JP4884369B2 - 微弱光標本撮像ユニット、微弱光標本撮像装置および微弱光標本撮像方法 - Google Patents

微弱光標本撮像ユニット、微弱光標本撮像装置および微弱光標本撮像方法 Download PDF

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Description

本発明は、微弱光を発する標本を撮像する微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置に関し、特に微弱な蛍光を発する標本、生体発光をする標本等の微小な発光源を有する標本の撮像に適用して好適な微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置に関するものである。
近年、細胞生物学、分子生物学などの研究分野では、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ；GreenFluorescent Protein）や生物発光酵素であるルシフェラーゼ遺伝子を発現のレポーターとして働かせ、細胞内の特定部位や機能蛋白質に蛍光標識や発光標識を付して生体細胞を観察する必要性が高まっている。
ＧＦＰを用いる観察では、ＧＦＰが励起光の照射に応じて蛍光を発する蛋白質であり、ＧＦＰを作用させた標本に大きな強度の励起光を照射して蛍光を得るため、標本に損傷を与えやすく、１〜２時間程度の観察が限度であるが、ルシフェラーゼを用いる観察では、ルシフェラーゼが自己発光酵素であり、標本に損傷を与える励起光を必要としないため、５日間程度の観察が可能である。一方、ＧＦＰを用いる観察では、たとえば、コンフォーカルレーザスキャニング顕微鏡によって励起光を標本の一点に収斂し、蛍光の発光量を増大させることが可能だが、ルシフェラーゼを用いる観察では、励起光によって発光量を増大させることができないため、ルシフェラーゼからの微弱光によって標本を観察せざるを得ない。
一般に、微弱光を捉える用途は幅広く、ルシフェラーゼを用いた観察に限らず、ＧＦＰを用いた観察でも励起光を弱めて観測する場合や、ＤＮＡチップの蛍光測光、微生物の鞭毛の暗視野観察などがある。このような用途に対して高感度の冷却ＣＣＤカメラの開発が盛んに行われている。
また、微弱光を捉える用途では、標本からより多くの光を集光できるようにするため、従来、標本の像を結像する光学系に開口数（ＮＡ；Numerical Aperture）の大きな対物レンズが使用されている。なお、対物レンズによって標本側のＮＡを大きくすることは別に、顕微鏡の結像レンズの像側に縮小倍率を有したレンズを配置して結像側のＮＡを大きくすることもあるが、この目的は、目視で観察する視野とＣＣＤが撮像する視野の大きさを一致させることにあって、微弱光の観察のためではなかった。
図２８は、縮小倍率を有したレンズを配置した結像光学系の一例を示している。図２８に示すように、縮小倍率を有したレンズ１０４が、対物レンズ１０２および結像レンズ１０３からなる結像光学系の像空間である結像レンズ１０３と像面１０６との間の空間に配置され、全体として像側にテレセントリックな結像光学系が形成されている。標本１０１上で光軸ＯＡ３上にある物点１０１ａと光軸ＯＡ３から外れた物点１０１ｂは、レンズ１０４が配置されない場合、それぞれ像面１０６上の像点１０６ａ，１０６ｂに結像されるが、レンズ１０４が配置された場合、それぞれ像面１０５上の像点１０５ａ，１０５ｂに結像される。また、この例では、像点１０５ｂは、像点１０６ｂに比して約１／２倍の高さに結像される。なお、レンズ１０４の配置の有無にかかわらず、結像光学系の射出瞳Ｐｕの位置および口径は変化しないように設定されている。
また、図２８に示すような像側にテレセントリックな結像光学系は、従来、測長顕微鏡等によく利用され、近年ではＣＣＤカメラ用に必須の光学系として利用されている。像側にテレセントリックな結像光学系とは、射出瞳が無限遠に位置する光学系であって、この光学系を射出して各像点に向かう主光線が光軸に平行となる光学系である。通常、ＣＣＤカメラでは、撮像面に対する光の入射角が大きくなるにつれて感度が低下するため、撮像面全体で均一かつ高感度に撮像を行うには、ＣＣＤカメラの各画素に入射する光の主光線を撮像面に垂直にすることが必要であり、これを実現するため、像側にテレセントリックな結像光学系が必須とされている。
他にも、像側にテレセントリックな結像光学系は、顕微鏡等によく利用される（たとえば、特許文献１，２参照）。特許文献１に開示されている顕微鏡では、対物レンズの交換にともなう射出瞳位置の変化に応じて交換可能な光学手段を配置することによって、対物レンズを交換した場合にも像側をテレセントリックに維持できるようにしている。また、特許文献２に開示されている顕微鏡では、光軸に対してＣＣＤカメラの撮像面を多少傾けることによって、レーザー光源を用いた場合にも撮像面上に干渉縞を生成させることなく、鮮明な観察画像を得られるようにしている。
なお、ＣＣＤカメラでは、高感度化とは別に高解像力化の開発も行われ、たとえば、画素サイズが２〜３μｍ、画素数が５００万個という高精細なＣＣＤカメラが実現されている。そして、このような高精細なＣＣＤカメラと顕微鏡とを組み合わせることによって、バーチャルスライドといわれる装置が開発されている。バーチャルスライドでは、倍率が２０倍程度であり像面湾曲およびディストーションを小さく抑えた結像光学系を用いて、プレパラート上の標本を複数の領域に分割して撮像した複数の画像をあらかじめ取得し、取得した各画像を画像データ上でつなぎ合わせた後、電子的な拡大処理である電子ズームによって５〜１００倍程度の任意倍率の画像をモニター上に表示させるようにしている。このようにして、バーチャルスライドは、実際の顕微鏡と標本がその場になくても、高精細な標本の画像をモニターに表示できるため、医学生用の教材として利用されている。
特許第２９９０８７１号公報 特開２０００−２３５１５０号公報 特開２００４−１９１２５２号公報 David K. Welsh, Seung-Hee Yoo, Andrew C. Liu, Joseph S. Takahashi, and Steve A. Kay, "Bioluminescence Imaging of Individual Fibroblasts Reveals Persistent, Independently Phased Circadian Rhythms of Clock Gene Expression", Current Biology, 2004, Vol.14, p.2289-2295 N. Takasuka, M. R. H. White, C. D. Wood, W. R. Robertson, and J. R. E. Davis, "Dynamic Changes in Prolactin Promoter Activation in Individual Living Lactotrophic Cells", Endocrinology, 1998, Vol.139 p.1361-1368
ところで、ルシフェラーゼ遺伝子をレポーター遺伝子として細胞に導入し、ルシフェラーゼ活性による細胞からの発光量を指標にしてルシフェラーゼ遺伝子の発現の強さを調べる際、ルシフェラーゼ遺伝子の上流や下流に目的のＤＮＡ断片をつなぐことによって、このＤＮＡ断片がルシフェラーゼ遺伝子の転写に及ぼす影響を調べることができる。また、ルシフェラーゼ遺伝子の転写に影響を及ぼすと思われる転写因子などの遺伝子を発現ベクターにつないでルシフェラーゼ遺伝子と共発現させることによって、その遺伝子産物がルシフェラーゼ遺伝子の発現におよぼす影響を調べることができる。
ルシフェラーゼ遺伝子などのレポーター遺伝子を細胞に導入する方法には、リン酸カルシウム法、リポフェクチン法、エレクトロポレーション法などがあるが、これらの方法は、導入の目的や細胞の種類に応じて使い分けられる。そして、ルシフェラーゼ活性による細胞からの発光量の測定では、細胞溶解液をルシフェリン、ＡＴＰ、マグネシウムなどを含む基質溶液と反応させた後、光電子増倍管を用いたルミノメーターによって発光量が定量される。この測定では、細胞を溶解した後に発光量が測定されるため、ある時点での発現量が細胞全体の平均値として計測される。
また、遺伝子の発現量の経時変化を捉えるためには、生きた細胞からの発光量を時系列に測定する必要がある。たとえば、細胞を培養するインキュベーターにルミノメーターの機能を設け、培養している全細胞集団から発せられる光量を一定時間ごとに測定することによって、一定の周期性をもった発現リズムなどを計測することができる。この場合、細胞全体の経時的な発現量の変化が計測される。
一方、遺伝子の発現が一過性である場合には、個々の細胞での発現量に大きなばらつきが生じる。たとえば、ＨｅＬａ細胞などのクローン化した培養細胞であっても、細胞膜表面のレセプターを介した薬剤の応答が個々の細胞でばらつくことがある。すなわち、細胞全体としての応答は検出されなくとも、数個の細胞は応答している場合がある。この場合、細胞全体からではなく個々の細胞での発現量を測定することが重要である。
しかしながら、個々の細胞の発光を顕微鏡等で観察するためには、生きた細胞からの発光量が極めて弱いため、たとえば、フォトンカウンティングＣＣＤカメラ、−９０℃程度の冷却ＣＣＤカメラ等の高感度のＣＣＤカメラを用い、３０分程度の長時間の露光を行わなければならないという問題があった（非特許文献１，２参照）。
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、ルシフェラーゼ遺伝子を発光色素として導入した細胞のような微弱光を発する標本であっても、０℃程度の比較的高温の冷却ＣＣＤカメラによって、フォトンカウンティングすることなく、短い露光時間で標本像を撮像することができる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置を提供することを目的とする。
上記の目的を達成するために、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、微弱光を発する点光源を有した標本の標本像を結像する結像光学系と、入射する光を受光する複数の画素を有し、前記標本像に対応する画像を撮像する撮像手段とを備える撮像ユニットであって、前記結像光学系は、該結像光学系の標本像側にテレセントリックであるとともに、前記点光源からの微弱光を集光して前記画素に略同じ大きさ、あるいは、前記画素より小さいエアリーディスクを形成することを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、上記の発明において、前記結像光学系は、該結像光学系の標本側にテレセントリックであるとともに、前記点光源からの微弱光を平行光束に変換する対物レンズと、前記対物レンズによって変換された平行光束を集光して前記エアリーディスクを形成する結像レンズと、を備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、上記の発明において、前記対物レンズは、焦点距離および標本側開口数の少なくとも一方が該対物レンズと異なる交換対物レンズと交換可能に配置されることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、上記の発明において、前記対物レンズは、該対物レンズを配置する際の基準となる対物配置基準面を有し、該対物配置基準面から標本側焦点および射出瞳までの各距離が該対物レンズと略等しい前記交換対物レンズと交換可能に配置されることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、上記の発明において、前記対物レンズは、開口径が可変な可変明るさ絞り（ＡＳ：Aperture