JP2018120006A - 超解像顕微鏡 - Google Patents

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慶記 池滝
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英明 加納
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Abstract

【課題】非染色で回折限界を上回る空間分解能が得られる超解像顕微鏡を提供する。【解決手段】超解像顕微鏡は、対物レンズ１４を経て波長の異なる複数色の照明光を少なくとも空間的に重複して試料Ｓに照射する照明部１０と、照明光の試料Ｓへの照射に起因して、試料Ｓから発生する信号光を検出する検出部５０と、を備える。照明部１０は、照明光として、試料Ｓに対して非線形光学効果を誘導する第１照明光と、第１照明光とは対物レンズ１４の集光面における波面分布が異なり、非線形光学効果の誘導を抑制する第２照明光と、を試料Ｓに照射する。検出部５０は、試料Ｓから非線形光学効果により発生する信号光を検出する。【選択図】図２

Description

本発明は、超解像顕微鏡に関するものである。
超解像顕微鏡として、例えば、少なくとも２以上の励起量子状態をもつ分子を含む試料を、２重共鳴吸収過程を用いて回折限界を超える高い空間分解能で観察可能な蛍光顕微鏡が知られている（例えば、特許文献１、２参照）。
特許文献１、２に開示の蛍光顕微鏡は、試料中の分子を安定状態、例えば基底状態Ｓ０から第１量子状態Ｓ１に励起するためのポンプ光と、分子を更に他の量子状態に遷移させるためのイレース光とを一組として、回折限界以下に収縮した蛍光スポットにより試料面を空間走査する。そして、各計測点の蛍光信号をコンピュータ上で２次元的に配列して画像処理することにより、回折限界の空間分解能を上回る解像度を有する蛍光画像を得ている。
その代表例として、蛍光色素分子を含む試料にポンプ光を照射して、蛍光色素分子を第１電子励起状態に励起する。さらに、試料にイレース光を照射して蛍光色素分子を他の量子状態に強制遷移させることで、第１電子励起状態の分子をクエンチする。その結果として、第１電子励起状態からの蛍光緩和を抑制する。対物レンズによりポンプ光と中空状のイレース光とを試料に同時に照射すれば、蛍光色素で染色された試料面に形成される蛍光スポットは、中心部を残し回折限界以下に収縮される。
特開２００１−１００１０２号公報 特開２０１０−１５０２６号公報
しかしながら、上述した従来の超解像顕微鏡においは、試料を蛍光色素分子で染色する必要がある。そのため、特に、生きた生物試料を観察する場合に、色素分子が生物試料の代謝現象などに影響を与えて、生物試料の本来の生命現象を捉えることができない場合がある。
したがって、かかる観点に鑑みてなされた本発明の目的は、非染色で回折限界を上回る空間分解能が得られる超解像顕微鏡を提供することにある。
上記目的を達成する本発明に係る超解像顕微鏡は、
対物レンズを経て波長の異なる複数色の照明光を少なくとも空間的に重複して試料に照射する照明部と、
前記照明光の前記試料への照射に起因して、該試料から発生する信号光を検出する検出部と、を備え、
前記照明部は、前記照明光として、前記試料に対して非線形光学効果を誘導する第１照明光と、該第１照明光とは前記対物レンズの集光面における波面分布が異なり、前記非線形光学効果の誘導を抑制する第２照明光と、を前記試料に照射し、
前記検出部は、前記試料から前記非線形光学効果により発生する信号光を検出する。
前記非線形光学効果は、２次非線形光学過程、３次非線形光学過程、４次非線形光学過程、５次非線形光学過程果のいずれかの過程で生じるものであり、
前記２次非線形光学過程は、
第２高調波発生（ＳＨＧ: second harmonic generation）、２次和周波発生（ＳＦＧ: sum frequency generation）、差周波発生（ＤＦＧ: difference frequency generation）、光パラメトリック過程（optical parametric process）のいずれかであり、
前記３次非線形光学過程は、
第３高調波発生（ＴＨＧ: third harmonic generation）、３次和周波発生（ＴＳＦＧ: third-order sum frequency generation）、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ: coherent anti-Stokes Raman scattering）、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ: stimulated Raman scattering (ＳＲＧ: stimulated Raman gain, ＳＲＬ: stimulated Raman loss)）、光学カー効果（ＯＫＥ: optical Kerr effect）、ラマン誘導カー効果（ＲＩＫＥ: Raman induced Kerr effect）、誘導レイリー散乱（stimulated Rayleigh scattering）、誘導ブリルアン散乱（ＳＢＳ: stimulated Brillouin scattering）、誘導カー散乱（stimulated Kerr scattering）、誘導Rayleigh-Bragg散乱（stimulated Rayleigh-Bragg scattering）、誘導 Mie散乱（stimulated Mie scattering）、自己位相変調（ＳＰＭ: self phase modulation）、相互位相変調（ＸＰＭ: cross phase modulation）、光場複屈折（optical-field induced birefringence）、電界誘起ＳＨＧ（electric-field induced ＳＨＧ）のいずれかであり、
