JP2017156694A - 光学顕微鏡、及び観察方法 - Google Patents

Abstract

【課題】広視野、かつ、高ＮＡで観察可能な光学顕微鏡を提供する。【解決手段】本発明の一態様にかかる光学顕微鏡は、光源１１と、照射光を偏向するサーボ型走査ミラー１７と、試料２１での非線形光学現象によって生じた観察光を屈折する対物レンズ２０と、ダイクロイックミラーＤＣＭ２によって分離された観察光が入射するリレーレンズＬＸ１、ＬＸ２と、リレーレンズＬＸ１、ＬＸ２からの観察光を検出する光検出器ＰＭＴ１と、を備え、対物レンズ２０の中央部には、サーボ型走査ミラー１７は、照射光が中央領域４１内に投影されるよう、照射光を走査し、対物レンズ２０の中央領域４１と周辺領域４２とを通過した観察光がリレーレンズＬＸ１、ＬＸ２を介して光検出器ＰＭＴ１で検出される。【選択図】図１

Description

本発明は、光学顕微鏡、及び観察方法に関する。

２光子励起顕微鏡は、物質の励起に２光子吸収過程を用いている（非特許文献１、２）。すなわち、２光子励起顕微鏡では、１つの蛍光分子が２つの光子をほぼ同時に吸収して、励起状態となる非線形光学現象を利用している。蛍光分子が励起状態から安定状態に戻る際に、エネルギーが蛍光として放出される。２光子励起顕微鏡では、蛍光を検出して画像を構築する。蛍光吸収波長の半分のエネルギーの励起光であっても、集光することにより強度を高めれば、光子密度の高い焦点のみで蛍光分子を励起することができる。

焦点での光子密度を高くするため、フェムト秒パルスレーザが用いられている。短パルスレーザを用いることで、高いピークパワーと低い平均パワーを両立させることが可能なため、試料へのダメージを低減できる。したがって、フェムト秒パルスレーザは、生体試料の観察に適している。２光子顕微鏡では、焦点以外では蛍光が発生しないため、試料の深さ方向の観察が可能となる。特に、低侵襲で脳深部の観察ができるため、２光子励起顕微鏡は、脳研究などに有用である。また、２光子励起顕微鏡では、コンフォーカル顕微鏡とは異なり、ピンホールなしで、観察することができる。このため、蛍光を励起光と同じ光路に戻して検出する必要がない。すなわち、２光子励起顕微鏡では、ノンデスキャン検出器を用いることができる。

Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ Ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｍｕｔｉｐｈｏｔｏｎ Ｅｘｉｔａｔｉｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ：http://www.biomolphysics.kth.se/courses/fluorescence12/DW%20Piston-multiphoton.pdf インターネット検索［平成２７年１０月２８日］ Ｔｗｏ−Ｐｈｏｔｏｎ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｌｉｇｈｔ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｐｅｔｅｒ Ｔｃ Ｓｏ著：http://web.mit.edu/solab/Documents/Assets/So-2PF%20light%20microscopy.pdf インターネット検索［平成２７年１０月２８日］

脳研究では、広域ネットワーク観察のため、広視野での観察が望まれる。また、２光子蛍光画像の明るさは、対物レンズのＮＡ（Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ａｐｅｒｔｕｒｅ：開口数）に依存する。したがって、広視野、すなわち低倍率で高ＮＡの対物レンズが望まれる。

しかしながら、以下の理由により、広視野の対物レンズは、低ＮＡとなっている。
（１）低倍率であるならば、画素数が増加するので、低ＮＡでも必要な分解能を満たせる。
（２）低倍率高ＮＡレンズはサイズが巨大となり、顕微鏡に設置するのが困難となる
（３）低倍率高ＮＡレンズは、収差補正が困難である。

したがって、市販の対物レンズを用いた２光子顕微鏡では、広視野、かつ高ＮＡでの観察が困難である。

本発明は、このような事情を背景としてなされたものであり、広視野かつ高ＮＡでの観察を行うことができる光学顕微鏡、及び観察方法を提供することを目的とするものである。

本実施形態の一態様にかかる光学顕微鏡は、照射光を発生する光源と、前記照射光を偏向して、試料上での照射位置を走査する光スキャナと、前記光スキャナで偏向された前記照射光を集光して前記試料に照射するともに、前記試料での非線形光学現象によって生じた観察光を屈折する対物レンズと、前記光スキャナでデスキャンされる前に、前記対物レンズからの前記観察光を前記照射光の光路から分離する光分離手段と、前記光分離手段によって分離された前記観察光が入射するコンデンサレンズと、前記コンデンサレンズからの前記観察光を検出する光検出器と、を備え、前記対物レンズの中央部には、収差補正が施された中央領域が形成され、かつ、前記中央領域の外側には周辺領域が形成され、前記光スキャナは、前記照射光が前記中央領域内に投影されるよう、前記照射光を走査し、前記対物レンズの前記中央領域と前記周辺領域とを通過した前記観察光が前記コンデンサレンズを介して前記光検出器で検出されるものである。これにより、広視野かつ高ＮＡでの観察を行うことができる

上記の光学顕微鏡は、前記光スキャナで偏向した照射光が入射するスキャンレンズと、前記スキャンレンズから前記対物レンズまでの間に配置され、前記スキャンレンズからの前記照射光を平行光束とするチューブレンズと、をさらに備えていてもよい。

