JP2010063411A - 細胞培養用基材 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】平均繊維径が0.05〜5μmである高分子化合物より形成された繊維構造体の繊維表面上に、疎水性材料結合部位および細胞接着部位を有するキメラタンパク質が固定化された細胞培養用基材、かかる基材に幹細胞を播種して培養することにより得られる幹細胞培養複合体、ならびに該基材を含む細胞培養増殖装置。
【選択図】なし
Description
一方、免疫グロブリンの重鎖を構成する定常領域は細胞膜を貫通できるなど疎水性が高い。
すなわち、本発明は平均繊維径が0.05〜5μmである高分子化合物より形成された繊維構造体の繊維表面上に、疎水性材料結合部位および細胞接着部位を有するキメラタンパク質が固定化された細胞培養用基材である。
また、本発明はかかる細胞培養用基材に幹細胞を播種して培養することにより得られる幹細胞培養複合体である。
さらに、本発明は前記細胞培養用基材を含む細胞培養増殖装置である。
本発明の細胞培養用基材に上述したような幹細胞を播種して培養することにより、本発明の幹細胞培養複合体を得ることができる。
本発明の細胞培養用基材を用いて幹細胞を培養している際、その培養液中に適当な生物機能因子を添加することにより幹細胞を所望の組織へと分化することもできる。
(N−Cad−Fc発現ベクターの作製)
N−カドヘリンを発現する成熟マウスの脳よりTRIzol試薬(インビトロジェン社)を用いてmRNAを調製し、M−MLV逆転写酵素(インビトロジェン社)を用いてマウス脳のcDNAライブラリーを作製した。得られたcDNAライブラリーをもとに、配列番号1および配列番号2で表されるプライマーを用いてPCR法によりN−カドヘリン配列を増幅した。次にこの配列を鋳型として配列番号3および配列番号4で表されるプライマーを用いたPCR法により、N−カドヘリン細胞外ドメインのcDNAを増幅した。このDNA配列にはN−カドヘリンをコードするDNA配列と、それをベクターに連結するための配列がPCRの過程で付加されている。また、IgGのFcドメインの配列は、Protein Aとの親和性を向上させるために変異導入されたもの(特開2004−321100号参照)を用いた。これらの遺伝子をpRc/CMVベクター(インビトロジェン社)のMCSに挿入することにより、N−カドヘリンの細胞外ドメイン配列とFc配列が連結された発現ベクターN−cad−fcpRc/CMVベクター(図1)を得た。
上記の方法により得られたプラスミドをチャイニーズハムスター卵巣細胞CHO−K1にリポフェクタミン試薬(インビトロジェン社)を用いて遺伝子導入し、500μg/mLのG418を含む培養液を用いて限外希釈法により安定発現細胞株をクローニングした。
クローニングした細胞を、血清を含まないCHO−SFM培地に馴化させ、大量培養した。培養上清を回収して10〜20倍に濃縮後、HiTrap rProtein A FF(GEヘルスケア社)を用いてN−Cad−Fcを精製した。精製したN−Cad−Fcについてはリン酸緩衝液を用いて4℃で透析後、以下に示す方法でタンパク質濃度および純度を測定して以降の実験に使用した。
サンプルを等量の2×サンプルバッファー(100mM トリス塩酸 pH6.8、 4% SDS、1.2% 2−メルカプトエタノール、20% グリセロール)と混合し、95℃で5分間加熱してタンパク質を変性させた後、10%のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離した。電気泳動後のゲルをPVDF膜にセミドライ法により20Vの定電圧で90分間転写した。このPVDF膜を0.1% Tween20を含むリン酸緩衝液(PBS−T)で洗浄し、BlockingOne(ナカライテスク社)を用いて室温で30分間ブロッキング処理を行った。Fc部位を確認するためにパーオキシダーゼ標識抗マウスIgG(Jackson Immunoresearch Laboratories)の1/10,000希釈液を室温で90分間反応させた。検出にはECL試薬(GEヘルスケア社)を用いて発光させ、X線フィルムに露光した。
精製したN−Cad−Fc溶液の全タンパク質濃度をDC Protein Assay Kit(Bio−Rad社)を用いて測定した。タンパク質濃度は約200μg/mLであった。次にサンプルを10%のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動に供し、Copper Stain & Destain Kit(Bio−Rad社)を用いて泳動後のゲルを染色した。染色後の泳動像について画像解析ソフトImage−Jを用いてN−Cad−Fcの純度を解析した結果、純度は約70%であった。
