JP5208825B2 - 光学顕微鏡 - Google Patents
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Description
ラマン過程には、生体試料や工業材料を染色せずに、それらの光応答を観測することにより、構造を解析するラマン分光法が存在し、顕微鏡分野への応用が期待されている(例えば、特許文献1参照)。ラマン分光とは、ラマン効果と呼ばれている一種の非線型光学効果を基礎にしている。入射光が強いフォトンフラックスで分子や原子により散乱されると、分子の量子状態が変化して、それらの系全体のエネルギーが変化する。そのとき、変化したエネルギー分が散乱された光子に移行し、結果として入射した光と異なる波長の光が発生する。このような現象をラマン散乱と言う。このラマン散乱には、単色光を用いた、(1)非共鳴ラマン散乱、(2)真正共鳴ラマン散乱、(3)前期共鳴ラマン散乱、の3種類と、多色光を用いた、(4)コヒーレント・ラマン散乱とが知られている。以下、これらのラマン散乱について、図24および図25を参照して、さらに詳細に説明する。
図24(a)は、非共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。非共鳴ラマン散乱は、原子および分子の立場からみると、二次の摂動論で説明できる。すなわち、図24(a)に示すように、S(imaginary)と言う仮想的な量子準位を仮定した一種の2光子過程に対応する。この2光子励起過程では、最低電子状態で、かつ最低振動回転準位、すなわち基底状態S0にあった分子は、例えば、非常に強いレーザ光で、一度、仮想的な量子準位S(imaginary)に励起され、その後、最低電子状態の高い振動回転準位(V2)に脱励起する。結果的には、図24(a)から明らかなように、入射した光が、(Ei−E0)の光子エネルギーを原子または分子に与え、非共鳴ラマン散乱後の光は、その分、光子エネルギーを損失して、見かけ上、光の波長がλ1であったのが、長波長のλ2に変化して散乱される。一般に、非共鳴ラマン散乱を含む仮想的な量子準位を前提とした2光子過程は、極めて遷移確率が小さく、この過程を誘発するためには、フェムト秒オーダの超短パルスレーザを必要とする場合もある。
図24(b)は、真正共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。真正共鳴ラマン散乱は、非共鳴ラマン散乱が特殊な条件を満たす場合の散乱過程で、図24(b)に示すように、S(imaginary)が、実在する第1電子励起状態S1に一致した場合である。この場合は、基底状態S0の分子が、実在する第1電子励起状態S1に励起され、その後、最低電子状態の高い振動回転準位(V2)に脱励起する過程に対応する。したがって、見かけ上、図24(b)に示すように、あたかもS0→S1励起後、λ2という蛍光を発光する過程と一致する。この真正共鳴ラマン散乱は、実在する量子状態を利用するので、極めて散乱確率が高く、非共鳴ラマン散乱と比較すると格段に強い光強度でラマン散乱を発現できる。
図24(c)は、前期共鳴ラマン散乱を説明するエネルギーダイアグラムである。前期共鳴ラマン散乱は、真正共鳴ラマン散乱と非共鳴ラマン散乱との中間の性質をもつ。すなわち、第1電子励起状態S1の近傍にS(imaginary)が存在する場合である。
図25は、コヒーレント・ラマン散乱を説明する図で、図25(a)はコヒーレント・アンチストークスラマン散乱(Coherent Anti-Stokes Raman Scattering;CARS)のエネルギーダイアグラム、図25(b)はコヒーレント・ストークスラマン散乱(Coherent Stokes Raman Scattering;CSRS)のエネルギーダイアグラムである。コヒーレント・ラマン散乱(Coherent Raman Scattering)は、時間領域で振動ダイナミクスを研究する手段の一つで、実験および理論の両側面から様々な研究が行われている。
高調波過程が起因する現象は、レーザ光学の現場でしばしば目撃され、広く応用されている。例えば、ある波長のレーザ光を、波長オーダの空間的に秩序もった誘電体構造を有する光学媒質に入射させると、この光学媒質から高調波が発生する。つまり、誘電体は、強いレーザ光により、その振動電場で強制振動して、振動電場の振幅に比例しない歪みを持った振動電場を二次波として発生する(非線形光学効果)。その結果、入射レーザ光の振動数に対して、整数倍の成分をもったコヒーレント光を発生する。特に、周期性の良い結晶を用いると、非常に強い2倍高調波が発生する。したがって、結晶の種類や入射角度を調整することにより、入射光を任意の波長のレーザ光に波長変換することができる。