上記の光学顕微鏡において、前記対物レンズから前記試料に向かう方向における前記対物レンズのＮＡが、前記試料から前記対物レンズに向かう方向における前記対物レンズのＮＡよりも小さくなっていてもよい。

上記の光学顕微鏡は、前記試料において２光子励起により発生した蛍光を前記観察光として、前記光検出器が検出するものであってもよい。

本実施形態の一態様にかかる観察方法は、試料上での照射位置を走査するよう、光スキャナにより照射光を偏向するステップと、対物レンズにより、前記光スキャナで偏向された前記照射光を集光して前記試料に照射するステップと、前記光スキャナでデスキャンされる前に、前記対物レンズからの前記観察光を前記照射光の光路から分離するステップと、分離された前記観察光を、コンデンサレンズを介して検出するステップと、を備え、前記対物レンズの中央部には、収差補正が施された中央領域が形成され、かつ、前記中央領域の外側には周辺領域が形成され、前記光スキャナは、前記照射光が前記中央領域内に投影されるよう、前記照射光を走査し、前記対物レンズの前記中央領域と前記周辺領域とを通過した前記観察光が前記コンデンサレンズを介して前記光検出器で検出されるものである。これにより、広視野かつ高ＮＡでの観察を行うことができる

上記の観察方法は、前記光スキャナで偏向した照射光が入射するスキャンレンズと、前記スキャンレンズから前記対物レンズまでの間に配置され、前記スキャンレンズからの前記照射光を平行光束とするチューブレンズと、をさらに備えていてもよい。

上記の観察方法において、前記対物レンズから前記試料に向かう方向における前記対物レンズのＮＡが、前記試料から前記対物レンズに向かう方向における前記対物レンズのＮＡよりも小さくなっていてもよい。

上記の観察方法は、前記試料において２光子励起により発生した蛍光を前記観察光として、光検出器が検出するものであってもよい。

本発明によれば、広視野かつ高ＮＡでの観察を行うことができる光学顕微鏡、及び観察方法を提供することができる。

光学顕微鏡の２光子顕微鏡モードでの光学系を示す図である。 光学顕微鏡の１光子顕微鏡モードでの光学系を示す図である。 ２光子顕微鏡モードでの照明光学系を説明するための図である。 ２光子顕微鏡モードでの検出光学系を説明するための図である。 対物レンズの瞳の領域を説明するための図である。 ２光子顕微鏡モードでの光学系を簡略化して示す図である。 比較例にかかる２光子顕微鏡の光学系を示す図である。 比較例にかかる２光子顕微鏡で撮像された画像を示す図である。 本実施の形態にかかる２光子顕微鏡で撮像された画像を示す図である。 本実施の形態にかかる２光子顕微鏡で撮像された画像を示す図である。 図１０の拡大画像を示す図である。

以下に、本発明を適用可能な実施の形態が説明される。以下の説明は、本発明の実施形態を説明するものであり、本発明が以下の実施形態に限定されるものではない。説明の明確化のため、以下の記載は、適宜、省略及び簡略化がなされている。又、当業者であれば、以下の実施形態の各要素を、本発明の範囲において容易に変更、追加、変換することが可能であろう。尚、各図において同一の符号を付されたものは同様の要素を示しており、適宜、説明が省略される。

本実施の形態にかかる光学顕微鏡１００は、２光子顕微鏡である。より具体的には、光学顕微鏡１００は、２光子顕微鏡モードと１光子顕微鏡モードを切り替え可能な顕微鏡である。すなわち、光学系を光路中に挿脱することで、２光子顕微鏡モードと１光子顕微鏡モードを切り替えることができる。図１は２光子顕微鏡モードでの光学系の構成を示し、図２は１光子顕微鏡モードでの光学系の構成を示している。

まず、２光子顕微鏡モードの光学系について、図１を参照して説明する。光学顕微鏡１００は、光源１１、ミラー１２、ミラー１３、ミラー１４、アライメントセンサ１５、ミラーＭＲ１、ミラーＭＲ２、ビームエキスパンダＥＸＰ１、波長フィルタＦＬ１、ミラーＭＲ３、共振型走査ミラー１６、サーボ型走査ミラー１７、スキャンレンズ１８、チューブレンズ１９、ダイクロイックミラーＤＣＭ２、対物レンズ２０、波長フィルタＦＬ４、リレーレンズＬＸ１、ダイクロイックミラーＤＣＭ３、波長フィルタＦＬ５、波長フィルタＦＬ６、リレーレンズＬＸ２、リレーレンズＬＸ３、フォトマルチプライアＰＭＴ１、フォトマルチプライアＰＭＴ２を備えている。

照射光が伝搬する照明光学系１０１について説明する。光源１１は、試料２１を照射する照射光を生成する。例えば、光源１１はフェムト秒モードロックチタンサファイアレーザであり、短パルスの近赤外光を生成する。ここでは、照射光のパルス幅は１００ｆｓｅｃ、繰り返し周波数は８０ＭＨｚ、平均パワーは３Ｗである。短パルスレーザ光を用いることで、ピークパワーを高めると同時に平均パワーを低減することができる。このため、試料２１へのダメージを低減することができ、生体試料の観察に好適である。また、光源１１は、波長可変となっており、可変波長域は６９０〜１０４０ｎｍとなっている。光源１１からの照射光は平行光束となっている。

光源１１からの照射光は、ミラー１２〜１４を介して、アライメントセンサ１５に入射する。アライメントセンサ１５は、照射光の波長を変えた時の光軸のずれを調整する。アライメントセンサ１５からの照射光は、ミラーＭＲ１、ＭＲ２で反射して、ビームエキスパンダＥＸＰ１に入射する。

