WO2015151461A1 - 超解像観察装置及び超解像観察方法 - Google Patents

超解像観察装置及び超解像観察方法 Download PDF

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文宏 嶽
知子 氏家
洋紀 矢澤
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株式会社ニコン
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    • G01N2201/0675—SLM

Definitions

  • the present invention relates to a super-resolution observation apparatus and a super-resolution observation method.
  • New unstained microscopes that may meet these requirements include stimulated emission microscopy, coherent anti-Stokes Raman scattering (CARS) microscope, stimulated Raman scattering (SRS) microscope, two-photon
  • CARS coherent anti-Stokes Raman scattering
  • SRS stimulated Raman scattering
  • the present invention provides a super-resolution observation apparatus and a super-resolution observation method capable of super-resolution observation without staining a sample in order to solve the above-described problems.
  • the first illumination light having the first optical frequency ⁇ 1 is condensed on the first region to be observed, and partially overlaps the first region.
  • the second illumination light having the second optical frequency ⁇ 2 ′ is collected in the second region, and the third optical frequency ⁇ is included in the third region including the non-overlapping region that does not overlap with the second region in the first region.
  • the first illumination light having the first optical frequency ⁇ 1 is collected in the first region to be observed, and partially overlaps the first region.
  • the second illumination light having the second optical frequency ⁇ 2 ′ is collected in the second region, and the third optical frequency ⁇ is included in the third region including the non-overlapping region that does not overlap with the second region in the first region.
  • the third illumination light having 2 is condensed, and the light generated in the entire first region, the second region, and the third region is changed according to the energy level change of the substance existing in the non-overlapping region.
  • the signal light generated is extracted.
  • a super-resolution observation apparatus and a super-resolution observation method capable of super-resolution observation without staining a sample are realized.
  • FIG. 1 is a configuration diagram of the stimulated emission microscope of the present embodiment.
  • the stimulated emission microscope includes a pulsed laser light source 11, a lens 12, beam splitters 131 and 132, a mirror M1, optical parametric oscillators (OPOs) 141, 142, and 143, and an acoustic wave.
  • An optical modulator (AOM) 15, a phase plate 18, a mirror M2, a dichroic mirror 133, 134, an objective lens 19, a sample 20, a sample stage 28, an objective lens 21, and a wavelength
  • a selection filter 22, a condenser lens 23, a photodetector 24 such as a photodiode, a lock-in amplifier 25, a signal generator 26, and a personal computer 27 are arranged.
  • the pulse laser light source 11 is a pulse laser light source such as a femtosecond pulse laser light source or a picosecond pulse laser light source.
  • the pulse oscillation repetition frequency fr by the pulse laser light source 11 is 80 MHz, for example, and the pulse width ⁇ T of the pulse laser light oscillated by the pulse laser light source 11 is, for example, several hundred fs (femtosecond).
  • the pulsed laser light emitted from the pulsed laser light source 11 becomes a parallel light beam having a large diameter by the lens 12 and enters the beam splitter 131.
  • the pulse laser beam incident on the beam splitter 131 is divided into a pulse laser beam that passes through the beam splitter 131 and a pulse laser beam that reflects off the beam splitter 131, and the pulse laser beam that has passed through the beam splitter 131 is an optical parametric oscillator 141.
  • the pulse laser beam reflected by the beam splitter 131 is incident on the beam splitter 132, the pulse laser beam is split into a pulse laser beam that reflects the beam splitter 132 and a pulse laser beam that transmits the beam splitter 132, and the pulse laser beam reflected by the beam splitter 132.
  • the laser light is incident on the optical parametric oscillator 142.
  • the pulse laser beam that has passed through the beam splitter 132 is reflected by the mirror M 1 and enters the optical parametric oscillator 143.
  • the optical parametric oscillator 141 converts the optical frequency of the incident pulse laser light into ⁇ 1
  • the optical parametric oscillator 142 converts the optical frequency of the incident pulse laser light into ⁇ 2 ′
  • the optical parametric oscillator 143 It converts the optical frequency of the pulsed laser light to ⁇ 2.
  • the magnitude relationship between the optical frequencies ⁇ 1 , ⁇ 2 ′, and ⁇ 2 is ⁇ 1 > ⁇ 2 ′, ⁇ 1 > ⁇ 2 , and ⁇ 2 ′ ⁇ 2 .
  • a predetermined frequency difference is provided between the optical frequencies ⁇ 2 and ⁇ 2 ′ so that the wavelength of the light having the optical frequency ⁇ 2 ′ and the light having the optical frequency ⁇ 2 can be separated.
  • This frequency difference is preferably several nm or more in terms of a wavelength difference.
  • Acousto-optic modulator 15 emerging optical path of the optical parametric oscillator 141, i.e. disposed alone optical path of the optical frequency omega 1 of the pulsed laser beam, modulating the intensity of the pulse laser beam toward the time direction at the modulation frequency f 1. Note that the modulation frequency f 1 and the modulation timing of the pulse laser beam by the acousto-optic modulator 15 are controlled by the signal generator 26.
  • the phase plate 18 is arranged in the emission optical path of the optical parametric oscillator 142, that is, in the single optical path of the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 ′.
  • the phase delay amount distribution of the phase plate 18 is set non-uniformly in the circumferential direction around the optical axis and uniform in the radial direction around the optical axis. Further, the phase delay amount distribution in the circumferential direction of the phase plate 18 is a distribution in which a phase difference ⁇ is given between two positions whose circumferential positions are shifted by 180 °. Therefore, the shape of the light spot (described later) formed by the pulsed laser light having the optical frequency ⁇ 2 ′ on the observation target surface P 0 of the sample 20 is a donut shape.
  • the pulsed laser light having the optical frequency ⁇ 1 emitted from the optical parametric oscillator 141 reflects the mirror M 2 via the acousto-optic modulator 15 and reflects the dichroic mirror 134 via the dichroic mirror 133.
  • the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 ′ emitted from the optical parametric oscillator 142 is reflected by the dichroic mirror 133 via the phase plate 18 and integrates the optical path with the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 1 .
  • the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 emitted from the optical parametric oscillator 143 passes through the dichroic mirror 134 and integrates the optical path with the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 1 and the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 ′.
  • a light intensity adjustment mechanism (ND filter) (not shown) is installed in each of the emission optical paths of the optical parametric oscillators 141, 142, and 143. According to these ND filters, the intensity of the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 1 , the intensity of the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 ′, and the intensity of the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 can be adjusted independently. Can do.
  • the phase plate 18 as described above, the optical frequency omega 1 of the pulsed laser beam, the optical frequency omega 2 'pulsed laser beam, among the light frequency omega 2 of the pulsed laser beam, the optical frequency omega 2' of the pulsed laser light alone Located only in the optical path. Therefore, the light spot optical frequency omega 1 of the pulsed laser light is formed on the observation target plane P 0 is circular, the light spot pulsed laser beam to form an optical frequency omega 2 'the observation target plane P 0 is donut The light spot formed by the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 on the observation target surface P 0 is circular.
  • the optical path length of the pulsed laser light having the optical frequency ⁇ 1 and the optical frequency ⁇ 2 ′ are set so that the order of irradiation to the observation target surface P 0 is as follows.
  • the relationship between the optical path length of the pulse laser beam and the optical path length of the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 is adjusted in advance.
  • Pulse laser beam with optical frequency ⁇ 1 Pulse laser beam with optical frequency ⁇ 2 ′ (3) Pulse laser beam with optical frequency ⁇ 2 Of these, the pulse laser beam with optical frequency ⁇ 1 is the observation target surface P
  • the circular light spot formed at 0 has a function of transferring (exciting) the energy level of electrons of a specific observation target substance to the excitation level, and the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 ′ is observed on the observation target plane P.
  • the donut-shaped light spot formed at 0 has the function of generating stimulated emission light by transferring the excited electrons to the ground level (stimulated emission), and the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 is the observation target surface.
  • the circular light spot formed at P 0 has a function of generating stimulated emission light by shifting excited electrons that have not been stimulated and emitted by the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 2 ′ to the ground state (stimulated emission). is there.
  • the optical frequency ⁇ 1 is preferably set to a value in the wavelength range of about ultraviolet to visible in terms of wavelength, and each of the optical frequencies ⁇ 2 and ⁇ 2 ′ is about in the range of ultraviolet to It is desirable to set the value within the wavelength range of the near infrared region.
  • the pulse laser beam having the optical frequency ⁇ 1 that is first irradiated to the observation target surface P 0 is referred to as “excitation light”, and the optical frequency ⁇ that is subsequently irradiated.
  • the 2 ′ pulse laser beam is referred to as “doughnut guide light”, and the last pulse laser beam with the optical frequency ⁇ 2 that is irradiated is referred to as “circular guide light”.
  • the individual light spot formed on the observation target plane P 0, is drawn shifted in the optical axis direction.
  • excitation light spot a circular area observation target plane P 0 Oite excitation light is irradiated
  • donor donut shaped region donut inducing light is irradiated in the observation target plane P 0 This is referred to as a “guide light spot”
  • guide light spot a circular region irradiated with circular guide light on the observation target surface P 0 is referred to as a “circular guide light spot”.
  • the contour of the excitation light spot Ae, the inner contour of the donut guide light spot Ad, and the contour of the circular guide light spot Ao are substantially coincident. This is because the size of these contours is almost determined by the diffraction limit.
  • the intensity of the donut guiding light is set sufficiently high so that the inner contour of the donut guiding light spot Ad is smaller than the contour of the excitation light spot Ae. .
  • the transmittance of the ND filter inserted in the single optical path of the donut guiding light is set high.
  • the reflection ratio of the beam splitters 131 and 132 is set high.
  • the donut-induced light spot Ad overlaps with the excitation light spot Ae in the donut-shaped region Ad ′ as indicated by the oblique line in the lower right of FIG.
  • the donut-shaped region Ad ′ overlapping with the donut induction light spot Ad is referred to as “overlapping region Ad ′”, and the excitation light spot Ae is a circular shape that does not overlap with the donut induction light spot Ad.
  • the area Am is referred to as “non-overlapping area Am”.
  • the super-resolution effect is obtained by limiting the signal light detection source (observation target point) only to the non-overlapping region Am.
  • limiting the detection source of the signal light to a region (non-overlapping region Am) smaller than the size determined by the diffraction limit (the size of the excitation light spot Ae) is referred to as “super-resolution”.
  • a set of the excitation light spot Ae, the donut guide light spot Ad, and the circular guide light spot Ao is simply referred to as “light spot”.
  • FIG. 3A shows the time waveform of the excitation light
  • FIG. 3B shows the time waveform of the donut guide light
  • FIG. 3C shows the time waveform of the circular guide light. It is.
  • FIG. 3D is an enlarged view of the waveform of three pulses of excitation light, donut guide light, and circular guide light on the same coordinates.
  • the pulse of the excitation light is indicated by a solid line
  • the pulse of donut induced light is indicated by a fine dotted line
  • the pulse of circular induced light is indicated by a rough dotted line.
  • the timing at which the pulse of excitation light reaches the observation target surface P 0 the timing at which the pulse of donut induced light reaches the observation target surface P 0
  • the pulse of circular guide light is the observation target surface
  • the deviation ⁇ from the timing to reach P 0 is set to a degree slightly larger than the pulse width ⁇ T of each of the excitation light, the donut induced light, and the circular induced light, for example, several hundred fs (femtosecond).
  • the deviation ⁇ is not longer than a period during which electrons of the observation target substance can maintain the excited state (excited state lifetime, for example, approximately femtosecond to picosecond). This ensures that stimulated emission occurs.
  • the pulse width ⁇ T is also not longer than the lifetime of the excited state. This makes it possible to reliably separate pulses that are close in time while keeping the deviation ⁇ below the lifetime of the excited state.
  • the single optical path of the excitation light, the donut-induced light, and the circular guided light reach the observation target surface P 0 .
  • the single optical path of the excitation light, the donut-induced light It is desirable that at least two of the single optical path and the single optical path of the circular guide light are provided with an optical path length adjusting mechanism (not shown) configured by a movable mirror or the like.
  • the sample 20 is, for example, a transparent living cell housed in a culture container together with a culture solution, and a specific substance (for example, a specific protein such as hemoglobin) in the living cell is an observation target substance. is there. Since the stimulated emission microscope uses an energy level unique to the observation target substance, the observation target substance does not need to be fluorescently stained in advance.
  • a specific substance for example, a specific protein such as hemoglobin
  • the sample stage 28 is a transmission type stage that supports the sample 20, moves the sample 20 in the optical axis direction (Z direction), and moves the sample 20 in a direction perpendicular to the optical axis (XY direction).
  • Z direction optical axis direction
  • XY direction optical axis
  • the observation target plane P 0 can be two-dimensionally scanned (at the observation target point in the spot).
  • the light emitted from the light spot on the observation target surface P 0 that is, the excitation light emitted from the light spot, the donut-induced light emitted from the light spot, the circular induced light emitted from the light spot, and the stimulated emission light generated at the light spot are:
  • the light enters the objective lens 21 from the front end side of the objective lens 21.
  • the objective lens 21 (numerical aperture, magnification, etc.) is the same as the specification of the objective lens 19, the positional relationship and orientation relationship between the objective lens 21 and the objective lens 19 is symmetrical with respect to the observation target plane P 0 is there.
  • the specification of the objective lens 21 and the specification of the objective lens 19 are common here, they may not be completely common.
  • the numerical aperture of the objective lens 21 may be larger than the numerical aperture of the objective lens 19.
  • the light incident on the objective lens 21 from the tip side that is, the excitation light, donut induced light, circular induced light, and stimulated emission light emitted from the light spot on the observation target surface P 0 is emitted from the pupil side of the objective lens 21. It goes to the photodetector 24 through the wavelength selection filter 22 and the condenser lens 23 in this order.
  • the wavelength selection filter 22 is given wavelength selectivity that cuts light of the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 ′ and allows light of the optical frequency ⁇ 2 to pass.
  • the excitation light (light frequency ⁇ 1 ) emitted from the light spot and the donut-induced light (light frequency ⁇ 2 ′) emitted from the light spot do not enter the photodetector 24 and are circular guided light emitted from the light spot.
  • Optical frequency ⁇ 2 and stimulated emission light (optical frequency ⁇ 2 ) generated at the light spot enter the photodetector 24.
  • the photodetector 24 is a photoelectric conversion element such as a photodiode that converts the intensity of incident light into an electrical signal.
  • the lock-in amplifier 25 performs lock-in detection using, as a signal, a component that changes at the same frequency as the modulation frequency f 1 of the excitation light from the electrical signal output from the photodetector 24.
  • the detection frequency and detection timing of the lock-in amplifier 25 are controlled by the signal generator 26.
  • the personal computer 27 takes in the signal detected by the lock-in amplifier 25.