通常、分子は、構成原子の価電子の結合状態で決定される電子状態を有しており、量子力学的に不連続なエネルギー準位を持つ。さらに、原子核の結合距離が揺動する振動状態や分子全体の回転運動のような状態が重複する。特に、一番低い状態すなわち基底状態から、次の励起状態にある電子状態(第1電子励起状態:図24参照)に照明励起すると、第1電子励起状態から強い蛍光が発生する。通常の蛍光顕微鏡は、この蛍光を捕えて画像化している。この場合、基底状態と第1電子励起状態との間のエネルギーギャップよりも大きい光子エネルギーを有する照明光を用いる必要がある。
前記刺激光とは異なる波長からなり、前記刺激光の前記試料への照射による副次的応答光の抑制効果を誘導するイレース光を出射するイレース光光源を有し、
前記イレース光を、前記刺激光の集光領域から放出される応答光は抑制せず、該応答光以外の前記副次的応答光は抑制するように、前記刺激光と同時に前記試料に照射することを特徴とするものである。
前記イレース光光源は、前記副次的応答光として蛍光を抑制する波長を含む光を、前記イレース光として出射する、ことを特徴とするものである。
前記試料に照射する前記刺激光および前記イレース光と、前記試料からの前記応答光とを光学的に分離する光学分離素子を有する、ことを特徴とするものである。
前記応答光として散乱光を検出するように構成した、ことを特徴とするものである。
前記散乱光として、ラマン過程により刺激された散乱光を検出するように構成した、ことを特徴とするものである。
前記散乱光として、共有ラマン過程により刺激された散乱光を検出するように構成した、ことを特徴とするものである。
前記副次的応答光を、2重共鳴吸収過程または誘導放出過程により抑制するように構成した、ことを特徴とするものである。
前記応答光として、蛍光性プローブにより染色された試料からの応答光を検出するように構成した、ことを特徴とするものである。
前記試料に前記刺激光および前記イレース光を同時照射して前記散乱光を検出する散乱光検出モードと、前記試料に前記刺激光のみを照射して前記蛍光性プローブによる蛍光を検出する蛍光検出モードとを切り替え可能に構成した、ことを特徴とするものである。
前記応答光として、多光子吸収過程により誘導される蛍光を検出するように構成した、ことを特徴とするものである。
前記応答光として、蛍光性プローブにより染色された試料からの蛍光を検出するように構成した、ことを特徴とするものである。
前記刺激光または前記イレース光の集光位置、集光サイズ、集光強度のいずれかを調整する調整手段を有する、ことを特徴とするものである。
前記調整手段は、前記イレース光の波面を変調して集光位置でのピーク強度を低下させる波面変調素子を有する、ことを特徴とするものである。
前記調整手段は、前記刺激光の集光位置と前記イレース光の集光位置とを異ならせる、ことを特徴とするものである。
前記イレース光光源は、前記イレース光として近赤外光を出射する、ことを特徴とするものである。
前記刺激光光源および前記イレース光光源は、それぞれパルス光源であり、前記刺激光光源は10ピコ秒以下のパルス幅を有する刺激光を出射し、前記イレース光光源は、前記刺激光のパルス幅以上のパルス幅を有するイレース光を出射する、ことを特徴とするものである。
前記刺激光光源または前記イレース光光源は、チタンサファイアレーザ、Nd:YAGレーザ、ファイバーレーザ、半導体レーザ、スーパーコンティニュアム光源のいずれかを含む、ことを特徴とするものである。
前記試料の表面で発生する前記副次的応答光を検出する副次光検出手段と、
前記副次光検出手段の出力に基づいて前記イレース光光源から出射する前記イレース光の強度を調整するイレース光強度調整手段とを有する、
ことを特徴とするものである。
前記試料から放出される前記応答光を検出する応答光検出手段と、
前記応答光検出手段の出力に基づいて画像信号を生成する画像処理手段と、
前記画像処理手段から得られる画像信号に基づいて、前記イレース光光源から出射する前記イレース光の強度を設定する強度設定手段とを有する、
ことを特徴とするものである。
前記強度設定手段は、前記画像処理手段から得られる画像信号に基づいて、前記応答光の強度分布を示すヒストグラムを生成し、前記イレース光光源から出射する前記イレース光の強度変化に対する前記ヒストグラムの変化に基づいて前記イレース光の最適強度を設定する、ことを特徴とするものである。
前記試料に照射する前記イレース光の強度は、前記イレース光の照射により副次的な発光現象が発生しない予め取得された最高強度以下である、ことを特徴とするものである。
前記イレース光光源から出射される前記イレース光を、二次元のシート状の強度分布を有するイレース光として前記試料に照射するイレース光照射手段を有する、ことを特徴とするものである。
先ず、本発明の実施の形態の説明に先立って、本発明の概要について説明する。
I∝P1 2P2 ・・・(1)
本発明の第1実施の形態に係る顕微鏡は、共鳴ラマン散乱を用いて、生体分子を可視化する。生体試料には、例えば、トリプトファン、チロシン、フェニールアラニン、アデニンをはじめとする核酸塩基が含まれている。これらの核酸塩基は、生体構造や活動を解析するのに極めて重要な分子であり、何れもベンゼン環や窒素塩基を含み、波長260nm前後の帯域に極めて強い電子遷移によるS0→S1吸収帯を持つ。したがって、これらの分子を、ラマン過程誘導刺激光として、例えば、Nd:YAGレーザ光の4倍波(波長266nm)で励起すれば、波長290nm〜400nmの領域でラマンバンドを出現させることができる。