Stop）を備えることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、上記の発明において、前記結像レンズは、焦点距離および標本像側開口数の少なくとも一方が該結像レンズと異なる交換結像レンズと交換可能に配置されることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、上記の発明において、前記結像レンズは、該結像レンズを配置する際の基準となる結像配置基準面を有し、該結像配置基準面から標本像側焦点および入射瞳までの各距離が該結像レンズと略等しい前記交換結像レンズと交換可能に配置されることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、上記の発明において、前記結像レンズは、前記対物レンズの射出瞳径と同等以上の大きさの入射瞳径を有することを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、上記の発明において、前記撮像手段は、所定の撮像特性が該撮像手段と異なる交換撮像手段と交換可能に配置されることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像ユニットは、上記の発明において、前記結像光学系の結像倍率は、略２倍以上、略８倍以下であることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の微弱光標本撮像ユニットと、前記標本を保持する標本保持手段と、前記標本を照明する照明手段と、前記結像光学系、前記撮像手段および前記標本保持手段の少なくとも１つを前記微弱光標本撮像ユニットの光軸方向に移動させて、前記微弱光標本撮像ユニットの前記標本に対する焦点合わせを行う焦点調整手段と、を備え、前記結像光学系は、前記照明手段によって照射された照射光であって前記標本を透過または反射した照射光を集光して前記標本の明視野標本像を結像し、前記焦点調整手段は、前記明視野標本像が鮮明に結像されるように焦点合わせを行うことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の微弱光標本撮像ユニットと、前記標本を保持する標本保持手段と、前記標本を照明する照明手段と、前記対物レンズ、前記結像レンズ、前記撮像手段および前記標本保持手段の少なくとも１つを前記微弱光標本撮像ユニットの光軸方向に移動させて、前記微弱光標本撮像ユニットの前記標本に対する焦点合わせを行う焦点調整手段と、を備え、前記結像光学系は、前記照明手段によって照射された照射光であって前記標本を透過または反射した照射光を集光して前記標本の明視野標本像を結像し、前記焦点調整手段は、前記明視野標本像が鮮明に結像されるように焦点合わせを行うことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記標本を励起する励起光を選択的に透過させる励起光透過フィルター、前記励起光によって励起された標本から発せられる蛍光を選択的に透過させる蛍光透過フィルターおよび前記励起光を反射し前記蛍光を透過させるダイクロイックミラーを有し、前記対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置される蛍光ユニットと、前記励起光を発する励起光源を有し、該励起光源から発せられた励起光を前記ダイクロイックミラーによって反射させ前記標本に照射させる蛍光照射手段と、を備え、前記結像光学系は、前記微弱光として前記蛍光を集光し、前記エアリーディスクを形成することを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記励起光および前記蛍光の少なくとも一方に対する光学特性が互いに異なる複数の前記蛍光ユニットを保持し、該保持した複数の蛍光ユニットのうち１つの蛍光ユニットを選択的に前記対物レンズと前記結像レンズとの間に配置する蛍光切替手段を備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記蛍光照射手段は、前記励起光を略平行光束として前記標本に照射させることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記微弱光から所定の波長域の光を抽出する波長抽出フィルターを備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、抽出する波長域が互いに異なる複数の前記波長抽出フィルターを保持し、該保持した複数の波長抽出フィルターのうち少なくとも１つの波長抽出フィルターを、フィルター非配置を含めて選択的に前記対物レンズと前記結像レンズとの間に配置するフィルター切替手段を備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記微弱光のうち所定の第１波長域の光を透過させるとともに該第１波長域と異なる第２波長域の光を反射するダイクロイックミラーと、前記ダイクロイックミラーによって反射された前記第２波長域の光を集光する反射側結像レンズと、複数の画素を有し、前記反射側結像レンズによって集光された前記第２波長域の光を受光する反射側撮像手段と、を備え、前記反射側結像レンズは、前記反射側撮像手段が有する画素内の受光領域に略内接する大きさのエアリーディスクを形成することを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記第１波長域および前記第２波長域の少なくとも一方が互いに異なる複数の前記ダイクロイックミラーを保持し、該保持した複数のダイクロイックミラーのうち１つのダイクロイックミラーを選択的に前記対物レンズと前記結像レンズとの間に配置するダイクロイックミラー切替手段を備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記ダイクロイックミラーと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記第１波長域の光から所定の第３波長域の光を抽出する透過側波長抽出フィルターと、前記ダイクロイックミラーと前記反射側結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記第２波長域の光から所定の第４波長域の光を抽出する反射側波長抽出フィルターと、を備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記標本を透過または反射した前記照明光を反射するミラーと、前記ミラーによって反射された照射光を集光して前記標本の明視野像を結像する明視野結像レンズと、前記明視野結像レンズによって結像された明視野像に対応する明視野画像を撮像する明視野撮像手段と、を備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記結像光学系または前記撮像手段を前記微弱光標本撮像ユニットの光軸に略直交する方向に移動させて、前記撮像手段と前記反射側撮像手段または前記明視野撮像手段との位置合わせを行う位置調整手段を備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記焦点調整手段による焦点合わせおよび前記位置調整手段による位置合せの少なくとも一方の自動制御を行う調整制御手段を備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記標本保持手段は、前記標本を内部に保持する収容手段と、前記収容手段の内部の環境条件を調整する環境調整手段と、を備えたことを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記環境条件は、前記収容手段の内部の温度、湿度、気圧および成分濃度の少なくとも１つに対応する条件であることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、当該微弱光標本撮像装置は、外部からの光を遮断する遮光手段内に配置されることを特徴とする。
また、この発明にかかる微弱光標本撮像装置は、上記の発明において、前記撮像手段が撮像した画像であって前記明視野標本像と前記微弱光による前記標本像とのそれぞれに対応する画像を重ね合わせて表示する表示手段を備えたことを特徴とする。
本発明にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によれば、ルシフェラーゼ遺伝子を発光色素として導入した細胞のような微弱光を発する標本であっても、０℃程度の比較的高温の冷却ＣＣＤカメラによって、フォトンカウンティングすることなく、短い露光時間で標本像を撮像することができる。
図１は、本発明の実施の形態１にかかる微弱光標本撮像ユニットの構成を示す図である。 図２は、図１に示した微弱光標本撮像ユニットによって形成されるエアリーディスクを示す図である。 図３−１は、エアリーディスク径と画素内の受光領域の大きさとをほぼ等しくした場合のエアリーディスクの光量分布を示す図である。 図３−２は、エアリーディスク内に４つの画素が含まれる場合のエアリーディスクの光量分布を示す図である。 図３−３は、１つの画素の受光領域に２つのエアリーディスクが含まれる場合のエアリーディスクの光量分布を示す図である。 図４は、結像側ＮＡとエアリーディスク径との関係を示す図である。 図５は、光学的ローパスフィルターの特性を説明する図である。 図６は、本発明の実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置の構成を示す図である。 図７−１は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によって標本の明視野像を撮像した画像を示す図である。 図７−２は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によって標本の自己発光による像を１分間露光して撮像した画像を示す図である。 図７−３は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によって標本の自己発光による像を５分間露光して撮像した画像を示す図である。 図７−４は、図７−１および図７−３に示した画像を重ね合わせて表示した画像を示す図である。 図８−１は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置による実験の標本の作成方法を説明する図である。 図８−２は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置による実験の標本の作成方法を説明する図である。 図９−１は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によって標本の明視野像を撮像した画像を示す図である。 図９−２は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によって標本の自己発光による像を１分間露光して撮像した画像を示す図である。 図９−３は、図９−１および図９−２に示した画像を重ね合わせて拡大表示した画像を示す図である。 図１０は、図９−３に示した画像のうち所定の領域に対応する標本からの発光強度の経時変化を測定した結果を示す図である。 図１１は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットによる標本の深度方向の結像状態を説明する図である。 図１２は、標本の深度に対する測光量の変化を示す図である。 図１３−１は、総合倍率を２倍とした微弱光標本撮像ユニットによって微弱光による標本像を撮像した画像を示す図である。 図１３−２は、総合倍率を４倍とした微弱光標本撮像ユニットによって微弱光による標本像を撮像した画像を示す図である。 図１３−３は、総合倍率を８倍とした微弱光標本撮像ユニットによって微弱光による標本像を撮像した画像を示す図である。 図１４は、微弱光標本撮像ユニットの総合倍率ごとに微弱光による標本像の状態を考察した結果を示す図である。 図１５は、微弱光標本撮像ユニットにおける対物レンズ、総合倍率、測光深度および焦点深度の対応関係を示す図である。 図１６は、顕微鏡用対物レンズの種類に応じた焦点距離および開口数を示す図である。 図１７は、図６に示した微弱光標本撮像装置に落射蛍光装置を付加した場合の要部構成を示す図である。 図１８は、図６に示した微弱光標本撮像装置に平行光束照明用の落射蛍光照明装置を付加した場合の要部構成を示す図である。 図１９は、図６に示した微弱光標本撮像装置によって結像されるＤＮＡチップとＣＣＤの撮像範囲との対応関係を示す図である。 図２０は、図６に示した微弱光標本撮像装置にフィルターユニットを付加した場合の要部構成を示す図である。 図２１は、多色ルシフェラーゼ遺伝子の発光特性および図２０に示した波長抽出フィルターの透過率特性を示す図である。 図２２は、図６に示した微弱光標本撮像装置に分光ユニットを付加した場合の要部構成を示す図である。 図２３は、図６に示した微弱光標本撮像装置にミラー切換明視野撮像ユニットを付加した場合の要部構成を示す図である。 図２４は、図６に示した微弱光標本撮像装置を遮光装置内に配置して外部から自動制御を行う場合の構成を示す図である。 図２５は、図６に示した標本１を内部に保持し環境条件が可変な収容器の構成を示す図である。 図２６は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置に適用可能な各部構成を系統的に示す図である。 図２７は、図６に示した微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置に適用可能な対物レンズに応じた結像レンズとその組み合わせにおける性能仕様とを示す図である。 図２８は、縮小倍率を有するレンズを配置した像側にテレセントリックな結像光学系の一例を示す図である。