ビームエキスパンダＥＸＰ１は、一対のレンズを有しており、照射光のスポット径を拡大する。具体的には、ビームエキスパンダＥＸＰ１は、対物レンズ２０の瞳径に応じたビーム径になるよう、照射光のビーム径を拡大する。ビームエキスパンダＥＸＰ１からの照射光は、波長フィルタＦＬ１に入射する。波長フィルタＦＬ１は、可視光を反射し、赤外光を透過する。これにより、ノイズとなる可視光成分が除去される。

照射光は、波長フィルタＦＬ１を透過して、ミラーＭＲ３に入射する。ミラーＭＲ３は、照射光を共振型走査ミラー１６の方向に反射する。共振型走査ミラー１６で反射された照射光は、サーボ型走査ミラー１７に入射する。共振型走査ミラー１６、サーボ型走査ミラー１７は、それぞれ光スキャナであり、試料２１上における照射光の照射位置を走査する。すなわち、共振型走査ミラー１６、サーボ型走査ミラー１７が照射光を偏向して、試料２１上における照射光の照射位置を走査する。

共振型走査ミラー１６は、レゾナントスキャナであり、所定の共振周波数で動作する。共振型走査ミラー１６には、例えばＭＥＭＳ（Ｍｉｃｒｏ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｓｙｓｔｅｍｓ）ミラーを用いることができる。サーボ型走査ミラー１７は、サーボ制御により動作する。サーボ型走査ミラー１７には、例えば、ガルバノミラーを用いることができる。例えば、共振型走査ミラー１６はＸ方向に照射光を偏向し、サーボ型走査ミラー１７は、Ｙ方向に照射光を偏向する。Ｘ方向とＹ方向は、光軸と垂直な平面において、互いに直交する方向である。よって、試料２１上では、Ｘ方向及びＹ方向の２次元走査が行われる。これにより、試料２１において、所定の領域を観察することができる。なお、照射光を走査する光スキャナの構成については特に限定されるものではなく、公知の光スキャナを用いることができる。例えば、２軸タイプの走査ミラーを用いてもよい。

共振型走査ミラー１６、サーボ型走査ミラー１７によってＸＹ方向に走査された照射光は、スキャンレンズ１８に入射する。スキャンレンズ１８は対物レンズ２０の一次像面に照射光を集光する。一次像面では、共振型走査ミラー１６、及びサーボ型走査ミラー１７の偏向角によって、照射光の位置が走査される。

そして、スキャンレンズ１８を通過した照射光は、一次像面を通過した後、チューブレンズ１９に入射する。チューブレンズ１９は、スキャンレンズ１８から対物レンズ２０までの間に配置されている。チューブレンズ１９は、照射光を屈折して、平行光束とする。チューブレンズ１９からの照射光は、ダイクロイックミラーＤＣＭ２に入射する。ダイクロイックミラーＤＣＭ２は、赤外光を透過して、可視光を反射する。よって、照射光はダイクロイックミラーＤＣＭ２を透過して、対物レンズ２０に入射する。このように、チューブレンズ１９からの照射光は、ダイクロイックミラーＤＣＭ２を介して、対物レンズ２０に入射する。

対物レンズ２０は、照射光を集光して、試料２１を照明する。すなわち、対物レンズ２０を通過した照射光が、微小スポットとなって試料２１に照射される。試料２１の微小スポットに照射光が入射することで、試料２１中の蛍光物質を励起する。上記のように、照射光を赤外光として、２光子励起による蛍光のみを観察しているため、照射光の集光スポットの蛍光物質のみから蛍光が発生する。換言すると、照射光の焦点面以外からの蛍光がほとんど発生しない。対物レンズ２０の焦点が観察点となる。これにより、高い解像度（分解能）での観察が可能となる。

また、共振型走査ミラー１６、及びサーボ型走査ミラー１７によって照射光の照射位置がＸＹ方向に走査されているので、試料２１の所定の領域を照明することができる。照射光を走査した時の蛍光を検出することで、二次元画像を構築することができる。また、ＸＹＺステージ２２（図６を合わせて参照）などで試料２１をＺ方向に走査することで、３次元画像を構築することができる。

なお、試料２１はＸＹＺステージ２２上に載置されている。したがって、試料２１における観察位置を任意の位置に移動させることが可能になる。さらに、Ｚ方向に駆動することで、異なる深さでの観察が可能になる。試料２１の深部を焦点とすることで、試料２１の深部を観察することが可能になる。

対物レンズ２０によって集光された照射光は、試料２１に入射する。そして、対物レンズ２０の焦点において、２光子励起によって蛍光が発生する。すなわち、試料２１の１つの蛍光分子が２光子をほぼ同時に吸収して、励起状態となると、安定状態に戻る際に蛍光が放出される。このような２光子励起によって生じた蛍光を観察光とする。蛍光の波長は、蛍光物質によって異なっている。

