JP5616611B2 - 微弱光標本撮像装置 - Google Patents
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Description
一方、GFPを用いる観察では、例えば、共焦点レーザ走査型顕微鏡によって励起光を標本の一点に収斂し、蛍光の発光量を増大させることが可能であるのに対し、ルシフェラーゼを用いる観察では、励起光によって発光量を増大させることができないため、ルシフェラーゼから自己発光される微弱光によって標本を観察せざるを得ない。
特許文献1に記載されている顕微鏡は、対物レンズの交換に伴う射出瞳位置の変化に応じて交換可能な光学手段を配置することによって、対物レンズを交換した場合にも像側をテレセントリックな状態に維持できるようにしている。
また、特許文献2に記載されている顕微鏡は、光軸に対してCCDカメラの撮像面を多少傾けることによって、レーザ光線を用いた場合にも撮像面上に干渉縞を生成させることなく、鮮明な観察画像が得られるようにしている。
特許文献3に記載の微弱光標本撮像ユニットは、発光などの微弱光を発する点光源を有した標本の標本像を結像する結像光学系と、入射する光を受光する複数の画素を有し、前記標本像に対応する画像を撮像する撮像手段とを備える撮像ユニットであって、前記結像光学系は、該結像光学系の標本像側にテレセントリックであるとともに、前記点光源からの微弱光を集光して前記画素に略同じ大きさ、あるいは、前記画素より小さいエアリーディスクを形成することで、1つの画素の受光量および起電流を増大させ、S/N比を向上させて。短い露光時間で標本を撮像できるようにしている。
しかしながら、上述した特許文献1〜3に記載の技術は、この要求に対応しうる十分な手段を備えていない。
しかしながら、従来の装置では、発光もしくは蛍光を1台の装置で観察する場合には、複数の撮像部位を持たなければならないという問題点を有していた。
しかしながら、結像光学系をテレセントリック光学系に構成した場合、結像レンズの焦点位置は対物レンズの後側焦点位置にしなければならず、結像レンズの倍率が下がると結像レンズの焦点距離が短くなり、その結果、対物レンズと結像レンズとの間の距離を短くしなければならなくなる。
本件出願人の経験では、一般的なCCDを用いて微弱光を観察する条件としては、明るさ(NA)を確保するためには、倍率が0.36倍以下の結像レンズが必要である。すると、結像レンズの主点から対物レンズにおける結像レンズ側レンズ面までの距離が65mm以下となる。また、結像光学系を通る光束の径を、通常の顕微鏡での光束の径14.5mmに設定した場合、照明光と検出光との分離のために対物レンズと結像レンズとの間に配置すべきダイクロイックミラーは、照明光と検出光の分離の関係上、光束に対し斜め45度に配置する必要があるため、26mm径のダイクロイックミラーを使用する場合には、高さが18mm必要となる。しかし、そのような高さでは、対物レンズと結像レンズの間の距離が短いために、照明光と蛍光を分離するダイクロイックミラーを、対物レンズと結像レンズとの間に配置することが出来ない。ダイクロイックミラーを対物レンズと結像レンズとの間に配置するためには、撮像光学系を大型な光学系で構成せざるを得ない。
第一実施形態
図1は本発明の第一実施形態にかかる微弱光標本撮像装置の全体構成の一例を示す模式図である。
第一実施形態の微弱光標本撮像装置は、少なくとも蛍光を含む微弱光を発する点光源を有する標本10の標本像を結像する結像光学系1と、標本10に光源からの光を照射し、蛍光を射出させる蛍光励起照明光学系2と、入射する光を受光する標本像に対応する画像を撮像する撮像手段としてのカメラ3を備えて構成されている。
対物レンズ11は、光学レンズ11aと、開口絞り11bと、対物レンズ枠11cを有して構成されている。光学レンズ11a、開口絞り11bは、カシメ等によって対物レンズ枠11c内に保持されている。開口絞り11bは、開口径が固定の絞りで構成されている。また、対物レンズ11は、無限遠補正されたレンズ系として構成されている。
結像レンズ12は、光学レンズ12aと、結像レンズ枠12bを有して構成されている。光学レンズ12aは、カシメ等によって結像レンズ枠12b内に保持されている。
