JP2016009131A

JP2016009131A - 検査装置

Info

Publication number: JP2016009131A
Application number: JP2014130615A
Authority: JP
Inventors: 吉井　実; Minoru Yoshii; 実吉井; 岩瀬　秀夫; Hideo Iwase; 秀夫岩瀬; 晋宏井上; Akihiro Inoue
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2014-06-25
Filing date: 2014-06-25
Publication date: 2016-01-18

Abstract

【課題】実質的に同一箇所かつ同一時間で複数の検出方法（マルチモダリティ）による検出が可能な顕微鏡及び内視鏡を提供する。【解決手段】本発明の一実施形態に係る顕微鏡１００は、単一のレーザ発振部１０１と、レーザ発振部から出力された光の時間幅を変更するパルス幅制御部９と、光を被測定物１２に集光して照射する光学系１０と、パルス幅制御部を用いて光の時間幅を変更することによって、被測定物上の集光箇所からのフレネル反射光の強度と、非線形発光の情報とを検出する信号処理部１５と、を備える。【選択図】図１

Description

本発明は、組織境界と組成分子情報などの複数の情報を同一画像に重ね合わせて検出、表示する検査装置に関する。

従来、生体等の標本にその表面から超短パルスレーザ光を照射して、標本の表面下の比較的深い位置から発せられる多光子励起発光（多光子蛍光）を検出することにより、細胞等の機能を観察する装置として、多光子励起型の測定装置が知られている。

高調波発生（ＨＧ）が生じる状態では、複数の入射光子が同時に消滅して、入射光子の合計エネルギーと等しいエネルギーを持つ新しい光子が１つ生成される。第２高調波発生（ＳＨＧ）の場合、構成物質の規則性が高く、非反転対称であるときに信号が発生する。

２光子励起（多光子励起）とＳＨＧは非線形過程であり、信号は入射光強度の２乗に依存して発生する。多光子励起顕微鏡において、非線形性の信号発生を観測する為に高い光子密度が必要である。多光子励起顕微鏡は、深さ方向の解像度を数μｍとし、且つ数ｍｍの深さまで断層像を得ることができ、眼科撮影、皮膚科撮影、歯科撮影等への適用が検討されてきている。

特許文献１には、光ファイバーの非線形効果を利用して、入射光源を多波長（広域）化し、複数波長の超短パルスレーザ光を標本に照射して、多光子励起発光を観察することができる多光子励起走査型レーザ顕微鏡を提供する方法が開示されている。

また、特許文献２には、異なったモダリティ（検出方法）で微細構造の画像をそれぞれ得ることで、生体の初期形態及び動態を二次元、三次元及び四次元的な特徴に結び付ける方法を開示されている。特許文献２では、これを一体的な顕微鏡検査用装置として構成する。特許文献２の構成によれば、例えば（ａ）異なるフォーマット、異なる分解能および視野による画像を比較でき、（ｂ）構造的並びに機能的情報を取得できる。さらに、（ｃ）これらの作業を一台の装置を用いて検体を移動、変更することなく達成することができる。

特開２００６−３３０６８５号公報特表２００９−５１０５３１号公報

しかしながら、特許文献１に記載の発明では、多光子励起発光画像を用いているため、生体の分子情報は得られるが、多光子励起発光の検出結果から組織境界と分子が存在しない領域とを峻別することは難しい。このため、組織境界の検出は困難である。

一方、特許文献２に記載の発明では、１つの装置で異なる検出方法（例えば、ＳＤ−ＯＣＴ、ＯＣＭ、ＳＥＣＭ、蛍光ＯＣＭ等）を実現している。ところが、機械的な機構（スライダ）によって光学系ないし光学機能の切り替えを行うことを要するので、組織境界と生体の分子情報とを同一箇所、同一時間で得るのは困難である。

本発明は、上述の問題に鑑みて行われたものであって、実質的に同一箇所かつ同一時間で複数の検出方法（マルチモダリティ）による検出が可能な検査装置を提供することを目的とする。

