JP6223157B2 - 三次元画像撮像方法、三次元画像解析方法、及び三次元画像撮像システム - Google Patents

Description

本発明は、三次元画像撮像方法、三次元画像解析方法、及び三次元画像撮像システムに関するものである。

生物細胞が蛍光を発するように改変して得られた試料を観察対象として、細胞イメージングする技術は、種々の生命現象の観察に大いに役立てられてきた。特に、蛍光を発するように改変された生物細胞については、蛍光により発せられる光強度が比較的強いことから、二次元及び三次元での細胞イメージングに多用されてきた。その一方で、発光を発するように改変された生物細胞については、その有用性が理解されながらも、発光により発せられる光が非常に微弱なことから、二次元か三次元かに関わらず、細胞イメージング自体が非常に困難であった。

そこで、従来、自家発光により生じる肉眼では観察できない微弱な光に対して合焦位置を合わせることができる微弱光検出方法及び装置が提案されてきた（例えば、特許文献１参照）。特許文献１の微弱光検出方法及び装置によれば、鮮明な二次元発光画像を取得することができる。また、複数の異なる発光部位を有する胚等の生体試料について、異なる焦点距離において撮像して画像を得て、得られた各画像内の発光部位のコントラストに基づいて、画像の三次元再構成に使用する画像を取捨選択する方法及び装置が提案されてきた（例えば、特許文献２参照）。特許文献２の画像化方法によれば、生体試料内部で発生する光を正確に画像化することができる。

ここで、蛍光を発するように改変された生物細胞を用いた細胞イメージングでは、光強度が比較的強いため、細胞内の細部構造を精細に把握することが可能である一方で、細胞内部構造による光の散乱の影響が大きく、光強度に基づいて定量的なデータを取得することは困難であった。また、蛍光による細胞イメージングでは、蛍光を励起させるための励起光の照射時間が長くなるほど検出される蛍光強度が減衰し、また、励起光の照射により、イメージング対象とする生物細胞の挙動に影響が出るからである。

さらに、近年、単独の細胞レベルの生命現象を観察するための観察系と、組織レベルの生命現象を観察するための観察系との橋渡しとなる観察系として、複数の細胞同士が三次元的に離間した状態で生じる細胞間の相互作用を観察するための観察系に対する要求が高まってきた。細胞は、単独で培養されている場合と、複数の細胞が適宜離間した状態で培養されている状態とでは、薬剤等に対する応答が異なるので、単独で培養されている細胞で観察された応答をそのまま組織の応答として解釈することはできなかったからである。したがって、複数の細胞同士が三次元的に離間した状態で生じる細胞間の相互作用を観察するための観察系に使用する試料の培養担体として、様々な三次元培養担体が開発されている。

特許第５２８９７６８号公報 特開２０１２−１２２８２９号公報

しかし、これらの三次元培養担体は、一般的に、シリカ、リン酸カルシウム、及び脂肪酸ポリエステルといった白色系の材料（部材）により構成され、これらの材料は、少なくとも可視光に対し高い反射または散乱を示す。仮に、三次元培養担体が、光透過性が比較的高い材料（例えば、ガラス）を含むような場合でも、三次元培養担体の外部から明視野照明光や蛍光用励起光を照射すると、三次元的に配置される細胞の外部と内部とでは届く光量が異なり、またばらつき易いので、個々の細胞から正確な生物学的情報を得るのが難しい。

したがって、かかる事情に鑑みてなされた本発明の目的は、三次元培養担体により担持された三次元試料について、高精彩な三次元発光画像を取得するための新たな方途を提供することにある。

上記目的を達成する本発明に係る三次元画像撮像方法は、非照明条件下で自己発光するよう調製された複数の細胞を、担体上で、１μｍ以上前記複数の細胞の平均的な大きさの２倍以下の、前記複数の細胞間での相互作用が可能な離間距離で、三次元的に離間した配置状態で培養して、三次元試料を準備するステップと、前記三次元試料中の、前記複数の細胞を含むボリュームについて非照明条件下での三次元発光画像を取得するステップと、を含むことを特徴とするものである。

さらに、上記三次元画像撮像方法において、前記三次元試料を準備するステップで、前記複数の細胞間に前記担体の部材を介在させることにより、前記複数の細胞間での相互作用が可能な距離である、前記離間距離を隔てて、前記複数の細胞の少なくとも一部を、一つ一つ三次元的に離間して配置させることが好ましい。

さらに、上記三次元画像撮像方法において、前記三次元発光画像を取得するステップは、対物光学系を備える画像撮像装置を用いて前記複数の細胞を含むボリュームについて、非照明条件下での三次元発光画像を取得するステップであり、該ステップは、さらに、前記三次元試料について、前記対物光学系の合焦位置を光軸方向に所定ピッチで移動させるステップと、各合焦位置にて、前記三次元試料の前記ボリュームに含まれる前記複数の細胞の発光画像を、非照明条件下で撮像する撮像ステップと、前記撮像ステップで撮像された複数枚の前記発光画像を三次元合成して、前記複数の細胞の三次元発光画像を生成する三次元合成ステップとを含むことが好ましい。