  • the personal computer 27 during scanning as described above, when viewed point performs signal capture when in the position of the observation target surface P 0, to obtain a distribution of the signal in the observation object surface as stimulated emission image, not Display on the monitor shown.
  • the electron energy level of the observation target substance located at the excitation light spot Ae shifts (excitation) to the excitation level.
  • the energy level of the excited electrons returns to the ground level in the overlapping region Ad ′, but in the non-overlapping region Am, the excited electrons There is no change in the energy level.
  • the detection source (signal acquisition source) of the stimulated emission light is smaller than the resolution limit (the size of the excitation light spot Ae) of the objective lens 19 by irradiation with the donut induced light. It is limited only to the overlapping area Am. Therefore, the stimulated emission microscope of the present embodiment is capable of super-resolution observation of the sample 20.
  • signal light stimulated emission light
  • noise light generated in a sample in response to the induced light and stimulated light emitted from the sample
  • the intensity of the excitation light is modulated at the frequency f 1 by the acousto-optic modulator 15 as described above, and is changed at the frequency f 1 from the electrical signal output from the photodetector 24.
  • the lock-in was detected by the lock-in amplifier 25.
  • FIG. 5 is a diagram for explaining light incident on the photodetector 24.
  • FIG. 5A is a diagram for explaining the relationship between the stimulated emission process and the light incident on the photodetector 24, and
  • FIG. 5B shows the waveforms of excitation light, donut-induced light, and circular guided light. It is a figure explaining the relationship with the waveform of the light which injects into the photodetector 24.
  • FIG. 5A is a diagram for explaining the relationship between the stimulated emission process and the light incident on the photodetector 24, and
  • FIG. 5B shows the waveforms of excitation light, donut-induced light, and circular guided light. It is a figure explaining the relationship with the waveform of the light which injects into the photodetector 24.
  • FIG. 5 illustrates light traveling from the non-overlapping area Am to the photodetector 24, and the right side of FIG. 5 illustrates light traveling from the overlapping area Ad ′ to the photodetector 24.
  • the light from the non-overlapping area Am and the light from the overlapping area Ad ′ are drawn separately, but the actual photodetector 24 includes the light from the non-overlapping area Am and the overlapping area Ad ′.
  • the incident light is not distinguished from the incident light.
  • the donut-induced light is not irradiated, so that the generation of signal light is not suppressed at all. Therefore, the light traveling from the non-overlapping area Am toward the photodetector 24 is both signal light and noise light.
  • the overlapping region Ad ' is irradiated with donut-induced light, so that generation of signal light is suppressed. Therefore, the light traveling from the overlapping region Ad ′ to the photodetector 24 is only noise light.
  • the excitation light is modulated at the frequency f 1 as shown in FIGS.
  • the amount of signal light changes according to the intensity of the excitation light, whereas the amount of noise light does not depend on the intensity of the excitation light.
  • the modulation of the frequency f 1 is transferred to the waveform of light from the non-overlapping area Am toward the photodetector 24 (the modulation amount is the intensity of the signal light).
  • the modulation of the frequency f 1 is transferred to the waveform of the light from the overlapping region Ad ′ toward the photodetector 24.
  • the intensity of the signal light can be detected with high accuracy by performing lock-in detection of a signal that changes at the frequency f 1 from the electrical signal output from the photodetector 24 as in the present embodiment (see above). Description of lock-in detection.)
  • the wavelength selection filter 22 that passes the light is disposed in front of the photodetector 24.
  • the donut guide light and the circular guide light may be polarized and separated. That, together with providing a difference in the polarization direction of the circular induced light directed to the polarization direction of the observation target surface of the donut-induced light toward the observation target plane P 0, and cuts light of the same polarization direction as the donut-induced light circular induction light
  • An analyzer that allows light of the same polarization direction to pass may be disposed in front of the photodetector 24 (see the following modification).
  • FIG. 6 is a block diagram of a modified stimulated emission microscope.
  • the optical frequency of the donut induced light is set to be the same as the optical frequency ⁇ 2 of the circular induced light.
  • the wavelength selection filter 22 is provided with wavelength selectivity that cuts light having the optical frequency ⁇ 1 and allows light having the optical frequency ⁇ 2 to pass.
  • a polarizer 41 and a quarter wavelength plate 51 are sequentially arranged in each of the single optical path of the excitation light, the single optical path of the donut induced light, and the single optical path of the circular guided light.
  • a quarter-wave plate 60 and an analyzer 70 are sequentially disposed between the objective lens 21 and the condenser lens 23.
  • the axial direction of the polarizer 41 and the quarter-wave plate 51 are adjusted in advance, as shown in FIG. 7, the excitation light is incident on the observation target plane P 0 and a circular induction light the polarization state of the is set to circular polarization to pivot in the same direction (e.g., right-handed circularly polarized light), the polarization state of the donut-induced light incident on the observation target plane P 0 is the reverse turning of the excitation light and the circular induction light Of circularly polarized light (for example, left-handed circularly polarized light).
  • the axial direction of the quarter wave plate 60 is also adjusted in advance, and the polarization states of the excitation light and the circular induced light toward the analyzer 70 are in a predetermined direction as shown on the left side of FIG.
  • the polarization state of the donut induced light toward the analyzer 70 is set to the linearly polarized light in the direction orthogonal to the excitation light and the circular induced light.
  • the analyzer is in the same direction as the polarization direction of the circular induced light and the excitation light incident on the analyzer 70 (that is, the direction orthogonal to the polarization direction of the donut induced light). 70 transmission axis directions are set.
  • the donut-induced light emitted from the observation target surface P 0 is cut before the photodetector 24, and the circular guided light emitted from the observation target surface P 0 is incident on the photodetector 24. To do.
  • the polarization direction of the excitation light incident on the observation target plane P so were matched to the polarization direction of the circular induced light incident on the observation target plane P 0, the efficiency of the stimulated emission in the non-overlapping regions Am Can be increased.
  • the donut-induced light spot can be isotropic (rotationally symmetric about the optical axis).
  • the polarization state of the donut guiding light passing through the phase plate 18 may be linearly polarized light.
  • Each polarization state of the guide light may be linearly polarized light.
  • the polarization direction of the donut guide light may be orthogonal to the polarization direction of the circular guide light and the polarization direction of the excitation light in front of the photodetector 24.
  • the timing at which the excitation light reaches the observation target surface P 0 the timing at which the donut guide light reaches the observation target surface P 0 , and the circular guide light at the observation target surface P 0 .
  • the arrival timing is shifted, but at least two of these three timings may be matched.
  • circular observation light may be irradiated after simultaneously irradiating the observation target surface P 0 with excitation light and donut induction light (provided that ⁇ 2 ′ ⁇ ⁇ 2 ).
  • the excitation light, the donut induction light, and the circular induction light may be simultaneously irradiated in a state where a wavelength difference of 3600 cm ⁇ 1 or more in energy conversion is applied between the excitation light and the circular induction light (provided that ⁇ 2 ′ ⁇ ⁇ 2 ).
  • the present invention is applied to a stimulated emission microscope.
  • the present invention can be similarly applied to an excited state absorption (ESA) microscope.
  • ESA excited state absorption
  • the light of the optical frequency ⁇ 1 whose light spot is circular is used as the excitation light
  • the light of the optical frequency ⁇ 2 ′ whose light spot is a donut shape is used as the guide light.
  • the photon energy (optical frequency ⁇ 2 ) of the remaining light having a circular light spot is set to a value corresponding to the energy difference between the first excited state and the second excited state of the ESA. Is done.
  • the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 ′ are set in the wavelength range from about the ultraviolet region to the visible region in terms of wavelength
  • the optical frequency ⁇ 2 is in the wavelength range from about the visible region to the near infrared region in terms of wavelength. Is set.
  • the present invention is applied to a stimulated emission microscope.
  • the present invention can also be applied to a GSD (Ground State Depletion) microscope that depletes ground state electrons. it can.
  • the optical frequency omega 1 of the light beam spot is circular
  • the light spot using the light of the optical frequency omega 2 ' is a donut shape
  • the light spot and the optical frequency omega 2 of the light is circular
  • Their optical frequencies ⁇ 1 , ⁇ 2 ′, ⁇ 2 are set to values that cause excitation from the ground state to the excited state.
  • each of the optical frequencies ⁇ 1 , ⁇ 2 ′, and ⁇ 2 is set in a wavelength range of approximately ultraviolet to visible in terms of wavelength.
  • FIG. 9 is a configuration diagram of the CARS microscope.
  • the optical frequency ⁇ 2 ′ of the donut guiding light is set to be the same as the optical frequency ⁇ 2 of the circular guiding light.
  • the timing at which the excitation light (optical frequency ⁇ 1 ) is irradiated onto the observation target surface P 0 , the timing at which the donut guide light (optical frequency ⁇ 2 ) reaches the observation target surface P 0 , and circular guidance The timing at which the light (optical frequency ⁇ 2 ) reaches the observation target plane P 0 is matched.
  • the pulse shapes (pulse light intensity and pulse width) of the excitation light, the donut guide light, and the circular guide light, and the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 are within the light spot on the observation target surface P 0 .
  • the CARS process is set to occur in the observation target substance ( ⁇ 1 > ⁇ 2 ).
  • the pulse shape of these lights can be adjusted by the shape of the pulse oscillated by the pulse laser light source 11, the transmission reflectance of the beam splitter 131, and the transmission reflectance of the beam splitter 132 (note that the ND filter described above is used). You may adjust by the transmittance
  • the light having the same optical frequency (2 ⁇ 1 ⁇ 2 ) as the CARS light is passed through the wavelength selection filter 22 in the CARS microscope, and the light having the optical frequency ⁇ 1 and the light having the optical frequency ⁇ 2 are cut. Wavelength selectivity is provided.
  • a highly sensitive photodetector such as a photomultiplier tube (PMT) as the photodetector 24 of the CARS microscope.
  • PMT photomultiplier tube
  • the polarizer 41 is disposed in the single optical path of the excitation light
  • the polarizer 41 and the quarter wavelength plate 51 are disposed in the single optical path of the donut guiding light.
  • the polarizer 41 and the quarter-wave plate 51 are sequentially arranged in the single optical path of the circular guide light
  • the analyzer 70 is arranged between the objective lens 21 and the condenser lens 23.
  • the axial direction of the polarizer 41 and the quarter-wave plate 51 are adjusted in advance, as shown in FIG. 10, the polarization state of the pumping light to be incident on the observation target plane P 0 is , the predetermined direction of the linearly polarized light (hereinafter, 0 ° and the direction of linearly polarized light.) is set to the polarization state of the donut-induced light incident on the observation target plane P 0 is circularly polarized light of right turn or left turn (hereinafter , is set to.) and right-handed circularly polarized light, the polarization state of the circular induced light incident on the observation target plane P 0 is the circularly polarized light to pivot opposed to the donut-induced light (here the left-handed circularly polarized light) Is set.
  • the predetermined direction of the linearly polarized light hereinafter, 0 ° and the direction of linearly polarized light.
  • both the donut-induced light that is right-handed circularly polarized light and the circular guided light that is left-handed circularly polarized light are incident on the overlapping area Ad ′ of the observation target surface P 0 .
  • the total polarization state of the guide light is a combination of donut guide light and circular guide light.
  • the amplitude of the donut-induced light toward the observation target plane P 0, the donut-induced light phase toward the observation target plane P 0, and amplitude of the circular induced light toward the observation target plane P 0, the observation target surface P 0 relationship between the circular induction light phase toward the synthetic direction of polarization of the donut-induced light and circular stimulating light toward the observation target plane P 0 is assumed to be previously adjusted to be 90 ° direction.
  • the donut-induced light that is right-handed circularly polarized light is not incident on the non-overlapping region Am, so the total polarization state of the guided light in the non-overlapping region Am is left-handed circularly polarized light.
  • CARS light (optical frequency 2 ⁇ 1 - ⁇ 2 ) generated in the non-overlapping region Am is the same as the guide light acting on the non-overlapping region Am.
  • CARS light (optical frequency 2 ⁇ 1 ⁇ 2 ) generated in the overlapping region Ad ′ is “linearly polarized light in the 90 ° direction” in the same manner as the induced light acting on the overlapping region Ad ′.
  • the transmission axis direction of the analyzer 70 is set to be the same as the polarization direction of excitation light (here, 0 ° direction) as shown in FIG.
  • the CARS light generated in the overlapping region Ad ′ is cut before the photodetector 24, and the CARS light generated in the non-overlapping region Am is incident on the photodetector 24.
  • the detection source of CARS light can be limited only to the non-overlapping region Am smaller than the resolution limit of the objective lens 19 (the size of the excitation light spot Ae). That is, in the CARS microscope of the present embodiment, super-resolution observation of the sample 20 is possible.
  • the donut-induced light spot Ad can be isotropic (rotationally symmetric about the optical axis).
  • the polarization state of the donut guiding light passing through the phase plate 18 may be linearly polarized light.
  • the excitation light incident on the observation target plane P 0 donuts induced light incident on the observation target surface P 0, the circular induction light incident on the observation target surface P 0
  • Each polarization state may be linearly polarized light.
  • the polarization direction of the donut-induced light incident on the observation target plane P it is sufficient to perpendicular to the polarization direction of the circular induction light and the excitation light incident on the observation target plane P 0.
  • the intensity of the excitation light is modulated at the frequency f 1 in the time direction, and lock-in detection is performed at the frequency f 1 or 2f 1. Thereby, the detection accuracy of CARS light may be improved.
  • the lock-in detection method is as described in the first embodiment.
  • the CARS light from the overlapping region Ad ′ in front of the photodetector 24 in order to cut the CARS light from the overlapping region Ad ′ in front of the photodetector 24, the CARS light from the overlapping region Ad ′ and the CARS light from the non-overlapping region Am was separated by polarization.
  • the microscope of the present embodiment is a CARS microscope in which signal light (CARS light) having an optical frequency (2 ⁇ 1 ⁇ 2 ) is detected, but signal light having an optical frequency (2 ⁇ 1 ⁇ 2 ) ( If signal light (CSRS light) having an optical frequency (2 ⁇ 2 ⁇ 1 ) is used as a detection target instead of CARS light), a coherent Stokes Raman scattering (CSRS) microscope is realized. Similarly to the CARS microscope, this CSRS microscope can reflect the molecular vibration of the non-overlapping region Am with respect to the signal light (CSRS light), so that the unstained super-resolution observation of the sample 20 is possible.
  • CSRS coherent Stokes Raman scattering
  • FIG. 12 is a block diagram of a dual frequency lock-in type CARS microscope.
  • the polarizer 41, the quarter-wave plate 51, and the analyzer 70 are omitted, and instead, an acousto-optic modulator 15, a signal generator 26, and a lock-in amplifier 25 are provided. It is done.
  • the acousto-optic modulator 15 is arranged in both the single optical path of the excitation light and the single optical path of the circular guide light.
