JP6375239B2 - レーザ顕微鏡装置 - Google Patents

Description

本発明は、レーザ顕微鏡装置に関するものである。

従来、光検出器としてＰＭＴ(光電子増倍管)を採用したレーザ顕微鏡装置が知られている（例えば、非特許文献１参照。）。光検出器としては、ＰＭＴの他に、ＭＰＰＣ（Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｘｅｌ Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ)、ＳｉＰＭ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）、マルチピクセル型アバランシェフォトダイオードのようなＰＰＤ（Ｐｉｘｅｌａｔｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、マルチピクセル型のフォトン検出器）が知られている。

光を検出するとその光の強度に関係なく一定強度の信号を出力する動作モード、すなわち、ガイガーモードでＰＰＤを使用すると、１フォトンレベルの微弱光を検出することが可能になる。ガイガーモードでＰＰＤを使用した場合において、単位時間当たりに検出することができるフォトン数は１ピクセル当たり１フォトン程度であるが、ＰＰＤはマルチピクセルであるから、ＰＰＤへの入射フォトン数が多くなっても、それに応じたフォトン数を検出することができる。

原口徳子，木村宏，平岡泰編集、「講義と実習 生細胞蛍光イメージング−阪大・北大 顕微鏡コースブック」、共立出版、ｐ．１５１−１５２

ＰＰＤのダイナミックレンジの上限（飽和レベル）は、ＰＰＤが有する全ピクセルの内、光が入射するピクセルの数に依存し、光が入射するピクセルの数が多い程、飽和レベルが高くなる。すなわち、ＰＰＤの飽和レベルはＰＰＤに入射する光のビーム径に依存し、ビーム径が大きい程、ＰＰＤの飽和レベルが高くなる。ビーム径は、対物レンズの射出ＮＡ等の観察条件に応じて変化する。したがって、例えば、ユーザが対物レンズを射出ＮＡが大きいものから小さいものへ切り替えたときに、ＰＰＤの飽和レベルが低下してしまう。しかしながら、観察条件の変更に伴って変化するＰＰＤの飽和レベルをユーザが判断することは難しいという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、観察条件の変更に伴って変化する光検出器の飽和レベルをユーザが容易に判断することができるレーザ顕微鏡装置を提供することを目的とする。

上記目的を達成するため、本発明は以下の手段を提供する。
本発明は、レーザ光を標本上において走査する走査部と、前記レーザ光の照射によって標本において発生した観察光を集光する対物レンズと、単一のフォトンを検出可能な複数の検出要素が平面上に配列してなる受光面を有し、前記対物レンズによって集光されて前記受光面に入射した前記観察光を受光し、受光した前記観察光の光量に応じた強度を有する強度信号を出力する光検出部と、該光検出部から出力された前記強度信号の強度と前記走査部による前記レーザ光の走査位置とに基づいて前記標本の画像を生成する画像生成部と、該画像生成部による前記画像の生成に使用される前記強度信号に所定の閾値以上の強度を有する強度信号が含まれる場合に、前記所定の閾値以上の強度を有する前記強度信号の存在をユーザに認識させる認識手段とを備え、前記所定の閾値が、前記受光面に入射する前記観察光のビーム径に応じて設定されるレーザ顕微鏡装置を提供する。

本発明によれば、走査部によって標本上でレーザ光が走査されることによって標本において発生した観察光は、対物レンズによって集光され、光検出部によって検出され、光検出部から観察光の強度に対応する強度信号が出力される。光検出部から出力された強度信号は、画像生成部において、走査部によるレーザ光の標本上における走査位置と対応付けられることによって、画像化される。

この場合に、光検出部においては、１フォトンレベルで光を検出する検出要素が複数個用いられることによって、観察光全体の強度が検出される。このような光検出部の飽和レベル（光検出部が検出可能な光の最大強度）は、観察条件毎に決まり、受光面への観察光の入射ビーム径に依存する。一方、入射ビーム径に応じて、飽和レベルに相当する所定の閾値が設定されるが、該所定の閾値は、光検出部の飽和レベルが変化したときに該飽和レベルと連動して変化する。認識手段は、画像内に飽和レベル相当の強度信号が存在する場合に作動することによって、その旨をユーザに認識させる。このように、認識手段の作動の基準として、光検出部の飽和レベルと連動する所定の閾値を用いることによって、観察条件の変更に伴って変化する光検出部の飽和レベルを認識手段の作動に基づいてユーザが容易に判断することができる。

上記発明においては、前記所定の閾値が、前記対物レンズの射出ＮＡに基づいて設定されてもよい。
受光面へ入射する観察光のビーム径は、対物レンズの射出ＮＡに依存する。したがって、対物レンズの射出ＮＡを用いて光検出部の飽和レベルを算定することができる。

上記発明においては、前記対物レンズと前記光検出部との間に設けられ、前記対物レンズの焦点と光学的に共役な位置に配置されたピンホールを有するピンホール部材を備え、前記所定の閾値が、前記ピンホールの孔径に基づいて設定されてもよい。
ピンホールを通過した観察光を光検出部によって検出する共焦点顕微鏡の構成において、受光面へ入射する観察光のビーム径は、ピンホールの孔径に依存する。したがって、ピンホールの孔径を用いて光検出部の飽和レベルを算定することができる。

上記発明においては、前記対物レンズと前記光検出部との間に設けられ、前記対物レンズによって集光された観察光を波長毎に分離してスペクトル列を生成する回折格子と、該回折格子によって生成された前記スペクトル列の配列方向に幅寸法を有し、前記スペクトル列の内の一部のみを通過させるスリットを有するスリット部材とを備え、前記所定の閾値が、前記スリットの幅寸法に基づいて設定されてもよい。
観察光を回折格子によって分光してスリットを通過した一部の波長の光のみを検出する構成において、受光面へ入射する観察光のビーム径は、スリットの幅寸法に依存する。したがって、スリットの幅寸法を用いて光検出部の飽和レベルを算定することができる。