本発明の一態様は、検査装置であって、単一のレーザ発振部と、前記レーザ発振部から出力された光の時間幅を変更するパルス幅制御部と、前記光を被測定物に集光して照射する光学系と、前記パルス幅制御部を用いて前記時間幅を変更することによって、前記被測定物上の集光箇所からのフレネル反射光の強度と非線形発光の情報とを取得する信号処理部と、を備えることを特徴とする。

本発明によれば、光の時間幅を変更することによってフレネル反射光及び非線形発光の両方を検出するため、機械的な光学系の切り替えがなく、被測定物の分子情報と組織境界の情報を実質的に同一箇所でかつ同時にマルチモダリティ検出を行い、それらを同一画像上に表示することができる。また被測定物に対して垂直方向からだけではなく斜めからも検出できる。

本発明の一実施形態に係るマルチモダリティ顕微鏡の概略構成図である。本発明の一実施形態に係るパルス幅制御部の概略構成図である。マルチモダリティ顕微鏡を通過するパルス光のパルス幅の変化を説明する模式図である。パルス光の集光光束位置と検出光の種類との関係を説明する模式図である。従来のＯＣＴ方式と本発明の一実施形態に係る境界面の検出方式とを比較する模式図である。本発明の一実施形態に係るパルス幅圧縮部の概略構成図である。パルス幅圧縮部によるパルス幅制御の原理を説明する模式図である。本発明の一実施形態に係るパルス幅圧縮部の概略構成図である。ＣＦＢＧの機能を説明する模式図である。ＣＦＢＧの斜視図である。伸縮前後のＣＦＢＧの特性変化を示す模式図である。本発明の一実施形態に係るパルス幅圧縮部の概略構成図である。本発明の一実施形態に係るパルス幅圧縮部の概略構成図である。本発明の一実施形態に係るビーム走査制御部の概略構成図である。本発明の一実施形態に係るマルチモダリティ内視鏡の概略構成図である。本発明の一実施形態に係る集光光学系及びフォーカス制御部の概略構成図である。

以下、図面を参照して、本発明の実施の形態を説明するが、本発明は本実施形態に限定されるものではない。なお、以下で説明する図面で、同機能を有するものは同一符号を付け、その繰り返しの説明は省略することもある。

（第１の実施形態）
図１は、本実施形態に係る検査装置としてのマルチモダリティ顕微鏡１００の概略構成図である。マルチモダリティ顕微鏡１００は、検出に用いるための種光としてのフェムト秒パルスレーザ光を発生させる単一の種光部１０１（レーザ発振部）を備える。種光部１０１としては、周知のレーザ発振器を用いることができ、本実施形態では、励起ＬＤ３（励起レーザダイオード）と、カプラ１と、利得部２と、モードロック生成部６と、波長可変フィルタ４とがリング状に接続された構成を用いる。種光部１０１の出力部には、パルス光を時間的に伸長するファイバーを含むパルス幅伸長部５が接続される。パルス幅伸長部５は、後にパルス光を増幅する際に、パルス光のピークエネルギーがファイバーの破壊閾値を超えないように下げるためのものである。パルス幅伸長部５の出力部には、伸長されたレーザ光を光増幅する利得媒体部８が接続されている。利得媒体部８は利得媒体をファイバーにドープしたものからなり、励起ＬＤ７からのレーザを用いてパルス光を増幅する。

利得媒体部８の出力部には、伸長及び増幅されたパルス光の時間幅を圧縮し短パルスにする機能と、逆にパルス光の時間幅を伸長する機能とを有するパルス幅制御部９が接続される。

パルス幅制御部９の出力部からパルス光が出射される方向には、光路を変更するための複数のミラーと、パルス幅制御部９からのパルス光及び試料１２から戻ってきた検出光を透過及び反射させる半透ミラー１９とが設けられる。さらに、半透ミラー１９をパルス光透過する方向には、パルス光を２次元（ＸＹ方向）に走査するビーム走査制御部１１と、ビーム走査制御部１１からのパルス光を試料１２上に集光する集光光学系１０とが設けられる。集光光学系１０によるパルス光の集光箇所には、ステージ１２ａが設けられ、ステージ１２ａ上に観察しようとする被測定物としての生体試料１２が載置される。ステージ１２ａは、フォーカス制御部１８が駆動することによってパルス光の光軸方向（Ｚ方向）に移動可能である。フォーカス制御部１８は、信号処理部１５により制御される。