前記４次非線形光学過程は、
４光波混合（ＦＷＭ: four-wave mixing）であり、
前記５次非線形光学過程は、
ハイパーラマン散乱（hyper-Raman scattering）、ハイパーレイリー散乱（hyper-Rayleigh scattering）、コヒーレント・アンチストークス・ハイパーラマン散乱（coherent anti-Stokes hyper-Raman scattering）のいずれかであるとよい。
前記第２照明光は、前記集光面における強度分布に極小値を有するとよい。
前記第１照明光は、前記集光面における強度分布に極大値を有するとよい。
前記第１照明光及び前記第２照明光はそれぞれコヒーレント光であり、
前記照明部は、前記第２照明光の位相又は電場ベクトルの空間分布を変調する空間変調素子を備えるとよい。
前記照明部は、前記集光面において、前記第１照明光の前記極大値と前記第２照明光の前記極小値とを同軸で重ねるとよい。
前記検出部は、前記信号光として前記試料からの前方散乱光を検出するとよい。
前記非線形光学効果は、非線形ラマン効果、２次又は３次和周波発生効果、２次又は３次差周波発生効果のいずれかであるとよい。
前記第１照明光は、波長の異なる少なくとも２色の照明光を含み、該少なくとも２色の照明光はそれぞれ前記集光面における強度分布に極大値を有するとよい。
前記空間変調素子は、前記第２照明光の位相を、光軸を中心とする１周回で０から２π又はその整数倍変化させるとよい。
前記空間変調素子は、前記第２照明光の光軸を中心として複数の同心状の領域を有し、隣接する前記領域において前記第２照明光の位相の符号を動径方向で反転させてもよい。
前記空間変調素子は、前記領域の各々において、前記第２照明光の位相を、光軸を中心とする１周回で０から２π又はその整数倍変化させてもよい。
前記空間変調素子は、前記第２照明光の電場ベクトルの方向を、光軸を中心とする対称位置で反転させてもよい。
前記空間変調素子は、前記第２照明光の光軸を中心として複数の同心状の領域を有し、隣接する前記領域において前記第２照明光の電場ベクトルの方向を反転させてもよい。
前記照明部は、前記第１照明光及び前記第２照明光のそれぞれの波長が可変としてもよい。
前記第２照明光は、有限帯域の波長幅を有してもよい。
前記第２照明光の波長は、前記試料における観察対象の分子の電子遷移による吸収端の波長より短いとよい。
前記照明部は、複数の光源点を有し、該複数の光源点からそれぞれ前記第１照明光及び前記第２照明光を抽出して前記試料に照射し、
前記検出部は、複数の前記光源点に対応して前記試料から発生する複数の前記信号光を分離して検出してもよい。
前記複数の光源点は、複数のスーパーコンティニュアム光源のファイバが束ねられたマルチファイババンドルの射出端からなり、
前記検出部は、前記マルチファイババンドルのファイバ本数以上の画素数を有する２次元検出器を備えるとよい。
本発明によれば、非染色で回折限界を上回る空間分解能が得られる超解像顕微鏡を提供することができ、試料に存在する分子振動状態や化学結合状態等の多角的な情報を得ることができる。
ＣＡＲＳ過程のエネルギーダイアグラムを示す図である。 第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。 空間変調素子の第１の例を示す概略構成図である。 空間変調素子の第２の例を示す概略構成図である。 空間変調素子の第３の例を示す概略構成図である。 空間変調素子の第４の例を示す概略構成図である。 空間変調素子の第５の例を示す概略構成図である。 空間変調素子の第６の例を示す概略構成図である。 空間変調素子の第７の例を示す概略構成図である。 図１の超解像顕微鏡における励起ダイアグラムを示す図である。 ライン発振のレーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。 スーパーコンティニュアム光源からの白色レーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。 第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。 本発明の変形例を説明する励起ダイアグラムを示す図である。
本発明に係る超解像顕微鏡は、非線形光学効果によって試料から発生する信号光を検出することにより、試料を超解像で観察する。非線形光学効果は、例えば、２次非線形光学過程、３次非線形光学過程、４次非線形光学過程、５次非線形光学過程果のいずれかの過程で生じるものであってよい。
２次非線形光学過程には、例えば、第２高調波発生（ＳＨＧ: second harmonic generation）、２次和周波発生（ＳＦＧ: sum frequency generation）、差周波発生（ＤＦＧ: difference frequency generation）、光パラメトリック過程（optical parametric process）のいずれかが含まれる。