  • the acousto-optic modulator 15 arranged in the optical path of the excitation light modulates the intensity of the excitation light in the time direction at the frequency f 1.
  • the acousto-optic modulator 15 arranged in the optical path of the circular guide light The light intensity is modulated at a frequency f 2 in the time direction (where f 1 ⁇ f 2 ).
  • the CARS light (optical frequency 2 ⁇ 1 ⁇ 2 ) generated in the non-overlapping region Am has frequencies f 1 , f 2 , 2f 1 ,
  • the lock-in amplifier 25 in the two-frequency lock-in type CARS microscope performs non-overlapping Am by performing lock-in detection at any of the frequencies f 2 ,
  • the detection source of CARS light can be limited only to the non-overlapping region Am smaller than the resolution limit of the objective lens 19 (the size of the excitation light spot Ae). That is, the super-resolution observation of the sample 20 is possible even with a two-frequency lock-in type CARS microscope.
  • the relationship between the frequencies f 1 and f 2 is not important, but each of the frequencies f 1 and f 2 and the detection frequency of the lock-in detection (frequency f 2 ,
  • the shape of the donut (the intensity distribution of the donut induced light spot) is made more isotropic. can do.
  • the CSRS microscope described in the second embodiment can be modified in the same manner as in this modification (that is, can be transformed into a two-frequency lock-in type). However, in that case, it is desirable to set the detection frequency for lock-in detection to any one of f 1 ,
  • an SRS microscope will be described as a third embodiment of the present embodiment. Here, only differences from the second embodiment (the CARS microscope of FIG. 9) will be described.
  • FIG. 15 is a configuration diagram of the SRS microscope.
  • the pulse shapes (pulse light intensity and pulse width) of excitation light, donut guide light, and circular guide light, and optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 are within the light spot on the observation target surface P 0 .
  • the SRS process is set to occur in the observation target substance ( ⁇ 1 > ⁇ 2 ).
  • the pulse shape of these lights can be adjusted by the shape of the pulse oscillated by the pulse laser light source 11, the transmission reflectance of the beam splitter 131, and the transmission reflectance of the beam splitter 132 (note that the ND filter described above is used). You may adjust by the transmittance
  • the optical frequency of the signal light (SRS light) to be detected by the SRS microscope is ⁇ 1 or ⁇ 2 .
  • the signal light of the optical frequency (omega 1 or omega 2) is the same as the excitation light of the optical frequency (omega 1) or stimulating light of optical frequencies (omega 2), an acousto-optic modulator 15, signal generator 26
  • the lock-in detection by the lock-in amplifier 25 is required. Note that the configuration example shown in FIG. 15 is a configuration example in which the optical frequency to be detected and omega 2.
  • the optical frequency to be detected is ⁇ 1
  • the optical frequency ⁇ 1 in FIG. 15 may be replaced with ⁇ 2 and the optical frequency ⁇ 2 may be replaced with ⁇ 1 . Since lock-in detection for eliminating the influence of noise light having the same optical frequency as that of signal light is known, the description thereof is omitted.
  • the wavelength selection filter 22 in the SRS microscope is given wavelength selectivity that allows light having the same optical frequency ( ⁇ 1 or ⁇ 2 ) as SRS light to pass and cuts light having an optical frequency different from that of the SRS light.
  • signal light (here, SRS light) generated in the overlapping region Ad ′ of the observation target surface P 0 and the non-overlapping region Am The polarization direction is deviated from the signal light (SRS light in this case) generated in the above. Therefore, even in the SRS microscope, the signal light (here, SRS light) generated in the non-overlapping area Am can be separated from the signal light (here, SRS light) generated in the overlapping area Ad ′.
  • this embodiment can also be modified similarly to the second embodiment (CARS microscope).
  • CARS microscope CARS microscope
  • two-frequency lock-in instead of polarization-separating SRS light from the overlapping region Ad ′ and SRS light from the non-overlapping region Am, “two-frequency lock-in” may be performed (see the following modification example). ).
  • a dual-frequency lock-in SRS microscope will be described as a modification of the third embodiment. Here, only differences from the third embodiment will be described.
  • FIG. 17 is a block diagram of a dual frequency lock-in SRS microscope.
  • the polarizer 41, the quarter-wave plate 51, and the analyzer 70 are omitted, and instead of being used not only for the single light of the excitation light but also for the single light path of the circular guide light.
  • An acousto-optic modulator 15 is arranged.
  • the acousto-optic modulator 15 disposed in the single optical path of the excitation light modulates the intensity of the excitation light in the time direction at the frequency f 1
  • the acousto-optic modulator 15 disposed in the single optical path of the circular guide light includes: The intensity of the circular guide light is modulated at the frequency f 2 in the time direction (where f 1 ⁇ f 2 ).
  • the lock-in amplifier 25 detects the SRS light (optical frequency ⁇ 2 ) generated in the non-overlapping region Am by performing lock-in detection at the frequency
  • the detection source of the SRS light (optical frequency ⁇ 2 ) is limited only to the non-overlapping region Am smaller than the resolution limit of the objective lens 19 (the size of the excitation light spot Ae). Can do. That is, the super-resolution observation of the sample 20 is possible even with a two-frequency lock-in SRS microscope.
  • optical frequency of the signal light is ⁇ 2 here, it goes without saying that it may be ⁇ 1 .
  • the shape of the donut (the intensity distribution of the donut induced light spot) is made more isotropic. can do.
  • FIG. 19 is a block diagram of a two-photon absorption microscope.
  • the configuration of the two-photon absorption microscope is basically the same as the configuration of the third embodiment (SRS microscope).
  • the pulse shapes (pulse light intensity and pulse width) of the excitation light, donut guide light, and circular guide light, and the optical frequencies ⁇ 1 and ⁇ 2 are the light on the observation target surface P 0 .
  • the two-photon absorption process is set to occur in the observation target substance in the spot ( ⁇ 1 > ⁇ 2 ).
  • the optical frequency of the two-photon absorption microscope detection signal light to be (decrease of light by two-photon absorption) it is omega 2
  • the wavelength selective filter 22 in the two-photon absorption microscope, the signal light (two-photon absorption) The wavelength selectivity of passing light having the same optical frequency ( ⁇ 2 ) as that of the light reduced by (2), and cutting light having an optical frequency ( ⁇ 1 ) different from that of the signal light (light reduced by two-photon absorption). Is granted.
  • the present embodiment can be modified similarly to the third embodiment (SRS microscope).
  • SRS microscope SRS microscope
  • two-frequency lock-in instead of polarization-separating the signal light from the overlapping region and the signal light from the non-overlapping region, “two-frequency lock-in” may be performed (see the following modification).
  • a two-frequency lock-in type two-photon absorption microscope will be described as a modification of the fourth embodiment.
  • only differences from the fourth embodiment will be described.
  • FIG. 20 is a configuration diagram of a two-frequency lock-in type two-photon absorption microscope.
  • the polarizer 41, the quarter-wave plate 51, and the analyzer 70 are omitted, and instead of the single light of the excitation light, the single optical path of the circular guide light is used instead. Also, an acousto-optic modulator 15 is arranged.
  • the acousto-optic modulator 15 arranged in the optical path of the excitation light modulates the intensity of the excitation light in the time direction at the frequency f 1.
  • the acousto-optic modulator 15 arranged in the optical path of the circular guide light The light intensity is modulated at a frequency f 2 in the time direction (where f 1 ⁇ f 2 ).
  • the lock-in amplifier 25 performs signal lock-in detection at the frequency
  • the detection source of the signal light (the decrease in light due to the two-photon absorption) is a non-overlapping region smaller than the resolution limit of the objective lens 19 (the size of the excitation light spot Ae). It can be limited to Am only. That is, the super-resolution observation of the sample 20 is possible even with a two-frequency lock-in type two-photon absorption microscope.
  • for detecting lock-in have a non-integer multiple relationship.
  • the shape of the donut (the intensity distribution of the donut induced light spot) is made more isotropic. can do.
  • the size of the non-overlapping area Am on the observation target surface P 0 may be reduced in order to further enhance the super-resolution effect (spatial resolution).
  • the intensity of the donut-induced light may be increased.
  • the transmittance of the ND filter inserted in the single optical path of the donut guiding light may be set high.
  • the reflection ratio of the beam splitters 131 and 132 may be set high.
  • the orthogonality between the polarization of light from the overlapping region Ad ′ and the polarization of light from the non-overlapping region Am deteriorates as the intensity of the donut-induced light increases. There is a possibility that the ratio of signals from the overlapping area Am may be reduced. For this reason, when using polarized light, it is desirable to appropriately adjust the intensity of the donut-induced light in consideration of the polarization state of the light from the overlapping region Ad ′.
  • the combination of one laser light source and three optical parametric oscillators is used to generate three laser beams having different optical paths.
  • one laser light source and two parametric oscillators are used.
  • a combination with an oscillator may be used.
  • the laser beam emitted from the laser light source is used as it is as any one of the three laser beams.
  • optical frequency omega 2 optical frequency omega 2 ' when are equal, the optical parametric oscillator and an optical frequency omega 2 for generating light of optical frequency omega 2' be made common and optical parametric oscillator for generating a light Good.
  • a combination of one laser light source and three optical parametric oscillators is used to generate three laser beams having different optical paths.
  • the wavelength differs from one optical parametric oscillator. You may take out two lights and use each. However, it should be noted that in this case, if one optical frequency of the two lights is changed, the other optical frequency also changes accordingly.
  • one laser light source and three optical parametric oscillators are used to generate three laser lights having different optical paths.
  • three laser light sources may be used.
  • it is desirable that the three laser light sources are synchronized in timing.
  • the acousto-optic modulator 15 is used to modulate the intensity of the pulsed laser light in the time direction, but a combination of an electro-optic element and a polarizer may be used.
  • the acousto-optic modulator 15 is used to modulate the intensity of the pulsed laser beam in the time direction.
  • the repetition frequency of the pulsed laser beam may be controlled.
  • the repetition frequency frep1 of the optical frequency omega 1 of the pulsed laser beam was set to 1 / m times the repetition frequency frep2 optical frequency omega 2 of the pulsed laser beam, and the lock
  • the detection frequency of in detection may be set to frep1 (where m is an integer of 2 or more).
  • the intensity of light applied to the sample 20 is modulated in the time direction, but other characteristics of the light applied to the sample 20, for example, Any of phase, polarization, and optical frequency may be modulated in the time direction.
  • the polarization of light directed to the sample 20 is modulated in the time direction.
  • an analyzer may be arranged on the upstream side of the sample 20 in the optical path of the modulated light.
  • the characteristics of one of the three lights irradiated on the sample 20 are modulated in the time direction. However, at least two of the three lights are modulated. The characteristics of two lights may be modulated with different modulation frequencies in the time direction.
  • the transmission type microscope has been described.
  • the present invention can also be applied to a reflection type microscope.
  • the number of the light spot formed at the same time to the observation target plane P 0 (i.e. the number of viewed point) was a single, or a plurality . If the number of observation target points is made plural, the time required to scan the entire observation target plane P 0 with a light spot (at the observation target point) can be shortened.
  • the shape of the light spot in the in-plane direction is made donut-shaped in order to improve the in-plane resolution, but in order to improve the resolution in the optical axis direction.
  • the shape of the light spot in the optical axis direction may be a donut shape.
  • a phase plate 18 ′ in which a phase difference of ⁇ [rad] is given between the central circular region and the peripheral ring region may be used (the phase plate 18 ′ is not shown).
  • the first to fourth embodiments described above are used.
  • a high sectioning ability (resolution in the optical axis direction) can be obtained in the modified example, but the sectioning ability is further improved by applying the present method.
  • the light spot shape in the in-plane direction has a donut shape (generated by the phase plate 18), and the light spot shape in the optical axis direction has a donut shape (generated by the phase plate 18 ′). ) May be used as donut-induced light. In this case, a super-resolution effect can be obtained in both the in-plane direction and the optical axis direction.
  • the light that has undergone a phase change by the phase plate 18 and the light that has undergone a phase change by the phase plate 18 ′ are synthesized and synthesized by a light combining element such as a beam splitter or a polarizing beam splitter.
  • the collected light may be focused by the objective lens toward the sample.
  • the first illumination light (excitation light) having the optical frequency ⁇ 1 is collected, and the second optical frequency is applied to the second region (donut guiding light spot Ad) partially overlapping with the first region (irradiation region Ae).
  • Extraction unit acousto-optic modulator 15, signal generator 26, lock-in amplifier 25, polarizer 41, quarter wavelength plate 51, wavelength selection filter 22, quarter wavelength plate 60, detection photon 70, etc.
  • Extraction unit acousto-optic modulator 15, signal generator 26, lock-in amplifier 25, polarizer 41, quarter wavelength plate 51, wavelength selection filter 22, quarter wavelength plate 60, detection photon 70, etc.
  • any of the above-described embodiments or modifications are based on the resolution limit of the illumination optical system (the size of the excitation light spot Ae).
  • the small non-overlapping region (Am) can be used as a detection source of the signal light (stimulated emission light, CARS light, CSRS light, SRS light, light decrease due to two-photon absorption).
  • the illumination optical system (pulse laser light source 11, optical parametric oscillators 141, 142, 143, phase plate 18, objective lens 19) in the first embodiment or the modified example (stimulated emission microscope) is the observation target (sample 20). ) Are sequentially irradiated with the first illumination light (excitation light), the second illumination light (donut guidance light), and the third illumination light (circular guidance light), and the extraction unit (acousto-optic modulator 15). , the signal generator 26, the lock-in amplifier 25, a polarizer 41,1 / 4 wavelength plate 51, the wavelength selecting filter 22, detected photons 70) extracts the signal light having an optical frequency omega 2 (the stimulated emission light) To do.
  • the extraction unit (signal generator 26, lock-in amplifier 25) in the first embodiment changes the characteristics of the first illumination light (excitation light) toward the observation target (sample 20) over time.
  • the source of the extracted signal light (stimulated emission light) is non-overlapping by modulating at the frequency f 1 in the direction and detecting lock-in of the light generated in the whole (light spot) at the frequency f 1. Restrict only to the area (Am).
  • the illumination optical system irradiates the first illumination light (excitation light) and the second illumination light (donut guidance light) at the same time, and then the third illumination light ( The first illumination light (excitation light) and the third illumination light (circular guide light) in a state where a wavelength difference of 3600 cm ⁇ 1 or more is applied in terms of energy.
  • One illumination light (excitation light), the second illumination light (donut guidance light), and the third illumination light (circular guidance light) are simultaneously irradiated, and the extraction unit is the signal light having an optical frequency ⁇ 2 To extract.
  • the extraction unit optical parametric oscillators 142 and 143, wavelength selection filter 22
  • the second illumination light that travels toward the observation target (sample 20).