上記発明においては、前記標本の観察条件が設定される条件設定手段と、前記標本の観察条件と前記所定の閾値とが対応付けられたテーブルを記憶し、前記条件設定手段に設定された観察条件と前記テーブルとに基づいて、前記認識手段によって使用される前記所定の閾値を設定する閾値設定手段とを備えていてもよい。あるいは、上記発明においては、前記標本の観察条件を設定する条件設定手段と、前記標本の観察条件と前記所定の閾値とを対応付けた関数を記憶し、前記条件設定手段によって設定された観察条件に基づいて前記関数から前記所定の閾値を算出する閾値設定手段とを備えていてもよい。
このようにすることで、観察条件に最適な所定の閾値を自動的に設定することができる。

上記発明においては、前記光検出部と前記画像生成部との間に設けられ、前記光検出部から出力された前記強度信号を増幅する増幅手段を備え、前記所定の閾値が、前記増幅手段による前記強度信号の増幅率に応じて設定されてもよい。
このようにすることで、増幅手段によって増幅されて画像生成部において画像生成に使用される強度信号と、所定の閾値との比較を容易にすることができる。

上記発明においては、前記所定の閾値は、前記受光面に入射する前記観察光のビーム径に基づいて決まる、前記光検出部から出力される前記強度信号の強度が取り得る範囲の最大値に応じて設定されてもよい。
このようにすることで、所定の閾値を、光検出部の飽和レベルに相当する値に設定することができる。光検出部の飽和レベルは、走査部によるレーザ光の走査速度に応じて変化するので、前記所定の閾値は、前記走査部による前記レーザ光の走査速度に応じて設定されてもよい。

上記発明においては、前記認識手段が、警告表示、警告光および警告音の内、少なくとも１つを出力する報知部を備えていてもよい。
このようにすることで、強度信号の強度が所定の閾値以上である飽和画素の存在を、視覚または聴覚を介してユーザに確実に認識させることができる。

上記発明においては、前記認識手段が、前記画像生成部によって生成される前記画像において、前記強度信号の強度が前記所定の閾値以上である画素を他の画素に対して強調表示させてもよい。
このようにすることで、飽和画素が画像に存在する場合に当該飽和画素が画像内において強調表示されるので、ユーザは、観察している画像から容易に飽和画素の存在を認識することができる。

上記発明においては、前記認識手段が、前記所定の閾値と等しい前記強度信号の強度が前記画像の各画素が取り得る階調値の範囲の最大値に相当するように、前記画像生成部によって生成される前記画像の階調を変更してもよい。
このようにすることで、飽和画素が存在する場合には当該飽和画素が画像内において最大階調値で表示されるので、ユーザは、観察している画像から容易に飽和画素の存在を認識することができる。さらに、所定の閾値の変化に伴う画像内の飽和画素の明るさの変化が抑制されるので、ユーザは、所定の閾値の変動を必要以上に気にすることなく画像を観察することができる。

上記発明においては、前記光検出部と前記画像生成部との間に設けられ、前記強度信号を増幅する増幅手段を備え、前記認識手段は、前記強度信号の強度が前記所定の閾値以上であるときに、前記所定の閾値と等しい前記強度信号の強度が前記画像の各画素が取り得る階調値の範囲の最大値に相当するように、前記増幅手段による前記強度信号の増幅率を調整してもよい。
このようにすることで、飽和画素が存在する場合には当該飽和画素が画像内において最大階調値で表示されるので、ユーザは、観察している画像から容易に飽和画素の存在を認識することができる。さらに、所定の閾値の変化に伴う画像内の飽和画素の明るさの変化が抑制されるので、ユーザは、所定の閾値の変動を必要以上に気にすることなく画像を観察することができる。

上記発明においては、前記光検出部への前記観察光の入射光量を低減させる入射光量低減手段と、前記強度信号の強度が前記所定の閾値以上であるときに、前記入射光量低減手段の作動を許可する入射光量低減許可手段とを備えていてもよい。
このようにすることで、観察光に対して光検出部が飽和状態であるときに、入射光量低減手段の作動によって、光検出部への観察光の入射光量を低減させることによって、強い観察光の強度も正確に検出することができる。

上記発明においては、前記入射光量低減手段が、前記標本に照射される前記レーザ光を減弱させてもよい。
このようにすることで、標本に照射されるレーザ光の減弱に伴って標本から発せられる観察光を減弱させることによって、光検出部への観察光の入射光量を簡便な構成で低減させることができる。

上記発明においては、前記入射光量低減手段が、前記対物レンズと前記光検出部との間の光路に挿脱可能に設けられた、または、該光路に前記観察光の光量の低減量を変更可能に設けられたＮＤフィルタを備えていてもよい。
あるいは、上記発明においては、前記入射光量低減手段が、前記対物レンズと前記光検出部との間の光路に挿脱可能に設けられ、前記観察光の一部のみを透過させ、他の部分を反射する部分反射ミラーを備えていてもよい。
このようにすることで、ＮＤフィルタまたは部分反射ミラーを前記光路に挿入するだけ、または、ＮＤフィルタによるレーザ光の光量の低減量を変更するだけの簡単な構成と制御のみで、光検出部への観察光の入射光量を低減させることができる。

上記発明においては、前記部分反射ミラーによって反射された光を吸収するビームダンパを備えていてもよい。
上記発明においては、前記部分反射ミラーによって反射された光を検出する副光検出部を備え、前記光検出部と前記副光検出部とが、同時に前記観察光を検出し、前記画像生成部が、前記光検出部から出力された強度信号と、前記副光検出部から出力された強度信号とを平均化した信号に基づいて前記画像を生成してもよい。
このようにすることで、画像のＳＮ比を向上することができる。

上記発明においては、前記光検出部が、前記検出要素に入射した前記観察光を増倍する増倍機能を有し、前記所定の閾値以上の強度を有する前記強度信号が含まれる場合に、前記光検出部による前記観察光の増倍率の低減を許可する増倍率低減許可手段を備えていてもよい。
このようにすることで、観察光に対して光検出部が飽和状態となっているときに、観察光の増倍率を低減することによって、強い観察光に対する光検出部の感度を適正化することができる。