３次非線形光学過程には、例えば、第３高調波発生（ＴＨＧ: third harmonic generation）、３次和周波発生（ＴＳＦＧ: third-order sum frequency generation）、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ: coherent anti-Stokes Raman scattering）、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ: stimulated Raman scattering (ＳＲＧ: stimulated Raman gain, ＳＲＬ: stimulated Raman loss)）、光学カー効果（ＯＫＥ: optical Kerr effect）、ラマン誘導カー効果（ＲＩＫＥ: Raman induced Kerr effect）、誘導レイリー散乱（stimulated Rayleigh scattering）、誘導ブリルアン散乱（ＳＢＳ: stimulated Brillouin scattering）、誘導カー散乱（stimulated Kerr scattering）、誘導Rayleigh-Bragg散乱（stimulated Rayleigh-Bragg scattering）、誘導 Mie散乱（stimulated Mie scattering）、自己位相変調（ＳＰＭ: self phase modulation）、相互位相変調（ＸＰＭ: cross phase modulation）、光場複屈折（optical-field induced birefringence）、電界誘起ＳＨＧ（electric-field induced ＳＨＧ）のいずれかが含まれる。
４次非線形光学過程には、例えば、４光波混合（ＦＷＭ: four-wave mixing）が含まれる。
５次非線形光学過程には、例えば、ハイパーラマン散乱（hyper-Raman scattering）、ハイパーレイリー散乱（hyper-Rayleigh scattering）、コヒーレント・アンチストークス・ハイパーラマン散乱（coherent anti-Stokes hyper-Raman scattering）のいずれかが含まれる。
本発明の一実施の形態では、非線形光学過程として３次非線形光学過程であるＣＡＲＳ過程を利用する。ＣＡＲＳ過程は、現在、振動分光手法として最も広く使われている代表的な非線形光学過程である。
図１は、ＣＡＲＳ過程のエネルギーダイアグラムを示す図である。ＣＡＲＳ過程では、一般に角振動数の異なる２つのレーザ光（ω１光、ω２光）を用いる。ω１光はポンプ光とも呼ばれ、振動準位ν０の分子を振動準位ν１よりも高い励起状態に励起する。ω２光はストークス光とも呼ばれ、ポンプ光ω１により励起された分子を振動準位ν１に脱励起する。これら２つの入射光の角振動数差ω１−ω２が試料分子の持つ振動モードの角振動数Ωと一致すると、多数の試料分子の振動モードが同時に励振される。
このようにして生じた分子振動（振動コヒーレンス）は、分子が３つ目のレーザ光（ω３光又はプローブ光）と相互作用することにより、３次の非線形分極に由来するωＣＡＲＳ光（ＣＡＲＳ光）として取り出される。ＣＡＲＳ過程では、エネルギー保存則から、ωＣＡＲＳ＝ω１−ω２＋ω３の条件を満たす。また、ＣＡＲＳ光は、位相整合条件から、ｋＣＡＲＳ＝ｋ１−ｋ２＋ｋ３の方向に発生する。ここで、ｋｘはωｘ光の波数ベクトルある。
ＣＡＲＳ過程では、多くの場合、ω３光としてω１光が用いられる。すなわち、ポンプ光をプローブ光として用いる。その場合、ＣＡＲＳ光の角振動数は、（２ω１−ω２）となる。また、ＣＡＲＳ光の信号強度は、ω１光の強度の２乗及びω２光の強度の一乗にそれぞれ比例する。つまり、ＣＡＲＳ光の信号強度は、ω１光の強度に対して非線形に増大する。また、位相整合条件から、ＣＡＲＳ過程により指向性のよいラマン散乱光（ＣＡＲＳ光）を得ることができる。特に、前方への散乱光は強度が強い特徴をもっているので、速い計測速度で画像が取得できる。
ＣＡＲＳ過程の優れているところは、観察しようとする分子の振動準位に起因した散乱光を検出するので、染色を行うことなく同分子の存在を検出することができる。これは、生きた試料を薬品処理することなく、そのままの姿で、生物試料の生体分子を検出する際に好都合である。
（第１実施の形態）
図２は、本発明の第１実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。図２に示す超解像顕微鏡は、ＣＡＲＳ顕微鏡を構成するもので、照明部１０と検出部５０とを備える。照明部１０は、第１光源１１と、マルチバンドパスフィルタ１２と、ビームコンバイナ１３と、対物レンズ１４と、第２光源１５と、１／４波長板１６と、空間変調素子１７とを備える。
第１光源１１は、試料Ｓに対してＣＡＲＳ過程を誘導する第１照明光を射出する。本実施の形態では、第１光源１１を１台のスーパーコンティニュアム光源で構成して、該スーパーコンティニュアム光源からの射出光から、第１照明光となるω１光及びω２光に対応するポンプ光（プローブ光）及びストークス光を生成する。スーパーコンティニュアム光源１１は、例えば波長１５６０ｎｍのフェムト秒のパルス光を射出するファイバレーザ２１と、該ファイバレーザ２１の射出光をシード光として白色のレーザ光を射出するフォトニック結晶ファイバ２２とを有する。