次に、観察光が伝搬する検出光学系１０２について説明する。観察光は、照明された微小スポットから全方位に向けて発生する。したがって、試料２１で生じた観察光の一部は、対物レンズ２０に戻る戻り光となる。戻り光となった観察光は、対物レンズ２０に入射する。対物レンズ２０は、入射した観察光を屈折する。ここでは、対物レンズ２０は、試料２１からの戻り光（観察光）を平行光束となるように、屈折する。対物レンズ２０を通過した観察光は、ダイクロイックミラーＤＣＭ２に入射する。上記のように、ダイクロイックミラーＤＣＭ２は赤外光を透過して、可視光を反射する。よって、２光子励起によって発生した蛍光（観察光）は可視光となっている。このため、観察光は、ダイクロイックミラーＤＣＭ２で波長フィルタＦＬ４の方向に反射される。なお、試料２１に入射してそのまま反射した照射光も対物レンズ２０を介して、ダイクロイックミラーＤＣＭ２に入射する。しかしながら、照射光は赤外光であるため、ダイクロイックミラーＤＣＭ２を透過する。これにより、ノイズとなる照射光が検出されるのを防ぐことができる。

このように、ダイクロイックミラーＤＣＭ２は、波長に応じて、対物レンズ２０からの照射光と観察光を分離する光分離手段となる。また、ダイクロイックミラーＤＣＭ２は、対物レンズ２０とチューブレンズ１９との間に配置されている。したがって、ダイクロイックミラーＤＣＭ２は、共振型走査ミラー１６、及びサーボ型走査ミラー１７によって観察光がデスキャンされる前に、対物レンズ２０からの観察光を照射光から分離する。このように、２光子顕微鏡モードでは、光学顕微鏡１００は、ノンデスキャン検出器を構成することになる。

ダイクロイックミラーＤＣＭ２で反射した観察光は、波長フィルタＦＬ４に入射する。波長フィルタＦＬ４は、赤外光を反射して、可視光を透過するフィルタである。波長フィルタＦＬ４を光路中に配置することで、ノイズとなる赤外光（照射光）が検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２で検出されるのを防ぐことができる。

波長フィルタＦＬ４を通過した観察光は、ダイクロイックミラーＤＣＭ３に入射する。ダイクロイックミラーＤＣＭ３は、波長に応じて観察光を分岐する。ダイクロイックミラーＤＣＭ３は、緑色光を反射し、赤色光を透過する。ダイクロイックミラーＤＣＭ３を反射した緑色の観察光は、波長フィルタＦＬ５を介して、リレーレンズＬＸ２に入射する。リレーレンズＬＸ２は、観察光を集光する。リレーレンズＬＸ２で集光された観察光は、光検出器ＰＭＴ１で検出される。なお、波長フィルタＦＬ５は、緑色光を透過して、それ以外の波長の光を透過しない。これにより、目的とする波長光以外の迷光が光検出器ＰＭＴ１で検出されてノイズとなるのを防ぐことができる。リレーレンズＬＸ１、ＬＸ２は、コンデンサレンズであり、観察光を集光する。具体的には、リレーレンズＬＸ１、ＬＸ２は、対物レンズ２０の瞳をリレーする。光検出器ＰＭＴ１は、対物レンズ２０の瞳がリレーされた位置に配置されている。

ダイクロイックミラーＤＣＭ３を透過した赤色の観察光は、波長フィルタＦＬ６を介して、リレーレンズＬＸ３に入射する。リレーレンズＬＸ３は、観察光を集光する。リレーレンズＬＸ３で集光された赤色の観察光は、光検出器ＰＭＴ２で検出される。なお、波長フィルタＦＬ６は、赤色光を透過して、それ以外の波長の光を透過しない。これにより、目的とする波長光以外の迷光が光検出器ＰＭＴ２で検出されてノイズとなるのを防ぐことができる。リレーレンズＬＸ１、ＬＸ３は、コンデンサレンズであり、観察光を集光する。ここでは、リレーレンズＬＸ１、ＬＸ３は、対物レンズ２０の瞳をリレーする。光検出器ＰＭＴ２は、対物レンズ２０の瞳がリレーされた位置に配置されている。

光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２は、例えば、光電子増倍管であり、検出光量に応じた検出信号を出力する。例えば、光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２は大面積の１受光画素から構成されている。具体的には、光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２は、例えば、１７ｍｍ×１７ｍｍの正方形状の受光領域を有している。検出信号は、図示しない処理装置に入力される。処理装置は、照射光の走査位置と検出信号とを対応付けて記憶する。すなわち、試料２１中における位置と検出光量とが対応付けられている。こうすることで、試料２１の２次元画像が生成される。さらに、ＸＹＺステージなどにより、試料２１をＺ方向に移動させることで、試料２１の３次元画像を生成することができる。

なお、上記の説明では、蛍光波長の異なる蛍光物質（蛍光色素）を１波長で同時に励起する多重同時染色を行っているために２系統の光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２を用いている。すなわち、異なる蛍光物質を同時観察するために２系統の検出光学系を設けている。しかしながら、検出光学系は１系統のみであってもよい。すなわち、観察対象の蛍光物質の蛍光波長に応じた系統の検出光学系を設ければよい。この場合、ダイクロイックミラーＤＣＭ３、波長フィルタＦＬ５、及び光検出器ＰＭＴ１等が不要となる。さらには、検出光学系は３系統以上であってもよい。

２光子励起モードでは、照射光として赤外光を用いている。このため、照射光が試料２１の深部にまで到達する。したがって、試料２１の深部を観察する３次元観察に適している。特に試料２１が生体である場合、生体組織では、赤外光の吸収が少ないため、試料２１の深部の観察に好適である。また、コンフォーカル顕微鏡のようにピンホールを用いていないため、受光感度を高くすることができる。