試料１２の反射側において半透ミラー１９により試料１２から戻ってきた検出光が反射される方向には、バンドパスフィルタ１７ｂと、試料１２の組織境界からの（線形な）反射光の強度を検出する光電変換部１３とが設けられる。バンドパスフィルタ１７ｂは、フレネル反射の波長帯域を通過させて該波長帯域以外をフィルタリングする。光電変換部１３は、微弱な検出光を電気的に増幅するロックインアンプ１４を介して信号処理部１５に接続される。ロックインアンプ１４は省略されてもよい。

また、試料１２の透過側には、多光子励起の波長帯域を通過させて該波長帯域以外をフィルタリングするバンドパスフィルタ１７ａと、試料１２を透過した多光子励起発光（非線形発光）の強度を検出するスペクトル／光電変換部１６とが設けられる。スペクトル／光電変換部１６は信号処理部１５に接続される。スペクトル／光電変換部１６と信号処理部１５との間には、微弱な検出光を電気的に増幅するロックインアンプが接続されてもよい。

マルチモダリティ顕微鏡１００において、パルス光がパルス幅制御部９から出射されて試料１２に到達するまでの光路は空間伝搬により構成されているが、該光路の少なくとも一部の光路はファイバー等の光導波路により構成されてもよい。

図２は、本実施形態に係るパルス幅制御部９の概略構成図である。パルス幅制御部９は、パルス幅伸長部９ａと、パルス幅圧縮部９ｂとを備える。パルス幅伸長部９ａは、パルス光を時間的に伸長するファイバーを含み、通過するパルス光の時間幅を伸ばす。パルス幅圧縮部９ｂは、通過するパルス光の時間幅を圧縮する。パルス幅圧縮部９ｂは信号処理部１５に接続されており、パルス光の圧縮の度合いを制御可能に構成されている。本実施形態ではパルス光の時間幅を変えているが、パルス光の波長幅を変えてもよい。パルス幅圧縮部９ｂの詳細な構成については、図６〜１３を用いて後述する。

信号処理部１５が、パルス幅圧縮部９ｂによる圧縮の度合いを、パルス幅伸長部９ａによる伸長の度合いよりも大きく調整することによって、パルス幅制御部９は全体として入力されたパルス光を圧縮する。逆に、信号処理部１５が、パルス幅圧縮部９ｂによる圧縮の度合いを、パルス幅伸長部９ａによる伸長の度合いよりも小さく調整することによって、パルス幅制御部９は全体として入力されたパルス光を伸長する。このような構成によって、パルス幅制御部９は、パルス光の時間幅を圧縮する機能と、パルス光の時間幅を伸長する機能とを実行することができる。信号処理部１５は、多光子励起光を検出する場合にはパルス光の時間幅を約１０ｐｓ以下に圧縮し、フレネル反射光を検出する場合にはそれよりも大きく伸長する。

図３は、マルチモダリティ顕微鏡１００を通過するパルス光のパルス幅の変化を説明する模式図である。図３（ａ）は、パルス幅制御部９がパルス光の時間幅を圧縮するように制御されている場合のパルス幅の変化を示す。図３（ｂ）は、パルス幅制御部９がパルス光の時間幅を伸長するように制御されている場合のパルス幅の変化を示す。図３（ａ）、（ｂ）に示すパルス幅（パルスの時間幅）の値は一例であり、これらの具体的な値に限定されない。

図３（ａ）、（ｂ）において、まず、マルチモダリティ顕微鏡１００の種光部１０１は、種光（短パルス光）を生成する。一般に、分散（光周波数帯域）幅Δνとパルス時間幅Δｔとは式（１）の関係を有することが知られている

多光子励起光源においては、分散（光周波数帯域）幅Δνとパルス時間幅Δｔとのバランスが実際上重要である。

多光子励起を起こさせるパルス時間幅Δｔとしては、Δｔ=１００フェムト秒が実用上よく用いられている。このパルス幅による決まる分散幅Δνは、それに対応する波長分散をΔλとすると、波長をλ₀=１．０ｕｍとして、式（２）により表される。