フォトニック結晶ファイバ２２から射出される白色のレーザ光は、マルチバンドパスフィルタ１２に入射されて、ポンプ光（プローブ光）及びストークス光が分光して取り出される。本実施の形態では、ファイバレーザ１１からフォトニック結晶ファイバ１２に入射される波長１５６０ｎｍのシード光を、ω１光に対応するポンプ光（プローブ光）として利用する。したがって、ポンプ光（プローブ光）は十分に先頭値が高く、十分に非線形光学過程であるＣＡＲＳ過程を誘導することができる。また、ω２光に対応するストークス光は、波長２０２１ｎｍの光を利用する。
マルチバンドパスフィルタ１２から取り出されるω１光及びω２光は、ビームコンバイナ１３を経て対物レンズ１４に入射されて試料Ｓに集光される。ここで、試料Ｓに集光されるω１光及びω２光は、ガウスビームで集光面における強度分布に極大値を有する。これにより、試料Ｓ中の特定の有機分子のＣＨ化学基の基本振動に起因するＣＡＲＳ光を選択的に誘導することが可能となる。
第２光源１５は、ω１光及びω２光の第１照明光とは対物レンズ１４の集光面における波面分布が異なり、ＣＡＲＳ過程の誘導を抑制する第２照明光（以下、クエンチ光とも言う）を射出する。第２光源１５は、例えば波長可変のフェムト秒レーザが用いられる。第２光源１５から射出されるクエンチ光は、１／４波長板１６で円偏光に変換された後、空間変調素子１７を経てビームコンバイナ１３に入射され、ここで第１照明光と同軸に合成されて対物レンズ１４により試料Ｓに集光される。クエンチ光の波長は、例えば試料Ｓにおける観察対象の分子の電子遷移による吸収端の波長より短い。
空間変調素子１７は、例えば図３又は図４に示すように構成される。図３に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の位相を、光軸を中心とする１周回で０から２π（又はその整数倍）まで連続的に変化させるものである。図４に示す空間変調素子１７は、光軸の周りに独立した４領域を有し、クエンチ光の位相を光軸中心に０から２π（又はその整数倍）までπ／２（又はその整数倍）ずつ段階的に変化させるものである。
図３又は図４に示した空間変調素子１７をクエンチ光が透過すると、クエンチ光の位相は、光軸を中心とする対称点で位相が反転する。したがって、このクエンチ光を対物レンズ１４で集光すると、集光面において強度分布に極小値を有する中空状のビームスポットが形成される（例えば、”Formation of a doughnut laser beam for super-resolving microscopy using a phase spatial light modulator”: T. Watanabe, Y. Igasaki, N. Fukuchi, M. Sakai, S. Ishiuchi, M. Fujii, T. Omatsu, K. Yamamoto and Y. Iketaki, Opt. Eng., 43(2004) 1136.参照）。
空間変調素子１７は、例えば図５又は図６に示すように構成してもよい。図５に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の光軸を中心として複数（図５では２つ）の同心状の領域を有し、隣接する領域においてクエンチ光の位相の符号を動径方向で反転させるものである。図６に示す空間変調素子１７は、図５と同様に、クエンチ光の位相の符号を同心状の隣接する領域において動径方向で反転させる他、各領域においてクエンチ光の位相を、図３と同様に光軸を中心とする１周回で０から２π又はその整数倍変化させるものである。
図５又は図６に示した空間変調素子１７をクエンチ光が透過すると、クエンチ光の位相が動径方向に反転するので、このクエンチ光を対物レンズ１４で集光すると、図３及び図４の場合と同様に、集光面において強度分布に極小値を有する中空状のビームスポットが形成される。しかも、この場合は、クエンチ光の電場が３次元的に相殺されるので、焦点とその近傍のみで光が当たらない３次元的な微小空間が生成される（例えば、ＷＯ２００５０３８４４１Ａ１参照）。
図３乃至図６に示した空間変調素子１７は、構造が簡単で、例えば光学薄膜やエッチング等を用いて作製することができる（例えば、“Three-dimensional super-resolution microscope using two-color annular phase plate”: Y. Iketaki, Appl. Phys. Express, 3 (2010) 085203、 ”New Design Method for a Phase Plate in Super-Resolution Fluorescence Microscopy”: N. Bokor and Y. Iketaki, Appl. Spectroscopy. 68(2014) 353、”Generation of a doughnut -shaped beam using a spiral phase plate”: T. Watanabe, M. Fujii,Y. Watanabe, N. Nobuhito and Y. Iketaki, Rev. Sci. Instrum. 75(2004) 5132参照）。