  • An optical frequency difference is given between the (doughnut guide light) and the third illumination light (circular guide light), and light having the same optical frequency ( ⁇ 2 ′) as that of the second illumination light (donut guide light) is By cutting on the downstream side of the observation target (sample 20), mixing of the second illumination light (doughnut induced light) with respect to the extracted signal light (stimulated emission light) is suppressed.
  • the extraction unit includes the second illumination light (doughnut induced light) directed to the observation target (sample 20) and the A polarization direction difference is given between the third illumination light (circular guide light) and light having the same polarization direction as that of the second illumination light (doughnut guide light) is cut downstream of the observation target (sample 20). This suppresses mixing of the second illumination light (doughnut induced light) with respect to the extracted signal light (stimulated emission light).
  • the illumination optical system pulse laser light source 11, optical parametric oscillators 141, 142, 143, and objective lens 19 in the second embodiment or the modified example (CARS microscope) is the above-described observation target (sample 20).
  • the first illumination light (excitation light), the second illumination light (donut guidance light), and the third illumination light (circular guidance light) are simultaneously irradiated, and the extraction unit (wavelength selection filter 22) has an optical frequency (2 ⁇ ).
  • the signal light (CARS light) having 1 ⁇ 2 ) is extracted.
  • the said extraction part (polarizer 41, analyzer 70) in 2nd Embodiment (CARS microscope) is the said 2nd illumination light (doughnut guidance light) and said 3rd illumination light which go to the said observation object (sample 20).
  • the extraction unit (acousto-optic modulator 15, signal generator 26, lock-in amplifier 25) is connected to the observation target (sample 20).
  • the characteristic of the first illumination light (excitation light) that is directed is modulated at a frequency f 1 over the time direction
  • the characteristic of the third illumination light (circular guide light) that is directed toward the observation target (sample 20) is frequency f over the time direction.
  • the illumination optical system pulse laser light source 11, optical parametric oscillators 141, 142, 143, and objective lens 19 in the modified example (CSRS microscope) of the second embodiment is the above-described observation target (sample 20).
  • the first illumination light (excitation light), the second illumination light (donut guidance light), and the third illumination light (circular guidance light) are simultaneously irradiated, and the extraction unit (wavelength selection filter 22) has an optical frequency (2 ⁇ ).
  • the signal light (CSRS light) having 2 ⁇ ⁇ 1 ) is extracted.
  • the extraction unit (polarizer 41, analyzer 70) in the second embodiment includes the second illumination light (donut guidance light) and the third illumination light toward the observation target (sample 20). (Observation of light having the same polarization direction as the combined polarization direction of the second illumination light (doughnut guidance light) and the third illumination light (circular guidance light).
  • the source of the extracted signal light (CSRS light) is limited only to the non-overlapping region (Am).
  • the said extraction part (Acousto-optic modulator 15, the signal generator 26, lock-in amplifier 25) is to the said observation object (sample 20).
  • the characteristic of the first illumination light (excitation light) that is directed is modulated at a frequency f 1 over the time direction
  • the characteristic of the third illumination light (circular guide light) that is directed toward the observation target (sample 20) is frequency f over the time direction.
  • the source of the signal light (CSRS light) is limited only to the non-overlapping area (Am).
  • the illumination optical system (pulse laser light source 11, optical parametric oscillators 141, 142, 143, phase plate 18, objective lens 19 in the third embodiment or the fourth embodiment and modifications (SRS microscope or two-photon absorption microscope). ) Simultaneously irradiates the observation target (sample 20) with the first illumination light (excitation light), the second illumination light (donut guidance light), and the third illumination light (circular guidance light),
  • the extraction unit acousto-optic modulator 15, signal generator 26, lock-in amplifier 25, polarizer 41, quarter-wave plate 51, wavelength selection filter 22, detection photon 70
  • the signal light (SRS light or a decrease in light due to two-photon absorption) is extracted.
  • the said extraction part (polarizer 41, analyzer 70) in 3rd Embodiment or 4th Embodiment (SRS microscope or a two-photon absorption microscope) is the said 2nd illumination light (the sample 20) which goes to the said observation object (sample 20).
  • a polarization direction difference is given between the donut guide light) and the third illumination light (circular guide light), and the combined polarization of the second illumination light (donut guide light) and the third illumination light (circular guide light).
  • the source of the extracted signal light (SRS light or a decrease in light due to two-photon absorption) is cut by cutting light having the same polarization direction as that of the observation target (sample 20) on the downstream side. Restrict only to non-overlapping areas (Am).
  • the extraction unit acousto-optic modulator 15, signal generator 26, lock in the two-frequency lock-in SRS microscope or the two-frequency lock-in two-photon absorption microscope) of the third embodiment or the fourth embodiment. in amplifier 25
  • the characteristics of the observation object (the heading to the sample 20) the first illumination light (excitation light) modulated over the time direction at a frequency f 1
  • the third light toward the observation target (sample 20)
  • the characteristic of light (circular guide light) is time-modulated at a frequency f 2 in the time direction, and light generated in the whole (light spot) is detected by lock-in detection at a frequency
  • the generation source of the signal light (SRS light or a decrease in light due to two-photon absorption) is limited only to the non-overlapping region (Am).
  • the characteristic that is the modulation target of the extraction unit is the light Intensity, phase, polarization, or optical frequency.
  • the first region (excitation light spot Ae) and the third region (circular) The shape of the guide light spot Ao) is circular, the shape of the second region (doughnut guide light spot Ad) is ring-shaped, the center of the first region (excitation light spot Ae) and the second region
  • the center of the (donut guiding light spot Ad) coincides with the center of the third region (circular guiding light spot Ao).
  • any one of the above-described super-resolution observation apparatuses or modified examples has the observation target point (non-overlapping region Am) as the illumination optics. It can be made smaller than the resolution limit of the system (the size of the excitation light spot Ae).
  • the requirements of the above-described embodiments can be combined as appropriate. Some components may not be used.
  • the disclosure of all publications and US patents relating to the devices cited in the above embodiments and modifications are incorporated herein by reference.
  • SYMBOLS 11 Pulse laser light source, 12 ... Lens, 131, 132 ... Beam splitter, M1 ... Mirror, 141, 142, 143 ... Optical parametric oscillator (OPO), 15 ... Acousto-optic modulator (AOM) modulator), 18 ... phase plate, M2 ... mirror, 133, 134 ... dichroic mirror, 19 ... objective lens, 20 ... sample, 28 ... sample stage, 21 ... objective lens, 22 ... wavelength selection filter, 23 ... condensing lens, 24 ... photodetector, 25 ... lock-in amplifier, 26 ... signal generator, 27 ... personal computer

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Abstract

本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２'を有した第２照明光を集光し、前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光する照明光学系と、前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する抽出部とを備える。

Description

超解像観察装置及び超解像観察方法
　本発明は、超解像観察装置及び超解像観察方法に関する。
　近年、バイオサイエンス、特に分子生物学の分野や病理診断の分野では、試料を蛍光プローブなどで染色せず「そのままの状態で」顕微することのできる無染色顕微鏡の必要性が高まりつつある。この無染色顕微鏡が満たすべき要求は、主に以下の（１）、（２）である。
（１）高い光学分解能（例えば、平面分解能＜５０ｎｍ、奥行分解能＜１００ｎｍ）。（２）試料内部における観察対象の識別能力。
　これらの要求を満たす可能性のある新しい無染色顕微鏡として、誘導放出顕微鏡、コヒーレントアンチストークスラマン散乱（ＣＡＲＳ：Coherent anti-Stokes Raman scattering）顕微鏡、誘導ラマン散乱（ＳＲＳ：Stimulated Raman scattering）顕微鏡、２光子吸収顕微鏡などが提案された（例えば、特許文献１を参照。）。
特開２００９－４７４３５号公報
　これらの無染色顕微鏡は、何れも観察対象物に固有のエネルギー準位を利用するため、上記の要求（２）を十分に満たしうるものの、上記の要求（１）を満たすためには依然として改善の余地があり、ここに現状の課題が存する。
　そこで本発明は、上記の課題を解決すべく、試料を染色せずに超解像観察することの可能な超解像観察装置及び超解像観察方法を提供する。