上記発明においては、前記光検出部が、所定の降伏電圧未満の電圧が印加されている状態で駆動するリニアモード、および、前記所定の降伏電圧以上の電圧が印加されている状態で駆動し、前記検出要素に入射した前記観察光を前記リニアモードよりも高い増倍率で増倍するガイガーモードで択一的に動作し、前記増倍率低減許可手段は、前記所定の閾値以上の強度を有する前記強度信号が含まれる場合に、前記ガイガーモードから前記リニアモードへの切り替えを許可してもよい。
このようにすることで、観察光に対して光検出部の感度が飽和状態となっているときに、観察光を高い増倍率で増倍する高感度のガイガーモードから、観察光を低倍率で増倍する低感度のリニアモードへ切り替えることによって、強い観察光に対する光検出部の感度を適正化することができる。

本発明によれば、観察条件の変更に伴って変化する光検出器の飽和レベルをユーザが容易に判断することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係るレーザ顕微鏡装置を示す概略構成図である。 対物レンズの射出ＮＡと、ＰＰＤへ入射する観察光のビーム径との関係を説明する、図１のレーザ顕微鏡装置の部分的な拡大図である。 ＰＰＤへの入射光量とＰＰＤから出力される強度信号との関係を表すグラフである。 図１のレーザ顕微鏡装置による、ＰＰＤの飽和状態の判定に係る処理を説明するフローチャートである。 本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置において、画像生成ソフトウェアが有するＬＵＴを示す図である。 図１のレーザ顕微鏡装置の第１の変形例の部分的な構成図である。 図６のレーザ顕微鏡において、ＰＰＤへの入射光量とＰＰＤから出力される強度信号との関係を表すグラフである。 図１のレーザ顕微鏡装置の第２の変形例の部分的な拡大図である。 図１のレーザ顕微鏡装置の第２の変形例の他の例を示す部分的な構成図である。 図１のレーザ顕微鏡装置の第３の変形例の部分的な拡大図である。 図１のレーザ顕微鏡装置の第３の変形例の他の例を示す部分的な拡大図である。

〔第１の実施形態〕
本発明の第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１について図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１は、図１に示されるように、顕微鏡本体２と、該顕微鏡本体２をユーザが操作するためのコンピュータ３と、顕微鏡本体２とコンピュータ３との間に接続され、コンピュータ３への入力に従って顕微鏡本体２を駆動制御する駆動制御部４とを備えている。

顕微鏡本体２は、レーザ光Ｌを出力するレーザ光源５と、レーザ光源５から出力されたレーザ光Ｌを２次元的に走査するＸＹガルバノミラー（走査部）６と、ＸＹガルバノミラー６によって走査されたレーザ光Ｌをリレーするリレー光学系７と、リレー光学系７によってリレーされたレーザ光Ｌを標本Ｓに照射し、標本Ｓから発せられる観察光Ｌ’（例えば、蛍光）を集光する対物レンズ８とを備えている。

さらに、顕微鏡本体２は、対物レンズ８によって集光されてレーザ光Ｌの光路を戻る観察光Ｌ’を分岐するダイクロイックミラー９と、ダイクロイックミラー９によって分岐された観察光Ｌ’を反射する反射ミラー１０と、反射ミラー１０によって反射された観察光Ｌ’を集光する集光レンズ１１と、集光レンズ１１によって集光された観察光Ｌ’の通過を制限するコンフォーカルアパーチャ（ピンホール部材）１２と、コンフォーカルアパーチャ１２を通過した観察光Ｌ’を略平行光束に変換するコリメートレンズ１３と、コリメートレンズ１３によって略平行光束に変換された観察光Ｌ’を検出するＰＰＤ（Ｐｉｘｅｌａｔｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、光検出部）１４とを備えている。

対物レンズ８は、ＮＡや倍率の異なる複数種類のものがレボルバ１５によって支持されている。レボルバ１５は、駆動制御部４の制御またはユーザの手動によって、いずれか１つの対物レンズ８をレーザ光Ｌの光路に挿入するようになっている。

ダイクロイックミラー９は、レーザ光源５からのレーザ光ＬをＸＹガルバノミラー６に向けて反射し、標本Ｓから対物レンズ８やＸＹガルバノミラー６等を介してレーザ光Ｌの光路を戻る観察光Ｌ’を反射ミラー１０に向けて透過させる。
コンフォーカルアパーチャ１２は、対物レンズ８の焦点と光学的に共役な位置に配置されたピンホール１２ａを有し、対物レンズ８の焦点位置からの観察光Ｌ’のみがピンホール１２ａを通過するようになっている。

ＰＰＤ１４は、例えば、ＭＰＰＣ（Ｍｕｌｔｉ−Ｐｉｘｅｌ Ｐｈｏｔｏｎ Ｃｏｕｎｔｅｒ）、ＳｉＰＭ（Ｓｉｌｉｃｏｎ Ｐｈｏｔｏｍｕｌｔｉｐｌｉｅｒ）、マルチピクセル型アバランシェフォトダイオード等の光検出器である。ＰＰＤ１４は、観察光Ｌ’を検出する複数のピクセル（検出要素、図示略）が２次元配列された受光面１４ａを有している。各ピクセルは、フォトン検出を行う単位である。

ＰＰＤ１４は、各ピクセルが入射光強度に関わらず一定強度のパルスを出力するガイガーモードで駆動するよう設定されている。ガイガーモードにおいて、ＰＰＤ１４の各ピクセルが単位時間当たりに検出するフォトン数は、１フォトン程度である。観察光Ｌ’を検出したピクセルはパルスを出力し、ＰＰＤ１４は、各ピクセルから出力されるパルスの和を強度信号として出力する。

ＰＰＤ１４の後段には、ＰＰＤ１４から出力された強度信号を増幅する増幅器（増幅手段）１６と、該増幅器１６によって増幅された強度信号の強度をデジタル値（強度信号値）に変換するＡＤ変換器（増幅手段）１７とが接続されている。ＡＤ変換器１７は、デジタル変換前に強度信号を増幅する増幅機能を有していてもよい。