空間変調素子１７は、上述したクエンチ光の位相を変調する場合に限らず、クエンチ光の偏光を変調しても、同様に集光面における強度分布に極小値を有する中空状のビームスポットを形成することが可能である。図７乃至図９は、クエンチ光の偏光を変調する空間変調素子１７の構成を示す概略図である。図７及び図８に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の電場ベクトルの方向を、光軸を中心とする対称位置で反転させるように構成したものである。図９に示す空間変調素子１７は、クエンチ光の光軸を中心として複数（図９では２つ）の同心状の領域を有し、隣接する領域においてクエンチ光の電場ベクトルの方向を反転させるように構成したものである。図７乃至図９の空間変調素子１７は、波長板を張り合わすことによって容易に作製することができる。
図２において、ビームコンバイナ１３で同軸に合成されるクエンチ光と、ポンプ光（プローブ光）及びストークス光とが、対物レンズ１４により試料Ｓに集光されと、超解像でＣＡＲＳ光を誘導すること可能となる。すなわち、中空状に集光されるクエンチ光の輪帯部では、ポンプ光（プローブ光）及びストークス光によるＣＡＲＳ過程が阻害されるので、ＣＡＲＳ光が発生する領域は、ポンプ光（プローブ光）及びストークス光の回折限界サイズの集光スポットよりも小さくなる。
試料Ｓは、対物レンズ１４の光軸方向であるｚ方向と、ｚ方向と直交する面内で直交するｘ方向及びｙ方向との３次元方向に移動可能な試料ステージ４０上に載置される。
検出部５０は、コレクタレンズ５１と、集光レンズ５２と、共焦点ピンホール５３と、分光器５４と、分光器スリット５５と、光電子増倍管５６とを備える。コレクタレンズ５１は、試料Ｓの前方散乱光であるＣＡＲＳ光を入射して平行光に変換する。コレクタレンズ５１で平行光に変換されたＣＡＲＳ光は、集光レンズ５２により集光されて、共焦点ピンホール５３を経て分光器５４に入射される。そして、分光器５４で分光されて、所望の波長成分が分光器スリット５５により取り出されて光電子増倍管５６で検出される。ここで、共焦点ピンホール５３は、空間フィルタとして機能するだけでなく、ＣＡＲＳ光の単色性を向上させる機能も持ち合わせている。
ポンプ光（プローブ光）、ストークス光及びクエンチ光の３色が集光して形成されるＣＡＲＳ光の発生領域は、実質上、光プローブとして機能する。したがって、この光プローブに対して試料Ｓを空間走査すれば、回折限界を上回る空間分解能で試料ＳからのＣＡＲＳ光を画像化することが可能となる。具体的には、試料ステージ４０を空間走査しながら、光電子増倍管５６で検出される試料ＳからのＣＡＲＳ信号をマッピングする。例えば、平面走査を行えば、超解像の顕微鏡画像が得られる。また、本実施の形態では、共焦点ピンホール５３を有しているので、試料ステージ４０をｚ方向に移動させながらｘｙ方向に空間走査すれば、３次元的な超解像顕微鏡像が得られる。
図１０は、本実施の形態に係る超解像顕微鏡における励起ダイアグラムを示す図である。ＣＡＲＳ過程は、見方を変えると、振動準位ν１を中間準位とする２段階の励起過程と見なすことができる。まず、ポンプ光（角振動数：ω１、波長：λ１）とストークス光（角振動数：ω２、波長：λ２）とのコヒーレントな重ね合わせより発生する差周波成分（Δω）により、基底状態Ｓ０の分子を振動準位ν１に励起する。この中間状態の分子からのプローブ光（ω１）の照射によるアンチストークス（ＣＡＲＳ）光は、角振動数がω１＋Δω（波長：λＣＡＲＳ）と見なせる。
この過程においては、振動準位ν１の存在が大前提である。プローブ光の他に、別の波長のクエンチ光（角振動数：ωｑ、波長：λｑ）が入射すると、振動準位ν１の中間準位は、クエンチ光とカップリングして和周波光（角振動数：ωｑ＋Δω、波長：λｏｕｔ）を発生する。その結果、本来の角振動数（ω１＋Δω）で発生するＣＡＲＳ光と競合して、ＣＡＲＳ光強度が減少する。すなわち、振動準位ν１は、ＣＡＲＳ光と和周波光（角振動数：ωｑ＋Δω）とを分岐するのに利用される。
和周波光の強度はクエンチ光の強度に比例するので、その分ＣＡＲＳ光の強度は減少する。すなわち、ＣＡＲＳ光は、中空状のクエンチ光の辺縁部で抑制されるので、蛍光抑制型の超解像顕微鏡法と同様に、回折限界を超える分解能を得ることができる。これにより、試料Ｓに存在する分子振動状態や化学結合状態等の多角的な情報を得ることができる。
なお、より効果的にＣＡＲＳ光を抑制する方法として、分光学的な原理に基づく方法やレーザの機能に着目した方法を適用することも可能である。
分光学的な原理に基づく方法としては、クエンチ光の周波数を調整して、和周波光を試料分子の電子励起状態Ｓ１よりも高くする。これにより、和周波光を電子励起状態Ｓ１と共鳴させて、電子状態間の遷移を誘導する。すなわち、基底状態Ｓ０から電子励起状態Ｓ１の遷移エネルギーより大きい励起エネルギーに対応する振動数を有するクエンチ光を照射する。これにより、吸収断面積が大きく、弱い照射強度でＣＡＲＳ光を確実に抑制することができる（例えば、S. Koura, K. Inoue, T. Omari, M. Ishihara, M. Kikuchi, M. Fuji, and M. Sakai, Opt. Express, 18, 13402 (2010)、 M. Sakai, M. Fuji, Chem. Phys. Lett. 396 (2004) 298.参照）。