符号の説明
１，１０１ 標本
２ 撮像レンズ
３，３４ａ〜３４ｃ ＣＣＤ
３ａ 撮像面
３ｐn 画素
４ 赤外光カットフィルター
５ カメラ筐体
５ａ 取り付けネジ
６，６−１〜６−３，１０２ 対物レンズ
６ａ，７ａ，９ 鏡筒
７，７−１〜７−５，３７，１０３ 結像レンズ
８ 明るさ絞り
１０ つなぎ鏡筒
１１ 本体架台
１１ａ 操作ダイヤル
１２ ベース架台
１３ 試料台
１４ 照明架台
１５ 照明ファイバー
２１ 励起フィルター
２２ 吸収フィルター
２３，３５ ダイクロイックミラー
２４ 蛍光キューブ
２５ 蛍光用投光管
２６ 励起光源
２７ 平行光束光源
２８ ビームエキスパンダー
２９ 投光レンズ
３０ 波長選択ミラー
３１ フィルターユニット
３１ｃ 空穴
３２，３３ 波長抽出フィルター
３２ＳＰ，３３ＬＰ 透過率曲線
３５Ｇ，３５Ｒ 分光特性曲線
３６ 分光キューブ
３８ ミラー
３９ 切換装置
４１ ベース
４２ 囲い
４３ 蓋
４４ ヒンジ部
４５ ノブ
４６ 制御装置
４７ 入力装置
４８ 表示装置
５１ シャーレ
５２ 区画
５３ 透明板
５４ 給気パイプ
５５ 排気パイプ
１０１ａ，１０１ｂ 物点
１０４ レンズ
１０５，１０６ 像面
１０５ａ，１０５ｂ，１０６ａ，１０６ｂ 像点
ａｏ，ｂｏ，ｏｃ，ｏｆ 点光源
ａｉ，ｂｉ，ｏｃｉ，ｏｆｉ 像点
ＡＤ エアリーディスク
ＡＤ１，ＡＤ２，ＡＤ３ａ，ＡＤ３ｂ 光量分布曲線
Ｃ１〜Ｃ４ カメラ
ＣＲ１，ＣＲ２ 主光線
ＤＩ ＤＮＡ個体像
ＦＩ 視野像
ＩＭ 像面
ＯＡ，ＯＡ’，ＯＡ１〜ＯＡ３ 光軸
Ｐｕ 射出瞳
ＰＨ ピンホール
ＰＰ 後側焦点
ＰＳ 励起ピンホール
以下、添付図面を参照して、本発明にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置の好適な実施の形態を詳細に説明する。なお、この実施の形態によりこの発明が限定されるものではない。また、図面の記載において、同一部分には同一の符号を付している。
（実施の形態１）
まず、本発明の実施の形態１にかかる微弱光標本撮像ユニットについて説明する。図１は、この実施の形態１にかかる微弱光標本撮像ユニットの構成を示す模式図である。図１に示すように、この実施の形態１にかかる微弱光標本撮像ユニットは、光軸ＯＡ１に沿って配置された、微弱光を発する観察対象としての標本１、結像光学系としての撮像レンズ２、赤外光を遮光する赤外光カットフィルター４および撮像手段としての固体撮像素子であるＣＣＤ３を備える。
撮像レンズ２は、標本１上で所定の視野内にある各点光源からの光を開口数ＮＡoで捉え、光軸ＯＡ１に垂直なＣＣＤ３の撮像面３ａ上に標本１の像を開口数ＮＡiでテレセントリックに結像する。撮像レンズ２は、たとえば、標本１上の点光源ａｏ，ｂｏからの光を集光して、それぞれ撮像面３ａ上の像点ａｉ，ｂｉに結像する。このとき、像点ｂｉに結像される光の主光線ＣＲ１は、撮像レンズ２によって光軸ＯＡ１に平行にされ、撮像面３ａに垂直に入射する。同様に、像点ｂｉ以外の撮像面３ａ上の各点に結像される光の主光線も、撮像レンズ２によって光軸ＯＡ１に平行にされ、撮像面３ａに垂直に入射する。なお、撮像レンズ２によるテレセントリックな結像とは、各主光線が光軸ＯＡ１に対して厳密に平行となる場合に限定されず、略平行となる場合を含むものである。また、撮像レンズ２は、赤外光カットフィルター４によって発生する球面収差、非点収差等を補正する。なお、開口数ＮＡoは約０．７以上にすることが望ましいが、０．７以上に限定して解釈する必要はなく、例えば０．６としても使用できる。
ＣＣＤ３は、高感度のモノクロームＣＣＤであって、０℃程度の比較的高温の冷却ＣＣＤによって実現される。ＣＣＤ３は、赤外光カットフィルター４とともにカメラ筐体５の内部に一体に保持される。カメラ筐体５は、Ｃマウント規格に対応した取り付けネジ５ａを有し、端面５ｂからの空気換算長であるフランジバックが１７．５３ｍｍの位置に撮像面３ａを配設するようにＣＣＤ３を保持している。
ここで、撮像レンズ２が標本１上の点光源を撮像面３ａ上に結像する条件について説明する。一般に、レンズ系によって結像される点光源の像は、単色光源の場合、明暗の輪帯状の縞模様を形成し、縞模様の中心部にあるもっとも明るい円盤部は、エアリーディスクと呼ばれる。撮像レンズ２は、標本１上の点光源からの光を開口数ＮＡoで捉え、たとえば図２に示すように、撮像面３ａ上にある画素３ｐn内の受光領域にほぼ内接する大きさのエアリーディスクＡＤを形成するようにして、像点ａｉに点光源ａｏの像を結像する。すなわち、撮像レンズ２は、エアリーディスクＡＤの径と画素３ｐn内の受光領域の大きさとがほぼ等しくなるように点光源ａｏの像を結像する。エアリーディスクＡＤ内の光量分布は、図３−１に示すように、光量分布曲線ＡＤ１で示される。エアリーディスクＡＤ内には、像点ａｉに結像する光量の約９０％が集中し、このエアリーディスクＡＤ内の光は、すべて画素３ｐnで受光される。なお、煩雑さを避けるため、図２および図３−１では、各画素と各画素内の受光領域とを同じ大きさで示している。
つぎに、エアリーディスク径と開口数等との関係式を示す。一般に、開口数ＮＡiで結像して形成されるエアリーディスク径φｄiは、結像する光の波長をλとして、次式（１）で示される。
φｄi＝１．２２・λ／ＮＡi ・・・（１）
波長λ＝０．６μｍとした場合、式（１）から得られるエアリーディスク径φｄiと開口数ＮＡiとの関係は、図４に示すようになる。
ここで、撮像レンズ２の倍率Ｍgが開口数ＮＡo，ＮＡiを用いて次式（２）で表されるため、式（１）は、式（３）に変換される。
Ｍg＝ＮＡo／ＮＡi ・・・（２）
φｄi＝１．２２・λ・Ｍg／ＮＡo ・・・（３）
また、撮像レンズ２の標本１上の解像力εがレイリーの解像力の基準をもとに次式（４）で表されるため、式（３）は、式（５）に変換される。
ε＝０．６１・λ／ＮＡo ・・・（４）
φｄi＝２・ε・Ｍg ・・・（５）
一方、撮像レンズ２の撮像面３ａ上の解像力Ｌは、レイリーの解像力の基準をもとに次式（６）で表される。
Ｌ＝０．６１・λ／ＮＡi ・・・（６）
式（６）は、式（２）および式（４）を用いて次式（７）に変換される。
Ｌ＝ε・Ｍg ・・・（７）
さらに、式（７）は、式（５）を用いて式（８）に変換される。
Ｌ＝（１／２）・φｄi ・・・（８）
一般に、ＣＣＤ等の撮像素子によって撮像を行う場合、モアレ縞を発生させずに鮮明な画像を得るには、サンプリング定理により、解像力Ｌに対応する大きさの中に少なくとも２つの画素が必要とされる。この条件をもとに、ＣＣＤ３の各画素の大きさをｈとし、解像力Ｌ＝２ｈとして式（８）に代入すると次式（９）が得られる。
φｄi＝４・ｈ ・・・（９）
この式（９）によって、ＣＣＤ３でモアレ縞を発生させずに鮮明な画像を得るには、エアリーディスク内に少なくとも４つの画素を入れる必要があることがわかる。
ところが、微弱光を発する標本１は、たとえばルシフェラーゼ遺伝子を発光色素として導入した細胞であり、点光源と考えられる程度に小さな発光源が暗い背景の中に点在するものであるため、モアレ縞の影響を考慮する必要はない。したがって、この実施の形態１にかかる微弱光標本撮像ユニットでは、式（９）で示される条件を考慮する必要がなく、図２および図３−１に示したように、エアリーディスク径と１つの画素内の受光領域の大きさとをほぼ等しくし、受光量の損失を低減するとともにＣＣＤのＳ／Ｎ比を向上させ、エアリーディスク内に集中した点光源からの微弱光を高感度に受光できるようにしている。
式（９）で示される条件を満足させる場合には、たとえば図３−２に示すように、エアリーディスク径がφｄi２である光量分布曲線ＡＤ２は、５つの画素３ｐn-2〜３ｐn+2にまたがる。よって、撮像レンズ２が集光した光を撮像面３ａでは、エアリーディスク内の２１個の画素（５×５画素のうち受光しない４隅を除いた画素）で分け合って受光することになる。この場合、各画素には一定のノイズ（暗電流）が発生しており、撮像レンズ２からの光と暗電流の比であるＳ／Ｎ比は、１画素に撮像レンズ２からの光を集中させた場合とで大きな差が出る。微弱光の測光では、Ｓ／Ｎ比をあげることがすなわち明るい画像を作ることになる。
暗電流は、ＣＣＤの受光部が赤外光に対して高感度であり、ＣＣＤを駆動した際に、ＣＣＤおよびＣＣＤ駆動回路の温度上昇によって発生した赤外光をＣＣＤ自身が受光するために生じる電流である。この暗電流は、ＣＣＤを冷却することによって低減させることができ、一般に、室温付近では、ＣＣＤの温度を８℃低下させる毎に１／２に減少させられるとされている。近年、−１４０℃まで冷却して赤外光および暗電流の発生を著しく抑制したきわめて高感度なＣＣＤが開発されているが、ルシフェラーゼ遺伝子等の微弱な発光色素を短時間で鮮明に観察できるほど十分なＳ／Ｎ比は得られていない。
これに対して、この実施の形態１にかかる微弱光標本撮像ユニットでは、エアリーディスク径と１つの画素内の受光領域の大きさをほぼ等しくすることによって、１つの画素の受光量および起電流を増大させ、Ｓ／Ｎ比を向上させて、標本１上の点光源を高感度に撮像できるようにしている。このため、ルシフェラーゼ遺伝子等の微弱な発光色素に対しても、０℃程度の比較的高温の冷却ＣＣＤによって、フォトンカウンティングすることなく、数分程度の短い露光時間で撮像可能なほどに十分な感度を得ることができる。
一方、たとえば図３−３に示すように、１つの画素の受光領域に複数のエアリーディスクが含まれるようにして、画素当たりの受光量および起電流をさらに増大させることも可能である。ところが、この場合、各光量分布曲線ＡＤ３ａ，ＡＤ３ｂに対応するエアリーディスクが識別できなくなる。しかし、本発明にかかる本微弱光標本撮像ユニットの目的は、例えば、発光色素１個ごとを分離して測光することではなく、標本１としての細胞内に撮像レンズ２の解像限界よりもはるかに密接して無数に分布する発光中の発光色素の集団が細胞のどの辺りにあるか、ほぼ観察できれば目的は十分に達成できる。極端には、発光中の細胞の形（存在）がわかり、その細胞の発光総量が測光できるだけでも良い。よって、エアリーディスクに対するＣＣＤ３の画素の大きさの規定は、Ｓ／Ｎをあげるための措置であり、また、後述する測光深度を得るためのパラメータである。
なお、図３−３に示すように、１つの画素の受光領域の幅に隣接する２つのエアリーディスクが含まれるようにするには、式（５）から明らかなように、エアリーディスク径と１つの画素内の受光領域の大きさを等しくする場合に比して、撮像レンズ２の倍率Ｍgの大きさを１／２倍すればよい。
以上説明したように、この実施の形態１にかかる微弱光標本撮像ユニットでは、標本側に高ＮＡを有した撮像レンズ２によって、標本１上の各点光源からの光をテレセントリックにＣＣＤ３上に結像し、画素内の受光領域にほぼ内接する大きさのエアリーディスクを形成するようにしているため、画素内に点光源からの微弱光をほぼ集中させて高感度に受光することを可能とし、Ｓ／Ｎ比を向上させている。これによって、たとえばルシフェラーゼ遺伝子を発光色素として導入した細胞のような微弱光を発する標本１に対しても、０℃程度の比較的高温の冷却ＣＣＤによって、フォトンカウンティングすることなく、数分程度の短い露光時間で標本像を撮像することができる。
なお、ＣＣＤ３をモノクロームＣＣＤとしているのは、たとえば単板式のカラーＣＣＤとした場合、１つの画素にＲ，Ｇ，Ｂの３原色のカラーフィルターを有した受光領域が設けられているため、受光量の損失と解像力の劣化が生じるからである。
また、通常ＣＣＤを使用する場合、モアレ縞が発生しないように撮像面の前に光学的なローパスフィルターを備えるが、この実施の形態１にかかる微弱光標本撮像ユニットではローパスフィルターを備えていない。これは、光学的なローパスフィルターが、たとえば図５に示すように、水晶フィルターＬＰＦによって実現され、光軸ＯＡから光軸ＯＡ’を分岐し、像ＩＭｏから２分割した像ＩＭｉ１，ＩＭｉ２を生成するため、受光量の損失と解像力の劣化が生じるからである。また、この実施の形態１にかかる微弱光標本撮像ユニットでは、上述したように、モアレ縞の影響を考慮する必要がないからである。
（実施の形態２）