本発明の第2実施の形態に係る顕微鏡は、コヒーレント・ラマン散乱を用いて、生体試料の環境応答性蛍光プローブを観察する。通常、コヒーレント・ラマン顕微鏡は、分子の共鳴振動を信号化するので、生体試料を染色する必要がない。しかし、従来のコヒーレント・ラマン顕微鏡で環境応答性蛍光プローブを観察すると、2光子吸収過程などを併発して、ラマン信号が蛍光信号に埋もれて検出できない場合がある。
本発明の第3実施の形態に係る顕微鏡は、2光子吸収過程により、蛍光色素で染色された試料を観察する。図5は、本実施の形態に係る2光子顕微鏡の要部の概略構成図である。この2光子顕微鏡は、刺激光光源である2光子励起光源51と、イレース光光源52とを有する。2光子励起光源51は、例えば、モードロック型のチタンサファイアパルスレーザを用い、該チタンサファイアパルスレーザから、近赤外の波長900nmから700nmの広い領域で、パルス幅10ピコ秒以下の尖頭値の高いパルス光をポンプ光(刺激光)として発生させる。この波長帯域のポンプ光は、ローダミンやフルオレセイン等を分子骨格にもつ蛍光色素を励起して、蛍光を発生させることができる。
図7は、本発明の第4実施の形態に係る2光子顕微鏡の要部の概略構成図である。この2光子顕微鏡は、図5に示した2光子顕微鏡において、イレース光光源52とダイクロイックミラー53との間のイレース光の光路中に、位相板71を配置したものである。位相板71は、イレース光の光軸回りでイレース光の位相差がnπ(nは2以上の正の整数)で周回するように構成されるもので、例えば、図8に示すように、光軸の周りに独立した8領域を有し、nπ/8ずつ位相が異なるように、ガラス基板をエッチングしたり、ガラス基板に透明薄膜を蒸着したりして形成する。
図9は、本発明の第5実施の形態に係る走査型共鳴ラマンレーザ顕微鏡の要部の概略構成図である。この走査型共鳴ラマンレーザ顕微鏡は、図3に示した走査型共鳴ラマンレーザ顕微鏡において、反射ミラー5とダイクロイックミラー3との間のイレース光の光路中に、図8と同様の構成からなる位相板72を配置して、生体試料8に照射するイレース光を中空状とし、その中空状の部分にラマン過程誘導刺激光を集光させるようにしたものである。
図10は、本発明の第6実施の形態に係るCARS顕微鏡の要部の概略構成図である。このCARS顕微鏡は、図4に示したCARS顕微鏡において、反射ミラー35とダイクロイックミラー33bとの間のイレース光の光路中に、図8と同様の構成からなる位相板73を配置して、生体試料38に照射するイレース光を中空状とし、その中空状の部分に、ポンプ光およびプローブ光を集光させるようにしたものである。
図11は、本発明の第7実施の形態に係る2光子顕微鏡の要部の概略構成図である。この2光子顕微鏡は、図7に示した2光子顕微鏡において、位相板71に代えて、イレース光光源52とダイクロイックミラー53との間のイレース光の光路中に、波面変調素子75を配置したものである。波面変調素子75は、例えば透過型液晶素子(Liquid Crystal Display:LCD)や球面収差を発生させるレンズ、あるいは位相板等を用いて構成する。これにより、イレース光の波面を変調(乱)してイレース光の集光性能を劣化させて、集光位置でのピーク強度を低下させる。
図12は、本発明の第8実施の形態に係る2光子顕微鏡の要部の概略構成図である。この2光子顕微鏡は、図5に示した2光子顕微鏡において、試料58の表面で発生する副次的応答光を検出する副次光検出手段76と、この副次光検出手段76の出力に基づいてイレース光光源52から出射するイレース光の強度を調整するイレース光強度調整手段77とを設けたものである。
図14は、本発明の第9実施の形態に係る2光子顕微鏡の要部の概略構成図である。この2光子顕微鏡は、図5に示した2光子顕微鏡において、応答光検出手段を構成する光電子増倍管61の出力を入力して、試料58からの応答光の空間強度分布を示す画像信号を生成する画像処理手段85と、画像処理手段85で生成された画像信号を入力して画像を表示するモニタ86と、画像処理手段85で生成された画像信号に基づいてイレース光光源52から出射するイレース光の強度を設定する強度設定手段87と、を設けたものである。なお、画像処理手段85や強度設定手段87は、2光子顕微鏡の全体の動作を制御するパーソナルコンピュータを有する制御部88により構成される。また、制御部88には、キーボード等からなる入力部89が接続されている。
図20は、本発明の第10実施の形態に係る2光子顕微鏡の要部の概略構成図である。この2光子顕微鏡は、図5に示した2光子顕微鏡において、イレース光光源52を省略し、2光子励起光源51から出射される刺激光の一部を波長変換して、イレース光としても用いるようにしたものである。