コンピュータ３には、顕微鏡本体２の作動条件を設定するためのアプリケーションソフトウェア（駆動制御ソフトェア）３１と、顕微鏡本体２から受信した強度信号値から標本Ｓの画像を生成して表示するためのアプリケーションソフトウェア（画像生成ソフトウェア）３２とがインストールされている。駆動制御ソフトェア３１がコンピュータ３によって実行されることによって、顕微鏡本体２が駆動制御部４による駆動制御に従って作動し、画像生成ソフトウェア３２がコンピュータ３によって実行されることによって、画像が生成および表示されるようになっている。

駆動制御ソフトェア（閾値設定手段）３１は、コンピュータ３に接続されたマウスやキーボード等の任意の入力装置（図示略）を介してユーザが顕微鏡本体２による標本Ｓの観察条件を入力することによって、観察条件を設定することができるようになっている。観察条件には、標本Ｓの観察に使用される対物レンズ８の種類と、ＸＹガルバノミラー６によるレーザ光Ｌの走査速度と、増幅器１６のゲイン（増幅率）とが少なくとも含まれる。さらに、ＡＤ変換器１７のゲイン（増幅率）が観察条件に含まれてもよい。駆動制御ソフトェア３１に入力された観察条件は、コンピュータ３から駆動制御部４へ送信されるようになっている。コンピュータ３から観察条件を受信した駆動制御部４は、該観察条件に従って顕微鏡本体２を駆動制御するようになっている。

さらに、駆動制御ソフトェア（条件設定手段）３１は、設定された観察条件に基づいて、観察光Ｌ’の強度信号値に対する上限値（所定の閾値）を設定する。上限値の設定には、コンピュータ３に内蔵される記憶装置に記憶されたテーブルが使用される。テーブルには、対物レンズ８の射出ＮＡ、コンフォーカルアパーチャ１２のピンホール１２ａの孔径、および、ＸＹガルバノミラー６によるレーザ光Ｌの走査速度の組み合わせからなる観察条件毎に上限基準値が対応付けられている。駆動制御ソフトェア３１は、記憶装置からテーブルを読み出し、現在設定されている観察条件と対応する上限基準値をテーブルから選択する。次に、駆動制御ソフトェア３１は、選択した上限基準値に、増幅器１６およびＡＤ変換器１７のゲインをかけ算することによって上限基準値を補正し、得られた補正値を上限値に設定する。

ここで、上限値と、顕微鏡本体２による標本Ｓの観察条件と、ＰＰＤ１４の観察光Ｌ’に対する飽和レベルとの関係について説明する。
飽和レベルは、ＰＰＤ１４が検出可能な観察光Ｌ’の強度の最大値である。受光面１４ａへの観察光Ｌ’の入射光量がゼロから飽和レベルまでの範囲のときは、図３に示されるように、ＰＰＤ１４から出力される強度信号は入射光量に比例する。しかし、受光面１４ａへの観察光Ｌ’の入射光量が飽和レベル以上となると、ＰＰＤ１４から出力される強度信号は飽和して入射光量に依らずに一定となる。

下式（１）は、ＰＰＤ１４において、入射光によって励起されてフォトン検出信号を出力するピクセルの数Ｎ_{ｆｉｒｅｄ}を表している。式（１）において、Ｎ_{ｔｏｔａｌ}はＰＰＤ１４の全ピクセルの内、観察光Ｌ’が入射する領域内のピクセルの総数、Ｎ_{ｐｈｏｔｏｎ}は入射フォトン数、Ｐ_ｗはレーザ光Ｌの走査速度に依存して決まる受光面１４ａへの観察光Ｌ’の入射時間（秒）、ｔ_ｄはピクセルの不感時間（秒）であり、Ｐ_ｗ＞ｔ_ｄである。Ｎ_{ｆｉｒｅｄ}は、ＰＰＤ１４の飽和レベルに相当する実効的なダイナミックレンジを表すと考えることができる。式（１）から分かるように、Ｎ_{ｆｉｒｅｄ}、すなわちＰＰＤ１４の実効的なダイナミックレンジは、Ｎ_{ｔｏｔａｌ}、すなわち、受光面１４ａに入射する観察光Ｌ’のビーム径に依存する。

図２に示されるように、射出ＮＡの大きな対物レンズ８を使用する場合、受光面１４ａに入射する観察光Ｌ’のビーム径が大きくなるため、Ｎ_{ｔｏｔａｌ}が大きくなり、ＰＰＤ１４の飽和レベルが大きくなる。一方、射出ＮＡの小さな対物レンズ８を使用する場合、受光面１４ａに入射する観察光Ｌ’のビーム径が小さくなるため、Ｎ_{ｔｏｔａｌ}が小さくなり、ＰＰＤ１４の飽和レベルが小さくなる。
受光面１４ａに入射する観察光Ｌ’のビーム径は、コンフォーカルアパーチャ１２のピンホール１２ａの孔径にも影響される。したがって、ＰＰＤ１４の飽和レベルは、対物レンズ８の射出ＮＡの他に、コンフォーカルアパーチャ１２のピンホール１２ａの孔径にも依存する。さらに、ＰＰＤ１４の飽和レベルは、ＸＹガルバノミラー６によるレーザ光Ｌの走査速度にも依存する。このように、ＰＰＤ１４の飽和レベルは、観察条件毎に異なる。

ここで、テーブルにおいて観察条件毎に対応付けられた上限基準値は、各観察条件の下において飽和レベル相当の観察光Ｌ’が受光面１４ａに入射したときにＰＰＤ１４から出力される強度信号の強度に相当する。上限基準値をゲインで補正して算出される上限値は、各観察条件の下において飽和レベル相当の観察光Ｌ’が受光面１４ａに入射したときに、ＡＤ変換器１７から出力される強度信号値に相当する。したがって、強度信号値が上限値以上である場合には、観察光Ｌ’の強度がＰＰＤ１４の飽和レベルを超えていることを意味する。

画像生成ソフトウェア３２は、強度信号値とＸＹガルバノミラー６によるレーザ光Ｌの走査位置情報とを対応付けることによって、強度信号値を画素の階調値とする標本Ｓの２次元的な画像を生成する。画像生成に必要な強度信号値とＸＹガルバノミラー６によるレーザ光Ｌの走査位置情報とは、コンピュータ３によって駆動制御部４から取得される。画像生成ソフトウェア３２は、生成された画像をコンピュータ３のディスプレイ３３に表示させる。