つぎに、本発明の実施の形態２について説明する。上述した実施の形態１では、一体の有限系のレンズ系である撮像レンズ２によって標本１の像を撮像面３ａ上に結像するようにしていたが、この実施の形態２では、対物レンズと結像レンズとからなる無限遠系のレンズ系によって標本１の像を結像するようにしている。
図６は本発明の実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置の構成を示す模式図である。図６に示すように、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットは、光軸ＯＡ２に沿って配置された結像光学系としての対物レンズ６および結像レンズ７と、赤外光カットフィルター４と、ＣＣＤ３とを備える。ここで、実施の形態１と同一の構成部分には同一符号を付している。
対物レンズ６は、カシメ等によって鏡筒６ａに保持され、鏡筒６ａは、鏡筒９の端面９ａに嵌合するようにネジで取り付けられ、結像レンズ７は、カシメ等によって鏡筒７ａに保持され、鏡筒７ａは、鏡筒９の端面９ｂに嵌合するようにネジで取り付けられる。また、ＣＣＤ３、赤外光カットフィルター４およびカメラ筐体５を備えるカメラＣ１は、つなぎ鏡筒１０の端面１０ａに嵌合するようにネジで取り付けられ、つなぎ鏡筒１０は、鏡筒９の端面９ｃに嵌合するようにネジで取り付けられる。これら鏡筒６ａ、鏡筒７ａ、つなぎ鏡筒１０およびカメラＣ１は、それぞれ着脱可能に取り付けられる。なお、カメラＣ１は、Ｃマウント規格に対応し、ＣＣＤ３の撮像面３ａは、端面１０ａから光軸ＯＡ２に沿って１７．５３ｍｍの位置に配設される。
また、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置は、微弱光標本撮像ユニットを保持する鏡筒９、鏡筒９をスライド面１１ａに沿って移動可能に保持する本体架台１１、本体架台１１を保持するベース架台１２、標本１を保持する試料台１３、標本１を照明する照明光を導光する照明手段としての照明ファイバー１５および照明ファイバー１５を保持する照明架台１４を備える。照明架台１４は、試料台１３に保持され、試料台１３は、本体架台１１に保持される。
鏡筒９は、操作ダイヤル１１ｂの回転操作に応じて、光軸ＯＡ２に略平行なスライド面１１ａに沿って図上で上下方向に位置調整され、これによって標本１に対する対物レンズ６の焦点合わせが行われる。また、照明ファイバー１５は、図示しない白色光源等の光源から発せられる照明光を導光し、標本１に対して透過照明である明視野照明を行う。なお、照明ファイバー１５は、標本によっては、光軸から傾いた角度の偏斜照明を行うようにしてもよい。
ここで、対物レンズ６および結像レンズ７からなる結像光学系について説明する。対物レンズ６は、無限遠補正されたレンズ系であり、この対物レンズ６の前側焦点位置に焦点合わせされた標本１上の各点光源からの光を開口数ＮＡoでテレセントリックに捉え、それぞれ平行光束にして射出する。対物レンズ６から射出した各平行光束は、対物レンズ６の後側焦点位置に配設された明るさ絞り８上に集光して射出瞳を形成する。
結像レンズ７は、前側焦点位置が明るさ絞り８上の射出瞳位置と合致するように配置され、明るさ絞り８を通過した各平行光束を集光して、光軸ＯＡ２に垂直なＣＣＤ３の観察面３ａ上に標本１の像を開口数ＮＡiでテレセントリックに結像する。このとき、結像レンズ７は、赤外光カットフィルター４によって発生する球面収差、非点収差等を補正して標本１の像を結像する。
対物レンズ６および結像レンズ７は、たとえば図６に示すように、標本１上の点光源ａｏ，ｂｏからの光を集光して、それぞれ撮像面３ａ上の像点ａｉ，ｂｉに結像する。このとき、像点ｂｉに結像される光の主光線ＣＲ２は、結像レンズ７によって光軸ＯＡ２に平行にされ、撮像面３ａに垂直に入射する。同様に、像点ｂｉ以外の撮像面３ａ上の各点に結像される光の主光線も、結像レンズ７によって光軸ＯＡ２に平行にされ、撮像面３ａに垂直に入射する。なお、対物レンズ６および結像レンズ７によるテレセントリックな結像とは、各主光線が光軸ＯＡ２に対して厳密に平行となる場合に限定されず、略平行となる場合を含むものである。
また、結像レンズ７は、実施の形態１の撮像レンズ２と同様に、撮像面３ａ上にある画素内の受光領域に内接する大きさのエアリーディスクを形成する。すなわち、結像レンズ７は、エアリーディスク径と画素内の受光領域の大きさとがほぼ等しくなるように、標本１上の点光源の像を撮像面３ａ上に結像する。これによって、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットでも、１つの画素の受光量および起電流を増大させ、Ｓ／Ｎ比を向上させて、標本１上の各点光源を高感度に撮像することができる。
なお、対物レンズ６の開口数ＮＡoは、約０．７以上にすることが望ましいが、０．７以上に限定して解釈する必要はなく、例えば０．６としてもよい。また、結像レンズ７の開口数ＮＡiは、０．１〜０．３程度にするとよく、この場合、波長λ＝０．６μｍとすると、図４に示したように、形成されるエアリーディスク径は７．３〜２．４μｍ程度となる。ここで、結像レンズ７は、対物レンズ６の射出瞳径と同等以上の大きさの入射瞳径を有するようにするとよい。
また、明るさ絞り８は、図示しない取り付け部材によって鏡筒６ａまたは鏡筒９に取り付けられる。ここでは、明るさ絞り８を開口径が固定の固定絞りとしているが、開口径が可変な可変絞りとして、開口数ＮＡo，ＮＡiを変更できるようにしてもよい。なお、明るさ絞り８は、対物レンズ６の内部に含まれるようにしてもよい。
さらに、対物レンズ６および結像レンズ７からなる結像光学系について、倍率をＭg、標本１上の解像力をε、撮像面３ａ上の解像力をＬ、撮像面３ａ上に形成するエアリーディスク径をφｄiとすると、撮像レンズ２と同様に式（１）〜（９）が適用できる。
また、対物レンズ６は、鏡筒６ａによって鏡筒９に着脱可能に取り付けられ、標本１の観察条件等に応じて、焦点距離および開口数ＮＡiの少なくとも一方が異なる交換用対物レンズと交換できる。交換用対物レンズでは、対物レンズ６と互いに同焦点にするため、対物レンズ６の配置基準面である胴付き面６ｂから前側焦点位置までの距離Ｌ１と、胴付き面６ｂから射出瞳位置までの距離Ｌ２とに対応する距離が、それぞれ対物レンズ６とほぼ等しくされる。
同様に、結像レンズ７は、鏡筒７ａによって鏡筒９に着脱可能に取り付けられ、撮像面３ａ上への結像条件等に応じて、焦点距離および開口数ＮＡoの少なくとも一方が異なる交換用結像レンズと交換できる。交換用結像レンズでは、鏡筒９に取り付けられた場合に後側焦点位置が撮像面３ａに合致するように、結像レンズ７の配置基準面である胴付き面７ｂから射出瞳位置までの距離Ｌ３と、胴付き面７ｂから後側焦点位置までの距離Ｌ４とに対応する距離が、それぞれ結像レンズ７とほぼ等しくされる。
さらに、鏡筒７ａの端面７ｄから撮像面３ａまでの距離Ｌ５は、Ｃマウント規格に対応したカメラＣ１が容易に交換可能なように１７．５３ｍｍ以上にされる。この距離Ｌ５は、結像レンズ７が交換用結像レンズに交換された場合にも、ほぼ一定に保たれる。
また、対物レンズ６および結像レンズ７がそれぞれ鏡筒９に取り付けられた場合の鏡筒６ａの端面６ｃと鏡筒７ａの端面７ｃと間の距離Ｌ６は、この間に各種光学素子が配置可能なように約２０ｍｍ以上にするとよい。また、標本１から撮像面３ａまでの距離Ｌ０が大きくなり過ぎ、結像レンズ７が大きくなり、高価となったり配置に支障をきたさないように約７０ｍｍ以下にするとよい。この距離Ｌ６は、対物レンズ６および結像レンズ７がそれぞれ交換用対物レンズおよび交換用結像レンズに交換された場合にも、ほぼ一定に保たれる。なお、距離Ｌ６は、この間に光学素子を配置する必要がない場合には２０ｍｍ以下でもよい。
このように、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置では、エアリーディスク径と画素内の受光領域の大きさとがほぼ等しくなるように標本１上の点光源の像を撮像面３ａ上に結像して高感度に撮像できるだけでなく、さらに、対物レンズ６および結像レンズ７からなる無限遠補正系の結像光学系によって標本１の像を撮像面３ａ上にテレセントリックに結像するようにしているため、対物レンズ６および結像レンズ７の少なくとも一方が容易に交換可能であり、開口数ＮＡo，ＮＡi、エアリーディスク径φｄi、倍率Ｍg等の結像条件を容易に変更することができる。また、照明ファイバー１５によって標本１を透過照明できるようにしているため、標本１の明視野像を観察することができる。
なお、図６に示した微弱光標本撮像装置では、鏡筒９をスライド面１１ａに沿って位置調整し標本１に対する焦点合わせを行うようにしているが、対物レンズ６および結像レンズ７からなる結像光学系が無限遠補正系であり、対物レンズ６を光軸ＯＡ２方向に多少前後させても結像性能に劣化が生じないため、対物レンズ６を位置調整して標本１に対する焦点合わせを行うようにしてもよい。
つぎに、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によって実際に撮像した画像を図７−１〜図７−４に示す。図７−１〜図７−４に示す画像は、ヒト由来のＨｅＬａ細胞にルシフェラーゼ遺伝子「pGL3-controlvector（プロメガ社製）」を導入し、１日培養した後、ハンクス平衡塩類溶液で洗浄し、１ｍＭのルシフェリンを含むハンクス塩類溶液に置換して作製した標本を撮像した画像である。
対物レンズ６および結像レンズ７として用いたレンズは、それぞれ「Ｏｉｌ、４０倍、ＮＡ１．０」および「５倍、ＮＡ０．１３」の仕様である市販の顕微鏡用対物レンズであり、結像光学系の倍率Ｍgに対応する総合倍率は８倍である。カメラＣ１として用いたカメラは、０℃冷却の天体観測用クールドＣＣＤカメラ（ＳＢＩＧ社製）であり、ＣＣＤ３としてのＣＣＤ素子は、２／３インチ型、画素数７６５×５１０、画素サイズ９μｍ角である。
図７−１は、標本の明視野像を撮像した画像、図７−２および図７−３は、標本の自己発光による像を撮像した画像であって、それぞれ１分間および５分間露光して撮像した画像である。図７−４は、図７−１および図７−３に示す２つの画像を重ね合わせて表示した画像である。
図７−２に示すように、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によれば、０℃冷却の比較的高温の冷却ＣＣＤであっても、フォトンカウンティングすることなく、１分間という短い露光時間で、ルシフェラーゼ遺伝子が発する微弱光を撮像できる。また、図７−３に示すように、露光時間を５分間にすることで、より微弱な光を発するルシフェラーゼ遺伝子を撮像することができる。さらに、図７−１に示すように、標本の明視野像を撮像することが可能であり、図７−４に示すように、明視野像と自己発光による像とを重ね合わせることによって、発光するルシフェラーゼ遺伝子の標本内の位置を観測することができるとともに、発光するルシフェラーゼ遺伝子を含む細胞を特定することができる。なお、非特許文献１では、この文献中のFigure2.に示されるように、標本がモザイク状に撮像され、発光する細胞を特定することは非常に困難であった。
さらに、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によって行った実験結果の別の一例として、単一細胞での経時的なレポーターアッセイの例を説明する。
このレポーターアッセイでは、まず、テトラサイクリン・リプレッサー（ＴｅｔＲ）を恒常的に発現させるベクター「pcDNA6/TR（インビトロジェン社製）」と、テトラサイクリン・オペレータ（ＴｅｔＯ２）をもつ発現ベクター「pcDNA4/TO（インビトロジェン社製）」にルシフェラーゼ遺伝子をつなげたプラスミドとをＨｅＬａ細胞に共発現させて標本を作製する。この状態では、図８−１に示すように、ＴｅｔＲホモダイマーがＴｅｔＯ２領域に結合しているため、ルシフェラーゼ遺伝子の転写は抑制される。つぎに、図８−２に示すように、培養液中にテトラサイクリンを添加してＴｅｔＲホモダイマーに結合させ、ＴｅｔＲホモダイマーの立体構造を変化させることによって、ＴｅｔＯ２からＴｅｔＲホモダイマーを分離させ、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を誘導する。なお、培養液は１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むＤ−ＭＥＭ培地であり、１ｍＭのルシフェリンを含む。