　本発明を例示する超解像観察装置の一態様は、観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２’を有した第２照明光を集光し、前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光する照明光学系と、前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する抽出部とを備える。
　本発明を例示する超解像観察方法の一態様は、観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２’を有した第２照明光を集光し、前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光し、前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する。
　本発明によれば、試料を染色せずに超解像観察することの可能な超解像観察装置及び超解像観察方法が実現する。
第１実施形態の誘導放出顕微鏡の構成図である。 励起光スポットと、ドーナツ誘導光スポットと、円形誘導光スポットとの関係を説明する図である。 励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の時間変化波形を説明する図（励起光の変調無し）である。 励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の時間変化波形を説明する図（励起光の変調有り）である。 光検出器２４へ入射する光（信号光及びノイズ光）を説明する図である。 変形例の誘導放出顕微鏡の構成図である。 変形例の誘導放出顕微鏡における励起光スポットと、ドーナツ誘導光スポットと、円形誘導光スポットとの関係を説明する図である。 励起光スポットにおける各光の偏光状態を説明する図である。 ＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。 ＣＡＲＳ顕微鏡における励起光スポットと、ドーナツ誘導光スポットと、円形誘導光スポットとの関係を説明する図である。 ＣＡＲＳ顕微鏡における各光の偏光状態を説明する図である。 ２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。 ２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡における励起光スポットと、ドーナツ誘導光スポットと、円形誘導光スポットとの関係を説明する図である。 ２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡における各光の変調周波数を説明する図である。 ＳＲＳ顕微鏡の構成図である。 ＳＲＳ顕微鏡における各光の偏光状態を説明する図である。 ２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡の構成図である。 ２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡における各光の変調周波数を説明する図である。 ２光子吸収顕微鏡の構成図である。 ２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡の構成図である。
［第１実施形態］
　以下、本発明の第１実施形態として誘導放出顕微鏡を説明する。
　図１は、本実施形態の誘導放出顕微鏡の構成図である。図１に示すとおり誘導放出顕微鏡には、パルスレーザ光源１１と、レンズ１２と、ビームスプリッタ１３１、１３２と、ミラーＭ１と、光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：optical parametric oscillator）１４１、１４２、１４３と、音響光学変調器（ＡＯＭ：Acousto-optic modulator）１５と、位相板１８と、ミラーＭ２と、ダイクロイックミラー１３３、１３４と、対物レンズ１９と、試料２０と、試料ステージ２８と、対物レンズ２１と、波長選択フィルタ２２と、集光レンズ２３と、フォトダイオードなどの光検出器２４と、ロックインアンプ２５と、信号発生器２６と、パーソナルコンピュータ２７とが配置される。
　パルスレーザ光源１１は、フェムト秒パルスレーザ光源、ピコ秒パルスレーザ光源などのパルスレーザ光源である。パルスレーザ光源１１によるパルス発振の繰り返し周波数ｆｒは、例えば８０ＭＨｚであり、パルスレーザ光源１１が発振するパルスレーザ光のパルス幅ΔＴは、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）である。
　パルスレーザ光源１１から射出したパルスレーザ光は、レンズ１２により径の太い平行光束となり、ビームスプリッタ１３１へ入射する。ビームスプリッタ１３１へ入射したパルスレーザ光は、ビームスプリッタ１３１を透過するパルスレーザ光と、ビームスプリッタ１３１を反射するパルスレーザ光とに分割され、ビームスプリッタ１３１を透過したパルスレーザ光は光パラメトリック発振器１４１へ入射する。
　ビームスプリッタ１３１を反射したパルスレーザ光は、ビームスプリッタ１３２へ入射すると、ビームスプリッタ１３２を反射するパルスレーザ光と、ビームスプリッタ１３２を透過するパルスレーザ光とに分割され、ビームスプリッタ１３２を反射したパルスレーザ光は、光パラメトリック発振器１４２へ入射する。
　ビームスプリッタ１３２を透過したパルスレーザ光は、ミラーＭ１を反射し、光パラメトリック発振器１４３へ入射する。
　光パラメトリック発振器１４１は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω１に変換し、光パラメトリック発振器１４２は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω２’に変換し、光パラメトリック発振器１４３は、入射したパルスレーザ光の光周波数をω２に変換する。
　ここで、光周波数ω１、ω２’、ω２の大小関係は、ω１＞ω２’、ω１＞ω２、ω２’≒ω２である。なお、本実施形態では、光周波数ω２’の光と光周波数ω２の光とを波長分離できるような所定の周波数差が光周波数ω２、ω２’の間に付与されると仮定する。この周波数差は、波長差に換算して数ｎｍ以上であることが望ましい。
　音響光学変調器１５は、光パラメトリック発振器１４１の射出光路、つまり光周波数ω１のパルスレーザ光の単独光路に配置され、そのパルスレーザ光の強度を時間方向にかけて変調周波数ｆ１で変調する。なお、音響光学変調器１５によるパルスレーザ光の変調周波数ｆ１及び変調タイミングは、信号発生器２６によって制御される。
　位相板１８は、光パラメトリック発振器１４２の射出光路、つまり光周波数ω２’のパルスレーザ光の単独光路に配置される。この位相板１８の位相遅延量分布は、光軸を中心とした周方向にかけて非一様、かつ、光軸を中心とした径方向にかけて一様に設定されている。また、位相板１８の周方向に亘る位相遅延量分布は、周位置が１８０°ずれた２つの位置の間に位相差πが付与されるような分布である。よって、光周波数ω２’のパルスレーザ光が試料２０の観察対象面Ｐ０に形成する光スポット（後述）の形状は、ドーナツ状となる。
　さて、光パラメトリック発振器１４１から射出した光周波数ω１のパルスレーザ光は、音響光学変調器１５を介してミラーＭ２を反射し、ダイクロイックミラー１３３を介してダイクロイックミラー１３４を反射する。
　光パラメトリック発振器１４２から射出した光周波数ω２’のパルスレーザ光は、位相板１８を介してダイクロイックミラー１３３を反射し、光周波数ω１のパルスレーザ光と光路を統合させる。
　光パラメトリック発振器１４３から射出した光周波数ω２のパルスレーザ光は、ダイクロイックミラー１３４を透過して、光周波数ω１のパルスレーザ光及び光周波数ω２’のパルスレーザ光と光路を統合させる。
　なお、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３の各々の射出光路には、不図示の光強度調整機構（ＮＤフィルタ）が設置されている。これらのＮＤフィルタによると、光周波数ω１のパルスレーザ光の強度と、光周波数ω２’のパルスレーザ光の強度と、光周波数ω２のパルスレーザ光の強度とを、独立に調整することができる。
　互いの光路を統合させた３つのパルスレーザ光（光周波数ω１、ω２’、ω２）は、対物レンズ１９の瞳側へ入射すると、対物レンズ１９の先端から射出し、試料２０の観察対象面Ｐ０の微小領域に向かって集光し、光スポットを形成する。
　なお、上記した位相板１８は、光周波数ω１のパルスレーザ光、光周波数ω２’のパルスレーザ光、光周波数ω２のパルスレーザ光のうち、光周波数ω２’のパルスレーザ光の単独光路にのみ配置されている。このため、観察対象面Ｐ０に光周波数ω１のパルスレーザ光が形成する光スポットは円形であり、観察対象面Ｐ０に光周波数ω２’のパルスレーザ光が形成する光スポットはドーナツ状（輪帯状）であり、観察対象面Ｐ０に光周波数ω２のパルスレーザ光が形成する光スポットは円形である。
　ここで、本実施形態の誘導放出顕微鏡では、観察対象面Ｐ０に照射される順序が以下の順序となるように、光周波数ω１のパルスレーザ光の光路長と、光周波数ω２’のパルスレーザ光の光路長と、光周波数ω２のパルスレーザ光の光路長との関係が予め調整されている。
　（１）光周波数ω１のパルスレーザ光
　（２）光周波数ω２’のパルスレーザ光
　（３）光周波数ω２のパルスレーザ光
　このうち、光周波数ω１のパルスレーザ光が観察対象面Ｐ０に形成する円形の光スポットには、特定の観察対象物質の電子のエネルギー準位を励起準位へ移行（励起）させる働きがあり、光周波数ω２’のパルスレーザ光が観察対象面Ｐ０に形成するドーナツ状の光スポットには、励起中の電子を基底準位へ移行（誘導放出）させて誘導放出光を発生させる働きがあり、光周波数ω２のパルスレーザ光が観察対象面Ｐ０に形成する円形の光スポットには、光周波数ω２’のパルスレーザ光によって誘導放出されなかった励起中の電子を基底状態へ変移（誘導放出）させて誘導放出光を発生させる働きがある。
　なお、光周波数ω１は、波長換算でおよそ紫外域～可視域の波長範囲内の値に設定されることが望ましく、光周波数ω２、ω２’の各々は、波長換算でおよそ紫外域～近赤外領域の波長範囲内の値に設定されることが望ましい。
　そこで以下では、図２（Ａ）に示すとおり、観察対象面Ｐ０に対して最初に照射される光周波数ω１のパルスレーザ光を「励起光」と称し、次に照射される光周波数ω２’のパルスレーザ光を「ドーナツ誘導光」と称し、最後に照射される光周波数ω２のパルスレーザ光を「円形誘導光」と称す。なお、図２（Ａ）では、観察対象面Ｐ０に形成される個々の光スポットを、光軸方向にずらして描いている。
　また、以下では、観察対象面Ｐ０おいて励起光が照射される円形の領域を「励起光スポット」と称し、観察対象面Ｐ０においてドーナツ誘導光が照射されるドーナツ状の領域を「ドーナツ誘導光スポット」と称し、観察対象面Ｐ０において円形誘導光が照射される円形の領域を「円形誘導光スポット」と称す。
　なお、基本的には、図２（Ａ）に示すとおり、励起光スポットＡｅの輪郭と、ドーナツ誘導光スポットＡｄの内輪郭と、円形誘導光スポットＡｏの輪郭とは、ほぼ一致する。なぜなら、これら輪郭のサイズは回折限界によってほぼ決まるからである。
　しかし、本実施形態では、図２（Ｂ）に示すとおり、励起光スポットＡｅの輪郭よりもドーナツ誘導光スポットＡｄの内輪郭が小さくなるように、ドーナツ誘導光の強度が十分に高く設定される。
　そのために、本実施形態では、例えば、ドーナツ誘導光の単独光路に挿入されたＮＤフィルタの透過率が高めに設定される。あるいは、ビームスプリッタ１３１、１３２の反射比率が高めに設定される。
　したがって、本実施形態では、ドーナツ誘導光スポットＡｄが図２（Ｂ）の右下に斜線を付したとおりドーナツ状の領域Ａｄ’にて励起光スポットＡｅに重複する。
　以下、励起光スポットＡｅのうち、ドーナツ誘導光スポットＡｄと重複するドーナツ状の領域Ａｄ’を「重複領域Ａｄ’」と称し、励起光スポットＡｅのうち、ドーナツ誘導光スポットＡｄと重複しない円形の領域Ａｍを「非重複領域Ａｍ」と称す。本実施形態では、信号光の検出元（観察対象点）を、この非重複領域Ａｍのみに制限することで、超解像効果を得る。
　なお、ここでは、回折限界で決まるサイズ（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さな領域（非重複領域Ａｍ）に信号光の検出元を制限することを「超解像」という。
　また、以下では、励起光スポットＡｅ、ドーナツ誘導光スポットＡｄ、円形誘導光スポットＡｏの集合を、単に「光スポット」と称す。
　図３（ａ）に示すのは励起光の時間波形であり、図３（ｂ）に示すのはドーナツ誘導光の時間波形であり、図３（ｃ）に示すのは円形誘導光の時間波形である。
　図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）に示すとおり、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の間でパルスの繰り返し周期Ｔｒは共通であるが、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の間でパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングは若干ずつずれている。図３（ｄ）は、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の３パルス分の波形を同一座標上に拡大表示したものである。図３（ｄ）において実線で示すのが励起光のパルスであり、細かい点線で示すのがドーナツ誘導光のパルスであり、粗い点線で示すのが円形誘導光のパルスである。図３（ｄ）に示すとおり励起光のパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、ドーナツ誘導光のパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、円形誘導光のパルスが観察対象面Ｐ０に到達するタイミングとの間のズレΔは、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各々のパルス幅ΔＴより若干大きい程度、例えば数百ｆｓ（フェムト秒）に設定される。
　ここで、ズレΔは、観察対象物質の電子が励起状態を維持できる期間（励起状態の寿命、例えばおよそフェムト秒～ピコ秒）以下であることが望ましい。これによって、誘導放出が確実に生起する。また、この場合、パルス幅ΔＴも励起状態の寿命以下であることが望ましい。これによって、ズレΔを励起状態の寿命以下に保ちつつ、時間的に近接するパルス同士を確実に分離することができる。
　なお、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングのズレΔを調整するために、本実施形態の誘導放出顕微鏡では、励起光の単独光路、ドーナツ誘導光の単独光路、円形誘導光の単独光路のうち少なくとも２つの光路には、可動ミラーなどで構成された光路長調整機構（不図示）が設けられていることが望ましい。
　また、図３（ａ）、（ｂ）、（ｃ）では、音響光学変調器１５による励起光の変調を可視化しなかったが、可視化すると図４（ａ）、（ｂ）、（ｃ）のとおりである。図４に示すとおり、音響光学変調器１５による励起光の変調周波数ｆ１は、パルスの繰り返し周波数ｆｒと比較して十分に低く、ｆ１≦ｆｒ／２であり、例えばｆ１は数ＭＨｚ程度である。なお、図４において符号Ｔ１で示すのは励起光の変調周期（＝変調周波数ｆ１の逆数）であり、符号Ｔｒで示すのはパルスの繰り返し周期（＝繰り返し周波数ｆｒの逆数）である。
　さて、図１に戻り、試料２０は、例えば、培養液と共に培養容器に収容された透明な生体細胞であり、この生体細胞中の特定物質（例えば、ヘモグロビンなどの特定タンパク質）が観察対象物質である。誘導放出顕微鏡は、観察対象物質に固有のエネルギー準位を利用するため、観察対象物質が予め蛍光染色されている必要は無い。
　試料ステージ２８は、試料２０を支持し、光軸方向（Ｚ方向）にかけて試料２０を移動させると共に、光軸に垂直な方向（ＸＹ方向）にかけて試料２０を移動させる透過型のステージである。試料ステージ２８がＺ方向にかけて試料２０を移動させると、試料２０の内部における観察対象面Ｐ０の深さが調整され、試料ステージ２８がＸＹ方向にかけて試料２０を移動させると、前述した光スポットで（スポット内の観察対象点で）観察対象面Ｐ０を二次元スキャンすることができる。
　観察対象面Ｐ０の光スポットから射出した光、すなわち、光スポットから射出した励起光、光スポットから射出したドーナツ誘導光、光スポットから射出した円形誘導光、光スポットで発生した誘導放出光は、対物レンズ２１の先端側から対物レンズ２１に入射する。
　対物レンズ２１の仕様（開口数、倍率など）は、対物レンズ１９の仕様と同じであり、対物レンズ２１と対物レンズ１９との間の位置関係及び姿勢関係は、観察対象面Ｐ０に関して対称である。なお、ここでは対物レンズ２１の仕様と対物レンズ１９の仕様とを共通としたが、完全に共通でなくても構わない。例えば、対物レンズ２１の開口数は対物レンズ１９の開口数より大きくても良い。
　対物レンズ２１に先端側から入射した光、すなわち、観察対象面Ｐ０の光スポットから射出した励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光、誘導放出光は、対物レンズ２１の瞳側から射出し、波長選択フィルタ２２、集光レンズ２３を順に介して光検出器２４へ向かう。
　但し、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１、ω２’の光をカットし、かつ、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与されている。
　よって、光スポットから射出した励起光（光周波数ω１）、光スポットから射出したドーナツ誘導光（光周波数ω２’）は、光検出器２４へ入射せず、光スポットから射出した円形誘導光（光周波数ω２）及び光スポットで発生した誘導放出光（光周波数ω２）は、光検出器２４へ入射する。
　光検出器２４は、入射光の強度を電気信号に変換するフォトダイオードなどの光電変換素子である。
　ロックインアンプ２５は、光検出器２４の出力する電気信号から、励起光の変調周波数ｆ１と同じ周波数で変化する成分を信号としてロックイン検出する。なお、ロックインアンプ２５の検出周波数及び検出タイミングは、信号発生器２６によって制御される。
　パーソナルコンピュータ２７は、ロックインアンプ２５の検出した信号を取り込む。また、パーソナルコンピュータ２７は、前述したスキャン中、観察対象点が観察対象面Ｐ０の各位置にあるときに信号の取り込みを行い、観察対象面における信号の分布を誘導放出画像として取得すると、不図示のモニタへ表示する。
　以下、図２（Ｂ）を参照して本実施形態の誘導放出過程を詳しく説明する。
　先ず、本実施形態では、観察対象面Ｐ０に励起光が照射されると、励起光スポットＡｅに位置していた観察対象物質の電子のエネルギー準位が励起準位へ移行（励起）する。
　続いて、観察対象面Ｐ０にドーナツ誘導光が照射されると、重複領域Ａｄ’では、励起中の電子のエネルギー準位が基底準位に戻るが、非重複領域Ａｍでは、励起中の電子のエネルギー準位は何ら変化しない。
　続いて、観察対象面Ｐ０に円形誘導光が照射されると、重複領域Ａｄ’では、励起中の電子が存在しないので誘導放出は生起しないが、非重複領域Ａｍでは、励起中の電子のエネルギー準位が基底準位に戻り、誘導放出光が発生する。
　したがって、本実施形態の誘導放出顕微鏡では、ドーナツ誘導光の照射により、誘導放出光の検出元（信号の取得元）が、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限される。したがって、本実施形態の誘導放出顕微鏡は、試料２０の超解像観察が可能である。
　以下、本実施形態のロックイン検出を説明する。
　通常、誘導放出顕微鏡では、誘導光に応じて試料で発生した誘導放出光（以下、「信号光」と称す。）と、試料から射出した誘導光（以下、「ノイズ光」と称す。）との間では、光周波数は共通（ω２）であり、伝播方向も共通であるため、信号光とノイズ光との分離を波長選択フィルタで行うことはできない。
　このため、本実施形態の誘導放出顕微鏡では、上述したとおり音響光学変調器１５で励起光の強度を周波数ｆ１で変調すると共に、光検出器２４の出力する電気信号から、周波数ｆ１で変化する成分をロックインアンプ２５でロックイン検出した。