レーザの機能に着目した方法としては、スーパーコンティニュアム光源の特性を利用する。スーパーコンティニュアム光源は、連続波長帯域の高輝度のコヒーレント光を生成できる。したがって、このようなブロードな帯域のクエンチ光を照射すれば、様々な分岐比で和周波光を発生できるので、相対的にＣＡＲＳ光を抑制できる。
図１１Ａは、ライン発振のレーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。図１１Ｂは、スーパーコンティニュアム光源からの白色レーザ光を用いた場合のクエンチ光の焦点面における集光パターンの強度分布を示す図である。図１１Ａは、クエンチ光の波長λｑが、６４６ｎｍ＜λｑ＜６４７ｎｍの場合である。図１１Ｂは、波長λｑの中心波長が６４７ｎｍで、帯域幅が約３０ｎｍである６３４ｎｍ＜λｑ＜６６０ｎｍの場合である。なお、いずれの場合も、図２に示した空間変調素子１７は、図５に示した構成のものとした。
図１１Ａ及び図１１Ｂの比較から明らかなように、白色レーザ光からブロードな帯域のクエンチ光を分光して使用する場合でも、焦点面に集光されるクエンチ光の中心部の強度はゼロとなる。したがって、超解像顕微鏡のクエンチ光として十分使用することができ、白色レーザ光の特徴を生かして、試料Ｓを効率的に照明することができる。
（変形例）
図１０に示した励起ダイアグラムに注目すると、以下の変形例が可能となる。すなわち、角振動数ωｑのクエンチ光をストークス光として利用し、反対に角振動数ω２のストークス光をクエンチ光として利用する。
この場合、角振動数ωｑのクエンチ光は、ビーム整形されず通常のガウスビームとして集光される。一方、角振動数ω２のストークス光は中空状に整形されて集光される。そして、集光スポット毎に和周波光（角振動数：ωｑ＋Δω）を検出して画像化する。この場合、角振動数ω２のストークス光の強度が大きくなると、和周波光の強度が抑制されて超解像顕微鏡観察が可能となる。
（第２実施の形態）
図１２は、本発明の第２実施の形態に係る超解像顕微鏡の概略構成を示す図である。図１２に示す超解像顕微鏡は、図２と同様にＣＡＲＳ顕微鏡を構成するもので、照明部１１０と検出部１５０とを備える。照明部１１０は、光源１１１と、コリメータレンズ１１２と、マルチバンドパスフィルタ１１３と、ガルバノミラー光学系１１４と、瞳投影レンズ１１５と、空間変調素子１１６と、対物レンズ１１７とを備える。
光源１１１は、複数のスーパーコンティニュアム光源を備える。スーパーコンティニュアム光源は、原理的には、フォトニック結晶ファイバ内で非線形光学効果により発生する白色光をファイバ端面より取り出して、分散光学素子（例えば、回折格子、分光ファイルタ等）により必要な波長の照明光を取り出すようにしている。本実施の形態では、複数のスーパーコンティニュアム光源のフォトニック結晶ファイバ端を束ねてマルチファイババンドル１２０を形成し、該マルチファイババンドル１２０の射出端を複数の光源点として、該複数の光源点から白色光のマルチビームを射出させる。
マルチファイババンドル１２０の複数の光源点から射出される白色光のマルチビームは、コリメータレンズ１１２により同軸で平行光に変換された後、マルチバンドパスフィルタ１１３に入射される。マルチバンドパスフィルタ１１３は、入射する白色光から第１照明光となるω１光及びω２光に対応するポンプ光（プローブ光）及びストークス光と、第２照明光となるクエンチ光との３色の照明光を取り出す。
マルチバンドパスフィルタ１１３から取り出される３色の照明光は、ガルバノミラー光学系１１４により２次元方向に偏向走査されて、瞳投影レンズ１１５及び空間変調素子１１６を経て対物レンズ１１７により試料Ｓにマルチスポットで集光される。空間変調素子１１６は、例えば図４に示したように構成され、試料Ｓに形成されるマルチスポットの各々に対して、ポンプ光（プローブ光）及びストークス光はガウシアン状に集光され、クエンチ光は中空状に集光されるように、偏光状態又は位相状態を変調する。これにより、試料Ｓに形成されるマルチスポットの各々は、クエンチ光の中空中心の光強度の極小値と、ポンプ光（プローブ光）及びストークス光の光強度の極大値とが一致する。
検出部１５０は、捕集レンズ１５１と、分光フィルタ１５２と、集光レンズ１５３と、２次元検出器１５４とを備える。捕集レンズ１５１は、試料Ｓのマルチスポットからの前方散乱光であるＣＡＲＳ光を捕集して平行光に変換する。捕集レンズ１５１で平行光に変換されたＣＡＲＳ光は、分光フィルタ１５２により所望の波長成分が取り出されて集光レンズ１５３により２次元検出器１５４にマルチスポットして集光される。２次元検出器１５４は、試料Ｓに形成されるマルチスポット数よりも多い画素数を有する例えば高感度ＣＣＤ（Charge Coupled Device）センサを用いて構成される。
本実施の形態によると、試料Ｓに形成されるマルチスポットをガルバノミラー光学系１１４により対物レンズ１１７の集光面内で２次元方向に走査して、マルチスポットからのＣＡＲＳ光を２次元検出器１５４で検出するので、試料Ｓを超解像で超高速計測が可能となり、生命現象のライブ観察が可能となる。
なお、本発明は、上記実施の形態にのみ限定されるものではなく、幾多の変形または変更が可能である。例えば、第１実施の形態において、試料Ｓのｘｙ方向の２次元走査は、第２実施の形態と同様にガルバノミラー光学系を用いて行ってもよい。また、第２実施の形態において、試料Ｓを対物レンズ１１７の光軸方向に移動させて３次元的な超解像顕微鏡像を得るようにしてもよい。この場合、ガルバノミラー光学系１１４に代えて、試料Ｓを第１実施の形態の場合と同様に、３次元方向に移動可能な試料ステージ上に載置してもよい。また、第２実施の形態においても、第１実施の形態において説明した変形例と同様の変形例が可能である。