さらに、上記三次元画像撮像方法において、前記撮像ステップを所定の時間間隔で繰り返し、各撮像ステップにて撮像された前記複数枚の発光画像について、前記三次元合成ステップを実施することが好ましい。

上記目的を達成する本発明に係る三次元画像解析方法は、上述の三次元画像撮像方法により得られた、前記複数の細胞の三次元発光画像に基づいて、該三次元発光画像に含まれる少なくとも一つの細胞の発光強度値を取得し、発光情報として提供するステップを含み、前記発光情報は、前記少なくとも一つの細胞と、該少なくとも一つの細胞の周囲の細胞との相互作用に関する情報を含むことを特徴とする。

上記目的を達成する本発明に係る三次元画像撮像システムは、対物光学系及び撮像部を備える画像撮像装置と、前記画像撮像装置を介して取得された画像を三次元合成する三次元画像合成装置と、を有する三次元画像撮像システムであって、非照明条件下で自己発光するよう調製された複数の細胞が担体上で、１μｍ以上前記複数の細胞の平均的な大きさの２倍以下の、前記複数の細胞間での相互作用が可能な離間距離で、三次元的に離間した配置状態で培養された三次元試料を有し、前記画像撮像装置は、前記三次元試料を保持する試料保持部と、前記三次元試料を覆う暗箱とを備え、前記三次元画像合成装置は、画像合成部を備え、該画像合成部は、前記画像撮像装置により撮像された、前記三次元試料中の複数の細胞を含むボリュームについて三次元発光画像を生成することを特徴とする。

さらに、上記三次元画像撮像システムにおいて、前記三次元試料の前記担体は、該担体を構成する複数の部材が、前記複数の細胞の前記離間距離内に介在して配置されてなることが好ましい。

さらに、上記三次元画像撮像システムにおいて、前記画像撮像装置は、さらに、前記対物光学系の合焦位置を光軸方向に所定ピッチで移動させる対物光学系調整部と、前記対物光学系調整部により移動された各合焦位置にて、前記三次元試料の前記ボリュームに含まれる少なくとも一つの細胞の発光画像を、非照明条件下で撮像するように前記撮像部を制御する撮像制御部と、を備え、前記三次元画像合成装置は、前記撮像部により撮像された複数枚の前記発光画像を三次元合成して、前記複数の細胞の三次元発光画像を生成する画像合成部を備えることが好ましい。

さらに、上記三次元画像撮像システムにおいて、前記撮像制御部は、前記撮像部が前記各合焦位置で前記発光画像を撮像して複数枚の発光画像を取得することを、所定の時間間隔で繰り返すように前記撮像部を制御し、前記画像合成部は、各時点で前記撮像部により撮像された前記複数枚の前記発光画像を三次元合成して、前記複数の細胞の三次元発光画像を複数枚生成することが好ましい。

本発明によれば、三次元培養担体により担持された三次元試料について、高精細な三次元発光画像を得ることができる。

本発明に係る三次元画像撮像システムの一例を示す概略構成図である。 図１に示す三次元画像撮像システムの一部の詳細構成の一例を示す図である。 図２に示す三次元試料の平面図である。 本発明に係る三次元画像撮像方法の一例を説明する図である。 本発明に係る三次元画像撮像方法により得られる発光画像及び三次元発光画像の一例を示す図である。 本発明に係る三次元画像撮像方法により得られる発光画像及び三次元発光画像の一例を示す図である。 本発明に係る三次元画像撮像方法により得られる発光画像及び三次元発光画像の一例を示す図である。 本発明に係る三次元画像撮像方法により得られる発光画像及び三次元発光画像の一例を示す図である。 本発明に係る三次元画像撮像方法により得られる発光情報の一例を示す図である。

以下、本発明の一実施形態による三次元画像撮像方法、三次元画像解析方法、及び三次元画像撮像システムの実施形態について、図面を参照して詳細に説明する。

図１は、本発明に係る三次元画像撮像システムの一例を示す概略構成図である。三次元画像撮像システム１０は、三次元試料１２を保持する試料保持部１１と、三次元試料１２の培養条件を調節するインキュベータ１３と、対物光学系１４と、撮像部１５と、対物光学系１４の移動を調整する対物光学系調整部１６と、試料保持部１１の移動を調整する試料保持部調整部１７と、これらを制御する制御部１８と、を備える。制御部１８は、特に、撮像部１５を制御する撮像制御部１９と、撮像された画像を合成する画像合成部２０とを備える。なお、対物光学系１４、撮像部１５、及び撮像制御部１９は、画像撮像装置を構成する。また、画像合成部２０は、三次元画像合成装置を構成する。さらに、三次元画像撮像システム１０は、試料保持部１１、三次元試料１２、及びインキュベータ１３を含む本体２１と、本体２１の外周部に設けられた暗箱２２と、暗箱２２を覆う蓋２３とを備える。暗箱２２及び蓋２３により、本体２１の内部は外来光から遮光され、光源２４をオフにした場合には、本体２１の内部は非照明条件となる。これにより、本体２１の内部は、三次元試料１２中の個々の細胞が遺伝子発現等の活性または存在量に応じて極微弱な生物発光を自己発光したとしても、撮像部１５が良好な撮像を実施できる状態に維持される。なお、暗箱２２は、三次元試料１２から撮像部１５に至る範囲に外来光が入射しない暗室を形成する構造であれば、どのような遮光構造であっても良い。