さらに、画像生成ソフトウェア３２は、駆動制御ソフトェア３１によって設定された上限値を駆動制御ソフトェア３１から取得する。画像生成ソフトウェア３２は、１フレームの画像の全画素の階調値（すなわち、強度信号値）を上限値と比較する。画像生成ソフトウェア３２は、上限値以上の階調値を有する画素（以下、「飽和画素」という。）の数が所定の数Ｎ以上であるときには、コンピュータ３から駆動制御部４へ状態異常信号を送信させる。一方、飽和画素の数が所定の数Ｎ未満であるときには、画像生成ソフトウェア３２は、コンピュータ３から駆動制御部４への状態異常信号を送信させない。状態異常信号を受信した駆動制御部４は、当該状態異常信号を報知部へ送信する。

所定の数Ｎは、画像生成ソフトウェア３２または駆動制御ソフトェア３１によって、画像の全画素数に基づいて自動的に算出および設定される。例えば、所定の数Ｎは、全画素数に所定の比率をかけ算した値である。あるいは、ユーザが駆動制御ソフトェア３１に対して任意の値を所定の数Ｎとして設定することができるようになっていてもよい。

報知部（認識手段）は、例えば、コンピュータ３である。コンピュータ３は、駆動制御部４から状態異常信号を受信したときに、ＰＰＤ１４が飽和していることを示す警告表示をディスプレイ３３に表示させるようになっている。なお、報知部は、ＰＰＤ１４が飽和していることを視覚または聴覚を介してユーザに認識させることができさえすれば、どのような形態であってもよい。例えば、報知部は、状態異常信号を受信したときに警告光を点灯するハザードランプ（図示略）であってもよく、状態異常信号を受信したときに警告音を出力するスピーカ（図示略）であってもよい。

このように構成されたレーザ顕微鏡装置１の作用について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置１により標本Ｓの画像を取得するには、まず、所望の観察条件がユーザによって駆動制御ソフトウェア３１に設定される。観察条件が設定されると、駆動制御ソフトウェア３１は、図４に示されるように、記憶装置からテーブルを読出し、観察条件に対応する上限基準値をテーブルから選択し（ステップＳ１）、選択した上限基準値に増幅値をかけ算することによって上限値を決定する（ステップＳ２）。次に、駆動制御ソフトェア３１に入力された観察条件がコンピュータ３から駆動制御部４に送信され、駆動制御部４が顕微鏡本体２の駆動を開始する（ステップＳ３）。

レーザ光源５から出力されたレーザ光Ｌは、ダイクロイックミラー９によって反射された後、ＸＹガルバノミラー６によって走査されてリレー光学系３によってリレーされ、対物レンズ８によって標本Ｓに照射される。これにより、ＸＹガルバノミラー６の揺動動作に応じて、標本Ｓ上でレーザ光Ｌが２次元的に走査される。

レーザ光Ｌが照射されることによって標本Ｓから発せられる観察光Ｌ’は、対物レンズ８によって集光された後、リレー光学系３およびＸＹガルバノミラー６を介してダイクロイックミラー９を透過し、反射ミラー１０によって反射されて集光レンズ１１によって集光される。集光レンズ１１によって集光された観察光Ｌ’の内、標本Ｓにおける対物レンズ８の焦点位置からの光のみがコンフォーカルアパーチャ１２のピンホール１２ａを通過し、コリメートレンズ１３によって略平行光束に変換されてＰＰＤ１４に入射する。

ＰＰＤ１４においては、全ピクセルの内、観察光Ｌ’が入射したピクセルのみから一定強度のパルスが出力され、パルスの和である強度信号が出力される。強度信号は、増幅器１６およびＡＤ変換器１７による増幅およびＡＤ変換器１７によるデジタル変換を経て、コンピュータ３へ送信される。これにより、コンピュータ３内の画像生成ソフトウェア３２によって、各強度信号値がＸＹガルバノミラー６によるレーザ光Ｌの走査位置情報と対応づけられ、２次元的な標本Ｓの画像が生成される。

ここで、画像内に飽和画素が何個存在するかが画像生成ソフトウェア３２によって判断される（ステップＳ４）。そして、所定の数Ｎ以上の飽和画素が存在する場合に（ステップＳ４のＹＥＳ）、駆動制御部４からコンピュータ３へ状態異常信号が送信され、ディスプレイ３３に警告表示が表示される（ステップＳ５）。ユーザは、ディスプレイ３３上の警告表示の出現に基づいて、ＰＰＤ１４の飽和レベルに対して観察光Ｌ’が強過ぎるために、一部の画素において観察光Ｌ’の強度が飽和してしまっていることを認識することができる。一度ディスプレイ３３に表示された警告表示は、例えば、ユーザがレーザ光Ｌを弱めたりレーザ光Ｌの走査速度を速めたりする等して、ＰＰＤ１４への観察光Ｌ’の入射光量を飽和レベル未満まで低下させることによって、消すことができる。

このように、本実施形態によれば、上限値は、観察条件毎に、各観察条件の下でＰＰＤ１４の飽和レベルに対応するように設定される。例えば、使用する対物レンズ８が射出ＮＡの異なるものに変更されてＰＰＤ１４の飽和レベルが変化したときに、変化後の飽和レベルに対応するように上限値も変更される。したがって、観察条件の変更に伴ってＰＰＤ１４の飽和レベルが変化したとしても、現在の観察条件の下でのＰＰＤ１４の飽和レベルを、警告表示の表示および非表示に基づいてユーザが容易に判断することができるという利点がある。

〔第２の実施形態〕
次に、本発明の第２の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置は、飽和画素の存在を報知部からの警告表示、警告光、警告音等の警報情報の出力によってユーザに認識させることに代えて、または、これに加えて、画像内の飽和画素を強調表示する点で、第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置と異なっている。