対物レンズ６および結像レンズ７として用いたレンズは、それぞれ「Ｏｉｌ、２０倍、ＮＡ０．８」および「５倍、ＮＡ０．１３」の仕様である市販の顕微鏡用対物レンズであり、倍率Ｍgに対応する総合倍率は４倍（対物レンズの実行ＮＡo＝０．５２）である。カメラＣ１として用いたカメラは、５℃冷却の顕微鏡用デジタルカメラ「DP30BW（オリンパス社製）」であり、ＣＣＤ３としてのＣＣＤ素子は、２／３インチ型、画素数１３６０×１０２４、画素サイズ６μｍ角である。
図９−１は、テトラサイクリンを添加する前の標本の明視野像を撮像した画像である。図９−２は、テトラサイクリンを添加してから９時間後の標本の自己発光による像を１分間露光して撮像した画像である。図９−３は、図９−１および図９−２に示す２つの画像を重ね合わせた画像であって、一部を拡大表示した画像である。なお、これらの観察は、室温（２５℃）で行われている。標本がインキュベーター内に載置される場合、あるいは、撮像ユニットまたは撮像装置の一部もしくは全部もインキュベーター内に収納される場合では、３７℃の環境で観察が可能である。
図９−２に示すように、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によれば、５℃冷却の冷却ＣＣＤによって、フォトンカウンティングすることなく、１分間という短い露光時間で、ルシフェラーゼ遺伝子が発する微弱光を撮像できる。また、図９−３に示すように、明視野像と自己発光による像とを重ね合わせることによって、発光するルシフェラーゼ遺伝子の位置を鮮明な画像で観測することができるとともに、このルシフェラーゼ遺伝子を含む細胞を容易に特定することができる。よって、細胞1個毎の発光量の経時的な変化を測定できる。
図１０は、図９−３に示した領域ＲＯＩ−１，ＲＯＩ−２について、ルシフェラーゼ遺伝子の発光強度の経時変化を測定した結果を示す図である。図１０は、テトラサイクリンを添加した２時間後から発光が捉えられ，６〜７時間後でプラトーに達したことを示している。このように、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置によれば、発光するルシフェラーゼ遺伝子の位置を特定して時系列に追跡し、発光現象の経時変化を測定することができる。
つぎに、対物レンズ６と結像レンズ７とからなる結像光学系の結像倍率と像の明るさとの関係について説明する。原理的に、結像光学系における対物レンズ６の集光能力は、標本１側の開口数ＮＡoの２乗に比例する。この光量が結像に用いられるので結像に関与する総光量ＬＱは、結像光学系の透過率等を無視して、次式（１０）で示される。
ＬＱ∝ＮＡo 2 ・・・（１０）
つまり、対物レンズ６の集光量はＮＡo 2に比例し、ＮＡoが大きいほど明るい。
一方、結像光学系が倍率Ｍgで標本１の標本像を結像させると、標本像の大きさは標本１のＭg倍となり、標本像の単位面積当たりの明るさは（１／Ｍg 2）に比例する。よって、標本１内の点光源としての発光体の分布が一様なときは、標本像の単位面積当たりの光量Ｑ0は、次式（１１）で示される。
Ｑ0∝（１／Ｍg 2） ・・・（１１）
これより、撮像面３ａ上の１画素の受光量ＱAは、画素の一辺の長さｄ、面積Ａを用い、面積Ａがｄ2に比例することから、次式（１２）で示される。
ＱA∝ｄ2・（１／Ｍg 2） ・・・（１２）
つまり、この画素の受光量はｄ2に比例し、Ｍg 2に反比例する。
また、一般の光学系は焦点深度と言われる概念を持っている。これは、対物レンズのピント位置から光軸方向に離れた物点が、像面で物体像としてピント上にある物点とほぼ同様に結像するとの概念であるが、これはまた、ピント位置から離れた発光点からの光を拾えるということでもある。そこで、説明をわかりやすくするために、標本１は発光色素が厚さ方向にも均一に分布しているものとし、結像光学系の像面上に直径φdのピンホールＰＨを置いて測光したときの光量について考える。
図１１に示すように、本実施の形態２の結像光学系では、対物レンズ６のピント位置にある点光源ａｏを、像面ＩＭ上に結像している。対物レンズ６のピント位置から遠方に距離Ｌoだけ離れた点光源ｏｃは、像面ＩＭから結像レンズ７側へ距離Ｌiだけ離れた像点ｏｃｉに結像している。この結像光学系の縦倍率は、倍率Ｍgを用いてＭg 2で表されるので、距離Ｌiは、距離Ｌoを用いて次式（１３）で示される。
Ｌi＝Ｌo・Ｍg 2 ・・・（１３）
また、結像レンズ７の射出側の開口数ＮＡiは微小であり、像点ｏｃｉと像点ａｉとの位置はわずかしか変わらないため、開口数ＮＡi、距離Ｌiおよびピンホール径φdは、次式（１４）で示される関係にある。
Ｌi・ＮＡi＝φd／２ ・・・（１４）
式（１３）を用いて、式（１４）を距離Ｌoについてまとめると、次式（１５）に示す関係が得られる。
Ｌo＝（φd／２）・｛１／（Ｍg 2・ＮＡi）｝ ・・・（１５）
さらに、倍率と開口数の関係を示す一般式としての次式（１６）を用いると、式（１５）は、式（１７）に示すように変形される。
ＮＡi＝ＮＡo／Ｍg ・・・（１６）
Ｌo＝（φd／２）・｛１／（Ｍg・ＮＡo）｝ ・・・（１７）
ここで、ピント位置から前後方向に距離Ｌo以内にある点光源ｏｃ，ｏｆ等からの光は、図１１に示すように、対物レンズ６によって集光された後、結像レンズ７によって結像される際に、ピンホールＰＨによってケラレることはない。つまり、ピント位置から前後方向に距離Ｌo以内の点光源からの光は、ピンホールＨＰによってケラレることなく測光可能である。このように、像面ＩＭ上のピンホールＰＨ等によってケラレることなく測光可能な標本側の深度を測光深度（Ｄ・Ｄ・Ｏ・Ｌ：Detectable Depth of Luminescence）として定義すると、この測光深度Ｌdは、式（１７）を用いて次式（１８）で示される。
Ｌd＝２Ｌo＝φd・｛１／（Ｍg・ＮＡo）｝ ・・・（１８）
なお、ピンホールＰＨを介した実際の受光量は、測光深度Ｌd外の点光源からの光も一部取り込めるため、標本側の深度に応じて図１２に示すように変化する。図１２では、標本側の深度ごとの受光強度がグラフとして示されており、実際の受光量は、このグラフを積分した値となる。この図１２より、実用的には測光深度Ｌd＝３Ｌo程度と考えられるが、ここでは考慮しない。
発光体（例えば、発光色素）が標本の厚さ方向にも密度ρで均一に分布している標本においては、標本側の開口数ＮＡo、結像光学系の倍率Ｍg、像面ＩＭ上のピンホール径φdの組の受光量ＴＱは、式（１０），（１２），（１８）の積と考えられるため、次式（１９）で示される。
ＴＱ∝ＮＡo 2・（１／Ｍg 2）・φd 3・ρ｛１／（Ｍg・ＮＡo）｝
＝φd 3・ＮＡo・ρ／Ｍg 3 ・・・（１９）
式（１９）の意味は、受光量ＴＱは、ピンホール径φdの３乗と標本側の開口数ＮＡoに比例し、倍率Ｍgの３乗に反比例するとの結果となる。つまり、測光上は倍率Ｍgの寄与が非常に高いので、ここでの結論としては、結像光学系の倍率Ｍgをできる限り小さくすることが好ましいこととなる。ピンホール径φdは、エアリーディスク径との関係ですでに決定されている。
ここで、「２０倍、ｆ１０ｍｍ、ＮＡo０．８」の仕様の対物レンズ６を用い、結像レンズ７の焦点距離を２００ｍｍ（総合倍率２０倍）および４０ｍｍ（総合倍率４倍）とした場合の光量比較を行う。まず、式（１９）におけるピンホール径φd、開口数ＮＡoおよび密度ρは一定として、総合倍率２０倍のときの受光量ＴＱ20は、次式（２０）で示される。
ＴＱ20∝１／２０3＝１／８０００ ・・・（２０）
また、総合倍率４倍のときの受光量ＴＱ4は、同様にして、次式（２１）で示される。
ＴＱ4∝１／４3＝１／６４ ・・・（２１）
これらの比ＴＱ4／ＴＱ20は、次式（２２）で示される。
ＴＱ4／ＴＱ20＝１２５ ・・・（２２）
つまり、総合倍率４倍では、総合倍率２０倍に比して１２５倍の明るさを得ることになる。また同様にして、総合倍率２倍および８倍では、それぞれ総合倍率２０倍に比して１０００倍および１６倍の明るさを得ることになる。
つぎに、微弱光標本撮像ユニットの解像力と明るさについて説明する。結像光学系の解像力は、基本的に対物レンズ６の標本側の開口数ＮＡoに依存し、結像レンズ７の焦点距離とは関与しない。しかし、ＣＣＤ３など、受光部が一定面積をもつとこの面積の大きさによって、解像力（像の表現力）が劣化する。測光上の最適なＣＣＤ３の画素の大きさについては既に述べたので、ここでは再記述しないが、本微弱光標本撮像ユニットで使用するＣＣＤ３の画素の１辺の大きさは、解像力にとって必要な画素の大きさの４倍以上であることから、実際に、標本がどのような解像力と明るさでモニター上に表現されるか実験した。
実験では、結像レンズ７として、仕様「ｆ４０ｍｍ、ＮＡ０．１３」の顕微鏡用対物レンズを用い、対物レンズ６として、総合倍率８倍では仕様「Ｕａｐｏ ４０Ｘ、ＮＡ１．３５、ｆ５ｍｍ」の顕微鏡用対物レンズ、総合倍率４倍では仕様「Ｕａｐｏ ２０Ｘ、ＮＡ０．７５、ｆ１０ｍｍ」の顕微鏡用対物レンズ、総合倍率２倍では仕様「ＵｐｌａｎＡｐｏ １０Ｘ、ＮＡ０．４０、ｆ２０ｍｍ」の顕微鏡用対物レンズをそれぞれ使用した。ここで、結像レンズ７のＮＡが０．１３であることから、対物レンズ６の有効ＮＡは、Ｕａｐｏ ４０Ｘでは１．０４（＝０．１３×８）、Ｕａｐｏ ２０Ｘでは０．５２（＝０．１３×４）、ＵｐｌａｎＡｐｏ １０Ｘでは０．２６（＝０．１３×２）である。また、カメラＣ１として、ＣＣＤ画素の大きさが６μｍ角である「DP30BW（オリンパス社製）」を使用した。これによって、図７−１〜７−４に結果を示した実験と同様の標本を、露光時間５分で撮像した。その結果を図１３−１〜１３−３に示す。
この結果をもとに、標本中の細胞の大きさを２５μｍ程度の円に内接する位と考え、総合倍率２倍、４倍、８倍の各場合で画質の品位と像の明るさについて考察した。その結果を図１４にまとめて示す。なお、図１４には、撮像において必要としたＣＣＤの画素数を参考として併記している。
総合倍率８倍と４倍と２倍とについて、式（１９）を用いて式（２２）と同様に像の明るさ（ＣＣＤ３の画素が受ける受光量）の比を計算すると、ＣＣＤの大きさを等しいとして、前記対物レンズ６の有効ＮＡを用いて、次式（２３）で示される。
ＴＱ8：ＴＱ4：ＴＱ2：＝１．０４／８3：０．５２／４3：０．２６／２3
＝１．０４／５１２：０．５２／６４：０．２６／８
＝４／６４：２／８：１／１
＝１／１６：１／４：１
＝１：４：１６ ・・・（２３）
ここで、ＴＱ8，ＴＱ4，ＴＱ2はそれぞれ総合倍率８倍、４倍、２倍での受光量を示している。この計算値を考慮しながら、目的に合った適当な倍率を考えると、つぎのようになる。すなわち、総合倍率２倍は、広い視野の中で細胞形状を気にすることなく細胞全体の測光をしたい場合に適し、総合倍率８倍は、暗いが、細胞の輪郭も観察し、測光する場合に適し、総合倍率４倍は、２倍と８倍との中間で汎用的に使用する場合に適している。
ここでの結論としては、微弱光標本撮像ユニットにおける結像光学系の結像倍率Ｍgは、像の見え具合と明るさとから、略２倍〜略８倍程度が好ましく、像を観察するとともに測光を行う目的からは、像の見え具合の観点から１倍以下は目的からはずれ、１０倍以上は特別に明るい標本でない限り、測光時間などで不具合が出るといえる。
実験からは、このような結論となったが、式（１８）から算出される測光深度についても検討した。まず、結像光学系における対物レンズ６と結像レンズ７とに顕微鏡用対物レンズを用いた場合の、種々の組み合わせにおける総合倍率、測光深度および焦点深度（Ｄ・Ｏ・Ｆ：Depth of Focus）を図１５に示す。焦点深度Ｆdは、波長λ＝０．６μｍとして、次式（２４）で示される。図１５では、光軸方向の前後の焦点深度Ｆdを合わせた深度（２Ｆd）が、焦点深度として示されている。
Ｆd＝λ／（２・ＮＡo 2）＝０．３／ＮＡo 2 ・・・（２４）
ここで、測光深度および焦点深度の観点からは、微弱光標本撮像ユニットの結像光学系は、次のように構成することが好ましいといえる。第１に、測光深度が標本である細胞の厚さに対して大きすぎると、対象細胞の光軸方向の前後にある細胞の光量を拾うことになるので、測光深度は、細胞の厚さの１／５程度以下とすることが好ましい。本発明で検討したＨｅｌａ細胞は径が２５μｍ程度で、厚さはスライドガラス上で１０μｍ程度のものである。第２に、測光深度は、焦点深度の２倍と同等またはそれ以上とすることが好ましい。なぜなら、焦点深度内にある点光源が像として観察されているにもかかわらず暗く撮像されるからである。
この考察をもとに図１５を見ると、「Ｄｒｙ、２０倍」の対物レンズでは総合倍率８倍以下、「Ｏｉｌ、４０倍」の対物レンズでは総合倍率１６倍以下が好ましい。また、式（１８）における倍率Ｍgは、結像光学系の総合倍率であるため、つぎのように言い換えることができる。すなわち、測光深度からは、結像光学系は、開口数ＮＡoが０．８以上で、総合倍率が８倍以下であることが好ましい。ただし、開口数ＮＡoは０．８以上にこだわる必要はなく、例えば０．６以上でも実使用上で大きな支障はない。