また、上記実施の形態では、３色の照明光を試料に集光するので、それらの照明光の組合せによる様々な２次及び／又は３次の和周波の発生過程等も競合する。上記実施の形態においては、このような２次及び／又は３次の和周波の発生過程等も、ＣＡＲＳ光を抑制することに利用できるので、より広い超解像顕微鏡法の実施が可能となる。また、本発明は、４次又は５次の非線形効果などで発生する信号光についても、上記以外の波長のクエンチ光により競合過程を人為的に誘導できれば、有効に適用することができる。
また、上記実施の形態では、ＣＡＲＳ過程の非線形光学効果を利用するため、クエンチ光を含めて３色のレーザ光を用いたが、ＳＨＧ光子発生過程の非線形光学効果を利用する場合は、２色のレーザ光を用いて超解像顕微鏡観察を行うことができる。図１３は、この場合の励起ダイアグラムを示す図である。
図１３において、例えば、凝集相中の分子の高い電子励起状態の量子準位は、ブロードである。この場合、励起光の角振動数ω１として、その２倍の周波数に対応するエネルギー準位が存在すれば、その２倍の２ω１の和周波が発生する。
しかし、別の角振動数ω２の励起光を照射したときに、ω２＋ω１の角振動数に対応するエネルギー準位も存在すれば、ω２＋ω１の和周波も発生することになる。その場合、ω１光がω２光と結合するので、この領域では２ω１の信号光の強度が低下することなる。つまり、この場合は、角振動数ω２の励起光がクエンチ光（第２照明光）となる。これにより、２色のレーザ光のみを用いる非線形光学効果による超解像顕微鏡を構成することができる。
特に、図１３に示したように、電子状態Ｓ１と電子状態Ｓｎとを有する場合は、ω１とω２とのカップリングが容易に起り、弱い強度の照明光により信号光強度の減少を誘導できる。しかし、照明光がピコ秒やフェムト秒の先頭値強度の高いレーザ光を用いる場合は、電子状態Ｓ１と電子状態Ｓｎとが共鳴しなくても、最小２色のレーザ光の任意の波長の組み合わせで、和周波や倍波を発生させることができるので、本発明を広く応用することができる。
Ｓ 試料
１０ 照明部
１１ 第１光源（スーパーコンティニュアム光源）
１２ マルチバンドパスフィルタ
１３ ビームコンバイナ
１４ 対物レンズ
１５ 第２光源
１６ １／４波長板
１７ 空間変調素子
２１ ファイバレーザ
２２ フォトニック結晶ファイバ
５０ 検出部
５１ コレクタレンズ
５２ 集光レンズ
５３ 共焦点ピンホール
５４ 分光器
５５ 分光器スリット
５６ 光電子増倍管
１１０ 照明部
１１１ 光源
１１２ コリメータレンズ
１１３ マルチバンドパスフィルタ
１１４ ガルバノミラー光学系
１１５ 瞳投影レンズ
１１６ 空間変調素子
１１７ 対物レンズ
１２０ マルチファイババンドル
１５０ 検出部
１５１ 捕集レンズ
１５２ 分光フィルタ
１５３ 集光レンズ
１５４ ２次元検出器

Claims (19)

  1. 対物レンズを経て波長の異なる複数色の照明光を少なくとも空間的に重複して試料に照射する照明部と、
    前記照明光の前記試料への照射に起因して、該試料から発生する信号光を検出する検出部と、を備え、
    前記照明部は、前記照明光として、前記試料に対して非線形光学効果を誘導する第１照明光と、該第１照明光とは前記対物レンズの集光面における波面分布が異なり、前記非線形光学効果の誘導を抑制する第２照明光と、を前記試料に照射し、
    前記検出部は、前記試料から前記非線形光学効果により発生する信号光を検出する、
    超解像顕微鏡。
  2. 請求項１に記載の超解像顕微鏡において、
    前記非線形光学効果は、２次非線形光学過程、３次非線形光学過程、４次非線形光学過程、５次非線形光学過程果のいずれかの過程で生じるものであり、
    前記２次非線形光学過程は、
    第２高調波発生（ＳＨＧ: second harmonic generation）、２次和周波発生（ＳＦＧ: sum frequency generation）、差周波発生（ＤＦＧ: difference frequency generation）、光パラメトリック過程（optical parametric process）のいずれかであり、
    前記３次非線形光学過程は、
    第３高調波発生（ＴＨＧ: third harmonic generation）、３次和周波発生（ＴＳＦＧ: third-order sum frequency generation）、コヒーレント反ストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ: coherent anti-Stokes Raman scattering）、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ: stimulated Raman scattering (ＳＲＧ: stimulated Raman gain, ＳＲＬ: stimulated Raman loss)）、光学カー効果（ＯＫＥ: optical Kerr effect）、ラマン誘導カー効果（ＲＩＫＥ: Raman induced Kerr effect）、誘導レイリー散乱（stimulated Rayleigh scattering）、誘導ブリルアン散乱（ＳＢＳ: stimulated Brillouin scattering）、誘導カー散乱（stimulated Kerr scattering）、誘導Rayleigh-Bragg散乱（stimulated Rayleigh-Bragg scattering）、誘導 Mie散乱（stimulated Mie scattering）、自己位相変調（ＳＰＭ: self phase modulation）、相互位相変調（ＸＰＭ: cross phase modulation）、光場複屈折（optical-field induced birefringence）、電界誘起ＳＨＧ（electric-field induced ＳＨＧ）のいずれかであり、