また、結像光学系1は、略テレセントリックに構成されている。
また、結像光学系1は、対物レンズ11と結像レンズ12の間に、エミッションフィルタ13を備えている。エミッションフィルタ13は、標本10からの光のうち、所望の蛍光波長の光のみを透過し、それ以外の波長、特に励起波長の光をカットする特性を有している。また、ここでのエミッションフィルタ13は、例えば、ターレットやスライダ等を介して対物レンズ11と結像レンズ12の間の光路に挿脱可能に構成された、透過波長帯域の異なる複数の波長吸収フィルタで構成されており、標本10に応じて波長選択的に目的とする蛍光波長の光のみを透過可能になっている。
また、結像光学系1は、標本10上の点光源からの微弱光を集光して撮像素子3の画素に略同じ大きさ又は画素よりも小さいエアリーディスクを形成するようになっている。即ち、結像レンズ12は、撮像面3a1上にある画素内の受光領域に内接する大きさのエアリーディスクを形成、即ち、エアリーディスク径と画素内の受光領域の大きさとが略等しくなるように、標本10上の点光源の像を撮像面3a1上に結像するように構成されている。
照明光源2aは、幅広い波長域の光を照射する。照明光シャッター2bは、開閉により標本10への光の照射・非照射の状態を制御することができるように構成されている。照明ファイバ2cは、照明光源2aからの光を標本10へ導くように配置されている。そして、照明ファイバ2cの出射端は、結像光学系1の略光軸OA2上に配置されている。励起フィルタ2dは、例えば、ターレットやスライダ等を介して蛍光励起光照明光学系2の光路に挿脱可能に構成された、透過波長帯域の異なる複数の波長吸収フィルタで構成されており、標本10に応じて波長選択的に光励起可能となっている。
カメラ筐体3cと、結像レンズ枠12bは、それぞれの枠の端部に設けられている螺子で嵌合する構造となっており、螺子の嵌め合い距離を調整することにより、結像レンズ12とCCD素子3aの焦点面3a1間の距離の調整が可能となっている。
能にするためのXYステージであり、標本10における所望の観察位置に位置合せする際
に使用する。5は本体架台である。
本体架台5には対物レンズ11が取付けられており、Z方向位置操作用の操作ダイヤル5aを換作することによりXYステージ4に対して直交する方向に対物レンズ11を移動
させることが可能である。6は本体架台5を保持するためのベース架台である。
蛍光観察を行う場合には、観察者は、照明光シャッター2bを開くように操作する。これにより照明光源2aから出射された幅広い波長を有する光が、照明ファイバ2cへ入射する。照明ファイバ2cの照明光源2a側端面(入射端)より入射した光は照明ファイパ2cを介して標本10側端面(出射端)より標本10側へ出射し、励起フィルタ2dに入射する。励起フィルタ2dは、入射した光のうち、選択された波長吸収フィルタのフィルタ性能に応じた波長の光のみ透過させる。そして、標本10は、励起フィルタ2dを透過した光により蛍光物質が励起され、蛍光を発する。標本10より発生した蛍光は、対物レンズ11の光学レンズ11aへ入射する。対物レンズ11は、無限遠補正されたレンズ系であり、この対物レンズ11の前側焦点位置に焦点合わせされた標本10上の各点光源からの光を開口数NAoでテレセントリックに捉え、それぞれ平行光束にして射出する。対物レンズ11から射出した各平行光束は、対物レンズ11の後側焦点位置に配設された開口絞り11b上に集光して射出瞳を形成した後、エミッションフィルタ13へ入射する。
発光観察を行う場合には、観察者は、照明光シャッター2bを閉じるように操作する。これにより照明光源2aからの光は標本10へ入射されなくなる。すると、標本10では蛍光励起されずに発光のみ発生する状態となる。標本10より発生した発光は、対物レンズ11の光学レンズ11aへ入射する。対物レンズ11は、無限遠補正されたレンズ系であり、この対物レンズ11の前側焦点位置に焦点合わせされた標本10上の各点光源からの光を開口数NAoでテレセントリックに捉え、それぞれ平行光束にして射出する。対物レンズ11から射出した各平行光束は、対物レンズ11の後側焦点位置に配設された開口絞り11b上に集光して射出瞳を形成した後、エミッションフィルタ13へ入射する。
