JP5302063B2 - 微弱光および高強度光の画像を撮像可能な顕微鏡撮像装置 - Google Patents
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<第1の実施形態>
図1
図1は、第1の実施形態における、蛍光および発光画像を撮像可能な顕微鏡撮像装置100の模式図である。
図2は、第1の実施形態における撮像手段120の第1の模式図である。
図3は、第1の実施形態における撮像手段120の第2の模式図である。
以下、第1の実施形態における顕微鏡撮像装置を使用した発光観察方法について説明する。
先ず、対物レンズ111と結像レンズ113間の距離を調節することができる第1の可動制御ユニット140を用いて、両レンズ間の距離を短く調節する。上述したように、対物レンズと結像レンズ間の距離が長くなると、結像レンズヘの入射光像高が高くなり、結像レンズ経を超えた光線は欠けてしまう。このため、光軸中心の像周辺の光量が減少し、十分な発光像の明るさを確保することができない。したがって、発光観察前に第1の可動制御ユニット140を用いて両レンズ間距離を短く調節することによって、十分な光量を確保する必要がある。ここで十分な光量とは、前記レンズ間距離が5mmのときに像高(IMH)2mmで得られる光量を基準として、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、さらにより好ましくは95%以上、最も好ましくは98%以上の光量である。このとき、両レンズ間距離は、例えば、38mm以下、好ましくは25mm以下、より好ましくは15mm以下、最も好ましくは5mm以下に調節するとよい。
次に、生物試料A内で発現した発光タンパク質を撮像する。
40倍用対物レンズ(UAPO40×Oil, NA=1.35, f=4.5mm, オリンパス社製)と、結像レンズ(5倍用対物レンズLMPLFL5X, NA=0.13, f=36mm, オリンパス社製を結像レンズとして使用)とを用いて細胞の発光観察を行った。両レンズ間の距離を5mm、38mm、81mmに設定し、それぞれ細胞の発光画像を撮像した。81mmの距離は、現在蛍光顕微鏡に用いられている蛍光キューブを装着した場合の値に相当する(比較例)。観察に用いた細胞はHeLa細胞であり、ルシフェラーゼ遺伝子pGL3 control vector(プロメガ社)をポリフェクト・トランスフェクション試薬(キアゲン社)を用いて遺伝子導入し、一晩培養した。その後、培養液中に500μMの濃度になるようにルシフェリン(プロメガ社)を添加し、発光画像を取得した。撮影したCCDカメラはORCA-ER(浜松ホトニクス社)で、露出時間は2分である。CCDカメラの撮像素子の大きさは2/3インチチップで、画素サイズは6.45μm×6.45μm、TVアダプターの倍率は1倍に設定した。
図4
図4は、上記各レンズ間距離において撮像した発光画像である。
図4aは、対物レンズと結像レンズ間の距離を5mmに設定して撮像した発光画像である。両レンズ間距離を5mmまで接近させて撮像を行うことによって、鮮明な発光画像を得ることができた。
続いて、図4bは、対物レンズと結像レンズ間の距離を38mmに設定して撮像した発光画像である。両レンズ間距離を38mmまで接近させて撮像を行った場合、その発光画像の明るさは、両レンズ間距離が5mmのときと比較してそれ程低下することなく、鮮明な発光画像を得ることができた。上記実験では、蛍光キューブユニットが介在した場合に相当する距離(例えば50〜100mm)よりも短くすることが有効と確認できた。また、実験に用いた装置では、5mmでも蛍光観察可能であったが、38mmの方が蛍光画像としてのピント合わせや各種光学素子の挿入による画質向上が容易となるので好ましく、この理由により15mm〜38mm、好ましくは25mm〜38mmのレンズ間距離において、発光画像による高感度観察と蛍光画像による高画質観察との両方を適度に満足する共通の設定条件であるということが出来る。なお、上記実験で用いた対物レンズおよび結像レンズの倍率等のレンズ仕様については、観察対象に応じて適宜変更してもよい。
図4cは、対物レンズと結像レンズ間の距離を81mmに設定して撮像した発光画像である。両レンズ間距離を81mmまで離して撮像を行った場合、発光像の十分な明るさを確保することができず、鮮明な発光画像を得ることができなかった。
Claims (11)
- 微弱光および高強度光による同一視野に対する撮像を共通の撮像手段を用いて行う顕微鏡撮像装置であって、
観察対象からの光を前記撮像手段に導くための対物レンズと結像レンズとを具備し、
微弱光観察の場合の前記対物レンズと結像レンズの間の距離を、高強度光観察の場合の前記対物レンズと結像レンズの間の距離より相対的に短く設定したことを特徴とする顕微鏡撮像装置。 - 蛍光観察用の励起光を照射する励起光照射手段と、前記励起光を透過する標本保持手段と、前記透過した励起光を集光する撮像手段とを備える、蛍光および発光画像を撮像可能な顕微鏡撮像装置であって、
前記対物レンズと結像レンズ間の距離が38mm以下であることを特徴とする、顕微鏡撮像装置。 - 前記撮像手段が、前記対物レンズと結像レンズ間の距離を調節することができる第1の可動制御ユニットを備えることを特徴とする、請求項1または2に記載の顕微鏡撮像装置。
- 前記撮像手段が、蛍光吸収フィルターを光路から外れた位置まで移動させることができる第2の可動制御ユニットを備えることを特徴とする、請求項3に記載の顕微鏡撮像装置。
- 前記対物レンズと結像レンズ間の距離が25mm以下であることを特徴とする、請求項2〜4のいずれか1項に記載の顕微鏡撮像装置。
- 前記対物レンズと結像レンズ間の距離が15mm以下であることを特徴とする、請求項2〜4のいずれか1項に記載の顕微鏡撮像装置。
- 前記対物レンズと結像レンズ間の距離が5mm以下であることを特徴とする、請求項2〜4のいずれか1項に記載の顕微鏡撮像装置。
- 前記蛍光吸収フィルターを挟んで前記対物レンズと結像レンズを一体化したことを特徴とする、請求項7に記載の顕微鏡撮像装置。
- 請求項3に記載の顕微鏡撮像装置を使用した発光観察方法であって、
対物レンズと結像レンズ間の距離を調節することができる第1の可動制御ユニットを用いて、前記対物レンズと結像レンズ間の距離を38mm以下に調節する、レンズ間距離制御ステップと、
生物試料内で発現した発光タンパク質を撮像する、発光撮像ステップと、
を含む、発光観察方法。 - 前記レンズ間距離制御ステップが、対物レンズの開口数(NA)と倍率(β)との関係において、(NA/β)の2乗が0.01以上の関係が成立している光学系において行われる、
請求項9に記載の発光観察方法。 - 明視野観察用の照明光源を蛍光励起用光源として用いることが可能な請求項2に記載の顕微鏡撮影装置。
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