ここで、三次元画像撮像システム１０は、非照明条件下で自己発光するように調製された三次元試料１２を撮像可能に構成されている。このため、三次元試料１２を照明するための機構は本実施形態による三次元画像撮像システム１０では必須の構成ではない。しかしながら、実用上、発光の観察及び撮像に先立って、試料表面に焦点を合わせるために、照明下で焦点位置を調節する必要が生じうることがある。したがって、図１では、三次元画像撮像システム１０は光源２４を備えるものとして図示するが、発光を観察する際には光源２４からの照明をオフに（非照明下）にする。さらに、三次元画像撮像システム１０は、必要に応じて、蓋２３内に備えられたフィルタ３０及び対物光学系１４と撮像部１５との間に配置されたフィルタ３１を備えても良い。フィルタ３０及び３１は、例えば、分光フィルムとして構成されうる。また、自己発光のために用いる発光タンパク質（例えばルシフェラーゼ）として異なる波長の発光を示すような１または２種以上の発光タンパク質を使用した場合には、発光する色ごとに識別するための分光フィルタを装置内で交換しながら撮像したり、波長ごとのフィルタを通し別々の撮像部（または撮像素子上の部分領域）で同時に撮像したりすることで、マルチカラーな三次元発光画像を得ることも可能である。

また、三次元撮像システム１０は、三次元試料１２について、対物光学系１４の光軸方向をＺ軸とした場合に、Ｚ軸方向において所定間隔で撮像を行い、撮像された各画像を三次元再構成することにより三次元画像を取得するものである。以下、三次元画像撮像システム１０の主要構成部についてそれぞれ説明することにより、本実施形態の三次元撮像システム１０の動作及び機能、並びに本発明の三次元画像撮像方法及び三次元画像解析方法の一例の詳細を明らかにする。

試料保持部１１は、三次元試料１２を保持し、ＸＹ軸方向で移動可能に構成される。かかる移動は、試料保持部調整部１７により調整される。試料保持部１１のＸＹ軸方向における移動により、三次元画像撮像システム１０を用いて画像を撮像する際の撮像視野を選択することができる。なお、試料保持部１１は、例えば、ステージにより構成される。

三次元試料１２は、非照明条件下で自己発光するよう調製された複数の細胞を、担体上で三次元的に離間した配置状態で培養して得られた三次元試料である。本明細書において「非照明条件下で自己発光するよう調製された」試料とは、先天的に自己発光性を有する試料や、例えば、ルシフェラーゼの発光ベクターのような、発光性の遺伝子のベクターを導入して自己発光性を後天的に付与した試料を意味する。また、本明細書において「三次元試料」とは、細胞を三次元的に保持可能な担体上で、細胞を三次元的に離間した配置状態で培養して得られた試料を意味する。なお、三次元試料１２の薬剤に対する応答を三次元画像撮像システム１０で観察及び撮像するにあたり、予め三次元試料１２に薬剤を投与しておいても良いし、観察下で投与しても良い。

得られる三次元発光画像を高精細化する観点から、三次元試料の調製にあたり、高輝度型の発光遺伝子を使用することが好ましい。三次元試料の自己発光の強度が十分であれば、三次元発光画像を一層高精細化することができるからである。より高輝度の発光を得ることができる発光ベクターについては、目下開発が進んでいるが、そのような発光ベクターの一例として、ＣＭＶ（cytomegarovirus）プロモーターにＬｕｃｉｏｌａ２（添付の配列表参照）という遺伝子を担持させたベクター（ｐＣＭＶ：：Ｌｕｃｉｏｌａ２）や、ｐＧＬベクター（プロメガ社）、ｐＮＬベクター（プロメガ社）、及びｐＥＬｕｃベクター（東洋紡績社）などが挙げられる。