L−ポリ乳酸(PLLA、多木化学株式会社)8重量部、ジクロロメタン−エタノール(7:2、和光純薬工業株式会社、特級)92重量部を室温(25℃)で混合し、溶液を調製した。図3に示す装置を用いて紡糸を行い、繊維構造体を得た。噴出ノズル1の内径は0.8mm、電圧は15kV、噴出ノズル1からコレクター4までの距離は20cmであった。得られた繊維構造体の平均径は3.4μmであった。
実施例2で作製したPLLAファイバーシートを実施例1で調製したN−Cad−Fc溶液(10μg/mL)に4℃で一晩浸すことにより、ファイバー表面にN−Cad−Fcを固定化した。当該シートをリン酸緩衝液で洗浄後、N−カドヘリンを発現するマウス胚性腫瘍細胞P19を1.3×104細胞/cm2の密度で播種し、4日間培養を続けた。
以上により、本発明の細胞培養用基材によれば、細胞を、その特性を損なうことなく、かつ細胞同士が重なり合うことなく分散した状態で3次元培養できることが示された。
実施例2で作製したPLLAファイバーシートをリン酸緩衝液で洗浄後、マウス胚性腫瘍細胞P19を1.3×104細胞/cm2の密度で播種し、4日間培養を続けた。
図4Aに示されるように、4日後の位相差顕微鏡観察にて多数のP19細胞がコロニー状に凝集塊を形成している様子が観察された。
実施例2で作製したPLLAファイバーシートを0.1% ゼラチン溶液に4℃で一晩浸すことにより、ファイバー表面にゼラチンを固定化した。当該シートをリン酸緩衝液で洗浄後、マウス胚性腫瘍細胞P19を1.3×104細胞/cm2の密度で播種し、4日間培養を続けた。
図4Bに示されるように、4日後の位相差顕微鏡観察像にて多数の細胞がコロニー状に凝集塊を形成している様子が観察された。
実施例2で作製したPLLAファイバーシートをE−Cad−Fc溶液(10μg/mL)に4℃で一晩浸すことにより、ファイバー表面にE−Cad−Fcを固定化した。当該シートをリン酸緩衝液で洗浄後、マウス胚性腫瘍細胞P19を1.3×104/cm2の密度で播種し、4日間培養を続けた。
図4Cに示に示されるように4日後の位相差顕微鏡観察像にて細胞がPLLA繊維に僅かに配向しながら接着している様子が観察された。これはE−カドヘリンとN−カドヘリンとの間の立体相同性に起因する結果と考えられる。
2 溶液
3 溶液保持槽
4 電極
5 高電圧発生機
A 未処理
B ゼラチン
C E−cad−Fc
D N−cad−Fc
Claims (8)
- 平均繊維径が0.05〜5μmである高分子化合物より形成された繊維構造体の繊維表面上に、疎水性材料結合部位および細胞接着部位を有するキメラタンパク質が固定化された細胞培養用基材。
- 疎水性材料結合部位が免疫グロブリンの定常部の少なくとも一部のアミノ酸配列を含み、細胞接着部位がカドヘリンスーパーファミリーの細胞外ドメインの少なくとも一部のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の細胞培養用基材。
- 高分子化合物が生分解性の脂肪族ポリエステルである、請求項1または2に記載の細胞培養用基材。
- 高分子化合物が熱可塑性樹脂である、請求項1または2に記載の細胞培養用基材。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の細胞培養用基材に幹細胞を播種して培養することにより得られる幹細胞培養複合体。
- 幹細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、間様系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、がん幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選ばれる一種以上の細胞である、請求項5に記載の幹細胞培養複合体。
- 請求項1〜4のいずれかに記載の細胞培養用基材を含む細胞培養増殖装置。
- 培養増殖可能な細胞が胚性幹細胞、体性幹細胞、間様系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、がん幹細胞、および人工多能性幹細胞からなる群から選ばれる一種以上の細胞である、請求項7に記載の細胞培養増殖装置。
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2008
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