣＡＣＡＧＣＴＴＴＡＴＧＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＴＧＣＣＣＣＣＣＡＡＣＴＴＣＧＡＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＴＡＣＡＡＧＣＣＣＧＡＡＧＡＧＴＴＣＧＣＣＣＧＧＧＡＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＴＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＡＣＣＧＧＣＣＴＧＣＣＴＡＡＡＧＧＣＧＴＧＡＴＧＣＴＧＧＣＣＣＡＣＡＧＡＴＣＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＣＧＧＴＴＣＡＧＣＣＡＣＴＧＣＡＡＧＧＡＣＣＣＣＧＴＧＴＴＣＧＧＣＡＡＣＣＡＧＡＴＣＡＴＣＣＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＴＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＴＧＡＴＣＣＣＴＴＴＣＣＡＣＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＧＣＡＴＧＴＴＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＧＧＣＴＡＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＧＣＴＴＣＣＧＧＡＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＧＡＡＧＴＴＣＧＡＣＧＡＧＣＡＣＴＡＣＴＴＴＣＴＧＡＡＧＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＡＧＡＴＣＣＡＧＴＴＴＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＴＧＴＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＣＡＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＡＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＣＣＣＣＣＣＴＧＧＣＴＡＡＡＧＡＡＧＴＧＧＧＡＧＡＧＧＣＣＧＴＣＧＣＣＡＡＧＣＧＧＴＴＴＡＡＧＣＴＧＣＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＣＡＧＧＧＣＴＡＣＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＧＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＡＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＧＣＧＡＧＧＡＴＡＡＧＣＣＴＧＧＣＴＣＴＡＣＡＧＧＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＧＣＣＡＡＧＡＴＣＧＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＧＣＣＣＴＣＡＣＣＡＧＡＧＧＧＧＡＧＡＡＣＴＣＴＡＣＣＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＣＡＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＧＣＴＡＣＴＧＣＡＡＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＡＴＧＡＴＣＧＡＣＡＡＧＧＡＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＣＡＣＴＣＣＧＧＣＧＡＣＧＴＴＧＣＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＣＧＧＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＴＣＧＴＧＧＡＣＣＧＧＣＴＧＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＧＧＣＴＡＣＣＡＧＧＴＧＧＣＣＣＣＴＧＣＣＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＴＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＣＡＴＣＣＣＴＧＣＡＴＣＴＴＣＧＡＴＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＣＧＧＣＧＴＧＣＣＡＧＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＣＧＧＣＧＡＡＣＴＧＣＣＴＧＧＣＧＣＣＴＧＴＧＴＧＧＴＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＧＴＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＧＧＡＣＴＡＣＧＴＣＧＣＣＧＧＣＣＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＣＴＡＣＡＡＧＡＧＡＣＴＧＡＧＡＧＧＣＧＧＴＧＴＧＣＧＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＧＡＧＡＴＣＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＴＧＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＣＣＧＧＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＣＴＧＡＡＧＡＡＡＣＣＣＣＡＧＡＧＣＡＡＧＡＴＧＴＧＡ（配列番号４）。
核局在シグナル：ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＣＡ（配列番号５）。

図５は、ＥＬｕｃルシフェラーゼとＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの発光スペクトルを示している。図５に示すように、ＥＬｕｃルシフェラーゼは、ピーク波長５３８ｎｍの緑色発光反応を触媒し、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼはピーク波長６０４ｎｍの赤色発光反応を触媒する。

（２）測定システムと測定条件
３５ｍｍガラスボトムディッシュに播いたＨｅＬａ細胞に、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用してＳＶ４０：：ＥＬｕｃ及びＣＭＶ：：ＳｆＲＥ１ベクターを導入した。２４時間培養した後、１０％のＦＢＳを含むＤ−ＭＥＭ培地に培地を交換し、最終濃度５００μＭでＤ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を加えて１時間静置した。ディッシュをＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷＬＶ２００（オリンパス社製）にセットした後、発光画像の撮影を行った。

撮像中のＨｅＬａ細胞は５％ＣＯ_２雰囲気下のインキュベーター内に静置され、観察時の対物レンズの倍率は１００倍、ＣＣＤカメラはＩｍａｇＥＭ（浜松ホトニクス社製）、Ｂｉｎｎｉｎｇは１ｘ１だった。発光観察時にはフィルターＦ１，Ｆ２としてＢＰ４６０−５１０ＨＱフィルター及び６１０ＡＬＰフィルターを使用し、ＥＬｕｃルシフェラーゼの緑色発光とＳｆＲＥ１ルシフェラーゼの赤色発光の色分離を行った。ＢＰ４６０−５１０ＨＱ２フィルター、６１０ＡＬＰフィルターを使用した際の露出時間は、いずれも、１０分（発光観察）だった。