三次元試料の担体としては、例えば、繊維状のシートないし不繊布の形態の担体（例えば、国際公開第２０１０／０８２６０３号、特開２０１０−６３４１１号、特開２００８−１９９８９７号）、複数の微粒子（直径：５０〜１０００ｎｍ）により、複数の細胞を３次元的に配置する担体（例えば、特表第２０１０−５２４４４２号）、及び、平面上に溝等の微細構造（マトリックス状ないし繊維状）を形成したフィルム形態の担体（例えば、特開２０１０−２２３６６号、特開２０１０−１６１９８１号）が挙げられる。フィルム形態の担体を三次元培養担体（三次元培養用支持体）として用いる場合には、２個以上、好ましくは５個以上の細胞が担体内部に高さないし深さ方向に保持できるように、１００μｍ以上、好ましくは２００μｍ以上の厚さであることが好ましい。この他に、三次元試料の担体としては、ゲル状担体も報告されている。一方、平面上に溝等の微細構造を形成したフィルム状の担体では、互いに溝で隔離された複数の細胞が培養によりスフェロイドという立体的な細胞塊が生成され、かかる細胞塊状に生長した細胞もまた、上述したような光照射による光量のばらつきや散乱等の影響で内部構造を観察し難い。そこで、本願に係る三次元画像撮像システムの三次元試料として適用することができる。上述した担体の中でも、細胞間に担体を構成する部材が介在することで、細胞間での相互作用が可能な距離で、担体に担持される複数の細胞の少なくとも一部を一つ一つ三次元的に離間して配置させることができる、繊維状のシートないし不繊布の形態の担体、及び複数の微粒子により複数の細胞を三次元的に配置する担体を使用することが好ましい。本発明者による検討では、発光タンパク質による遺伝子発現に関わる細胞間の相互作用に関して、例えば１μｍ以上、細胞２個相当の距離以内で細胞同士が非接触の状態で離間している場合、より生体組織に近い生物学的情報の取得が可能な状態における三次元発光画像を取得することができると考えられた。なお、これらの好ましい担体は、該担体を構成する繊維や微粒子等の複数の部材が、前記複数の細胞が前記複数の部材間に介在可能且つ相互作用可能な距離で、相互に離間して配置されてなるものである。

対物光学系１４は、三次元試料１２に含まれる複数の細胞から発せられる発光に対して合焦し、かかる発光を撮像部１５へと伝達する。対物光学系１４は、対物光学系調整部１７により、光軸方向に所定ピッチで移動され、三次元試料１２における合焦位置を光軸方向、すなわちＺ軸方向に移動可能である。これにより、担体上で複数の細胞を三次元的に離間して保持する三次元試料１２について、高精彩な三次元発光画像を取得することができる。

撮像部１５は、対物光学系１４から伝達される発光を、対物光学系調整部１６により移動された対物光学系１４の各合焦位置にて、三次元試料の複数の細胞を含むボリュームに含まれる少なくとも一つの細胞由来の発光の画像（発光画像）を、非照明条件下で撮像する。撮像部１５は、かかる撮像により、三次元試料１２中の複数の細胞を含むボリュームについて複数枚の発光画像を得る。ここで、「ボリューム」とは、対物光学系１４の観察視野と、Ｚ軸方向の観察範囲により規定される、ＸＹＺ軸方向に広がりを持つ観察領域を意味する。なお、Ｚ軸方向の観察範囲は、三次元試料１２のＺ軸方向の厚さ全体であっても、その一部であっても良い。また、「ボリューム」は、三次元画像撮像システム１０のユーザの用途に応じて、適宜設定することができる。なお、撮像部１５は、例えば、ＣＣＤ（Charge Coupled Device）カメラ、ＣＭＯＳ（Complementary MOS）センサなどのイメージセンサにより構成される。

制御部１８は、撮像部１５、対物光学系調整部１６、及び試料保持部調整部１７の動作をそれぞれ制御する。特に、制御部１８内の撮像制御部１９は、撮像部１５の撮像タイミング及び露出時間を制御する。この際、撮像制御部１９は、撮像部１５が、対物光学系１４から伝達される発光を、対物光学系調整部１６により移動された対物光学系１４の各合焦位置にて、三次元試料の複数の細胞を含むボリュームに含まれる少なくとも一つの細胞の発光画像を、非照明条件下で撮像するようにする。なお、対物光学系調整部１６は、具体的には微動ねじにより構成されることができる。さらに、撮像制御部１９は、上述した各合焦位置における撮像を、所定の時間間隔で繰り返すことができる。なお、制御部１８及び撮像制御部１９は、例えば、コントローラやＰＣ（Personal Computer）により構成され、これらは、使用者が撮像した画像を観察するためのディスプレイ等の表示部や、後述するような領域（ＲＯＩ）を指定するためのインターフェース（キーボードやタッチパネルのような入力手段等）を備えている。

画像合成部２０は、複数の細胞を含むボリュームについて非照明条件下での三次元発光画像を生成する。より具体的には、撮像部１５により撮像された複数枚の発光画像を三次元合成して、複数の細胞の三次元発光画像を生成する。ここでいう三次元合成とは、三次元再構成処理であり、撮像部１５により得られた複数枚の発光画像について、それぞれの位置情報を用いて各画像を三次元的に配列して合成する処理を意味する。なお、図１では、三次元画像撮像システム１０は、撮像制御部１９及び画像合成部２０を同じ制御部１８内に備えるものとして図示したが、これらを別個のハードウエア資源（プロセッサ）により実装することも勿論可能である。このようにして、本実施形態による三次元画像撮像システムにより三次元発光画像を撮像することで、三次元試料について、高精彩な三次元発光画像を取得することができる。すなわち、本実施形態による三次元画像撮像システムによれば、高精度な三次元発光イメージングを実現することができる。なお、図１は倒立型の対物光学系を示しているが、正立型（試料の情報に対物レンズが配置される）の対物光学系を、三次元画像撮像システム１０に採用することも勿論可能である。