つぎに、できる限り広い視野を実現したい要望がある。一般に顕微鏡の光学系の視野は、顕微鏡に規定されている視野数よりはるかに広いのであるが、光学的な収差と像面照度の均一さを保持する意味から、接眼レンズの前に絞りを置き、これで視野を規定している。本発明の微弱光標本撮像ユニットの結像光学系についても同様な考え方を用いて説明を行う。
一般的な顕微鏡の視野数は２４程度で、対物レンズの視野（実視野）ＦＮOBは、対物レンズの倍率ＭOBを用いて、次式（２５）で示される。
ＦＮOB＝２４／ＭOB ・・・（２５）
このとき、結像光学系の総合倍率Ｍgを上述の議論から４倍とすると、結像側の視野ＦＮOBIは、次式（２６）で示される。
ＦＮOBI＝（２４／ＭOB）・Ｍg＝９６／ＭOB ・・・（２６）
本発明の微弱光標本撮像ユニットは、像をＣＣＤで捕らえるので、像面の大きさ（視野数）は、２／３インチ（撮像面８．８×６．６ｍｍ、対角長１１ｍｍ）、１／２インチ（撮像面６．４×４．８ｍｍ、対角長８ｍｍ）を満足したい。これに対して、対物レンズ６の倍率ＭOBを１０倍とした場合の視野数ＦＮOBI10は、式（２６）をもとに次式（２７）で示される。
ＦＮOBI10＝９６／１０＝９．６ ・・・（２７）
この値は、２／３インチＣＣＤでは４隅にケラレを発生させるが、１／２インチＣＣＤを満足させる。しかし、１０倍対物レンズは、顕微鏡用の対物レンズを利用する場合、以下の開口数に関する問題が出る。
ＣＣＤ画素の受光量を求める式（１９）からは、本微弱光標本撮像ユニットにおいては測光重視との観点から、対物レンズ６の開口数ＮＡoを大きくしたい。ところで、顕微鏡の一般対物レンズの開口数ＮＡoは、物理的に標本と対物レンズとの間に介在する物質の屈折率からの制限に加え、使い勝手からのＷＤ（Working Distance）の必要から、Ｄｒｙ対物レンズ（介在物質が空気；屈折率ｎa＝１．０）で開口数ＮＡo＝０．９、Ｏｉｌ対物レンズ（介在物質が油；屈折率ｎo＝１．５）で開口数ＮＡo＝１．４が最大である。
また、顕微鏡の対物レンズの開口数を規制する要素には、上記の他に対物レンズを顕微鏡のレボルバーに取り付ける取付ネジ（２０．３２山３６）と、対物レンズの瞳の大きさとがある。対物レンズの瞳は、この取付ネジ付近に配置され、その瞳径ｄpは、開口数ＮＡoと焦点距離ｆとを用いて、次式（２８）で計算される。
ｄp＝２・ＮＡo・ｆ ・・・（２８）
よって、取付ネジを加工するための鏡枠の肉厚を２ｍｍ程度とすると、瞳径はｄpは、最大１６ｍｍ程度に抑える必要がある。この制限があって、種々の対物レンズの最大ＮＡoは、図１６に示すように構成されている。
結論として、１０倍と２０倍の対物レンズでは、開口数ＮＡoの大きなレンズは顕微鏡用とでは設計できない。そこで、結像光学系の対物レンズ６は、Ｄｒｙ対物レンズでは開口数ＮＡoが最大の２０倍対物レンズ、Ｏｉｌ対物レンズでは倍率が大きくなっても開口数ＮＡoは１．４で抑えられ、倍率が高くなると逆に、視野が小さくなるので、視野数が最大となる最低倍率の４０倍対物レンズが選択される。
以上の結果から、本微弱光標本撮像ユニットの結像光学系に現存の顕微鏡用対物レンズを用いる場合は、Ｄｒｙ対物レンズを用いる場合として、対物レンズ６を「２０倍、ＮＡo０．８、ｆ１０ｍｍ」、結像レンズ７を「ＮＡi０．２、ｆ４０ｍｍ」として、総合倍率４倍、標本上の実視野径１．２ｍｍ、ＣＣＤ３上の視野数４．８、とすることが好ましい。また、Ｏｉｌ対物レンズを用いる場合として、対物レンズ６を「４０倍、ＮＡo１．４、ｆ５ｍｍ」、結像レンズ７を「ＮＡi０．３５、ｆ２０ｍｍ」として、総合倍率４倍、標本上の実視野径０．６ｍｍ、ＣＣＤ３上の視野数２．４、とすることが好ましい。
ここで、結像レンズ７としての「ＮＡi０．３５、ｆ２０ｍｍ」は、製造上高価な上に視野数も小さく、Ｄｒｙ対物レンズ「ＮＡi０．２、ｆ４０ｍｍ」を流用するのもよい。この場合は、総合倍率８倍、視野数４．８となり、像はやや暗くなるが、鮮鋭な観察が可能となる。
なお、以上の理由により、図２６に示す本微弱光標本撮像ユニットの顕微鏡対物レンズを使用した場合の最適の光学構成が決定されるが、開口数ＮＡoは０．８以上のとらわれるものでなく、例えば０．６以上としてもよい。図２６に関する詳細は後述する。
対物レンズ６のレボルバーへの取付ネジを大きくし、レンズを新作する場合は、以下の仕様にすることで、顕微鏡用対物レンズで検討した明るさ、解像力を維持した上で、視野数を大きくすることができ、例えば、ＣＣＤ撮像面のケラレを１／２インチＣＣＤではなくすることができる。すなわち、Ｄｒｙ対物レンズを用いる場合、対物レンズ６を「１０倍、ＮＡo０．８、ｆ２０ｍｍ」、結像レンズ７を「ＮＡi０．２、ｆ８０ｍｍ」として、総合倍率４倍、標本上の実視野径２．４ｍｍ、ＣＣＤ３上の視野数９．６、とする。また、Ｏｉｌ対物レンズを用いる場合、対物レンズ６を「２０倍、ＮＡo１．４、ｆ１０ｍｍ」、結像レンズ７を「ＮＡi０．２、ｆ８０ｍｍ」として、総合倍率８倍、標本上の実視野径２．４ｍｍ、ＣＣＤ３上の視野数９．６、とする。ただし、結像レンズ７の実効開口数は０．１７５である。これによって、レンズは大きくなり、高価となるが、本微弱光標本撮像ユニットには最適の光学系とすることができる。
以上説明したように、本微弱光標本撮像ユニットの結像光学系の開口数を大きくし、かつ総合倍率を小さくすることによって、像の明るさを増し、同時に測光深度を深くすることによって、対物レンズピント位置から離れた点光源からの光を捕らえる結果、ＣＣＤ画素の受光量を大幅に増やすことができる。
ところで、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置では、対物レンズ６と結像レンズ７とからなる結像光学系を無限遠補正系としているため、対物レンズ６と結像レンズ７との間に各種光学素子を配置して、標本１を様々な方法で観察することができる。
図１７は、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置に、落射蛍光装置を備えた場合の要部構成を示す模式図である。この落射蛍光装置は、図１７に示すように、蛍光ユニットとしての蛍光キューブ２４、蛍光用投光管２５および励起光源２６を備える。蛍光キューブ２４は、標本１を励起するための励起光を選択的に透過させる励起光透過フィルターとしての励起フィルター２１と、励起光によって励起された標本１から発せられる蛍光を選択的に透過させる蛍光透過フィルターとしての吸収フィルター２２と、励起光を反射し蛍光を透過させるダイクロイックミラー２３とを一体に備える。蛍光用投光管２５は、集光レンズ２５ａ、明るさ絞り作りレンズ２５ｂ、投光レンズ２５ｃ、明るさ絞りＡＳおよび視野絞りＦＳを同軸に備える。
励起光源２６は、励起光を発する光源であり、水銀ランプ、キセノンランプ、レーザー等によって実現される。蛍光照射手段としての励起光源２６および蛍光用投光管２５は、ダイクロイックミラー２３によって励起光を反射させ標本１に照射する。励起フィルター２１は、励起光源２６から発せられた光の中から励起光を抽出するバンドパスフィルターであり、吸収フィルター２２は、所定のカットオフ波長を有するロングウェーブパスフィルターである。蛍光キューブ２４は、対物レンズ６と結像レンズ７との間の光軸ＯＡ２上に挿脱可能に配置される。なお、蛍光キューブ２４とともに、励起光および蛍光の少なくとも一方に対する光学特性が異なる複数の交換用蛍光キューブを一体に保持し、保持した蛍光キューブのうち１つの蛍光キューブを選択的に対物レンズ６と結像レンズ７との間に配置する蛍光キューブ切替装置を備えるようにしてもよい。
図１７に示すように、落射蛍光装置を付加することによって、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置では、標本１の蛍光像を撮像することができる。また、この微弱光標本撮像ユニットによれば、微弱な蛍光を観測することができるため、落射蛍光レーザースキャニングコンフォーカル顕微鏡を利用する場合のように強力な励起光を標本に照射する必要がなく、標本の損傷を軽減させることができる。さらに、強力な励起光源用レーザー、ガルバノミラー等のスキャニング装置、コンフォーカル光学系、フォトマルチプライヤー、画像作成用処理装置などが不要となる。
対象となる標本は、蛍光観察時も、生物細胞などの蛍光発光体が標本の厚み方向にも散在するものであり、観察の目的としては、細胞の微細な部位からの蛍光発光の観察ではなく、大まかに細胞のどのあたりの部位から発光しているかを特定し、発光量を測定しようとするものである。よって、このような目的に好適は照明は、標本の視野平面全体に均等な光量分布で、かつ、光軸方向（標本の厚み方向）にも均等な照明とすることが好ましい。なぜなら、式（１５），（１７）は、ＣＣＤの各画素が標本の円筒状の体積内にある発光蛍光体からの光を拾うことを意味しているからである。
図１８は、本実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置において、そのような照明を実現する落射蛍光照明装置を備えた場合の要部構成を示す模式図である。この落射蛍光照明装置は、図１８に示すように、平行光束光源２７、ビームエキスパンダー２８、励起ピンホールＰＳ、投光レンズ２９および波長選択ミラー３０を備える。
平行光束光源２７は、例えばレーザ光源が用いられ、励起光を平行光束として射出する。ビームエキスパンダー２８は、平行光束光源２７から射出された平行光束を拡大して透過させる。励起ピンホールＰＳは、投光レンズ２９の前側焦点位置に配置されており、ビームエキスパンダー２８から射出される平行光束を所定の光束径に制限して通過させる。投光レンズ２９は、励起ピンホールＰＳを通過した平行光束を、波長選択ミラー３０を介して、対物レンズ６の後側焦点ＰＰに集光する。この集光された励起光は、対物レンズ６によって、再び平行光束とされ、試料１に照射される。その後、標本１から発した蛍光は、対物レンズ６および結像レンズ７によってＣＣＤ３上に結像され、検出される。
このように落射蛍光照明装置を付加することで、本実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置では、標本１に対して視野平面内および厚み方向で均一に励起光を照射することができるとともに、この励起光をもとに発せられる微弱な蛍光を観測することができる。なお、励起光原としてレーザ光源の代わりに水銀ランプ等を用いる場合は、励起光量は落ちるが明るさ絞り（不図示）を絞ることで平行光束を作ることができるが、普通には、面光源をケーラー照明法で標本を照明するため、無理に明るさ絞りを絞る必要はない。
このように、図１７および図１８に示した微弱光標本撮像装置は、ＤＮＡチップリーダーとして利用することができる。ＤＮＡチップとは、ガラスやポリスチレンなどの樹脂基板上に、多種類のＤＮＡ断片や合成オリゴヌクレオチドを約０．３ｍｍの径で約０．６ｍｍ間隔に数百個塗りつけたものであり、遺伝子の発現や特定遺伝子の存在などを調べるために用いるものである。通常、このＤＮＡチップから発せられる蛍光は、微弱なものである。
一般的なＤＮＡチップリーダーは、レーザー照射のコンフォーカル光学系と高速移動スキャニングステージとの組み合わせであり、この装置での測光は、スポット励起光照射点の発光量の和であるため、スキャニング幅が変わると、その都度測定光量も変化することになり、絶対光量を測定することができない。例えば、特許文献３に開示されたＤＮＡチップリーダーとしての蛍光読み取り装置でも、標本上での照明視野径が０．２ｍｍと小さく、ＤＮＡチップ上に塗布された個々の合成ヌクレオチド（以下、ＤＮＡ個体と称する。）の径が０．３ｍｍであったことから、コンフォーカル光学系の弱点を改良しているものの、スキャニングステージ方式は変わっていない。
これに対して、図１７または図１８に示した微弱光標本撮像装置を利用すると、たとえば、０．５ｍｍ径の視野を有する対物レンズに対して、０．６ｍｍステップでＤＮＡチップを保持するステージを移動させ、停止する毎に測光することによって絶対光量を測定することができる。また、対物レンズ６として１０倍対物レンズ（実視野２．４ｍｍ）を用い、結像光学系の総合倍率を４倍とし、ＣＣＤ３として２／３インチＣＣＤ（撮像面８．８×６．６ｍｍ）を用いることで、例えば図１９に示すように、６個のＤＮＡ個体の測光を、ステージを移動させることなく一括して行うことができる。ここで、図１９は、ＣＣＤ３の撮像面３ａ上に結像される６個のＤＮＡ個体像ＤＩと、実視野に対応する視野像ＦＩとを示す図である。なお、現行の顕微鏡用対物レンズに限定せず、視野の大きなレンズを設計し、例えば、対物レンズの視野を２倍、総合倍率を２倍にすることで、３０個のＤＮＡ個体の測光が一括して行えるようになる。