図22は、本発明の第11実施の形態に係る光学顕微鏡の要部の概略構成図である。本実施の形態に係る光学顕微鏡は、上記各実施の形態に示した顕微鏡において、イレース光により二次元のシート状の強度分布を有するエバネッセント光を発生させて試料に照射するようにしたものである。このため、図22においては、イレース光光源101から出射されたイレース光を、カップリングレンズ102を介して光ファイバ103に入射させ、該光ファイバ103を通して、試料105の表面に密着したカバーガラス106の側面に入射させる。なお、顕微鏡対物レンズ107は、カバーガラス106よりも屈折率の低い液浸または非液浸対物レンズを用いる。刺激光については、上記実施の形態に示した顕微鏡に応じて、顕微鏡対物レンズ107に導入する。
図23は、本発明の第12実施の形態に係る光学顕微鏡の要部の概略構成図である。本実施の形態に係る光学顕微鏡は、図22に示した顕微鏡において、エバネッセント光を発生させることなく、二次元のシート状の強度分布を有するイレース光を試料に直接照射するようにしたものである。このため、図23に示すように、イレース光光源111から出射されたイレース光を、角度可変ミラー112で反射させた後、ビームエキスパンダ113で適切なビーム径に変換し、さらに、シリンドリカルレンズ114により二次元の薄いシート状の強度分布を有する照明光に変換して、顕微鏡対物レンズ115からの刺激光による観察光軸と直交する方向から試料116に照射する。
1a フェムト秒Nd:YAGレーザ
2 イレース光光源
2a ナノ秒Nd:YAGレーザ
2b チタンサファイアレーザ
3 ダイクロイックミラー
4 偏光ビームスプリッタ
5 反射ミラー
6 顕微鏡対物レンズ
7 試料ステージ
8 生体試料
9a ノッチフィルタ
9b ハイパスフィルタ
11 分光器
12 光電子増倍管
31 CARS光源
31a フェムト秒Nd:YAGレーザ
31b 光パラメトリック発振器
31c ハーフミラー3
32 イレース光光源
32a ナノ秒Nd:YAGレーザ
32b チタンサファイアレーザ
33a,33b ダイクロイックミラー
34 偏光ビームスプリッタ
35 反射ミラー
36 顕微鏡対物レンズ
37 試料ステージ
38 生体試料
39a ポンプ光カットフィルタ
39b プローブ光カットフィルタ
39c イレース光カットフィルタ
41 分光器
42 光電子増倍管
51 2光子励起光源
52 イレース光光源
53 ダイクロイックミラー
54 2次元スキャナ
55 照明光学系
56 ダイクロイックミラー
57 顕微鏡対物レンズ
58 試料
59 集光レンズ
60 NDフィルタ
61 光電子増倍管
65,67 可動反射ミラー
66 調整レンズ系
68 カバーガラス
71,72,73 位相板
Claims (22)
- 刺激光光源から出射される単一波長または複数の異なる波長からなる刺激光を試料に集光し、該試料から非線形光学応答過程により放出される応答光を検出する光学顕微鏡おいて、
前記刺激光とは異なる波長からなり、前記刺激光の前記試料への照射による副次的応答光の抑制効果を誘導するイレース光を出射するイレース光光源を有し、
前記イレース光を、前記刺激光の集光領域から放出される応答光は抑制せず、該応答光以外の前記副次的応答光は抑制するように、前記刺激光と同時に前記試料に照射することを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項1に記載の光学顕微鏡において、
前記イレース光光源は、前記副次的応答光として蛍光を抑制する波長を含む光を、前記イレース光として出射する、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項2に記載の光学顕微鏡において、
前記試料に照射する前記刺激光および前記イレース光と、前記試料からの前記応答光とを光学的に分離する光学分離素子を有する、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項3に記載の光学顕微鏡において、
前記応答光として散乱光を検出するように構成した、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項4に記載の光学顕微鏡において、
前記散乱光として、ラマン過程により刺激された散乱光を検出するように構成した、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項4に記載の光学顕微鏡において、
前記散乱光として、共有ラマン過程により刺激された散乱光を検出するように構成した、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項4,5または6に記載の光学顕微鏡において、
前記副次的応答光を、2重共鳴吸収過程または誘導放出過程により抑制するように構成した、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項5または6に記載の光学顕微鏡において、