さらに、撮像制御部１９により各合焦位置における撮像が繰り返された場合、画像合成部２０は、各時点において撮像された複数枚の発光画像について、それぞれ三次元合成を実施することができる。このようにして、本実施形態による三次元画像撮像システムは、細胞から発せられる発光について、タイムラプス撮影を実現することができる。

図２は、図１に示す三次元画像撮像システム１０の一部の詳細構成の一例を示す図である。三次元試料１２は複数の細胞（図中、黒の楕円で示される）を繊維状の担体内において三次元配置してなる。三次元試料１２は、ガラスボトムディッシュ１２１内に静置される。三次元試料１２内の複数の細胞の分散は均等ではなく、分散密度に粗密があり、それぞれ、対物光学系１４の光学面から、距離Ｚａ〜Ｚｅで離間して配置されている。さらに、図３に示す三次元試料１２の平面図からも明らかなように、ＸＹ平面上においても分散密度に粗密がある。

対物光学系１４は、対物光学系調整部１６によりＺ軸方向に所定ピッチで移動されるが、ここで、所定ピッチは、例えば、撮像対象とする細胞の平均的な大きさに基づいて決定することができる。例えば、撮像対象とする細胞の平均的な大きさが、縦２０μｍである場合には、所定ピッチを２０μｍ未満とすれば、観察対象とする細胞のＺ軸方向の分散密度が疎な領域であっても、細胞が撮像できなくなる虞を低減し、逆に、細胞のＺ軸方向の分散密度が密な領域であっても、各細胞を個別の細胞として認識することができる。

そして、撮像制御部１９（明確のため、図２には図示しない）は、対物光学系１４が対物光学系調整部１６によりＺ軸方向に所定ピッチで移動される度に、撮像部１５（明確のため、図２には図示しない）の駆動を制御して、撮像動作を実行させる。撮像制御部１９による撮像部１５の駆動の制御について、図４を参照して以下に説明する。

図４は、本発明に係る三次元画像撮像方法の一例を説明する図である。ここでは、対物光学系調整部１６は、タイムポイント（ＴＰ）毎に、Ｚ軸方向について、対物光学系１４の初期位置を基準として０μｍ〜１００μｍの間で、１μｍピッチで対物光学系１４を移動させる。ここで、タイムポイント（ＴＰ）とは、一枚の三次元発光画像を取得するための複数回の撮像を開始する時点を意味する。また、撮像に先立ち、光源２４により三次元試料１２に対して光を照射し、対物光学系１４側（図１では、三次元試料１２の下方）より明視野観察して、三次元試料１２に関して、その形態や配置などの二次元的な情報を得て、撮像を開始する視野位置及びＺ軸方向の対物光学系１４側の初期位置を定めることができる。例えば、初期位置は、明視野で三次元試料１２の表面に合焦した際の、対物光学系１４の位置として定めることができる。もちろん、明視野観察によらず、発光画像に基づいて、対物対物光学系１４の初期位置を定めることも可能である。そして、撮像制御部１９は、対物光学系調整部１６が対物光学系１４のＺ軸上での位置を１μｍピッチで移動して焦点位置を移動させる毎に、所定の露出時間（ＥＸＰ＿ｔ）で撮像領域内に含まれる細胞由来の発光を撮像し、発光画像を得る。そして、画像合成部２０は、このようにして一つのタイムポイント（ＴＰ_１，ＴＰ_２、またはＴＰ_ｘ）での複数回にわたる撮像により得られた発光画像を、三次元合成して、三次元発光画像を生成する。

さらに、撮像制御部１９は、あるタイムポイント（ＴＰ_１）での複数回にわたる撮像を終えると、タイムポイント（ＴＰ_１）から所定時間後のタイムポイント（ＴＰ_２）で、同様に複数回の撮像を実施する。そして、撮像制御部１９は、三次元画像撮像システム１０のユーザの用途に応じた頻度及び時間にわたり、各タイムポイントで複数回の撮像を繰り返す。このように、複数のタイムポイントについて対物光学系１４の焦点位置をＺ軸方向で移動させつつ三次元発光画像を撮像することで、タイムラプス撮影を実施し、複数の細胞由来の発光の経時的変化を捉えることができる。