本実施形態において、画像生成ソフトウェア３２は、画像の内、飽和画素を、飽和画素以外の画素に対して強調表示する。例えば、画像がモノクロ画像である場合には、飽和画素を、赤等の目立つ色で表示する。
本実施形態のその他の構成は、第１の実施形態と同一である。
本実施形態によれば、飽和画素を強調表示することによって、画像を観察するユーザが飽和画素を視覚的に容易に認識することができるという利点がある。特に、いずれの画素において強度信号が飽和しているかを、容易に視認することができるという利点がある。

〔第３の実施形態〕
次に、本発明の第３の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置は、飽和画素の存在を報知部からの警告表示、警告光、警告音等の警報情報の出力によってユーザに認識させることに代えて、画像において飽和画素が白で表示されるように、上限値に応じて画像の階調を変換する点で、第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置と異なっている。

本実施形態において、画像生成ソフトウェア（認識手段）３２は、駆動制御ソフトェア３１によって設定された上限値が、各画素が取り得る階調値の範囲の最大値となるように、画像の階調を変換する。例えば、図５に示されるように、画像のビット数が１２ビット（４０９６階調）である場合、階調値０が黒、階調値４０９６が白にそれぞれ対応するように、強度信号値と画素の階調値との対応関係を表す画像のルックアップテーブル（ＬＵＴ）が初期設定される。そして、駆動制御ソフトェア３１によって上限値が８００に設定されると、画像生成ソフトウェア３２は、階調値８００が白に対応するようにＬＵＴを変更することによって、画像の階調を変換する。
本実施形態のその他の構成は、第１の実施形態と同一である。

本実施形態によれば、飽和画素が存在している場合、画像において飽和画素は白で表示されるので、第２の実施形態で説明したような強調表示を飽和画素に施さずとも、画像を観察するユーザが飽和画素を視覚的に容易に認識することができるという利点がある。特に、いずれの画素において強度信号が飽和しているかを、容易に視認することができるという利点がある。

〔第４の実施形態〕
次に、本発明の第４の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置について説明する。
本実施形態に係るレーザ顕微鏡装置は、飽和画素の存在を報知部からの警告表示、警告光、警告音等の警報情報の出力によってユーザに認識させることに代えて、画像において飽和画素が白で表示されるように、上限値に応じて増幅器１６およびＡＤ変換器１７のうち少なくとも一方の強度信号のゲインを変更する点で、第１の実施形態に係るレーザ顕微鏡装置と異なっている。

本実施形態において、上限値が、画像の各画素が取り得る階調値の範囲の最大値（例えば、画像のビット数が１２ビットであるときには４０９６）未満である場合に、上限値が最大階調値となるように、駆動制御部４が増幅器１６およびＡＤ変換器１７のうち少なくとも一方のゲインを増強させる。
本実施形態のその他の構成は、第１の実施形態と同一である。

本実施形態によれば、第３の実施形態と同様に、飽和画素が存在している場合、画像において飽和画素は白で表示されるので、第２の実施形態で説明したような強調表示を飽和画素に施さずとも、画像を観察するユーザが飽和画素を視覚的に容易に認識することができるという利点がある。特に、いずれの画素において強度信号が飽和しているかを、容易に視認することができるという利点がある。

なお、上述した第１から第４の実施形態は、以下のように変形することができる。
（第１の変形例）
上述した実施形態の第１の変形例においては、図６に示されるように、コリメートレンズ１３とＰＰＤ１４との間に、対物レンズ８によって集光された光を分光して所定の波長帯域の光のみをＰＰＤ１４へ射出する分光部１８をさらに備えていてもよい。

分光部１８は、図６に示されるように、コリメートレンズ１３から射出された光を分光して波長が一方向に変化するスペクトル列Ｌ”に変換する回折格子１８１と、該回折格子１８１によって生成されたスペクトル列Ｌ”を反射するミラー１８２と、該ミラー１８２によって反射されたスペクトル列Ｌ”をＰＰＤ１４の受光面１４ａ上に集光させる結像レンズ１８３と、該結像レンズ１８３によって集光されたスペクトル列Ｌ”の内、一部の波長の光のみを通過させるスリット１８４ａが形成されたスリット部材１８４とを備える。

スリット部材１８４は、遮光材料から形成され、スペクトル列Ｌ”の波長の変化方向に移動可能に設けられている。スリット部材１８４の移動によってスペクトル列Ｌ”に対するスリット１８４ａの位置を変更することにより、スペクトル列Ｌ”を構成する光の内、ＰＰＤ１４へ通過させる光を選択することができるようになっている。

スリット部材１８４を備える構成において、ＰＰＤ１４に入射する観察光Ｌ’のビーム径はスリット１８４ａの幅寸法（スリット幅）にも依存する。すなわち、図７に示されるように、スリット幅が大きい程、ＰＰＤ１４の受光面１４ａに入射する光のビーム径が大きくなり、ＰＰＤ１４の飽和レベルが大きくなる。したがって、本変形例においては、駆動制御ソフトェア３１が、さらにスリット１８４ａの幅寸法も加味して上限値を設定する。

（第２の変形例）
上述した実施形態の第２の変形例においては、テーブルに基づいて上限値を設定することに代えて、駆動制御ソフトェア３１が、観察条件に基づいて上限値を演算により算出してもよい。
例えば、駆動制御ソフトェア３１に式（１）の関数が記憶されており、駆動制御ソフトェア３１が、顕微鏡本体２の観察条件に基づいて式（１）から上限値を算出する。この場合、各観察条件の下でのＰＰＤ１４に入射する観察光Ｌ’のビーム径とＮ_{ｔｏｔａｌ}とを対応づけて記憶しておき、現在の観察条件に対応するＮ_{ｔｏｔａｌ}を計算に使用する。観察条件は、駆動制御ソフトェア３１が自動取得してもよく、ユーザが手入力してもよい。
また、駆動制御ソフトェア３１による自動計算に代えて、ユーザが、観察条件と上限値とが対応付けられた早見表等を使用して、上限値を算出してもよい。