次に、１光子顕微鏡モードについて、図２を用いて説明する。図２は、１光子顕微鏡モードでの光学系を示す図である。なお、１光子顕微鏡モードと２光子顕微鏡モードの切り替えは、適宜光学素子を挿脱すればよい。すなわち、１光子顕微鏡モードでは、図１に示した光学素子（レンズ、ミラー等）を光路中から取り出して、図２に示す光学素子を光路中に挿入する。一方、２光子顕微鏡モードでは、図２に示す光学素子を光路中から取り出して、図１に示す光学素子を光路中に挿入すればよい。光学素子の挿脱機構は公知のものを用いるため省略する。

まず、１光子顕微鏡モードの照明光学系１０３について説明する。青色光源ＬＳは、照射光となる青色光を発生する。青色光源ＬＳからの照射光は、リレーレンズＬＣ１、ＬＣ２を介して、波長フィルタＦＬ３に入射する。波長フィルタＦＬ３は、青色光を通過して、赤色光、及び緑色光を反射する。したがって、照射光以外の光が、試料２１に照射されて、ノイズとなるのを防ぐことができる。

波長フィルタＦＬ３を通過した照射光は、ダイクロイックミラーＤＣＭ１に入射する。ＤＣＭ１は、青色光を反射して、赤色光、及び緑色光を透過する。よって、青色光源ＬＳからの照射光のみが、対物レンズ１２０の方向に反射される。対物レンズ１２０は、図１の対物レンズ２０と異なる対物レンズである。リボルバなどにより、対物レンズ２０と対物レンズ１２０は切替可能に配置されている。

対物レンズ１２０は、照射光を試料２１に集光する。試料２１の蛍光物質は青色の照射光により励起されて、観察光となる蛍光を発生する。試料２１で発生した蛍光は、全方位に発生する。したがって、試料２１で発生した蛍光の一部が対物レンズ１２０の方向に戻る戻り光となる。

次に、１光子顕微鏡モードの検出光学系１０４について説明する。試料２１からの観察光は、対物レンズ１２０を介して、ダイクロイックミラーＤＣＭ１に入射する。上記のように、ＤＣＭ１は、青色光を反射して、赤色光、及び緑色光を透過する。このため、赤色光又は緑色光である観察光は、ダイクロイックミラーＤＣＭ１を透過して、波長フィルタＦＬ２に入射する。なお、試料２１で反射された照射光は、青色光であるため、ダイクロイックミラーＤＣＭ１で反射される。よって、試料２１からの照射光は、波長フィルタＦＬ２に入射しない。このように、ダイクロイックミラーＤＣＭ１は、照射光と観察光を分離する。よって、照射光が撮像素子３１に入射してノイズとなるのを防ぐことができる。

波長フィルタＦＬ２は、青色光を反射して、緑色光及び赤色光を透過する。よって、観察光は、波長フィルタＦＬ２を透過して、チューブレンズ１９に入射する。チューブレンズ１９は、観察光を撮像素子３１の受光面に集光する。なお、チューブレンズ１９を通過した観察光は、ミラーＭＲ４で反射されて、撮像素子３１で受光される。

撮像素子３１は、ＣＭＯＳ（complementary metal oxide semiconductor）センサ等の２次元アレイ光検出器であり、受光画素がアレイ状に配置されている。もちろん、ＣＭＯＳセンサに限らず、ＣＣＤ（charge-coupled device）センサを２次元アレイ光検出器に用いることとも可能である。

図３、図４に、２光子顕微鏡モードの光路図を示す。図３は、２光子顕微鏡モードにおいて、サーボ型走査ミラー１７から試料２１までの照明光学系１０１の光路を示しており、図４は、試料２１から光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２までの検出光学系１０２の光路を示している。なお、試料２１から光検出器ＰＭＴ１までの光路と、試料２１から光検出器ＰＭＴ２までの光路は、ほぼ同様となっているため、図３、４では適宜簡略化して図示されている。図において、対物レンズ２０の光軸をＯＸ１として示している。

なお、図３、図４において、光学要素間の上方に示されている数値は、それぞれ光学要素（サーボ型走査ミラー１７、スキャンレンズ１８、一次像面、チューブレンズ１９、瞳４０、観察点２１ａ）間の距離（ｍｍ）を示している。なお、各レンズの位置は、主平面の位置としている。さらに、図３、図４において、Ｄは、照射光又は観察光を光軸ＯＸ１と垂直な面に投影した時のビーム径（ｍｍ）を示している。また、図３、図４には、サーボ型走査ミラー１７による像高ｈ（ｍｍ）を示している。具体的には、像高ｈは、光軸ＯＸ１と垂直な面における光軸ＯＸ１と、最大走査位置（最大偏向角度）における主光線との間の距離である。

まず、照明光学系における光路について図３を参照して説明する。図３に示すように、サーボ型走査ミラー１７には、ビーム径Ｄ＝６ｍｍの平行光束が照射光として入射する。サーボ型走査ミラー１７は、照射光をＸ方向（紙面内の上下方向）に走査する。サーボ型走査ミラー１７で走査された照射光は、スキャンレンズ１８に入射する。スキャンレンズ１８は焦点距離ｆ＝４０ｍｍとなっている。一次像面は、スキャンレンズ１８から４０ｍｍの位置となる。スキャンレンズ１８は、照射光を一次像面に集光する。よって、一次像面からの照射光は拡がりながら伝播する。