多光子励起光源としては、試料に照射する光子密度を上げるために、そもそもの光パルスエネルギーを１ｎＪ以上に上げる必要がある。本実施形態に係るマルチモダリティ顕微鏡１００では、ファイバーにドープすることによって得られた利得媒体部８により、パルス光を増幅する。ここで問題なのは、利得媒体がドープされたファイバーである利得媒体部８の光学破壊閾値により、パルスのピーク出力に制限があることである。

石英ファイバーの光学破壊閾値Ｄｔｈは、パルス光の時間幅をδｔ（単位はナノ秒）とすると、式（３）により表される。

この利得媒体部８の出力部で、パルス光の強度がこの光学破壊閾値Ｄｔｈを超えないようにすることが重要である。また経年変化に耐えるようにするには、パルス光のピーク出力がこの値の１桁以上低いことが望ましい。

本実施形態では、利得媒体部８に入力されるパルス光の強度が光学破壊閾値Ｄｔｈを十分に超えないようにするために、この利得媒体部８の入力部側、すなわち種光部１０１と利得媒体部８との間でパルス幅を伸長させて、ピーク出力を下げる。

通常の石英ファイバーの伝搬時間の波長依存性δｔ_ｄは、式（４）により表されることが知られている。

例えば、利得媒体部８に入力される前のパルス光のピーク出力を１／１００にするためには、光パルス幅を１００倍に伸長させることになる。本実施形態では、図３（ａ）、（ｂ）に示すように、種光部からの光パルス幅が１００フェムト秒である光パルスを、ファイバー導波路を含むパルス幅伸長部５により、１００倍の１０ピコ秒に伸長する。

１００フェムト秒のパルスにおいては、式（２）により、波長分散ΔλがΔλ＝１５ｎｍである。このとき、式（４）を用いると、必要なパルス幅伸長部５のファイバーの長さは６．７ｍであることがわかる。

上述のように、時間幅を１００倍に伸長されたパルス光は、ピーク出力が１／１００になっているので、１００倍の余裕度を持って、利得媒体部８により増幅できることになる。

パルス光が増幅された後の作用は、図３（ａ）に示すようにパルス幅制御部９がパルス光の時間幅を圧縮するように制御されている場合と、図３（ｂ）に示すようにパルス幅制御部９がパルス光の時間幅を伸長するように制御されている場合とで、異なる。

図３（ａ）では、パルス幅制御部９は、パルス幅伸長部５により１０ｐｓのパルス幅に伸長されたパルス光を、１／１００の１００フェムト秒のパルス幅に圧縮する。

このように圧縮されたパルス光を、集光光学系１０により集光させながら、試料１２に照射する。照射されたパルス光は、試料１２の中に侵入して、光子密度が所定の閾値レベル以上になると非線形現象による発光を起こさせる。

ビーム走査制御部１１は、パルス光の光束を光束照射方向（Ｚ方向、パルス光の光軸方向ともいう）に対し垂直方向である垂直面内（ＸＹ方向）に移動させることによって、試料１２中を走査する。パルス光が試料１２内に例えば５ｍｍ侵入したところで、光子密度が閾値レベル以上になったとすると、そこで自家蛍光、ラマン散乱、ＳＨＧ光、ＴＨＧ光などが発生する。それらの検出光の波長や光強度から、パルス光を照射した試料１２内の物質の分布や構造を測定することができる。さらにフォーカス制御部１８により試料１２の載置されたステージ１２ａを光束照射方向（Ｚ方向）に移動させることによって、試料１２の３次元的な組成を測定することができる。

図３（ｂ）では、パルス幅制御部９は、パルス幅伸長部５により１０ｐｓのパルス幅に伸長されたパルス光を、１００倍の１ナノ秒のパルス幅に伸長する。

このように伸長されたパルス光を、集光光学系１０により集光させながら、試料１２に照射する。照射されたパルス光は、試料１２の中に侵入する。この場合には、光子密度が所定の閾値レベルに達しないため、非線形現象は起こらず、単に屈折率界面があれば反射（フレネル反射）が起こる。