（第３の変形例）
上述した実施形態の第３の変形例においては、飽和画素の数が所定の数Ｎ以上である場合に、ＰＰＤ１４への観察光Ｌ’の入射光量を低減させる入射光量低減手段がさらに設けられていてもよい。入射光量低減手段は、観察光Ｌ’のビーム径を変化させることなくＰＰＤ１４への観察光Ｌ’の入射光量を低減させることができる構成であれば、どのような構成であってもよい。
本変形例においては、飽和画素の数が所定の数Ｎ以上であるときに、入射光量低減手段の作動を許可する入射光量低減許可手段（図示略）がさらに設けられる。入射光量低減許可手段は、例えば、コンピュータ３に設けられたＧＵＩである。

入射光量低減手段の第１の変形例は、レーザ光Ｌの光路に配置されレーザ光Ｌを強度を変調する音響光学素子（図示略）を備え、該音響光学素子によってレーザ光Ｌの強度を低下させることよって、標本Ｓにおいて発生する観察光Ｌ’の強度を低減するようになっている。
音響光学素子に代えて、レーザ光源５に供給する電力を低減してレーザ光源５からのレーザ光Ｌの出力強度を低減させてもよい。

入射光量低減手段の第２の変形例は、図８および図９に示されるように、対物レンズ８からＰＰＤ１４までの観察光Ｌ’の光路（検出光路）に配置されたＮＤ（ｎｅｕｔｒａｌ ｄｅｎｓｉｔｙ）フィルタ１９を備え、ＮＤフィルタ１９によって強度が低下した観察光Ｌ’がＰＰＤ１４に入射するようになっている。ＮＤフィルタ１９は、図８に示されるように、レーザ光Ｌの光軸に平行な回転軸回りに回転可能に設けられ、回転角度に応じて観察光Ｌ’の透過率（観察光Ｌ’の光量の低減量）が異なる可変式ＮＤフィルタであってもよい。あるいは、図９に示されるように、検出光路に挿脱可能に設けられ、一定の透過率を有する固定式ＮＤフィルタであってもよい。

入射光量低減手段の第３の変形例は、図１０および図１１に示されるように、対物レンズ８からＰＰＤ１４までの観察光Ｌ’の光路（検出光路）に挿脱可能に設けられ、観察光Ｌ’の一部のみを透過させ、他の部分を反射する部分反射ミラー２０を備える。部分反射ミラー２０によって反射された観察光Ｌ’は、図１０に示されるように、ビームダンパ２１によって吸収される。

ビームダンパ２１に代えて、図１１に示されるように、反射された観察光Ｌ’を検出するもう１つのＰＰＤ（副光検出部）２２を備えてもよい。ＰＰＤ２２を備える場合、観察光Ｌ’を２つのＰＰＤ１４，２２によって同時に検出し、ＰＰＤ１４から出力された強度信号とＰＰＤ２２から出力された強度信号とを平均化した信号を、画像の階調値として使用してもよい。このようにすることで、画像のＳＮ比を向上することができる。

上記の第１の変形例から第３の変形例の入射光量低減手段の内、複数を組み合わせて採用してもよい。複数種類の入射光量低減手段が設けられている場合には、いずれの入射光量低減手段を使用するかを、ユーザが選択することができるように構成されていてもよい。

（第４の変形例）
上述した実施形態の第４の変形例においては、ＰＰＤ１４が、ガイガーモードおよびリニアモードの２種類の動作モードを有していてもよい。
ガイガーモードは、ＰＰＤ１４への印加電圧を降伏電圧以上に設定してＰＰＤ１４を作動させるモードである。ガイガーモードにおいて、ＰＰＤ１４は、各ピクセルに入射した観察光Ｌ’を極めて高い増倍率で増倍させるので、微弱な観察光Ｌ’も極めて高い感度で検出することができる。ガイガーモードにおいて、ＰＰＤ１４には、ピクセルにフォトンが入射したとしてもフォトンを検出することができない不感時間が生じる。

一方、リニアモードは、ＰＰＤ１４への印加電圧を降伏電圧未満に設定してＰＰＤ１４を作動させるモードである。リニアモードにおいて、ＰＰＤ１４による観察光Ｌ’の増倍率は、ガイガーモードのそれに比べて低いが、強度信号の強度はＰＰＤ１４への観察光Ｌ’の入射光量に比例する。

本変形例においては、飽和画素の数が所定の数Ｎ以上であるときに、ガイガーモードからリニアモードへの変更を許可する増倍率低減許可手段（図示略）がさらに設けられる。増倍率低減許可手段は、例えば、コンピュータ３に設けられたＧＵＩである。
本変形例によれば、通常はガイガーモードを使用し、飽和状態となったときにガイガーモードから、観察光Ｌ’の増倍率が小さいリニアモードへ変更することによって、ＰＰＤ１４のダイナミックレンジを拡大して強い観察光Ｌ’の強度も正確に検出することができる。

１ レーザ顕微鏡装置
３ コンピュータ（認識手段）
６ ＸＹガルバノミラー（走査部）
８ 対物レンズ
１２ コンフォーカルアパーチャ（ピンホール部材）
１２ａ ピンホール
１４ ＰＰＤ（光検出部）
１４ａ 受光面
１６ 増幅器（増幅手段）
１７ ＡＤ変換器（増幅手段、信号変換手段）
１８１ 回折格子
１８４ スリット部材
１８４ａ スリット
１９ ＮＤフィルタ（入射光量低減手段）
２０ 部分反射ミラー（入射光量低減手段）
２１ ビームダンパ
２２ ＰＰＤ（副光検出部）
３１ 駆動制御ソフトェア（条件設定手段、閾値設定手段）
３２ 画像生成ソフトウェア（認識手段）
３３ ディスプレイ（認識手段）
Ｓ 標本
Ｌ レーザ光
Ｌ’ 観察光
Ｌ” スペクトル列

Claims (21)