チューブレンズ１９は、走査された照射光を屈折して、平行光束とする。平行光束となった照射光は、ダイクロイックミラーＤＣＭ２を通過して、対物レンズ２０に入射する。また、チューブレンズ１９で屈折された照射光は、対物レンズ２０の瞳４０を通過する。瞳４０では、各走査位置（偏向角）における照射光が重複している。すなわち、異なる偏向角の照射光が瞳４０で重なっている。瞳位置において、照射光のビーム径Ｄ＝３０ｍｍとなっている。対物レンズ２０は、照射光を試料２１中の観察点２１ａに集光する。

次に、図４を用いて、検出光学系１０２の光路について説明する。図４では、観察光の光路とともに、照射光が検出光学系１０２を伝搬したと仮定した時の光路を合わせて示している。観察点２１ａで発生した観察光は、対物レンズ２０に入射する。対物レンズ２０は、観察点２１ａで発生した観察光を平行光束とする。

対物レンズ２０の瞳４０では、照射光と観察光でビーム径Ｄが異なっている。具体的には、照射光のビーム径Ｄ＝３０ｍｍであり、観察光のビーム径Ｄ＝６０ｍｍとなっている。照射光のビーム径Ｄが観察光のビーム径Ｄよりも小さくなっている。換言すると、観察光は、対物レンズ２０の瞳径全体を通過しているのに対して、照射光は対物レンズ２０の瞳径の一部のみしか通過していない。

ここで、図５に示すように、対物レンズ２０の瞳４０において、照射光が通過する領域を中央領域４１とし、中央領域４１の外側の領域を周辺領域４２とする。中央領域４１は、光軸ＯＸを中心とする円形の領域である。周辺領域４２は、光軸ＯＸを中心とする円環状の領域であり、中央領域４１の外側に配置されている。観察光は、中央領域４１だけでなく、周辺領域４２を通過する。すなわち、観察光は対物レンズ２０の瞳径全体を通過する。

対物レンズ２０の瞳４０を通過した観察光は、平行光束となる。ただし、サーボ型走査ミラー１７での偏向角に応じて、観察光の伝播角度が異なっている。観察光は、波長フィルタＦＬ１を通過して、リレーレンズＬＸ１に入射する。リレーレンズＬＸ１は、観察光を集光する。そして、リレーレンズＬＸ１からの観察光は、波長に応じて、ダイクロイックミラーＤＣＭ３を透過又は反射する。すなわち、緑色の観察光はダイクロイックミラーＤＣＭ３で反射され、黄色・赤色の観察光は、ダイクロイックミラーＤＣＭ３を透過する。

ダイクロイックミラーＤＣＭ３からの観察光は、波長フィルタＦＬ５、又はＦＬ６を透過して、光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２に入射する。すなわち、ダイクロイックミラーＤＣＭ３で反射された緑色の観察光は波長フィルタＦＬ５を透過して、光検出器ＰＭＴ１で検出される。ダイクロイックミラーＤＣＭ３を透過した黄色・赤色の観察光は波長フィルタＦＬ６を透過して、光検出器ＰＭＴ２で検出される。光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２は大面積の１受光画素から構成されている。

光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２は、対物レンズ２０の瞳４０がリレーされた位置に配置されている。すなわち、対物レンズ２０の瞳と共役な位置に光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２が配置さている。これにより、照射光の走査角度（偏向角度）に依存せず、観察光は光検出器ＰＴＭ１、ＰＭＴ２の同じ位置に入射する。よって、効率よく観察光を検出することができる。

このように、照射光が対物レンズ２０の瞳４０の中央領域４１のみを通過している。一方、観察光は対物レンズ２０の瞳４０の中央領域４１のみではなく、周辺領域４２を通過している。したがって、照明用ＮＡを越えた検出用ＮＡ（集光ＮＡ）を有する対物レンズ２０を用いている。このようにすることで、効率的に蛍光を検出することができる。

そして、中央領域４１のみ、収差補正が施されている。換言すると、周辺領域４２には、収差補正が施されていない。もし、対物レンズ２０の瞳４０の全体を利用して照明する場合、収差が所定の基準を満足しないで試料２１が照明されることになる。この場合、収差により、照射光の焦点がぼけてしまう。したがって、２光子励起による蛍光を効率よく発生させることができなくなってしまう。

これに対して、本実施の形態では、照射光は、中央領域４１のみを通過する。共振型走査ミラー１６、及びサーボ型走査ミラー１７によって走査された照射光が中央領域４１内で走査される。すなわち、収差補正が施されていない周辺領域４２にはみ出さないように、共振型走査ミラー１６、及びサーボ型走査ミラー１７が照射光を走査する。これにより、照射光は試料２１において、微小なスポットに集光される。一方、観察光は、中央領域４１と周辺領域４２を通過することができる。よって、光検出器ＰＭＴ１、ＰＭＴ２に到達する観察光の立体角を広くすることができる。これにより、微弱な２光子蛍光の検出が可能となり、ＳＮ比を高くすることができる。よって、広視野で高ＮＡでの観察が可能である。また、中央領域４１のみ収差を考慮すればよいので、広視野で高ＮＡの対物レンズ２０の設計が容易になる。

図６、及び図７を用いて、本実施の形態にかかる２光子顕微鏡と、比較例にかかる２光子顕微鏡とを説明する。図６は本実施の形態にかかる２光子顕微鏡の光学系を模式的に示す図である。図７は、比較例にかかる２光子顕微鏡の光学系を模式的に示す図である。図６では、光学系の主要部のみを示している。したがって、図６、図７では、図１、図３、図４で示した光学系が簡略化して示されている。例えば、ダイクロイックミラーＤＣＭ３や波長フィルタ等が省略されている。