図２０は、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置に、分光測光用のフィルターユニットを備えた場合の要部構成を示す模式図である。図２０に示すように、分光測光用のフィルターユニット３１は、穴部３１ａ，３１ｂにそれぞれ波長抽出フィルター３２，３３を有し、対物レンズ６と結像レンズ７との間に配置される。フィルターユニット３１は、光軸ＯＡ２に略直交した面内でスライド式に移動可能に配置され、波長抽出フィルター３２，３３および空穴３１ｃの１つを選択的に光軸ＯＡ２上に配設する。なお、フィルターユニット３１は、ターレット式に移動可能としてもよく、さらに多くの波長抽出フィルターを保持するようにしてもよい。
フィルターユニット３１を利用して、たとえば、２色の光を発する多色ルシフェラーゼを標本１として分光測光を行う場合、波長抽出フィルター３２は、６５０ｎｍ以上の長波長の光を透過させるロングウェーブパスフィルターとし、波長抽出フィルター３３は、５５０ｎｍ以下の短波長の光を透過させるショートウェーブパスフィルターとするとよい。ここで、多色ルシフェラーゼの発光特性は、図２１に示す分光特性曲線３５Ｇ，３５Ｒで表され、波長抽出フィルター３２，３３の透過率特性は、それぞれ図２１に示す透過率曲線３２ＬＰ，３３ＳＰで表される。
この場合、フィルターユニット３１によって波長抽出フィルター３２を光軸ＯＡ２上に配設することによって、多色ルシフェラーゼから発せられる赤色光を測光することができ、波長抽出フィルター３３を光軸ＯＡ２上に配設することによって、多色ルシフェラーゼから発せられる緑色光を測光することができる。また、空穴３１ｃを光軸ＯＡ２上に配設して、標本１の明視野像を観察することができる。なお、波長抽出フィルター３２を配設した場合、分光特性曲線３５Ｇ，３５Ｒがクロスオーバーした波長域の一部が測光されるが、この光量は微量のため無視できる。
また、図２０に示すように、標本１から発せられる微弱光を検出するためのカメラＣ１と、標本１の明視野像を撮像するためのカメラＣ２とをスライダー等によって切り替えられるようにして、標本１の明視野像をカラー撮像できるようにしてもよい。カメラＣ２は、たとえば、ＣＣＤ３４ａ〜３４ｃを有する３板式のカラーＣＣＤカメラであり、各ＣＣＤ３４ａ〜３４ｃは、ＣＣＤ３よりも画素が小さく高精細なＣＣＤとするとよい。また、カメラＣ２は、高精細なモノクロＣＣＤを備えるモノクロＣＣＤカメラとしてもよい。
図２２は、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置に、カメラＣ１とともに分光測光用のカメラＣ３を備えた場合の要部構成を示す模式図である。図２２に示すように、この微弱光標本撮像装置は、対物レンズ６と結像レンズ７との間に波長抽出フィルター３２，３３およびダイクロイックミラー３５を一体に有した分光キューブ３６を備えるとともに、標本１から発しダイクロイックミラー３５で反射した微弱光を開口数ＮＡiでテレセントリックに結像する結像レンズ３７と、カメラＣ１と同様の特性を有するカメラＣ３とを備える。ここで、ダイクロイックミラー３５は、図２１に示した特性曲線３５Ｇ，３５Ｒの交点に対応する約６００ｎｍの波長を透過および反射の反転波長とし、この反転波長以上の波長を透過するとともに反転波長より短い波長を反射する。
図２２に示す微弱光標本撮像装置では、たとえば、図２１の特性曲線３５Ｇ，３５Ｒに示した発光特性を有する多色ルシフェラーゼを標本１として観察すると、カメラＣ１によって多色ルシフェラーゼから発せられる赤色光を測光することができるとともに、カメラＣ３によって多色ルシフェラーゼから発せられる緑色光を同時に測光することができる。なお、カメラＣ１，Ｃ３および結像レンズ７，３７の特性の個体差に起因する撮像倍率等の差は、あらかじめキャリブレーションして取り除くことが望ましい。
なお、分光キューブ３６は、対物レンズ６と結像レンズ７との間の光軸ＯＡ２上に挿脱可能に配置するとよい。また、分光キューブ３６とともに、分光特性等の光学特性が異なる複数の交換用分光キューブを一体に保持し、このうち１つの分光キューブを選択的に対物レンズ６と結像レンズ７との間に配置する分光キューブ切替装置を備えるようにしてもよい。さらに、分光キューブ切替装置は、ダイクロイックミラーおよび波長抽出フィルターを個別に交換できるようにしてもよい。
図２３は、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置に、カメラＣ１とともに明視野像観察用のカメラＣ４を備えた場合の要部構成を示す模式図である。図２３に示すように、この微弱光標本撮像装置は、ミラー３８、結像レンズ３７、カメラＣ４および吸収フィルター２２を備える。吸収フィルター２２は、スライダー等の切替装置３９によって、ミラー３８と結像レンズ７との間の光軸ＯＡ２上に挿脱可能に配置される。ミラー３８は、図示しない挿脱手段によって、対物レンズ６と結像レンズ７との間の光軸ＯＡ２上に挿脱可能に配置され、光軸ＯＡ２上に配置された場合、標本１からの光を結像レンズ３７に向けて反射する。なお、標本１は、ミラー３８が光軸ＯＡ２上に配置された場合、照明ファイバー１５によって明視野照明される。
カメラＣ４は、たとえば、ＣＣＤ３よりも画素が小さく高精細なＣＣＤを有したモノクロＣＣＤカメラであり、ミラー３８が光軸ＯＡ２上に配置された場合、標本１の明視野像を撮像する。一方、ミラー３８が光軸ＯＡ２上に配置されない場合には、カメラＣ１が標本１の自己発光による像を撮像する。このとき、吸収フィルター２２および切替装置３９を図２０に示したフィルターユニット３１に替えて、標本１からの微弱光を分光測光するようにしてもよい。なお、カメラＣ４は、３板式のカラーＣＣＤとしてもよい。
一般に、カメラＣ１に用いる高感度のクールドＣＣＤカメラは、筐体が大きく、たとえば図２０に示すようなカメラの交換は困難であるが、図２３に示す微弱光標本撮像装置では、ミラー３８を光軸ＯＡ２上に挿脱することによって、使用するカメラを容易に切り替えることが可能であり、標本１の明視野像および自己発光による像の撮像を容易に切り替えることができる。
なお、図２２および図２３に示した微弱光標本撮像装置では、カメラＣ１と、カメラＣ３またはカメラＣ４との位置合わせ、つまり各カメラで撮像する画像の中心を一致させる芯だしを行うため、結像レンズ７またはカメラＣ１を光軸ＯＡ２に略直交する方向に移動させる位置調整機構を備えることが望ましい。あるいは、図２２に示した微弱光標本撮像装置では、結像レンズ３７またはカメラＣ３をその光軸に略垂直な方向に移動させるようにしてもよく、図２３に示した微弱光標本撮像装置では、結像レンズ３７またはカメラＣ４をその光軸に略垂直な方向に移動させるようにしてもよい。
このように、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置では、対物レンズ６と結像レンズ７とからなる結像光学系を無限遠補正系としているため、対物レンズ６と結像レンズ７との間に各種光学素子を配置して、この微弱光標本撮像装置を多機能化することができる。
一方、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置は、たとえば図２４に示すように、外部からの光を遮断するチャンバー等の遮光装置内に配置することによって、外部の光の影響を受けることなく精度よく安定して微弱光を検出することができ、標本１の自己発光による像を鮮明に撮像することができる。ここで、図２４に示す遮光装置は、ベース４１、囲い４２および蓋４３によって暗室を形成し、この暗室内でベース４１上に微弱光標本撮像装置を備えている。この遮光装置では、ノブ４５を持ち上げることによってヒンジ部４４を中心に蓋４３を開扉し、標本１を交換することができる。
また、図２４に示すように、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置を遮光装置内に配設した場合、キーボード、マウス等の入力装置４７を有したコンピュータ等の制御装置４６によって、この微弱光標本撮像装置を遮光装置の外部から遠隔操作および自動制御できるようにするとよく、特に、標本１に対する焦点合わせおよび位置合わせ動作、カメラＣ１等の撮像動作、照明ファイバー１５による照明光の調光などを自動制御できるようにするとよい。
ここで、標本１に対する位置合わせとは、対物レンズ６および結像レンズ７からなる結像光学系、カメラＣ１および標本１を保持する試料台１３の少なくとも１つを光軸ＯＡ２に略直交する方向に移動させて、対物レンズ６の視野内に標本１を配設する処理である。
また、制御装置４６は、図２４に示すように、表示装置４８を備え、標本１の明視野像と自己発光による像とに対応する画像を重ね合わせて表示できるようにするとよい。さらに、制御装置４６は、これらの画像を保存するメモリー等の記憶部を備えるとよい。
一方、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像装置は、試料台１３に替えて、たとえば図２５に示すように、シャーレ５１、区画５２および透明板５３からなる収容手段としての密閉容器を備え、シャーレ５１上に標本１を保持するようにしてもよい。ここで、この密閉容器は、図示しない空調装置によって生成される定温低湿のＣＯ2を容器内に給気する給気パイプ５４と、容器内のＣＯ2を排気する排気パイプ５５とを備え、容器内の温度、湿度、気圧およびＣＯ2濃度の少なくとも１つを調整できるようにしている。なお、ＣＯ２を給排気する替わりに、この密閉容器の内部にヒートシート等を設けて電気的に容器内の温度調整等を行うようにしてもよい。
ここで、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置に適用して好適な各部構成を系統的に図２６に示す。図２６に示すように、対物レンズ６には、「Ｏｉｌ，４０倍，ＮＡ１．４，ｆ５ｍｍ」の仕様である対物レンズ６−１をはじめとして、「２０倍，ＮＡ０．８，ｆ１０ｍｍ」の仕様である対物レンズ６−２と、標本１の全体を観察できる「５倍，ＮＡ０．１５，ｆ４０ｍｍ」の仕様である対物レンズ６−３を用いるとよい。これらの対物レンズ６−１〜６−３には、一般に市販されている瞳位置が互いにほぼ等しい視野数２４程度で設計された顕微鏡用対物レンズを使用することができる。また、観察視野を大きくとれる「Ｏｉｌ，２０倍，ＮＡ１．４，ｆ１０ｍｍ」の仕様である対物レンズ６を使用してもよい。ただし、この場合、対物レンズ６の射出瞳径が２８ｍｍに拡大し、対物レンズ６とともに結像レンズ７やこれらのレンズ間に配置する光学素子の径が拡大し、一般の顕微鏡で使用される光学ユニット、光学素子等は使用できなくなる。なお、対物レンズ６に開口径が可変の可変明るさ絞りを備え、結像レンズ７の開口数ＮＡiを微調整できるようにし、透過明視野観察に使用してもよい。
結像レンズ７には、図２６に示すように、「ＮＡ０．３５，ｆ２０ｍｍ（４０倍対物レンズ使用時の総合倍率４倍、実視野０．６ｍｍ、視野数２．４）」の仕様である結像レンズ７−１、「ＮＡ０．２，ｆ４０ｍｍ（４０倍対物レンズ使用時の総合倍率８倍、実視野０．６ｍｍ、視野数４．８）」の仕様である結像レンズ７−２等を用いるとよい。また、明視野観察用に「ＮＡ０．０３，ｆ１００ｍｍ（５倍対物レンズ使用時の総合倍率２．５倍、実視野６ｍｍ、視野数１５）」の仕様である結像レンズ７−３を使用するとよい。
ここで、以上に説明した対物レンズ６と結像レンズ７との組み合わせの光学仕様とその特長とを、図２７にまとめて示す。なお、図２７中に示す「明るさ」は、Ｄｒｙ２０倍の対物レンズを用い、総合倍率を４倍とした場合の明るさを基準とした指標値である。
対物レンズ６と結像レンズ７との間に配置する中間鏡筒には、図１７に示した蛍光キューブ２４等を備える落射蛍光装置、図２０に示したフィルターユニット３１、図２２に示した分光キューブ３６等を備える分光ユニット、および図２３に示したミラー３８等を備えるミラー切換明視野撮像ユニットをそれぞれ用いるとよい。
標本１の像を撮像するカメラには、微弱光である標本１の自己発光による像を撮像するカメラとして、高感度のクールドモノクロＣＣＤカメラであるカメラＣ１，Ｃ３を用い、標本１の明視野像を撮像するカメラとして、３板式のカラーＣＣＤカメラであるカメラＣ２または高精細なモノクロＣＣＤカメラであるカメラＣ４を用いるとよい。なお、カメラＣ１，Ｃ３の画素の大きさは、６〜９μｍ角程度として、結像レンズ７によって形成されるエアリーディスクの大きさに合わせて選択するとよい。