前記応答光として、蛍光性プローブにより染色された試料からの応答光を検出するように構成した、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項8に記載の光学顕微鏡において、
前記試料に前記刺激光および前記イレース光を同時照射して前記散乱光を検出する散乱光検出モードと、前記試料に前記刺激光のみを照射して前記蛍光性プローブによる蛍光を検出する蛍光検出モードとを切り替え可能に構成した、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項3に記載の光学顕微鏡において、
前記応答光として、多光子吸収過程により誘導される蛍光を検出するように構成した、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項10に記載の光学顕微鏡において、
前記応答光として、蛍光性プローブにより染色された試料からの蛍光を検出するように構成した、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項1乃至11のいずれか一項に記載の光学顕微鏡において、
前記刺激光または前記イレース光の集光位置、集光サイズ、集光強度のいずれかを調整する調整手段を有する、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項12に記載の光学顕微鏡において、
前記調整手段は、前記イレース光の波面を変調して集光位置でのピーク強度を低下させる波面変調素子を有する、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項12に記載の光学顕微鏡において、
前記調整手段は、前記刺激光の集光位置と前記イレース光の集光位置とを異ならせる、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項1乃至14のいずれか一項に記載の光学顕微鏡において、
前記イレース光光源は、前記イレース光として近赤外光を出射する、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項1乃至15のいずれか一項に記載の光学顕微鏡において、
前記刺激光光源および前記イレース光光源は、それぞれパルス光源であり、前記刺激光光源は10ピコ秒以下のパルス幅を有する刺激光を出射し、前記イレース光光源は、前記刺激光のパルス幅以上のパルス幅を有するイレース光を出射する、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項1乃至16のいずれか一項に記載の光学顕微鏡において、
前記刺激光光源または前記イレース光光源は、チタンサファイアレーザ、Nd:YAGレーザ、ファイバーレーザ、半導体レーザ、スーパーコンティニュアム光源のいずれかを含む、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項1乃至17のいずれか一項に記載の光学顕微鏡において、
前記試料の表面で発生する前記副次的応答光を検出する副次光検出手段と、
前記副次光検出手段の出力に基づいて前記イレース光光源から出射する前記イレース光の強度を調整するイレース光強度調整手段とを有する、
ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項1乃至17のいずれか一項に記載の光学顕微鏡において、
前記試料から放出される前記応答光を検出する応答光検出手段と、
前記応答光検出手段の出力に基づいて画像信号を生成する画像処理手段と、
前記画像処理手段から得られる画像信号に基づいて、前記イレース光光源から出射する前記イレース光の強度を設定する強度設定手段とを有する、
ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項19に記載の光学顕微鏡において、
前記強度設定手段は、前記画像処理手段から得られる画像信号に基づいて、前記応答光の強度分布を示すヒストグラムを生成し、前記イレース光光源から出射する前記イレース光の強度変化に対する前記ヒストグラムの変化に基づいて前記イレース光の最適強度を設定する、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項1乃至20のいずれか一項に記載の光学顕微鏡において、
前記試料に照射する前記イレース光の強度は、前記イレース光の照射により副次的な発光現象が発生しない予め取得された最高強度以下である、ことを特徴とする光学顕微鏡。 - 請求項1乃至21のいずれか一項に記載の光学顕微鏡において、
前記イレース光光源から出射される前記イレース光を、二次元のシート状の強度分布を有するイレース光として前記試料に照射するイレース光照射手段を有する、ことを特徴とする光学顕微鏡。
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