図６、図７において、試料２１で発生した観察光Ｌ２は太線で、照射光Ｌ１は細線で示されている。また、図６では、試料２１から照射光Ｌ１が試料２１で反射して光検出器ＰＭＴ１に向かうと仮定した場合の光を、照射光Ｌ３として示している。すなわち、照射光Ｌ３は、照射光Ｌ１を検出光学系１０２に投影した様子を示している。図６、図７では、対物レンズの構成が異なっている。図７に示された対物レンズ２２０では、照射光Ｌ１が瞳２４０の全体を通過する。

上記のように、本実施の形態では、照射光Ｌ１が対物レンズ２０の瞳４０の一部の領域（図５で示した中央領域４１）のみを通過している。すなわち、収差補正が施されていない周辺領域４２を照射光Ｌ１が通過していないように、照射光Ｌ１が走査されている。対物レンズ２０は、照射光Ｌ１を試料２１に集光する。したがって、対物レンズ２０による照射光Ｌ１の焦点が、観察点となる。試料２１から光検出器ＰＭＴ１に向かう照射光Ｌ３は、中央領域４１のみしか通過していない。すなわち、照射光Ｌ３は周辺領域４２を通過しない。

２光子励起によって試料２１で生じた蛍光は観察光Ｌ２として、全方位に放出される。そして、試料２１で生じた観察光Ｌ２のうち、対物レンズ２０に入射した観察光Ｌ２のみがＰＭＴ１で検出される。換言すると、ＰＭＴ１で検出される観察光Ｌ２は、対物レンズ２０による開口制限を通過したもののみとなる。観察光Ｌ２は、瞳４０の中央領域４１、及び周辺領域４２を通過する。光検出器ＰＭＴ１に向かう観察光Ｌ２に対する対物レンズ２０のＮＡが、試料２１に向かう照射光Ｌ１に対する対物レンズ２０のＮＡよりも大きくなる。対物レンズ２０のＮＡが大きいほど、検出器ＰＭＴ１で検出される観察光の光量が高くなる。これにより、ＳＮ比を向上することができる。

上記のように、中央領域４１には収差補正が施されている。一方、周辺領域４２には収差補正が施されていない。図６に示すように、共振型走査ミラー１６とサーボ型走査ミラー１７とで走査された照射光Ｌ１は、中央領域４１のみを通過して、試料２１を照明する。これにより、試料２１上の微小スポットのみが照明される。像の解像力はこの微少スポットの大きさによって決定されるのだが、中央領域４１は収差補正が施されているため、スポットは十分に小さく、解像力は良好である。一方、観察光Ｌ２は、中央領域４１と周辺領域４２とを通過して、光検出器ＰＭＴ１に入射する。すなわち、対物レンズ２０の瞳４０全体を通過した観察光Ｌ２が光検出器ＰＭＴ１で検出される。

周辺領域４２は、収差補正が施されていないが、照明光は透過しないので解像度に影響はない。また、大面積の光検出器ＰＭＴ１で観察光Ｌ２を受光するため、高感度である。すなわち、大面積の１受光画素のみから構成される光検出器ＰＭＴ１が観察光Ｌ２を検出するので、収差によって観察光Ｌ２の像がぼけていたとしても、ＰＭＴ１の受光面積が大きければ、観察光Ｌ２の検出光量は減少しない。

このように、上記の対物レンズ２０を用いることで、検出立体角を広くすることができる。これにより、微弱な２光子蛍光の検出が可能となる。すなわち、高いＳＮ比で蛍光を検出することができる。広視野で高ＮＡでの観察が可能である。例えば、収差補正が施されている照明用ＮＡは０．４であり、検出用ＮＡは０．８となっている。また、対物レンズ２０の倍率は５倍となっている。

一方、図７に示すように、比較例にかかる２光子顕微鏡では、照射光Ｌ１に対する対物レンズ２２０のＮＡと、観察光Ｌ２に対する対物レンズ２２０のＮＡが等しくなっている。すなわち、照射光Ｌ１は、瞳２４０全体を通過する。換言すると、共振型走査ミラー１６、サーボ型走査ミラー１７が、瞳２４０全体に渡って照射光Ｌ１を走査している。このような対物レンズ２０を高ＮＡで低倍率にしようとすると、照明側に対する収差補正が非常に困難となる。瞳２４０は、対物レンズ２０の瞳４０よりも小さくなっている。瞳２４０の径は、対物レンズ２０の中央領域４１と同程度となっている。中央領域４１は、対物レンズ２２０の最大開口であり、共振型走査ミラー１６及びサーボ型走査ミラー１７で投影される領域全てである。

次に、試料２１として固定標本であるミジンコを撮像した画像を図８〜図１１に示す。図８は、比較例にかかる２光子顕微鏡で撮像された画像を示す。図９〜図１１は、本実施の形態にかかる２光子顕微鏡で撮像された画像を示す。図８は比較例にかかる２光子顕微鏡で撮像した５１２ピクセル×５１２ピクセルの画像１を示している。図９は、実施例にかかる２光子顕微鏡で撮像した５１２×５１２ピクセルの画像２を示している。図１０は、実施の形態にかかる２光子顕微鏡で撮像された２０４８×２０４８ピクセルの画像３であり、図１１は、図１０の矩形部分の拡大画像４である。