　図５は、光検出器２４へ入射する光を説明する図である。図５（Ａ）は、誘導放出過程と、光検出器２４へ入射する光との関係を説明する図であり、図５（Ｂ）は、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各波形と、光検出器２４へ入射する光の波形との関係を説明する図である。
　また、図５の左側は非重複領域Ａｍから光検出器２４へ向かう光を説明し、図５の右側は重複領域Ａｄ’から光検出器２４へ向かう光を説明している。なお、図５では、非重複領域Ａｍからの光と重複領域Ａｄ’からの光とを区別して描いたが、実際の光検出器２４には、非重複領域Ａｍからの光と重複領域Ａｄ’からの光とが区別されることなく入射する。
　先ず、図５（Ａ）の左側に示すとおり、非重複領域Ａｍでは、ドーナツ誘導光が照射されないため、信号光の発生が何ら抑制されない。よって、非重複領域Ａｍから光検出器２４に向かう光は、信号光とノイズ光との双方である。
　一方、図５（Ａ）の右側に示すとおり、重複領域Ａｄ’には、ドーナツ誘導光が照射されるため、信号光の発生が抑制される。よって、重複領域Ａｄ’から光検出器２４に向かう光は、ノイズ光のみである。
　そして、本実施形態では図５（Ｂ）（ａ）に示すとおり励起光が周波数ｆ１で変調される。信号光の量は、励起光の強度に応じて変化するのに対して、ノイズ光の量は、励起光の強度に依存しない。
　したがって、図５（Ｂ）（ｄ）の左側に示すとおり、非重複領域Ａｍから光検出器２４に向かう光の波形には、周波数ｆ１の変調が転写される（変調量は信号光の強度に応じた量となる）のに対して、図５（Ｂ）（ｄ）の右側に示すとおり、重複領域Ａｄ’から光検出器２４に向かう光の波形には、周波数ｆ１の変調が転写されない。
　したがって、本実施形態のように、光検出器２４の出力する電気信号から周波数ｆ１で変化する信号をロックイン検出すれば、信号光の強度を高精度に検知できることは明らかである（以上、ロックイン検出の説明。）。
　なお、本実施形態では、観察対象面Ｐ０の光スポットから射出したドーナツ誘導光を光検出器２４の手前でカットするために、ドーナツ誘導光と円形誘導光とを波長分離した。すなわち、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光の光周波数と円形誘導光の光周波数とに差異を与えると共に、ドーナツ誘導光と同じ光周波数の光をカットし円形誘導光と同じ光周波数の光を通過させる波長選択フィルタ２２を光検出器２４の手前に配置した。
　しかし、本実施形態では、ドーナツ誘導光と円形誘導光とを波長分離する代わりに、ドーナツ誘導光と円形誘導光とを偏光分離してもよい。すなわち、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光の偏光方向と観察対象面に向かう円形誘導光の偏光方向とに差異を与えると共に、ドーナツ誘導光と同じ偏光方向の光をカットし円形誘導光と同じ偏光方向の光を通過させる検光子を光検出器２４の手前に配置してもよい（以下の変形例を参照）。
［第１実施形態の変形例］
　以下、第１実施形態の変形例を説明する。ここでは、第１実施形態（図１）との相違点のみを説明する。
　図６は、変形例の誘導放出顕微鏡の構成図である。
　先ず、変形例の誘導放出顕微鏡では、ドーナツ誘導光の光周波数が円形誘導光の光周波数ω２と同じに設定される。
　また、変形例の誘導放出顕微鏡において、波長選択フィルタ２２には、光周波数ω１の光をカットし、かつ、光周波数ω２の光を通過させる波長選択性が付与される。
　また、変形例の誘導放出顕微鏡において、励起光の単独光路と、ドーナツ誘導光の単独光路と、円形誘導光の単独光路との各々には、偏光子４１及び１／４波長板５１が順に配置され、対物レンズ２１と集光レンズ２３との間には、１／４波長板６０及び検光子７０が順に配置される。
　また、変形例の誘導放出顕微鏡において、偏光子４１及び１／４波長板５１の軸方向は予め調整されており、図７に示すとおり、観察対象面Ｐ０に入射する励起光及び円形誘導光の偏光状態は、同じ方向に旋回する円偏光（例えば右旋回円偏光）に設定され、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光の偏光状態は、励起光及び円形誘導光とは逆旋回の円偏光（例えば左旋回円偏光）に設定される。
　また、変形例の誘導放出顕微鏡では、１／４波長板６０の軸方向も予め調整されており、検光子７０に向かう励起光及び円形誘導光の偏光状態は、図８左側に示すとおり所定方向の直線偏光に設定され、検光子７０に向かうドーナツ誘導光の偏光状態は、図８右側に示すとおり、励起光及び円形誘導光と直交する方向の直線偏光に設定される。
　また、変形例の誘導放出顕微鏡では、図８に示すとおり、検光子７０に入射する円形誘導光及び励起光の偏光方向と同じ方向（つまりドーナツ誘導光の偏光方向に直交する方向）に検光子７０の透過軸方向が設定される。
　したがって、変形例の誘導放出顕微鏡では、観察対象面Ｐ０から射出したドーナツ誘導光は光検出器２４の手前でカットされ、観察対象面Ｐ０から射出した円形誘導光は光検出器２４へ入射する。
　なお、ここでは、観察対象面Ｐ０に入射する励起光の偏光方向を、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の偏光方向と一致させたので、非重複領域Ａｍにおける誘導放出の効率を高めることができる。
　但し、非重複領域Ａｍにおける誘導放出の効率を高める必要の無い場合は、観察対象面Ｐ０に入射する励起光の偏光方向を、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の偏光方向と一致させなくてもよい。
　また、ここでは、位相板１８を通過するドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光としたので、ドーナツ誘導光スポットを等方的（光軸の周りに回転対称）にすることができる。
　但し、ドーナツ誘導光スポットを等方的にする必要の無い場合は、位相板１８を通過するドーナツ誘導光の偏光状態を直線偏光としてもよい。
　なお、その場合は、１／４波長板５１、６０を省略し、観察対象面Ｐ０に入射する励起光、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の各々の偏光状態を、直線偏光とすればよい。
　この場合も、光検出器２４の手前において、ドーナツ誘導光の偏光方向を、円形誘導光の偏光方向及び励起光の偏光方向と直交させればよい。
［第１実施形態及び変形例の補足］
　なお、第１実施形態及び変形例では、励起光が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、ドーナツ誘導光が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、円形誘導光が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングとをずらしたが、これら３つのタイミングのうち少なくとも２つを一致させてもよい。
　例えば、観察対象面Ｐ０へ励起光とドーナツ誘導光とを同時に照射した後に円形誘導光を照射してもよい（但し、ω２’≠ω２）。
　あるいは、励起光と円形誘導光との間にエネルギー換算で３６００ｃｍ－１以上の波長差を付与した状態で、励起光とドーナツ誘導光と円形誘導光とを同時に照射してもよい（但し、ω２’≠ω２）。
　また、第１実施形態及び変形例は、誘導放出顕微鏡に本発明を適用したものであるが、励起状態吸収（ＥＳＡ：exited state absorption）顕微鏡にも同様に本発明を適用することができる。
　この場合、光スポットが円形である光周波数ω１の光を励起光として使用し、光スポットがドーナツ状である光周波数ω２’の光を誘導光として使用する点は第１実施形態又は変形例と同様であるが、光スポットが円形である残りの光の光子エネルギー（光周波数ω２）は、ＥＳＡの第一励起状態と第二励起状態との間のエネルギー差に相当する値に設定される。例えば、光周波数ω１、ω２’は、波長換算でおよそ紫外域～可視域の波長範囲内に設定され、光周波数ω２は、波長換算でおよそ可視域～近赤外域の波長範囲内に設定される。
　また、第１実施形態及び変形例は、誘導放出顕微鏡に本発明を適用したものであるが、基底状態の電子を枯渇させるＧＳＤ（Ground State Depletion）顕微鏡にも同様に本発明を適用することができる。
　その場合は、光スポットが円形である光周波数ω１の光と、光スポットがドーナツ状である光周波数ω２’の光と、光スポットが円形である光周波数ω２の光と使用し、それらの光周波数ω１、ω２’、ω２は、基底状態から励起状態への励起が生じるような値に設定される。例えば、光周波数ω１、ω２’、ω２の各々は、波長換算でおよそ紫外域～可視域の波長範囲内に設定される。
　また、第１実施形態及び変形例では、励起光による励起が１光子励起であるか多光子励起であるか言及しなかったが、１光子励起でもよいし、多光子励起でもよい。例えば２光子励起の場合、励起光の光周波数ω１は、波換算で可視域～近赤外域の波長範囲内に設定されることが望ましい。
［第２実施形態］
　以下、本発明の第２実施形態としてＣＡＲＳ顕微鏡を説明する。ここでは、第１実施形態（図１）との相違点のみを説明する。
　図９は、ＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。
　先ず、ＣＡＲＳ顕微鏡では、ドーナツ誘導光の光周波数ω２’が円形誘導光の光周波数ω２と同じに設定される。
　また、ＣＡＲＳ顕微鏡では、励起光（光周波数ω１）が観察対象面Ｐ０に照射されるタイミングと、ドーナツ誘導光（光周波数ω２）が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングと、円形誘導光（光周波数ω２）が観察対象面Ｐ０に到達するタイミングとを一致させる。
　また、ＣＡＲＳ顕微鏡では、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と、光周波数ω１、ω２とは、観察対象面Ｐ０の光スポット内の観察対象物質にてＣＡＲＳ過程が生起するように設定されている（ω１＞ω２）。これらの光のパルス形状は、パルスレーザ光源１１が発振するパルスの形状と、ビームスプリッタ１３１の透過反射率と、ビームスプリッタ１３２の透過反射率とによって調整可能である（なお、前述したＮＤフィルタの透過率によって調整してもよい。）。
　また、ＣＡＲＳ顕微鏡で検出すべき信号光（ＣＡＲＳ光）の光周波数は（２ω１－ω２）であって、励起光の光周波数（ω１）、誘導光の光周波数（ω２）の何れとも異なるため、信号発生器２６、音響光学変調器１５、ロックインアンプ２５は基本的に不要である。
　その代わりに、ＣＡＲＳ顕微鏡における波長選択フィルタ２２には、ＣＡＲＳ光と同じ光周波数（２ω１－ω２）の光を通過させ、かつ、光周波数ω１の光及び光周波数ω２の光をカットする波長選択性が付与される。
　また、ＣＡＲＳ光は微弱であるため、ＣＡＲＳ顕微鏡の光検出器２４としては、高感度な光検出器、例えば光電子増倍管（ＰＭＴ：photomultiplier Tube）が使用されることが望ましい。
　また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、超解像を可能とするために、励起光の単独光路に偏光子４１が配置され、ドーナツ誘導光の単独光路に偏光子４１、１／４波長板５１が順に配置され、円形誘導光の単独光路に偏光子４１、１／４波長板５１が順に配置され、対物レンズ２１と集光レンズ２３との間に検光子７０が配置される。
　また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡において、偏光子４１及び１／４波長板５１の軸方向は予め調整されており、図１０に示すとおり、観察対象面Ｐ０に入射する励起光の偏光状態は、所定方向の直線偏光（以下、０°方向の直線偏光とする。）に設定され、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光の偏光状態は、右旋回又は左旋回の円偏光（以下、右旋回円偏光とする。）に設定され、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の偏光状態は、ドーナツ誘導光とは反対に旋回する円偏光（ここでは左旋回円偏光）に設定される。
　ここで、観察対象面Ｐ０の重複領域Ａｄ’には、右旋回円偏光であるドーナツ誘導光と、左旋回円偏光である円形誘導光との双方が入射するので、重複領域Ａｄ’における誘導光のトータルの偏光状態は、ドーナツ誘導光と円形誘導光の合成となる。
　但し、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光の振幅と、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光の位相と、観察対象面Ｐ０に向かう円形誘導光の振幅と、観察対象面Ｐ０に向かう円形誘導光の位相との関係は、観察対象面Ｐ０に向かうドーナツ誘導光及び円形誘導光の合成偏光方向が９０°方向となるように予め調整されているものとする。
　一方、非重複領域Ａｍには、右旋回円偏光であるドーナツ誘導光は入射しないので、非重複領域Ａｍにおける誘導光のトータルの偏光状態は、左旋回円偏光である。
　したがって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、図１１に示すとおり、非重複領域Ａｍで発生するＣＡＲＳ光（光周波数２ω１－ω２）は、非重複領域Ａｍに作用する誘導光と同じ「左旋回円偏光」となるのに対して、重複領域Ａｄ’で発生するＣＡＲＳ光（光周波数２ω１－ω２）は、重複領域Ａｄ’に作用する誘導光と同じく「９０°方向の直線偏光」となる。
　そこで、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡において、検光子７０の透過軸方向は、図１１に示すとおり、励起光の偏光方向（ここでは０°方向）と同じに設定される。
　したがって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、重複領域Ａｄ’で発生したＣＡＲＳ光は光検出器２４の手前でカットされ、非重複領域Ａｍで発生したＣＡＲＳ光は光検出器２４へ入射する。
　したがって、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、ＣＡＲＳ光の検出元を、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限することができる。つまり、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、試料２０の超解像観察が可能である。
　なお、ここでは、位相板１８を通過するドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光としたので、ドーナツ誘導光スポットＡｄを等方的（光軸の周りに回転対称）にすることができる。
　但し、ドーナツ誘導光スポットＡｄを等方的にする必要の無い場合は、位相板１８を通過するドーナツ誘導光の偏光状態を直線偏光としてもよい。
　なお、その場合は、１／４波長板５１を省略し、観察対象面Ｐ０に入射する励起光、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光の各々の偏光状態を、直線偏光とすればよい。
　その場合、観察対象面Ｐ０に入射するドーナツ誘導光の偏光方向を、観察対象面Ｐ０に入射する円形誘導光及び励起光の偏光方向と直交させればよい。
　また、ＣＡＲＳ顕微鏡において、光検出器２４の出力する電気信号が微弱である場合は、励起光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調すると共に、周波数ｆ１又は２ｆ１でロックイン検出を行うことにより、ＣＡＲＳ光の検出精度を高めてもよい。なお、ロックイン検出の方法は、第１実施形態で説明したとおりである。
　また、本実施形態のＣＡＲＳ顕微鏡では、重複領域Ａｄ’からのＣＡＲＳ光を光検出器２４の手前でカットするために、重複領域Ａｄ’からのＣＡＲＳ光と、非重複領域ＡｍからのＣＡＲＳ光とを偏光分離した。
　しかし、本実施形態では、重複領域Ａｄ’からのＣＡＲＳ光と非重複領域ＡｍからのＣＡＲＳ光とを偏光分離する代わりに、「２周波ロックイン」を行ってもよい（「第２実施形態の変形例」を参照）。
　また、本実施形態の顕微鏡は、光周波数（２ω１－ω２）の信号光（ＣＡＲＳ光）を検出対象としたＣＡＲＳ顕微鏡であったが、光周波数（２ω１－ω２）の信号光（ＣＡＲＳ光）の代わりに、光周波数（２ω２－ω１）の信号光（ＣＳＲＳ光）を検出対象とすれば、コヒーレントストークスラマン散乱（ＣＳＲＳ： Coherent Stokes Raman scattering）顕微鏡が実現する。このＣＳＲＳ顕微鏡もＣＡＲＳ顕微鏡と同様、信号光（ＣＳＲＳ光）に対して非重複領域Ａｍの分子振動を反映させることができるので、試料２０の無染色超解像観察が可能である。
［第２実施形態の変形例］
　以下、第２実施形態の変形例として、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡を説明する。ここでは、第２実施形態（図９）との相違点のみを説明する。
　図１２は、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡の構成図である。
　先ず、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡では、偏光子４１、１／４波長板５１、検光子７０は省略され、その代わりに、音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５が備えられる。
　また、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡において音響光学変調器１５は、励起光の単独光路と、円形誘導光の単独光路との双方に配置される。
　また、励起光の光路に配置された音響光学変調器１５は、励起光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、円形誘導光の光路に配置された音響光学変調器１５は、円形誘導光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調する（但し、ｆ１≠ｆ２）。
　以上の２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡において、観察対象面Ｐ０の非重複領域Ａｍには、ＣＡＲＳ過程を生起させる光として、図１３に示すとおり、周波数ｆ１で変調された励起光と、周波数ｆ２で変調された円形誘導光とが入射する。
　一方、観察対象面Ｐ０の重複領域Ａｄ’には、ＣＡＲＳ過程を生起させる光として、図１３に示すとおり、周波数ｆ１で変調された励起光と、変調されていないドーナツ誘導光と、周波数ｆ２で変調された円形誘導光とが入射する。
　よって、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡では、図１４に示すとおり、非重複領域Ａｍで発生するＣＡＲＳ光（光周波数２ω１－ω２）は、周波数ｆ１、ｆ２、２ｆ１、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れかで変化し、重複領域Ａｄ’で発生するＣＡＲＳ光（光周波数２ω１－ω２）は、周波数ｆ１、２ｆ１の何れかで変化する。
　そこで、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡におけるロックインアンプ２５は、周波数ｆ２、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れかでロックイン検出を行うことにより、非重複Ａｍで発生したＣＡＲＳ光のみを検出する。
　したがって、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡でも、ＣＡＲＳ光の検出元を、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限することができる。つまり、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡でも、試料２０の超解像観察が可能である。