制御部１８は、このようにして得られた複数の細胞の三次元発光画像に基づいて、該三次元発光画像に含まれる少なくとも一つの細胞の発光強度値を取得し、発光情報として提供する。発光情報は、ＣＰＵ（Central Computing Unit）等の演算部を備える図示しないＰＣ等に上述のようにして得られた三次元発光画像を読み込み、例えば、市販のイメージングソフトウエアであるｃｅｌｌＳｅｎｓ（登録商標）（オリンパス株式会社製）により取得することも可能である。そして、上述の発光情報は、三次元発光画像に撮像されたある一つの細胞（注目細胞）と、かかる細胞の周囲の細胞との相互作用に関する生物学的情報を含む。ここで、「周囲の細胞」とは、例えば、注目細胞から所定距離（例えば、注目細胞の大きさの２倍以内）内の細胞である。

ここで、発光情報の取得方法の一例について、以下に説明する。発光情報の取得にあたり対象とする細胞の三次元位置情報及び発光強度値とを対応づけるステップを実施することが好ましい。まず、あるタイムポイントＴＰ_ｎにて取得した一番目の発光画像について、一つの細胞αを含むＲＯＩ_ｘを設定する。発光画像について、例えば左下を原点としたＸＹ座標系を与える。そして、細胞αの中心位置のＸＹ座標を求め、細胞αのＸＹ位置情報として設定する。次に、タイムポイントＴＰ_ｎで撮像した全ての発光画像の中から、細胞αの輝度が最も高くなる画像を抽出する。そして、かかる画像の取得されたＺ軸方向における位置を、細胞αのＸ位置情報として設定する。このようにして、細胞の三次元位置情報を取得する。

また、発光強度値は、タイムポイントＴＰ_ｎで撮像した全ての発光画像における、細胞αの中心位置のＸＹ座標に対応する位置の輝度値の合計値とすることができる。あるいは、発光強度値は、タイムポイントＴＰ_ｎで撮像した全ての発光画像の中から、細胞αの中心位置のＸＹ座標に対応する位置の輝度値が最も高い画像を選出し、かかる画像における細胞αの中心位置のＸＹ座標に対応する位置の輝度値とすることができる。

本実施形態による三次元画像解析方法によれば、細胞間での相互作用が可能な距離で担体上に担持された複数の細胞の三次元発光画像に基づいて発光情報を提供するので、かかる発光情報にはおのずと、細胞間の相互作用に関する情報がより生体に近い状態で含まれる。このような情報は、組織レベルでの薬剤等に対する細胞間の応答を正確に把握するために非常に有利に用いることができる。

以上、本発明の一実施形態について説明したが、本発明について、本発明の趣旨及び範囲内で、多くの変更及び置換ができることは当業者に明らかである。

以下、上述の実施形態に係る三次元画像撮像方法、三次元画像解析方法、及び三次元画像撮像システムにより、実際の三次元試料について三次元発光イメージング及び三次元発光解析を実施した例について説明する。下記の例では、三次元画像撮像システムを、試料保持部及び対物光学系としてＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ（登録商標）ＬＶ２００（オリンパス社製）を採用し、撮像部としてＩｍａｇＥＭ（登録商標）（浜松ホトニクス社製）を採用し、対物光学系調整部として焦点位置調整装置（Ｐｒｉｏｒ社製）を採用し、制御部として解析ソフトウェアｃｅｌｌＳｅｎｓ（登録商標）（オリンパス社製）をインストールしたＰＣを採用して構成した。かかる三次元画像撮像システムを用いて、担体としてＣｅｌｌｂｅｄ（登録商標）（日本バイリーン社製）を使用した三次元試料（Ｕ２ＯＳ安定発現株）の三次元発光画像を取得した。

［Ｕ２ＯＳ細胞の三次元多重培養サンプルを使用した三次元発光イメージングによるＣＭＶプロモーター活性の検出］
本実施例では、三次元試料として、ヒト骨肉腫細胞であるＵ２ＯＳ細胞の三次元多重培養サンプルを三次元試料として用いた三次元発光イメージングを行うことで、同一の生細胞におけるＣＭＶプロモーター活性の変化を長時間に渡って追跡した。
本実施例における実験の手順について、以下に説明する。

ｐｃＤＮＡ３．１（+）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）のＭＣＳ（Multiple Cloning Site）に制限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩでＬｕｃｉｏｌａ２ルシフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子（配列表を参照）を挿入し、ＣＭＶプロモーターの制御下でルシフェラーゼを発現するベクターｐＣＭＶ：：Ｌｕｃｉｏｌａ２を作成した。