標本１を照明する照明手段には、白色光源等から照明光を導光する照明ファイバー１５の他に、図２６に示すように、白色ＬＥＤと単レンズとを組み合わせてクリティカル照明を実現する照明装置や、コンデンサーレンズを用いたケーラー照明装置である顕微鏡用ＵＣＤなどを用いてもよい。また、微分干渉観察や位相差観察を行う照明装置を備えてもよい。ただし、この場合、専用のリングストップ、プリズム、対物レンズ等を備える必要がある。
なお、この実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置は、ここまで倒立型として説明してきたが、正立型としてもよい。
また、上述した実施の形態１および実施の形態２にかかる微弱光標本撮像ユニットでは、撮像手段としてＣＣＤを用いるようにしたが、これに限定されず、ＣＭＯＳ等の撮像素子であって、０℃程度の冷却ＣＣＤと同等の撮像感度を有する撮像素子であってもよい。
以上のように、本発明にかかる微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置は、微弱光を発する標本を撮像する微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置に有用であり、微弱な蛍光を発する標本、生体発光をする標本等の微小な発光源を有する標本を撮像する微弱光標本撮像ユニットおよび微弱光標本撮像装置に適している。

Claims (30)

  1. 微弱光である発光を発する点光源を有した細胞を標本として、該標本の標本像を結像する結像光学系と、入射する光を受光する複数の画素を有し、前記標本像に対応する画像を撮像する撮像手段とを備える撮像ユニットであって、
    前記結像光学系は、該結像光学系の標本像側にテレセントリックであるとともに、前記点光源からの微弱光を集光して前記画素に略同じ大きさ、あるいは、前記画素より小さいエアリーディスクを形成することを特徴とする微弱光標本撮像ユニット。
  2. 前記結像光学系は、
    該結像光学系の標本側にテレセントリックであるとともに、前記点光源からの微弱光を平行光束に変換する対物レンズと、
    前記対物レンズによって変換された平行光束を集光して前記エアリーディスクを形成する結像レンズと、
    を備えたことを特徴とする請求項１に記載の微弱光標本撮像ユニット。
  3. 前記対物レンズは、焦点距離および標本側開口数の少なくとも一方が該対物レンズと異なる交換対物レンズと交換可能に配置されることを特徴とする請求項２に記載の微弱光標本撮像ユニット。
  4. 前記対物レンズは、該対物レンズを配置する際の基準となる対物配置基準面を有し、該対物配置基準面から標本側焦点および射出瞳までの各距離が該対物レンズと略等しい前記交換対物レンズと交換可能に配置されることを特徴とする請求項３に記載の微弱光標本撮像ユニット。
  5. 前記対物レンズは、開口径が可変な可変明るさ絞りを備えることを特徴とする請求項２〜４のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像ユニット。
  6. 前記結像レンズは、焦点距離および標本像側開口数の少なくとも一方が該結像レンズと異なる交換結像レンズと交換可能に配置されることを特徴とする請求項２〜５のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像ユニット。
  7. 前記結像レンズは、該結像レンズを配置する際の基準となる結像配置基準面を有し、該結像配置基準面から標本像側焦点および射出瞳までの各距離が該結像レンズと略等しい前記交換結像レンズと交換可能に配置されることを特徴とする請求項６に記載の微弱光標本撮像ユニット。
  8. 前記結像レンズは、前記対物レンズの射出瞳径と同等以上の大きさの入射瞳径を有することを特徴とする請求項２〜７のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像ユニット。
  9. 前記撮像手段は、所定の撮像特性が該撮像手段と異なる交換撮像手段と交換可能に配置されることを特徴とする請求項２〜８のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像ユニット。
  10. 前記結像光学系の結像倍率は、略２倍以上、略８倍以下であることを特徴とする請求項１〜９のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像ユニット。
  11. 請求項１に記載の微弱光標本撮像ユニットと、
    前記標本を保持する標本保持手段と、
    前記標本を照明する照明手段と、
    前記結像光学系、前記撮像手段および前記標本保持手段の少なくとも１つを前記微弱光標本撮像ユニットの光軸方向に移動させて、前記微弱光標本撮像ユニットの前記標本に対する焦点合わせを行う焦点調整手段と、
    を備え、
    前記結像光学系は、前記照明手段によって照射された照射光であって前記標本を透過または反射した照射光を集光して前記標本の明視野標本像を結像し、
    前記焦点調整手段は、前記明視野標本像が鮮明に結像されるように焦点合わせを行うことを特徴とする微弱光標本撮像装置。
  12. 請求項２〜９のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像ユニットと、
    前記標本を保持する標本保持手段と、
    前記標本を照明する照明手段と、
    前記対物レンズ、前記結像レンズ、前記撮像手段および前記標本保持手段の少なくとも１つを前記微弱光標本撮像ユニットの光軸方向に移動させて、前記微弱光標本撮像ユニットの前記標本に対する焦点合わせを行う焦点調整手段と、
    を備え、
    前記結像光学系は、前記照明手段によって照射された照射光であって前記標本を透過または反射した照射光を集光して前記標本の明視野標本像を結像し、
    前記焦点調整手段は、前記明視野標本像が鮮明に結像されるように焦点合わせを行うことを特徴とする微弱光標本撮像装置。
  13. 前記標本を励起する励起光を選択的に透過させる励起光透過フィルター、前記励起光によって励起された標本から発せられる蛍光を選択的に透過させる蛍光透過フィルターおよび前記励起光を反射し前記蛍光を透過させるダイクロイックミラーを有し、前記対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置される蛍光ユニットと、
    前記励起光を発する励起光源を有し、該励起光源から発せられた励起光を前記ダイクロイックミラーによって反射させ前記標本に照射させる蛍光照射手段と、
    を備え、
    前記結像光学系は、前記微弱光として前記蛍光を集光し、前記エアリーディスクを形成することを特徴とする請求項１２に記載の微弱光標本撮像装置。
  14. 前記励起光および前記蛍光の少なくとも一方に対する光学特性が互いに異なる複数の前記蛍光ユニットを保持し、該保持した複数の前記蛍光ユニットのうち１つの蛍光ユニットを選択的に前記対物レンズと前記結像レンズとの間に配置する蛍光切替手段を備えたことを特徴とする請求項１３に記載の微弱光標本撮像装置。
  15. 前記蛍光照射手段は、前記励起光を略平行光束として前記標本に照射させることを特徴とする請求項１３または１４に記載の微弱光標本撮像装置。
  16. 前記対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記微弱光から所定の波長域の光を抽出する波長抽出フィルターを備えたことを特徴とする請求項１２に記載の微弱光標本撮像装置。
  17. 抽出する波長域が互いに異なる複数の前記波長抽出フィルターを保持し、該保持した複数の波長抽出フィルターのうち少なくとも１つの波長抽出フィルターを、フィルター非配置を含めて選択的に前記対物レンズと前記結像レンズとの間に配置するフィルター切替手段を備えたことを特徴とする請求項１６に記載の微弱光標本撮像装置。
  18. 前記対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記微弱光のうち所定の第１波長域の光を透過させるとともに該第１波長域と異なる第２波長域の光を反射するダイクロイックミラーと、
    前記ダイクロイックミラーによって反射された前記第２波長域の光を集光する反射側結像レンズと、
    複数の画素を有し、前記反射側結像レンズによって集光された前記第２波長域の光を受光する反射側撮像手段と、
    を備え、
    前記反射側結像レンズは、前記反射側撮像手段が有する画素内の受光領域に略内接する大きさのエアリーディスクを形成することを特徴とする請求項１２に記載の微弱光標本撮像装置。
  19. 前記第１波長域および前記第２波長域の少なくとも一方が互いに異なる複数の前記ダイクロイックミラーを保持し、該保持した複数のダイクロイックミラーのうち１つのダイクロイックミラーを選択的に前記対物レンズと前記結像レンズとの間に配置するダイクロイックミラー切替手段を備えたことを特徴とする請求項１８に記載の微弱光標本撮像装置。
  20. 前記ダイクロイックミラーと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記第１波長域の光から所定の第３波長域の光を抽出する透過側波長抽出フィルターと、
    前記ダイクロイックミラーと前記反射側結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記第２波長域の光から所定の第４波長域の光を抽出する反射側波長抽出フィルターと、
    を備えたことを特徴とする請求項１８または１９に記載の微弱光標本撮像装置。
  21. 前記結像光学系または前記撮像手段を前記微弱光標本撮像ユニットの光軸に略直交する方向に移動させて、前記撮像手段と前記反射側撮像手段との位置合わせを行う位置調整手段を備えたことを特徴とする請求項１８〜２０のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像装置。
  22. 前記対物レンズと前記結像レンズとの間に挿脱可能に配置され、前記標本を透過または反射した前記照明光を反射するミラーと、
    前記ミラーによって反射された照射光を集光して前記標本の明視野像を結像する明視野結像レンズと、
    前記明視野結像レンズによって結像された明視野像に対応する明視野画像を撮像する明視野撮像手段と、
    を備えたことを特徴とする請求項１２に記載の微弱光標本撮像装置。
  23. 前記結像光学系または前記撮像手段を前記微弱光標本撮像ユニットの光軸に略直交する方向に移動させて、前記撮像手段と前記明視野撮像手段との位置合わせを行う位置調整手段を備えたことを特徴とする請求項２２に記載の微弱光標本撮像装置。
  24. 前記焦点調整手段による焦点合わせおよび前記位置調整手段による位置合せの少なくとも一方の自動制御を行う調整制御手段を備えたことを特徴とする請求項２１または２３に記載の微弱光標本撮像装置。
  25. 前記標本保持手段は、
    前記標本を内部に保持する収容手段と、
    前記収容手段の内部の環境条件を調整する環境調整手段と、
    を備えたことを特徴とする請求項１１〜２４のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像装置。
  26. 前記環境条件は、前記収容手段の内部の温度、湿度、気圧および成分濃度の少なくとも１つに対応する条件であることを特徴とする請求項２５に記載の微弱光標本撮像装置。
  27. 当該微弱光標本撮像装置は、外部からの光を遮断する遮光手段内に配置されることを特徴とする請求項１１〜２６のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像装置。
  28. 前記撮像手段が撮像した画像であって前記明視野標本像と前記微弱光による前記標本像とのそれぞれに対応する画像を重ね合わせて表示する表示手段を備えたことを特徴とする請求項１１〜２７のいずれか一つに記載の微弱光標本撮像装置。
  29. 請求項１〜１０のいずれかに一つに記載の微弱光標本撮像ユニットを用いて前記撮像手段から得られた画像に基づいて、前記微弱光である発光の光量を得ることを特徴とする微弱光標本撮像方法。
  30. 前記標本を照明光により透過または反射させて明視野標本像を取得し、前記微弱光による標本像と前記明視野標本像とを重ね合わせることにより前記微弱光である発光を発する細胞を特定することを特徴とする請求項２９に記載の微弱光標本撮像方法。
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