　なお、２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡において上記の周波数ｆ１、ｆ２の大小関係は問わないが、周波数ｆ１、ｆ２の各々とロックイン検出の検出周波数（周波数ｆ２、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れか）とが非整数倍の関係になるように、周波数ｆ１、ｆ２の組み合わせが選定されることが望ましい。
　また、１／４波長板５１を光パラメトリック発振器１４２の射出光路に挿入し、ドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光とすると、ドーナツの形状（ドーナツ誘導光スポットの強度分布）をより等方的にすることができる。
　また、第２実施形態で説明したＣＳＲＳ顕微鏡も、本変形例と同様に変形すること（すなわち２周波ロックイン型に変形すること）が可能である。但し、その場合は、ロックイン検出の検出周波数を、ｆ１、｜ｆ２±ｆ１｜、｜２ｆ２±ｆ１｜の何れかに設定することが望ましい。
［第３実施形態］
　以下、本実施形態の第３実施形態としてＳＲＳ顕微鏡を説明する。ここでは、第２実施形態（図９のＣＡＲＳ顕微鏡）との相違点のみを説明する。
　図１５は、ＳＲＳ顕微鏡の構成図である。
　先ず、ＳＲＳ顕微鏡では、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と、光周波数ω１、ω２とは、観察対象面Ｐ０の光スポット内の観察対象物質にてＳＲＳ過程が生起するように設定されている（ω１＞ω２）。これらの光のパルス形状は、パルスレーザ光源１１が発振するパルスの形状と、ビームスプリッタ１３１の透過反射率と、ビームスプリッタ１３２の透過反射率とによって調整可能である（なお、前述したＮＤフィルタの透過率によって調整してもよい。）。
　光スポット内でＳＲＳ過程が生起すると、光スポットから射出する光の強度が変化する。具体的には、光周波数ω１の光の強度が減少し、光周波数ω２の光の強度が減少する。したがって、ＳＲＳ顕微鏡で検出すべき信号光（ＳＲＳ光）の光周波数はω１又はω２である。この信号光の光周波数（ω１又はω２）は、励起光の光周波数（ω１）又は誘導光の光周波数（ω２）と同じであるため、音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５によるロックイン検出が必要となる。なお、図１５に示した構成例は、検出対象となる光周波数をω２とした場合の構成例である。検出対象となる光周波数をω１とする場合には、図１５における光周波数ω１をω２に、光周波数ω２をω１にそれぞれ置き換えれば良い。なお、信号光と同じ光周波数のノイズ光の影響を排除するためのロックイン検出は公知なので説明を省略する。
　また、ＳＲＳ顕微鏡における波長選択フィルタ２２には、ＳＲＳ光と同じ光周波数（ω１又はω２）の光を通過させ、かつＳＲＳ光とは異なる光周波数の光をカットする波長選択性が付与される。
　以上のＳＲＳ顕微鏡でも、第２実施形態（ＣＡＲＳ顕微鏡）と同様、図１６に示すとおり、観察対象面Ｐ０の重複領域Ａｄ’で発生する信号光（ここではＳＲＳ光）と、非重複領域Ａｍで発生する信号光（ここではＳＲＳ光）との間で偏光方向がずれる。よって、ＳＲＳ顕微鏡でも、非重複領域Ａｍで発生する信号光（ここではＳＲＳ光）を、重複領域Ａｄ’で発生する信号光（ここではＳＲＳ光）から分離することができる。
　したがって、ＳＲＳ顕微鏡でも、第２実施形態（ＣＡＲＳ顕微鏡）と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
　なお、本実施形態も、第２実施形態（ＣＡＲＳ顕微鏡）と同様に変形することが可能である。例えば、本実施形態では、重複領域Ａｄ’からのＳＲＳ光と非重複領域ＡｍからのＳＲＳ光とを偏光分離する代わりに、「２周波ロックイン」を行ってもよい（以下の変形例を参照）。
［第３実施形態の変形例］
　以下、第３実施形態の変形例として、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡を説明する。ここでは、第３実施形態との相違点のみを説明する。
　図１７は、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡の構成図である。
　先ず、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡では、偏光子４１、１／４波長板５１、検光子７０は省略され、その代わりに、励起光の単独光だけでなく、円形誘導光の単独光路にも音響光学変調器１５が配置される。
　また、励起光の単独光路に配置された音響光学変調器１５は、励起光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、円形誘導光の単独光路に配置された音響光学変調器１５は、円形誘導光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調する（但し、ｆ１≠ｆ２）。
　以上の２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡において、観察対象面Ｐ０の非重複領域Ａｍには、ＳＲＳ過程を生起させる光として、周波数ｆ１で変調された励起光と、周波数ｆ２で変調された円形誘導光とが入射する。
　一方、観察対象面Ｐ０の重複領域Ａｄ’には、ＳＲＳ過程を生起させる光として、周波数ｆ１で変調された励起光と、変調されていないドーナツ誘導光と、周波数ｆ２で変調された円形誘導光とが入射する。
　よって、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡では、図１８に示すとおり、非重複領域Ａｍで発生するＳＲＳ信号（ここではＳＲＳ信号の光周波数をω２とする。）の大部分は、周波数｜ｆ１±ｆ２｜で変化し、重複領域Ａｄ’で発生するＳＲＳ信号（光周波数ω２）の大部分は、周波数ｆ１で変化する。
　そこで、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡において、ロックインアンプ２５は、周波数｜ｆ１±ｆ２｜でロックイン検出を行うことにより、非重複領域Ａｍで発生したＳＲＳ光（光周波数ω２）を、重複領域Ａｄ’で発生したＳＲＳ光（光周波数ω２）から分離して検出する。
　したがって、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡でも、ＳＲＳ光（光周波数ω２）の検出元を、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限することができる。つまり、２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡でも、試料２０の超解像観察が可能である。
　なお、ここでは、信号光（ＳＲＳ光）の光周波数をω２としたが、ω１としてもよいことはいうまでもない。
　また、１／４波長板５１を光パラメトリック発振器１４２の射出光路に挿入し、ドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光とすると、ドーナツの形状（ドーナツ誘導光スポットの強度分布）をより等方的にすることができる。
　なお、上記の周波数ｆ１、ｆ２の大小関係は問わないが、周波数ｆ１、ｆ２の各々とロックイン検出の検出周波数｜ｆ１±ｆ２｜とが非整数倍の関係になるように、周波数ｆ１、ｆ２の組み合わせが選定されることが望ましい。
［第４実施形態］
　以下、本実施形態の第４実施形態として２光子吸収顕微鏡を説明する。ここでは、第３実施形態（図１５のＳＲＳ顕微鏡）との相違点のみを説明する。
　図１９は、２光子吸収顕微鏡の構成図である。
　図１９に示すとおり、２光子吸収顕微鏡の構成は、第３実施形態（ＳＲＳ顕微鏡）の構成と基本的に同じである。
　但し、２光子吸収顕微鏡では、励起光、ドーナツ誘導光、円形誘導光の各々のパルス形状（パルス光強度、パルス幅）と、光周波数ω１、ω２とは、観察対象面Ｐ０の光スポット内の観察対象物質にて２光子吸収過程が生起するように設定されている（ω１＞ω２）。
　また、２光子吸収顕微鏡で検出すべき信号光（２光子吸収による光の減少分）の光周波数はω２であるので、２光子吸収顕微鏡における波長選択フィルタ２２には、信号光（２光子吸収による光の減少分）と同じ光周波数（ω２）の光を通過させ、信号光（２光子吸収による光の減少分）とは異なる光周波数（ω１）の光をカットする波長選択性が付与される。
　以上の２光子吸収顕微鏡でも、第３実施形態（ＳＲＳ顕微鏡）と同様、試料２０の超解像観察が可能である。
　また、本実施形態も第３実施形態（ＳＲＳ顕微鏡）と同様に変形することが可能である。例えば、本実施形態では、重複領域からの信号光と非重複領域からの信号光とを偏光分離する代わりに、「２周波ロックイン」を行ってもよい（以下の変形例を参照）。
［第４実施形態の変形例］
　以下、第４実施形態の変形例として、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡を説明する。ここでは、第４実施形態との相違点のみを説明する。
　図２０は、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡の構成図である。
　先ず、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡では、偏光子４１、１／４波長板５１、検光子７０は省略され、その代わりに、励起光の単独光だけでなく、円形誘導光の単独光路にも音響光学変調器１５が配置される。
　また、励起光の光路に配置された音響光学変調器１５は、励起光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、円形誘導光の光路に配置された音響光学変調器１５は、円形誘導光の強度を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調する（但し、ｆ１≠ｆ２）。
　以上の２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡でも、ロックインアンプ２５は、周波数｜ｆ１±ｆ２｜でロックイン検出を行うことにより、非重複領域Ａｍで発生した信号光（２光子吸収による光の減少分）を、重複領域Ａｄ’で発生した信号光から分離して検出する。
　したがって、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡でも、信号光（２光子吸収による光の減少分）の検出元を、対物レンズ１９の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さい非重複領域Ａｍのみに制限することができる。つまり、２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡でも、試料２０の超解像観察が可能である。
　なお、上記の周波数ｆ１、ｆ２の大小関係は問わないが、周波数ｆ１、ｆ２の各々とロックイン検出の検出周波数｜ｆ１±ｆ２｜とが非整数倍の関係になるように、周波数ｆ１、ｆ２の組み合わせが選定されることが望ましい。
　また、１／４波長板５１を光パラメトリック発振器１４２の射出光路に挿入し、ドーナツ誘導光の偏光状態を円偏光とすると、ドーナツの形状（ドーナツ誘導光スポットの強度分布）をより等方的にすることができる。
［実施形態及び変形例の補足］
　なお、上述した第１実施形態～第４実施形態又は変形例において、超解像効果（空間分解能）を更に高めるためには、観察対象面Ｐ０における非重複領域Ａｍのサイズを小さくすればよい。
　また、非重複領域Ａｍのサイズを小さくするためには、ドーナツ誘導光の強度を高めればよい。そのためには、例えば、ドーナツ誘導光の単独光路に挿入されたＮＤフィルタの透過率を高めに設定すれば良い。あるいは、ビームスプリッタ１３１、１３２の反射比率を高めに設定すればよい。
　なお、何れかの実施形態で偏光を利用する場合は、ドーナツ誘導光の強度増加とともに重複領域Ａｄ’からの光の偏光と非重複領域Ａｍからの光の偏光との直交性が悪くなり、非重複領域Ａｍからの信号の割合が小さくなる虞がある。このため、偏光を利用する場合は、ドーナツ誘導光の強度調整を、重複領域Ａｄ’からの光の偏光状態を考慮しつつ適切に行うことが望ましい。
　また、上述した実施形態では、光路の異なる３つのレーザ光を生成するために１台のレーザ光源と３台の光パラメトリック発振器との組み合わせを使用したが、１台のレーザ光源と２台のパラメトリック発振器との組み合わせを使用してもよい。但し、その場合は、３つのレーザ光の何れか１つとしてレーザ光源から射出したレーザ光がそのまま使用される。
　また、光周波数ω２と光周波数ω２’とが等しい場合は、光周波数ω２の光を生成する光パラメトリック発振器と光周波数ω２’の光を生成する光パラメトリック発振器とを共通化してもよい。
　また、上述した実施形態では、光路の異なる３つのレーザ光を生成するために１台のレーザ光源と３台の光パラメトリック発振器との組み合わせを使用したが、１台の光パラメトリック発振器から波長の異なる２つの光を取り出してそれぞれを利用しても良い。ただし、この場合、２つの光のうち一方の光周波数を変化させると他方の光周波数もそれに伴って変化するため注意が必要である。
　また、上述した実施形態では、光路の異なる３つのレーザ光を生成するために１台のレーザ光源と３台の光パラメトリック発振器とを使用したが、３台のレーザ光源を使用してもよい。但し、その場合は、３台のレーザ光源はタイミング同期されることが望ましい。
　また、上述した幾つかの実施形態では、パルスレーザ光の強度を時間方向にかけて変調するために音響光学変調器１５を使用したが、電気光学素子と偏光子との組み合わせを使用してもよい。
　また、上述した幾つかの実施形態では、パルスレーザ光の強度を時間方向にかけて変調するために音響光学変調器１５を使用したが、パルスレーザ光の繰り返し周波数を制御してもよい。
　例えば、第１実施形態又は変形例においては、光周波数ω１のパルスレーザ光の繰り返し周波数ｆｒｅｐ１を、光周波数ω２のパルスレーザ光の繰り返し周波数ｆｒｅｐ２の１／ｍ倍に設定し、かつ、ロックイン検出の検出周波数をｆｒｅｐ１に設定してもよい（但し、ｍは２以上の整数）。
　また、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）では、試料２０に照射される光の強度を時間方向にかけて変調したが、試料２０に照射される光の他の特性、例えば、位相、偏光、光周波数の何れかを時間方向にかけて変調してもよい。
　また、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）では、試料２０に照射される光の強度を時間方向にかけて変調するために、試料２０に向かう光の偏光を時間方向にかけて変調すると共に、変調された光の光路のうち試料２０の上流側に検光子を配置してもよい。
　因みに、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）において、試料２０に向かう光の位相を時間方向にかけて変調したならば、試料２０に照射されるパルスレーザ光のパルス間隔が時間変化する。
　また、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）において、エネルギー準位変化を伴う光学過程（誘導放出、ＣＡＲＳ、ＣＳＲＳ、ＳＲＳ、２光子吸収など）が生起するか否か、すなわち信号光が生起するか否かは、試料２０に照射される光の光周波数に依存する。このため、試料２０に照射される光の光周波数を時間方向にかけて変調すれば、信号光の強度に変調が転写されることは明らかである。つまり、信号光をロックイン検出可能であることは明らかである。
　また、上述した幾つかの実施形態又は変形例（ロックイン型）では、試料２０に照射される３つの光のうち１つの光の特性を時間方向にかけて変調したが、３つの光のうち少なくとも２つの光の特性を、時間方向にかけて互いに異なる変調周波数で変調してもよい。
　また、上述した何れかの実施形態又は変形例では、透過型の顕微鏡を説明したが、反射型の顕微鏡にも本発明は適用可能である。
　また、上述した第１実施形態～第４実施形態又は変形例では、観察対象面Ｐ０へ同時に形成される光スポットの個数（すなわち観察対象点の個数）を単数としたが、複数としてもよい。観察対象点の個数を複数化すれば、観察対象面Ｐ０の全体を光スポットで（観察対象点で）スキャンするのに要する時間を短縮することができる。
　また、上述した第１実施形態～第４実施形態又は変形例では、面内分解能を向上させるために面内方向における光スポットの形状をドーナツ状にしたが、光軸方向の分解能を向上させるために光軸方向における光スポットの形状をドーナツ状にしてもよい。そのためには、中央の円形領域と周辺のリング領域との間にπ［ｒａｄ］の位相差が付与された位相板１８’を使用すればよい（位相板１８’は不図示）。前述した誘導放出、励起状態吸収、ＧＳＤ、２光子吸収、ＳＲＳ、ＣＡＲＳ、ＣＳＲＳが発生するのは光強度の高い集光点のみに制限されるため、上述した第１実施形態～第４実施形態又は変形例では高いセクショニング能力（光軸方向の分解能）が得られるが、そのセクショニング能力は本手法の適用により更に向上する。
　また、面内方向における光スポットの形状がドーナツ状である光（位相板１８により生成される）と、光軸方向における光スポットの形状がドーナツ状である光（位相板１８’により生成される）とを合成したものを、ドーナツ誘導光として使用してもよい。この場合は、面内方向と光軸方向との双方に亘って超解像効果を得ることができる。
　これを実現するためには、位相板１８により位相変化を受けた光と、位相板１８’により位相変化を受けた光とを、ビームスプリッタや偏光ビームスプリッタ等の光合成素子で合成し、合成された光を試料に向けて対物レンズで集光すれば良い。
　また、上述した第１実施形態～第４実施形態又は変形例では、無染色試料の観察に本発明を適用した場合を説明したが、染色された蛍光試料、染色された非蛍光試料など、他の試料の観察にも本発明は適用可能である。また、バイオ観察のみでなく、例えば材料観察などの他種の観察にも本発明は適用可能である。
［実施形態の作用効果］
　上述した何れかの実施形態又は変形例（誘導放出顕微鏡、ＣＡＲＳ顕微鏡、ＣＳＲＳ顕微鏡、ＳＲＳ顕微鏡、２光子吸収顕微鏡）は、観察対象（試料２０）の第１領域（励起光スポットＡｅ）に第１光周波数ω１を有した第１照明光（励起光）を集光し、前記第１領域（照射領域Ａｅ）と部分的に重複する第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）に第２光周波数ω２’を有した第２照明光（ドーナツ誘導光）を集光し、前記第１領域（励起光スポットＡｅ）のうち前記第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）と重複しない非重複領域（Ａｍ）を含む第３領域（円形誘導光スポットＡｏ）に第３光周波数ω２を有した第３照明光（円形誘導光）を集光する照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、位相板１８、対物レンズ１９）と、前記第１領域（励起光スポットＡｅ）及び前記第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）及び前記第３領域（円形誘導光スポットＡｏ）の全体（光スポット）で発生した光から、前記非重複領域（Ａｍ）に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光（誘導放出光、ＣＡＲＳ光、ＳＲＳ光、２光子吸収による光の減少分）を抽出する抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５、偏光子４１、１／４波長板５１、波長選択フィルタ２２、１／４波長板６０、検出光子７０など）とを備える。
　したがって、上述した何れかの実施形態又は変形例（誘導放出顕微鏡、ＣＡＲＳ顕微鏡、ＣＳＲＳ顕微鏡、ＳＲＳ顕微鏡、２光子吸収顕微鏡）は、前記照明光学系の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さな前記非重複領域（Ａｍ）を、前記信号光（誘導放出光、ＣＡＲＳ光、ＣＳＲＳ光、ＳＲＳ光、２光子吸収による光の減少分）の検出元とすることができる。
　また、第１実施形態又は変形例（誘導放出顕微鏡）における前記照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、位相板１８、対物レンズ１９）は、前記観察対象（試料２０）に対して前記第１照明光（励起光）、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）、前記第３照明光（円形誘導光）を順次に照射し、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５、偏光子４１、１／４波長板５１、波長選択フィルタ２２、検出光子７０）は、光周波数ω２を有した前記信号光（誘導放出光）を抽出する。