本件出願人の経験では、−30℃程度の一般的な冷却CCDを用いて微弱光を観察するための条件としては、明るさ(NA)を確保するためには、倍率が0.36倍以下の結像レンズが必要である。すると、結像レンズ12の主点から対物レンズ11における結像レンズ側レンズ面までの距離fが65mm以下となる。また、結像光学系を通る光束の径を考慮して、通常の顕微鏡での光束の径14.5mmに対し、26mm径のダイクロイックミラーを使用する場合、対物レンズ11と結像レンズ12の間の距離が短いために、照明光と蛍光を分離するダイクロイックミラーを、対物レンズ11と結像レンズ12との間に配置することが出来ない。
しかるに、本実施形態の微弱光標本撮像装置は、蛍光励起照明光学系2を、照明光源2aからの光を、対物レンズ11を経由させることなく標本10に照射するように、蛍光透過照明光学系として構成したので、対物レンズ11と結像レンズ12の間には、ダイクロイックミラーを設ける必要がなく、エミッションフィルタ13を挿入するのに十分なスペースが確保されている。一般的なエミッションフィルタの厚さは6mm程度であり、結像レンズ12と対物レンズ11のとの間の距離に対して十分な余裕があるので、さらに結像レンズ12の倍率を上げることも可能である。
また、テレセントリックな光学系で透過蛍光観察可能な構成となっているため、一般的なCCDでの微弱光観察が可能な明るさ(NA)を確保することができる。具体的には結像レンズの倍率が0.36倍以下、結像レンズの焦点距離が65mm以下の構成が可能となる。その結果、大口径の結像光学系を用いる必要がなく小型に装置を構成することが可能となる。
11 対物レンズ
11a 光学レンズ
11b 開口絞り
11c 対物レンズ枠
12 結像レンズ
12a 光学レンズ
12b 結像レンズ枠
13 エミッションフィルタ
2 蛍光励起光照明光学系
2a 照明光源
2b 照明光シャッター
2c 照明ファイバ
2d 励起フィルタ
3 撮像手段(カメラ)
3a CCD素子
3b 赤外光カットフィルタ
3c カメラ筐体
4 XYステージ
5 本体架台
5a 操作ダイヤル
6 ベース架台
10 標本
101 標本
101a,101b 物点
102 対物レンズ
103 結像レンズ
104 レンズ
105,106 像面
105a,105b,106a,106b 像点
Claims (2)
- 少なくとも蛍光を含む微弱光を発する点光源を有する標本の標本像を結像する、対物レンズと結像レンズを有する結像光学系と、前記標本に照明光源からの光を照射して蛍光を射出させる蛍光励起照明光学系と、入射する光を受光する複数の画素を有し、前記標本像に対応する画像を撮像する撮像手段と、を備える撮像装置であって、
前記蛍光励起照明光学系は、前記照明光源と、開閉により前記標本への照射・非照射の状態を制御する照明光シャッタと、前記照明光源からの光を前記標本に導く照明ファイバと、前記標本に応じて波長選択的に光励起可能な励起フィルタを有し、前記照明ファイバの出射端が前記結像光学系の略光軸上に配置されるとともに、前記励起フィルタが前記照明ファイバの出射端と前記標本との間に挿脱可能であって、前記照明光源から前記照明ファイバ、前記励起フィルタを経由した励起光が、前記対物レンズ、その他レンズを経由することなく直接的に前記標本に照射するように構成され、
前記結像光学系は、略テレセントリックであって、前記対物レンズと結像レンズの間に、前記標本からの蛍光を波長選択的に抽出するエミッションフィルタを備えるとともに、前記点光源からの微弱光を集光して、前記画素と略同じ大きさ又は前記画素よりも小さいエアリーディスクを形成するように構成され、
前記結像レンズの倍率が0.36倍以下、焦点距離が65mm以下である
ことを特徴とする微弱光標本撮像装置。 - 前記結像光学系は、前記エミッションフィルタが該結像光学系の光路に挿脱可能に構成されることを特徴とする請求項1に記載の微弱光標本撮像装置。
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