３５ｍｍ−ガラスボトムディッシュに播いたＵ２ＯＳ細胞に、ＦｕＧｅｎｅ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）を使用してｐＣＭＶ：：Ｌｕｃｉｏｌａ２ベクターを導入した。常法を用いて、本ベクターを導入したＵ２ＯＳ細胞からｐＣＭＶ：：Ｌｕｃｉｏｌａ２の安定発現株を作成した。作成したＵ２ＯＳ安定発現株を三次元培養担体であるＣｅｌｌｂｅｄ（登録商標）（日本バイリーン社製）に６×１０^６個播種した。２日に１度の培地交換を行いながら、１０日間に渡る培養を行い、Ｕ２ＯＳ安定発現株の三次元多重培養サンプルを作成した。滅菌したピンセットでＣｅｌｌｂｅｄ（登録商標）を裏返して３５ｍｍ−ガラスボトムディッシュ内へ静置し、ステンレス製リングの重しをＣｅｌｌｂｅｄ（登録商標）上部へ置いた。最終濃度１ｍＭのＤ−ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ（発光用の基質溶液）を１０％のＦＢＳ（Fetal Bovine Serum）を含むＤ−ＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle medium）培地に添加した後、ディッシュをＬＵＭＩＮＯＶＩＥＷ（登録商標）ＬＶ２００（オリンパス社製）にセットし、三次元多重培養Ｕ２ＯＳ細胞の発光画像のタイムラプス撮影を行った。ここで、三次元培養担体として、溶液の浸透が良好なマトリックス状ないし繊維状の構造物を使用したので、基質溶液が三次元培養担体全体に浸透し、三次元培養担体に付着等により保持された個々の細胞に対し均等に基質反応を進行させることができた。

タイムラプス撮像にあたり、Ｕ２ＯＳ細胞を５％ＣＯ_２雰囲気下のインキュベータ内に静置し、観察時の対物レンズの倍率は２０倍、撮像部を構成するＣＣＤカメラはＩｍａｇＥＭ（登録商標）（浜松ホトニクス社製）、ビニングは１×１、露出時間は１秒とした。発光画像を撮像するにあたり、分光フィルタは使用しなかった。ＬＶ２００の焦点位置調整用微動ねじに対して、対物光学系調整部を構成する焦点位置調整装置（Ｐｒｉｏｒ社製）を取り付け、各タイムポイントにおける複数回の撮像に際して、対物光学系の移動ピッチを１ｕｍとして、合焦位置を移動して１００回撮像できるように設定を行った（図４参照）。このような設定は、細胞の向きや形状により異なるものの、単一の細胞を約２０回に分割した発光画像を得るようなピッチ間隔であり、数個分の細胞に相当する高さ範囲を撮像範囲として含むものである。かかるピッチ間隔や高さ範囲については適宜増減して構わないことは言うまでもない。タイムラプス観察の結果得られた０時間、４時間、８時間、及び１２時間を経過した時点のタイムポイントで撮像された発光画像を、図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ、及び図８Ａに示す。図５Ａ、図６Ａ、図７Ａ、及び図８Ａにおいて、左上の数値は経過時間を意味する。また、各タイムポイントにおいて撮影された焦点位置の異なる１００枚の画像から、画像解析ソフトウェアｃｅｌｌＳｅｎｓ（登録商標）（オリンパス社製）を用いて三次元再構成画像を作成した。作成した三次元再構成画像をそれぞれ図５Ｂ、図６Ｂ、図７Ｂ、及び図８Ｂに示す。
さらに、得られたこれらの発光画像に対して実際に細胞の解析を行うための興味領域（Region of Interest, ROI）を複数箇所指定した。図５〜図８において、左上に数字が付された矩形は、各ＲＯＩ１〜５を示す。ここで、ＲＯＩは三次元的に培養された細胞の形状や配置に応じて異なる大きさであってよいが、細胞間の相互作用を解析する上では単一の細胞単位で領域を指定するのが好ましい。さらに、発光情報としてＲＯＩでの発光強度（輝度）の経時変化を取得して得たグラフを図９に示す。ここで、各ＲＯＩでの発光強度は、各ＲＯＩに含まれる細胞におけるＣＭＶプロモーター活性の強度に対応する。

図９より明らかな通り、１２時間に渡る観察において、ＲＯＩ１，２，４、及び５では、ＣＭＶプロモーター活性の緩やかな上昇が確認された。一方、ＲＯＩ３においては、８時間経過時点までは緩やかなＣＭＶプロモーター活性の上昇が確認されたが、１２時間経過時点においては急速な活性の低下が観察された。このような、ＲＯＩ１〜５で観察されるＣＭＶプロモーター活性の変化は、ＲＯＩ１〜５に含まれる各細胞と、三次元的に離間して配置されている周囲の細胞との間の相互作用を反映している。

ここで、各ＲＯＩ１〜５に含まれる細胞は、タイムラプス撮像中培養状態に維持されるため、その三次元位置が一定ではない。しかし、本実施例に使用した三次元画像撮像システムでは、各タイムポイントにおいて、対物光学系の合焦位置をＺ軸方向に所定ピッチで移動させつつ撮像を実施する。このため、このような長時間に渡る撮像においてＵ２ＯＳ細胞がＺ軸方向に移動したとしても、三次元再構成画像を用いて細胞の移動位置を確認することで、一細胞レベルで発光強度の変化を追跡することが可能である。

以上の実験結果より、本発明に従う三次元画像撮像方法、三次元画像解析方法、及び三次元画像撮像システムと、細胞の三次元多重培養サンプルとを用いた発光イメージングにより、同一の生細胞におけるプロモーター活性の変化を、経時的かつ定量的に長時間に渡って追跡することが可能であることが示された。