（３）結果
観察の結果得られたＢＰ４６０−５１０ＨＱフィルター使用時の発光画像を図６に、６１０ＡＬＰフィルター使用時の発光画像を図７に示す。

図６、図７の矢印で示した細胞において、ＥＬｕｃルシフェラーゼは細胞質３に、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼは核２に局在している様子を観察することが可能である。しかしながら、図５のスペクトルに示すように、ＢＰ４６０−５１０ＨＱフィルター及び６１０ＡＬＰフィルターでは完全に分光できないため、図６及び図５に示される細胞の発光には緑色及び赤色のそれぞれの成分が混在している。

そこで、本発光画像に対して色分離の処理を実行した。色分離に際しては市販のソフトウェアを使用し、フィルター透過率やスペクトルデータなどから色分離処理を実行することが可能である。ここでは、ＷａｖｅｌｅｎｇｔｈＵｎｍｉｘｉｎｇＳｏｆｔｗａｒｅｖｅｒ．１．２（オリンパス）を使用し、緑色及び赤色成分の色分離を実行した。

緑色成分の色分離結果を図８に、赤色成分の色分離結果を図９に示す。

図８及び図９に示すように、色分離前の画像と比較して、ＥＬｕｃルシフェラーゼは細胞質３に、ＳｆＲＥ１ルシフェラーゼは核２に局在している様子を、よりはっきりと観察することが可能である。しかしながら、色分離後であっても、緑色成分と赤色成分のごくわずかな混在が画像から確認できる。

そこで、残存した不要な色成分を除去するために、得られた色分離後の発光画像に対してＲＯＩを指定した（図１０、図１１）。ＲＯＩ１及びＲＯＩ２は細胞の核２内に指定し、ＲＯＩ３及びＲＯＩ４は細胞質３に指定した。さらに、指定したＲＯＩの発光強度を各々の発光画像に基づいて測定し、その発光強度をグラフで表示した（図１２）。

図１２に示すように、ルシフェラーゼの発光色に応じた分光フィルターを用いて発光画像を取得し、取得した発光画像に対してフィルター透過率に応じた色分離処理を実行した上で、各ルシフェラーゼに付与した局在配列に合わせてＲＯＩを設定することで、複数のルシフェラーゼの不要な色成分を除去することが可能である。

以上、実施形態に基づいて本発明を説明したが、本発明は、上述した実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨の範囲内で種々の変形や応用が可能なことは勿論である。

１，１Ａ，１Ｂ…細胞、２…核、３…細胞質、１０…発光イメージングシステム、２０…顕微鏡、２１…光学系、２２…光源、２３…撮像装置、３０…演算装置、３１…撮影制御部、３２…画像取得部、３３…光源制御部、３４…光学系制御部、３５…記録部、３６…画像解析部、４０…入力部、５０…生体試料、Ｆ１，Ｆ２…フィルター。

Claims

生体試料からの発光を測定する発光測定方法であって、
発光色が互いに異なり且つ互いに細胞内の異所に局在するように標識された複数の発光遺伝子を含む１つの細胞を含む、前記生体試料を作製する作製工程と、
前記発光色及び細胞内局在位置の両方の関係を各々の前記発光色毎に関連付けて、前記生体試料の発光画像を撮像する撮像工程と、
前記撮像工程で撮像した前記発光画像に基づいて、各々の細胞内局在位置の前記発光色の発光強度を定量的に測定する測定工程と、
を含むことを特徴とする発光測定方法。
前記細胞内の異所が、前記１つの細胞の核及び細胞質である請求項１に記載の発光測定方法。
前記生体試料に対し、当該生体試料外から所定の刺激を与える刺激工程を更に含む請求項１に記載の発光測定方法。
前記細胞内の異所の内の１つは、前記１つの細胞の核である請求項１に記載の発光測定方法。
前記作製工程は、前記生体試料として、発光色が互いに異なり且つ互いに細胞内の異所に局在するように標識された複数の発光遺伝子を含む、前記１つの細胞とは異種の１つの第２の細胞を更に含む、生体試料を作製し、
前記１つの細胞における前記複数の発光遺伝子と前記１つの第２の細胞における前記複数の発光遺伝子とは同じであるが、前記１つの細胞と前記１つの第２の細胞とで細胞内の局在関係が互いに異なる請求項１に記載の発光測定方法。
前記発光色は赤色と緑色である請求項１に記載の発光測定方法。
前記発光遺伝子は、ルシフェラーゼである請求項１に記載の発光測定方法。
前記ルシフェラーゼは、甲虫由来のルシフェラーゼである請求項７に記載の発光測定方法。
前記測定工程は、前記発光色の内の１つの前記発光強度を内部標準として使用する請求項１に記載の発光測定方法。