    前記４次非線形光学過程は、
    ４光波混合（ＦＷＭ: four-wave mixing）であり、
    前記５次非線形光学過程は、
    ハイパーラマン散乱（hyper-Raman scattering）、ハイパーレイリー散乱（hyper-Rayleigh scattering）、コヒーレント・アンチストークス・ハイパーラマン散乱（coherent anti-Stokes hyper-Raman scattering）のいずれかである、
    超解像顕微鏡。
  3. 請求項１又は２に記載の超解像顕微鏡において、
    前記第２照明光は、前記集光面における強度分布に極小値を有する、
    超解像顕微鏡。
  4. 請求項３に記載の超解像顕微鏡において、
    前記第１照明光は、前記集光面における強度分布に極大値を有する、
    超解像顕微鏡。
  5. 請求項４に記載の超解像顕微鏡において、
    前記第１照明光及び前記第２照明光はそれぞれコヒーレント光であり、
    前記照明部は、前記第２照明光の位相又は電場ベクトルの空間分布を変調する空間変調素子を備える、
    超解像顕微鏡。
  6. 請求項５に記載の超解像顕微鏡において、
    前記照明部は、前記集光面において、前記第１照明光の前記極大値と前記第２照明光の前記極小値とを同軸で重ねる、
    超解像顕微鏡。
  7. 請求項１乃至６のいずれかに記載の超解像顕微鏡において、
    前記検出部は、前記信号光として前記試料からの前方散乱光を検出する、
    超解像顕微鏡。
  8. 請求項７に記載の超解像顕微鏡において、
    前記非線形光学効果は、非線形ラマン効果、２次又は３次和周波発生効果、２次又は３次差周波発生効果のいずれかである、
    超解像顕微鏡。
  9. 請求項６に記載の超解像顕微鏡において、
    前記第１照明光は、波長の異なる少なくとも２色の照明光を含み、該少なくとも２色の照明光はそれぞれ前記集光面における強度分布に極大値を有する、
    超解像顕微鏡。
  10. 請求項６に記載の超解像顕微鏡において、
    前記空間変調素子は、前記第２照明光の位相を、光軸を中心とする１周回で０から２π又はその整数倍変化させる、
    超解像顕微鏡。
  11. 請求項６に記載の超解像顕微鏡において、
    前記空間変調素子は、前記第２照明光の光軸を中心として複数の同心状の領域を有し、隣接する前記領域において前記第２照明光の位相の符号を動径方向で反転させる、
    超解像顕微鏡。
  12. 請求項１１に記載の超解像顕微鏡において、
    前記空間変調素子は、前記領域の各々において、前記第２照明光の位相を、光軸を中心とする１周回で０から２π又はその整数倍変化させる、
    超解像顕微鏡。
  13. 請求項６に記載の超解像顕微鏡において、
    前記空間変調素子は、前記第２照明光の電場ベクトルの方向を、光軸を中心とする対称位置で反転させる、
    超解像顕微鏡。
  14. 請求項６に記載の超解像顕微鏡において、
    前記空間変調素子は、前記第２照明光の光軸を中心として複数の同心状の領域を有し、隣接する前記領域において前記第２照明光の電場ベクトルの方向を反転させる、
    超解像顕微鏡。
  15. 請求項５に記載の超解像顕微鏡において、
    前記照明部は、前記第１照明光及び前記第２照明光のそれぞれの波長が可変である、
    超解像顕微鏡。
  16. 請求項５に記載の超解像顕微鏡において、
    前記第２照明光は、有限帯域の波長幅を有する、
    超解像顕微鏡。
  17. 請求項５に記載の超解像顕微鏡において、
    前記第２照明光の波長は、前記試料における観察対象の分子の電子遷移による吸収端の波長より短い、
    超解像顕微鏡。
  18. 請求項５に記載の超解像顕微鏡において、
    前記照明部は、複数の光源点を有し、該複数の光源点からそれぞれ前記第１照明光及び前記第２照明光を抽出して前記試料に照射し、
    前記検出部は、複数の前記光源点に対応して前記試料から発生する複数の前記信号光を分離して検出する、
    超解像顕微鏡。
  19. 請求項１８に記載の超解像顕微鏡において、
    前記複数の光源点は、複数のスーパーコンティニュアム光源のファイバが束ねられたマルチファイババンドルの射出端からなり、
    前記検出部は、前記マルチファイババンドルのファイバ本数以上の画素数を有する２次元検出器を備える、
    超解像顕微鏡。
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