以上のように、本発明に従う三次元画像撮像方法、三次元画像解析方法、及び三次元画像撮像システムによれば、三次元培養担体により担持された三次元試料について、高精彩な三次元発光画像を取得することができる。

１０ 三次元画像撮像システム
１１ 試料保持部
１２ 三次元試料
１３ インキュベータ
１４ 対物光学系
１５ 撮像部
１６ 対物光学系調整部
１７ 試料保持部調整部
１８ 制御部
１９ 撮像制御部
２０ 画像合成部
２１ 本体
２２ 暗箱
２３ 蓋

Claims (9)

1. 非照明条件下で自己発光するよう調製された複数の細胞を、担体上で、１μｍ以上前記複数の細胞の平均的な大きさの２倍以下の、前記複数の細胞間での相互作用が可能な離間距離で、三次元的に離間した配置状態で培養して、三次元試料を準備するステップと、
   前記三次元試料中の、前記複数の細胞を含むボリュームについて非照明条件下での三次元発光画像を取得するステップと、を含むことを特徴とする三次元画像撮像方法。
2. 前記三次元試料を準備するステップで、前記複数の細胞間に前記担体の部材を介在させることにより、前記複数の細胞間での相互作用が可能な距離である、前記離間距離を隔てて、前記複数の細胞の少なくとも一部を、一つ一つ三次元的に離間して配置させることを特徴とする、請求項１に記載の三次元画像撮像方法。
3. 前記三次元発光画像を取得するステップは、対物光学系を備える画像撮像装置を用いて前記複数の細胞を含むボリュームについて、非照明条件下での三次元発光画像を取得するステップであり、該ステップは、さらに、
   前記三次元試料について、前記対物光学系の合焦位置を光軸方向に所定ピッチで移動させるステップと、
   各合焦位置にて、前記三次元試料の前記ボリュームに含まれる前記複数の細胞の発光画像を、非照明条件下で撮像する撮像ステップと、
   前記撮像ステップで撮像された複数枚の前記発光画像を三次元合成して、前記複数の細胞の三次元発光画像を生成する三次元合成ステップと、
   を含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の三次元画像撮像方法。
4. 前記撮像ステップを所定の時間間隔で繰り返し、各撮像ステップにて撮像された前記複数枚の発光画像について、前記三次元合成ステップを実施することを特徴とする、請求項３に記載の三次元画像撮像方法。
5. 請求項１〜４の何れか一項に記載の三次元画像撮像方法により得られた、前記複数の細胞の三次元発光画像に基づいて、該三次元発光画像に含まれる少なくとも一つの細胞の発光強度値を取得し、発光情報として提供するステップを含み、
   前記発光情報は、前記少なくとも一つの細胞と、該少なくとも一つの細胞の周囲の細胞との相互作用に関する情報を含むことを特徴とする、三次元画像解析方法。
6. 対物光学系及び撮像部を備える画像撮像装置と、前記画像撮像装置を介して取得された画像を三次元合成する三次元画像合成装置と、を有する三次元画像撮像システムであって、
   非照明条件下で自己発光するよう調製された複数の細胞が担体上で、１μｍ以上前記複数の細胞の平均的な大きさの２倍以下の、前記複数の細胞間での相互作用が可能な離間距離で、三次元的に離間した配置状態で培養された三次元試料を有し、
   前記画像撮像装置は、前記三次元試料を保持する試料保持部と、前記三次元試料を覆う暗箱とを備え、
   前記三次元画像合成装置は、画像合成部を備え、
   該画像合成部は、前記画像撮像装置により撮像された、前記三次元試料中の複数の細胞を含むボリュームについて三次元発光画像を生成することを特徴とする、
   三次元画像撮像システム。
7. 前記三次元試料の前記担体は、該担体を構成する複数の部材が、前記複数の細胞の前記離間距離内に介在して配置されてなる、ことを特徴とする、請求項６に記載の三次元画像撮像システム。
8. 前記画像撮像装置は、さらに、前記対物光学系の合焦位置を光軸方向に所定ピッチで移動させる対物光学系調整部と、前記対物光学系調整部により移動された各合焦位置にて、前記三次元試料の前記ボリュームに含まれる少なくとも一つの細胞の発光画像を、非照明条件下で撮像するように前記撮像部を制御する撮像制御部と、を備え、
   前記三次元画像合成装置は、前記撮像部により撮像された複数枚の前記発光画像を三次元合成して、前記複数の細胞の三次元発光画像を生成する画像合成部を備える、
   ことを特徴とする、請求項６又は７に記載の三次元画像撮像システム。
9. 前記撮像制御部は、前記撮像部が前記各合焦位置で前記発光画像を撮像して複数枚の発光画像を取得することを、所定の時間間隔で繰り返すように前記撮像部を制御し、
   前記画像合成部は、各時点で前記撮像部により撮像された前記複数枚の前記発光画像を三次元合成して、前記複数の細胞の三次元発光画像を複数枚生成することを特徴とする、請求項８に記載の三次元画像撮像システム。