1. レーザ光を標本上において走査する走査部と、
   前記レーザ光の照射によって標本において発生した観察光を集光する対物レンズと、
   単一のフォトンを検出可能な複数の検出要素が平面上に配列してなる受光面を有し、前記対物レンズによって集光されて前記受光面に入射した前記観察光を受光し、受光した前記観察光の光量に応じた強度を有する強度信号を出力する光検出部と、
   該光検出部から出力された前記強度信号の強度と前記走査部による前記レーザ光の走査位置とに基づいて前記標本の画像を生成する画像生成部と、
   該画像生成部による前記画像の生成に使用される前記強度信号に所定の閾値以上の強度を有する強度信号が含まれる場合に、前記所定の閾値以上の強度を有する前記強度信号の存在をユーザに認識させる認識手段とを備え、
   前記所定の閾値が、前記受光面に入射する前記観察光のビーム径に応じて設定されるレーザ顕微鏡装置。
2. 前記所定の閾値が、前記対物レンズの射出ＮＡに基づいて設定される請求項１に記載のレーザ顕微鏡装置。
3. 前記対物レンズと前記光検出部との間に設けられ、前記対物レンズの焦点と光学的に共役な位置に配置されたピンホールを有するピンホール部材を備え、
   前記所定の閾値が、前記ピンホールの孔径に基づいて設定される請求項１または請求項２に記載のレーザ顕微鏡装置。
4. 前記対物レンズと前記光検出部との間に設けられ、前記対物レンズによって集光された観察光を波長毎に分離してスペクトル列を生成する回折格子と、
   該回折格子によって生成された前記スペクトル列の配列方向に幅寸法を有し、前記スペクトル列の内の一部のみを通過させるスリットを有するスリット部材とを備え、
   前記所定の閾値が、前記スリットの幅寸法に基づいて設定される請求項１から請求項３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
5. 前記標本の観察条件を設定する条件設定手段と、
   前記標本の観察条件と前記所定の閾値とが対応付けられたテーブルを記憶し、前記条件設定手段によって設定された観察条件と前記テーブルとに基づいて、前記認識手段によって使用される前記所定の閾値を設定する閾値設定手段とを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
6. 前記標本の観察条件を設定する条件設定手段と、
   前記標本の観察条件と前記所定の閾値とを対応付けた関数を記憶し、前記条件設定手段によって設定された観察条件に基づいて前記関数から前記所定の閾値を算出する閾値設定手段とを備える請求項１から請求項４のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
7. 前記光検出部と前記画像生成部との間に設けられ、前記光検出部から出力された前記強度信号を増幅する増幅手段を備え、
   前記所定の閾値が、前記増幅手段による前記強度信号の増幅率に応じて設定される請求項１から請求項６のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
8. 前記所定の閾値は、前記受光面に入射する前記観察光のビーム径に基づいて決まる、前記光検出部から出力される前記強度信号の強度が取り得る範囲の最大値に応じて設定される請求項１から請求項７のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
9. 前記所定の閾値が、前記走査部による前記レーザ光の走査速度に応じて設定される請求項８に記載のレーザ顕微鏡装置。
10. 前記認識手段が、警告表示、警告光および警告音の内、少なくとも１つを出力する報知部を備える請求項１から請求項９のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
11. 前記認識手段が、前記画像生成部によって生成される前記画像において、前記強度信号の強度が前記所定の閾値以上である画素を他の画素に対して強調表示させる請求項１から請求項１０のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
12. 前記認識手段が、前記所定の閾値と等しい前記強度信号の強度が前記画像の各画素が取り得る階調値の範囲の最大値に相当するように、前記画像生成部によって生成される前記画像の階調を変更する請求項１から請求項１０のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
13. 前記光検出部と前記画像生成部との間に設けられ、前記強度信号を増幅する増幅手段を備え、
    前記認識手段は、前記所定の閾値と等しい前記強度信号の強度が前記画像の各画素が取り得る階調値の範囲の最大値に相当するように、前記増幅手段による前記強度信号の増幅率を調整する請求項１から請求項１０のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
14. 前記光検出部への前記観察光の入射光量を低減させる入射光量低減手段と、
    前記強度信号の強度が前記所定の閾値以上であるときに、前記入射光量低減手段の作動を許可する入射光量低減許可手段とを備える請求項１から請求項１３のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
15. 前記入射光量低減手段が、前記標本に照射される前記レーザ光を減弱させる請求項１４に記載のレーザ顕微鏡装置。
16. 前記入射光量低減手段が、前記対物レンズと前記光検出部との間の光路に挿脱可能に設けられた、または、該光路に前記観察光の光量の低減量を変更可能に設けられたＮＤフィルタを備える請求項１４に記載のレーザ顕微鏡装置。
17. 前記入射光量低減手段が、前記対物レンズと前記光検出部との間の光路に挿脱可能に設けられ、前記観察光の一部のみを透過させ、他の部分を反射する部分反射ミラーを備える請求項１４に記載のレーザ顕微鏡装置。
18. 前記部分反射ミラーによって反射された観察光を吸収するビームダンパを備える請求項１７に記載のレーザ顕微鏡装置。
19. 前記部分反射ミラーによって反射された観察光を検出する副光検出部を備え、
    前記光検出部と前記副光検出部とが、同時に前記観察光を検出し、
    前記画像生成部が、前記光検出部から出力された強度信号と、前記副光検出部から出力された強度信号とを平均化した信号に基づいて前記画像を生成する請求項１８に記載のレーザ顕微鏡装置。
20. 前記光検出部が、前記検出要素に入射した前記観察光を増倍する増倍機能を有し、
    前記所定の閾値以上の強度を有する前記強度信号が含まれる場合に、前記光検出部による前記観察光の増倍率の低減を許可する増倍率低減許可手段を備える請求項１から請求項１９のいずれかに記載のレーザ顕微鏡装置。
21. 前記光検出部が、所定の降伏電圧未満の電圧が印加されている状態で駆動するリニアモード、および、前記所定の降伏電圧以上の電圧が印加されている状態で駆動し、前記検出要素に入射した前記観察光を前記リニアモードよりも高い増倍率で増倍するガイガーモードで択一的に動作し、
    前記増倍率低減許可手段は、前記所定の閾値以上の強度を有する前記強度信号が含まれる場合に、前記ガイガーモードから前記リニアモードへの切り替えを許可する請求項２０に記載のレーザ顕微鏡装置。

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