　また、第１実施形態（誘導放出顕微鏡）における前記抽出部（信号発生器２６、ロックインアンプ２５）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第１照明光（励起光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調すると共に、前記全体（光スポット）で発生した光を周波数ｆ１でロックイン検出することにより、抽出される前記信号光（誘導放出光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
　また、第１実施形態（誘導放出顕微鏡）における前記照明光学系は、前記第１照明光（励起光）と前記第２照明光（ドーナツ誘導光）とを同時に照射した後に前記第３照明光（円形誘導光）を照射する、あるいは前記第１照明光（励起光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間にエネルギー換算で３６００ｃｍ－１以上の波長差を付与した状態で前記第１照明光（励起光）と前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）とを同時に照射し、前記抽出部は、光周波数ω２を有した前記信号光を抽出する。
　また、第１実施形態の超解像観察装置（誘導放出顕微鏡）における前記抽出部（光パラメトリック発振器１４２、１４３、波長選択フィルタ２２）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に光周波数差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と同じ光周波数（ω２’）の光を前記観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（誘導放出光）に対する前記第２照明光（ドーナツ誘導光）の混入を抑える。
　また、第１実施形態の変形例（誘導放出顕微鏡）における前記抽出部（偏光子４１、検光子７０）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と同じ偏光方向の光を前記観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（誘導放出光）に対する前記第２照明光（ドーナツ誘導光）の混入を抑える。
　また、第２実施形態又は変形例（ＣＡＲＳ顕微鏡）における前記照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、対物レンズ１９）は、前記観察対象（試料２０）に対して前記第１照明光（励起光）、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）、前記第３照明光（円形誘導光）を同時に照射し、前記抽出部（波長選択フィルタ２２）は、光周波数（２ω１－ω２）を有した前記信号光（ＣＡＲＳ光）を抽出する。
　また、第２実施形態（ＣＡＲＳ顕微鏡）における前記抽出部（偏光子４１、検光子７０）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）及び前記第３照明光（円形誘導光）の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（ＣＡＲＳ光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
　また、第２実施形態の変形例（２周波ロックイン型ＣＡＲＳ顕微鏡）では、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第１照明光（励起光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第３照明光（円形誘導光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体（光スポット）で発生した光を周波数ｆ２、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れかでロックイン検出することにより、抽出される前記信号光（ＣＡＲＳ光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
　また、第２実施形態の変形例（ＣＳＲＳ顕微）における前記照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、対物レンズ１９）は、前記観察対象（試料２０）に対して前記第１照明光（励起光）、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）、前記第３照明光（円形誘導光）を同時に照射し、前記抽出部（波長選択フィルタ２２）は、光周波数（２ω２－ω１）を有した前記信号光（ＣＳＲＳ光）を抽出する。
　また、第２実施形態（ＣＳＲＳ顕微鏡）における前記抽出部（偏光子４１、検光子７０）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）及び前記第３照明光（円形誘導光）の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（ＣＳＲＳ光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
　また、第２実施形態の変形例（２周波ロックイン型ＣＳＲＳ顕微鏡）では、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第１照明光（励起光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第３照明光（円形誘導光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体（光スポット）で発生した光を周波数ｆ１、｜ｆ２±ｆ１｜、｜２ｆ２±ｆ１｜の何れかでロックイン検出することにより、抽出される前記信号光（ＣＳＲＳ光）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
　また、第３実施形態又は第４実施形態及び変形例（ＳＲＳ顕微鏡又は２光子吸収顕微鏡）における前記照明光学系（パルスレーザ光源１１、光パラメトリック発振器１４１、１４２、１４３、位相板１８、対物レンズ１９）は、前記観察対象（試料２０）に対して前記第１照明光（励起光）、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）、前記第３照明光（円形誘導光）を同時に照射し、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５、偏光子４１、１／４波長板５１、波長選択フィルタ２２、検出光子７０）は、光周波数ω２又はω１を有した前記信号光（ＳＲＳ光、又は、２光子吸収による光の減少分）を抽出する。
　また、第３実施形態又は第４実施形態（ＳＲＳ顕微鏡又は２光子吸収顕微鏡）における前記抽出部（偏光子４１、検光子７０）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第２照明光（ドーナツ誘導光）と前記第３照明光（円形誘導光）との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光（ドーナツ誘導光）及び前記第３照明光（円形誘導光）の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象（試料２０）の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光（ＳＲＳ光、又は、２光子吸収による光の減少分）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
　また、第３実施形態又は第４実施形態の変形例（２周波ロックイン型ＳＲＳ顕微鏡又は２周波ロックイン型２光子吸収顕微鏡）における前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５）は、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第１照明光（励起光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象（試料２０）へ向かう前記第３照明光（円形誘導光）の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で時間変調すると共に、前記全体（光スポット）で発生した光を周波数｜ｆ１±ｆ２｜でロックイン検出することにより、抽出される前記信号光（ＳＲＳ光、又は、２光子吸収による光の減少分）の発生元を前記非重複領域（Ａｍ）のみに制限する。
　また、上述した何れかの実施形態又は変形例（ロックイン型）において、前記抽出部（音響光学変調器１５、信号発生器２６、ロックインアンプ２５）の変調対象である前記特性は、前記光の強度、位相、偏光、光周波数の何れかである。
　また、上述した何れかの実施形態又は変形例（誘導放出顕微鏡、ＣＡＲＳ顕微鏡、ＣＳＲＳ顕微鏡、ＳＲＳ顕微鏡、２光子吸収顕微鏡）において、前記第１領域（励起光スポットＡｅ）及び前記第３領域（円形誘導光スポットＡｏ）の形状は、円形であり、前記第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）の形状は、輪帯状であり、前記第１領域（励起光スポットＡｅ）の中心と前記第２領域（ドーナツ誘導光スポットＡｄ）の中心と前記第３領域（円形誘導光スポットＡｏ）の中心とは一致する。
　したがって、上述した何れかの超解像観察装置又は変形例（誘導放出顕微鏡、ＣＡＲＳ顕微鏡、ＣＳＲＳ顕微鏡、ＳＲＳ顕微鏡、２光子吸収顕微鏡）は、観察対象点（非重複領域Ａｍ）を、前記照明光学系の解像限界（励起光スポットＡｅのサイズ）より小さくすることができる。
［その他］
　また、上述の各実施形態の要件は、適宜組み合わせることができる。また、一部の構成要素を用いない場合もある。また、法令で許容される限りにおいて、上述の各実施形態及び変形例で引用した装置などに関する全ての公開公報及び米国特許の開示を援用して本文の記載の一部とする。
　１１…パルスレーザ光源、１２…レンズ、１３１、１３２…ビームスプリッタ、Ｍ１…ミラー、１４１、１４２、１４３…光パラメトリック発振器（ＯＰＯ：optical parametric oscillator）、１５…音響光学変調器（ＡＯＭ：Acousto-optic modulator）、１８…位相板、Ｍ２…ミラー、１３３、１３４…ダイクロイックミラー、１９…対物レンズ、２０…試料、２８…試料ステージ、２１…対物レンズ、２２…波長選択フィルタ、２３…集光レンズ、２４…光検出器、２５…ロックインアンプ、２６…信号発生器、２７…パーソナルコンピュータ

Claims (18)

  1. 　観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２’を有した第２照明光を集光し、前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光する照明光学系と、
    　前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する抽出部と、
    　を備えることを特徴とする超解像観察装置。
  2. 　請求項１に記載の超解像観察装置において、
    　前記照明光学系は、
    　前記観察対象に対して前記第１照明光、前記第２照明光、前記第３照明光を順次に照射し、
    　前記抽出部は、
    　光周波数ω２を有した前記信号光を抽出する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  3. 　請求項２に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部は、
    　前記観察対象へ向かう前記第１照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調すると共に、前記全体で発生した光を周波数ｆ１でロックイン検出することにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  4. 　請求項１に記載の超解像観察装置において、
    　前記照明光学系は、
    　前記第１照明光と前記第２照明光とを同時に照射した後に前記第３照明光を照射する、あるいは前記第１照明光と前記第３照明光との間にエネルギー換算で３６００ｃｍ－１以上の波長差を付与した状態で前記第１照明光と前記第２照明光と前記第３照明光とを同時に照射し、
    　前記抽出部は、
    　光周波数ω２を有した前記信号光を抽出する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  5. 　請求項３又は請求項４に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部は、
    　前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に光周波数差を与えると共に、前記第２照明光と同じ光周波数の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光に対する前記第２照明光の混入を抑える
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  6. 　請求項３又は請求項４に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部は、
    　前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光と同じ偏光方向の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光に対する前記第２照明光の混入を抑える
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  7. 　請求項１に記載の超解像観察装置において、
    　前記照明光学系は、前記観察対象に対して前記第１照明光、前記第２照明光、前記第３照明光を同時に照射し、
    　前記抽出部は、光周波数（２ω１－ω２）を有した前記信号光を抽出する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  8. 　請求項７に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部は、
    　前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光及び前記第３照明光の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  9. 　請求項７に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部は、
    　前記観察対象へ向かう前記第１照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象へ向かう前記第３照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体で発生した光を周波数ｆ２、｜ｆ１±ｆ２｜、｜２ｆ１±ｆ２｜の何れかでロックイン検出することにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  10. 　請求項１に記載の超解像観察装置において、
    　前記照明光学系は、前記観察対象に対して前記第１照明光、前記第２照明光、前記第３照明光を同時に照射し、
    　前記抽出部は、光周波数（２ω２－ω１）を有した前記信号光を抽出する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  11. 　請求項１０に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部は、
    　前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光及び前記第３照明光の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  12. 　請求項１０に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部は、
    　前記観察対象へ向かう前記第１照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象へ向かう前記第３照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体で発生した光を周波数ｆ１、｜ｆ２±ｆ１｜、｜２ｆ２±ｆ１｜の何れかでロックイン検出することにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  13. 　請求項１に記載の超解像観察装置において、
    　前記照明光学系は、前記観察対象に対して前記第１照明光、前記第２照明光、前記第３照明光を同時に照射し、
    　前記抽出部は、光周波数ω２又はω１を有した前記信号光を抽出する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  14. 　請求項１３に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部は、
    　前記観察対象へ向かう前記第２照明光と前記第３照明光との間に偏光方向差を与えると共に、前記第２照明光及び前記第３照明光の合成偏光方向と同じ偏光方向の光を前記観察対象の下流側でカットすることにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  15. 　請求項１３に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部は、
    　前記観察対象へ向かう前記第１照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ１で変調し、前記観察対象へ向かう前記第３照明光の特性を時間方向にかけて周波数ｆ２で変調すると共に、前記全体で発生した光を周波数｜ｆ１±ｆ２｜でロックイン検出することにより、抽出される前記信号光の発生元を前記非重複領域のみに制限する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  16. 　請求項３、請求項９、請求項１２、請求項１５の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
    　前記抽出部の変調対象である前記特性は、
    　前記光の強度、位相、偏光、光周波数の何れかである
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  17. 　請求項１～請求項１６の何れか一項に記載の超解像観察装置において、
    　前記第１領域及び前記第３領域の形状は、円形であり、
    　前記第２領域の形状は、輪帯状であり、
    　前記第１領域の中心と前記第２領域の中心と前記第３領域の中心とは一致する
    　ことを特徴とする超解像観察装置。
  18. 　観察対象の第１領域に第１光周波数ω１を有した第１照明光を集光し、
    　前記第１領域と部分的に重複する第２領域に第２光周波数ω２’を有した第２照明光を集光し、
    　前記第１領域のうち前記第２領域と重複しない非重複領域を含む第３領域に第３光周波数ω２を有した第３照明光を集光し、
    　前記第１領域及び前記第２領域及び前記第３領域の全体で発生した光から、前記非重複領域に存在する物質のエネルギー準位変化に応じて生じた信号光を抽出する
    　ことを特徴とする超解像観察方法。
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