図８、図９は、共振型走査ミラー１６が３３ｍｓｅｃで往復スキャンした時の画像である。なお、比較例では、対物レンズ２２０の拡大倍率は４倍、ＮＡは０．２となっている。本実施形態では、対物レンズ２０の拡大倍率は５倍、ＮＡは０．８となっている。本実施の形態では、比較例に比べて、高いＳＮ比で試料２１を撮像することができる。また、図１０では、共振型走査ミラー１６が、２６６ｍｓｅｃで片道スキャンしている。本実施の形態では、比較例に比べて、分解能も優れていることが分かる。また、ＸＹＺステージ２２をＺ方向に移動させることで、試料２１の三次元画像を撮像することが可能となる。すなわち、ＸＹＺステージ２２によって、試料２１をＺ方向に移動して、照射光を走査することで、断層画像を撮像することができる。よって、試料２１の深部観察も可能となる。

なお、本実施の形態にかかる光学顕微鏡１００が、２光子励起を行う２光子顕微鏡であるとして説明したが、光学顕微鏡１００は２光子顕微鏡に限定されるものではない。本発明は、非線形光学効果によって発生する観察光を検出する光学顕微鏡に適用可能である。非線形光学効果による光学顕微鏡では、照射光が試料に照射されると、試料において非線形光学効果が生じる。対物レンズを介して試料での非線形光学効果によって発生する観察光を光検出器で検出する構成となる。具体的には、本発明にかかる光学顕微鏡は、３光子以上の多光子で励起を行う多光子顕微鏡や和周波発生を用いた光学顕微鏡などにも、適用可能である。

以上、本発明者によってなされた発明を実施の形態に基づき具体的に説明したが、本発明は既に述べた実施の形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能であることはいうまでもない。

１１ 光源
１２ ミラー
１３ ミラー
１４ ミラー
１５ アライメントセンサ
１６ 共振型走査ミラー
１７ サーボ型走査ミラー
１８ スキャンレンズ
１９ チューブレンズ
２０ 対物レンズ
２１ 試料
２２ ＸＹＺステージ
３１ 撮像素子
ＬＳ 青色光源
ＤＣＭ ダイクロイックミラー
ＦＬ 波長フィルタ
ＰＭＴ 光検出器
ＬＸ リレーレンズ

Claims (8)

1. 照射光を発生する光源と、
   前記照射光を偏向して、試料上での照射位置を走査する光スキャナと、
   前記光スキャナで偏向された前記照射光を集光して前記試料に照射するともに、前記試料での非線形光学現象によって生じた観察光を屈折する対物レンズと、
   前記光スキャナでデスキャンされる前に、前記対物レンズからの前記観察光を前記照射光の光路から分離する光分離手段と、
   前記光分離手段によって分離された前記観察光が入射するコンデンサレンズと、
   前記コンデンサレンズからの前記観察光を検出する光検出器と、を備え、
   前記対物レンズの中央部には、収差補正が施された中央領域が形成され、かつ、前記中央領域の外側には周辺領域が形成され、
   前記光スキャナは、前記照射光が前記中央領域内に投影されるよう、前記照射光を走査し、
   前記対物レンズの前記中央領域と前記周辺領域とを通過した前記観察光が前記コンデンサレンズを介して前記光検出器で検出される光学顕微鏡。
2. 前記光スキャナで偏向した照射光が入射するスキャンレンズと、
   前記スキャンレンズから前記対物レンズまでの間に配置され、前記スキャンレンズからの前記照射光を平行光束とするチューブレンズと、をさらに備えた請求項１に記載の光学顕微鏡。
3. 前記対物レンズから前記試料に向かう方向における前記対物レンズのＮＡよりも、前記試料から前記対物レンズに向かう方向における前記対物レンズのＮＡが大きくなっている請求項１、又は２に記載の光学顕微鏡。
4. 前記試料において２光子励起により発生した蛍光を前記観察光として、前記光検出器が検出する請求項１〜３のいずれか１項に記載の光学顕微鏡。
5. 試料上での照射位置を走査するよう、光スキャナにより照射光を偏向するステップと、
   対物レンズにより、前記光スキャナで偏向された前記照射光を集光して前記試料に照射するステップと、
   前記光スキャナでデスキャンされる前に、前記対物レンズからの前記観察光を前記照射光の光路から分離するステップと、
   分離された前記観察光を、コンデンサレンズを介して検出するステップと、を備え、
   前記対物レンズの中央部には、収差補正が施された中央領域が形成され、かつ、前記中央領域の外側には周辺領域が形成され、
   前記光スキャナは、前記照射光が前記中央領域内に投影されるよう、前記照射光を走査し、
   前記対物レンズの前記中央領域と前記周辺領域とを通過した前記観察光が前記コンデンサレンズを介して検出される観察方法。
6. 前記光スキャナで偏向した照射光が入射するスキャンレンズと、
   前記スキャンレンズから前記対物レンズまでの間に配置され、前記スキャンレンズからの前記照射光を平行光束とするチューブレンズと、をさらに備えた請求項５に記載の観察方法。
7. 前記対物レンズから前記試料に向かう方向における前記対物レンズのＮＡが、前記試料から前記対物レンズに向かう方向における前記対物レンズのＮＡよりも小さくなっている請求項５、又は６に記載の観察方法。
8. 前記試料において２光子励起により発生した蛍光を前記観察光として、観察を行う請求項５〜７のいずれか１項に記載の観察方法。