ビーム走査制御部１１は、パルス光の光束を光束照射方向（Ｚ方向）に対し垂直面内（ＸＹ方向）に移動させることによって、試料１２中を走査する。パルス光が試料１２内に例えば３ｍｍ侵入したところで、生体の組織境界（屈折率境界）があるとすると、そこで共焦点顕微鏡と同様なフレネル反射による反射光が発生する。その検出光の光強度を検出することにより、パルス光を照射した試料１２内の組織構造を測定することができる。さらにフォーカス制御部１８により試料１２の載置されたステージ１２ａを光束照射方向（Ｚ方向）移動させることによって、試料１２の３次元的な構造を測定することができる。

本発明におけるもっとも重要な解決すべき課題は、試料内の組織境界と組成分子を実質的に同一箇所で同時に検出することである。種光を例えば４０ＭＨｚ程度の繰り返し周波数で発振すると、種光中のパルス間の間隔は２５ナノ秒となる。本実施形態では、まず、集光光学系１０による集光点で、圧縮された短パルス光を生成するようにパルス幅制御部９を制御して、試料１２内で多光子励起による非線形現象の発光を検出する。次に試料１２内で非線形現象を起こさないように、伸長された非短パルス光を生成するようにパルス幅制御部９を制御して、試料１２内で屈折率境界からのフレネル反射の反射光を検出する。検出された多光子励起発光からは試料１２中の分子情報を取得することができ、フレネル反射光からは組織境界の情報を取得することができる。多光子励起発光の検出とフレネル反射光の検出との順序は逆でもよい。

本実施形態に係るマルチモダリティ顕微鏡１００では、検出方法の切り替えを、機械的な光学系の切り替えではなく、パルス幅を変えることによって行っている。このため、非常に短い時間で多光子励起による非線形現象の発光とフレネル反射の反射光との両方を検出することができる。従って、本実施形態に係るマルチモダリティ顕微鏡１００は、実質的に同時に複数の検出方法（マルチモダリティ）による検出を実現することが可能である。また、パルス幅制御部９から出射されるパルス光が試料１２に到達するまでの光学系は多光子励起発光の検出とフレネル反射光の検出との間で同一であるため、機械的な光学系の切り替えに伴う位置ずれが生じ難い。このため、実質的に同一箇所で複数の検出方法（マルチモダリティ）による検出を実現することが可能である。

図４は、パルス光の集光光束位置と検出光の種類との関係を説明する模式図である。図４において、列（１）は試料１２の断面中の組織構造と集光光束位置との相対位置関係を示す。列（２）は、各相対位置関係について、パルス幅制御部９により圧縮されたパルス光（短パルス光）を試料１２に照射した場合の、スペクトル／光電変換部１６の出力を示す。列（３）は、各相対位置関係について、パルス幅制御部９により伸長されたパルス光（非短パルス光）を試料１２に照射した場合の、光電変換部１３又はロックインアンプ１４の出力を示す。

試料１２は上層と下層とを含み、上層と下層との間には組織境界が形成されている。欄（ａ）−（１）は集光光束位置が上層中の場合、欄（ｂ）−（１）は集光光束位置が組織境界上の場合、欄（ｃ）−（１）は集光光束位置が下層中の場合をそれぞれ表す。

欄（ａ）−（１）の場合について説明する。まず、パルス幅制御部９により発生された短パルス光を試料１２に照射する。そうすると、エネルギー密度が高いため多光子励起による非線形発光を起こすので、スペクトル／光電変換部１６では欄（ａ）−（２）のように上層の組織構造に特有なスペクトルが検出される。次に、パルス幅制御部９により発生された非短パルス光を試料１２に照射する。そうすると、エネルギー密度が低いため非線形発光は起こらず、さらに屈折率境界も近くにないため線形のフレネル反射による反射光は弱く、光電変換部１３又はロックインアンプ１４では欄（ａ）−（３）のように弱い信号が検出される。

欄（ｂ）−（１）の場合について説明する。まず、パルス幅制御部９により発生された短パルス光を試料１２に照射する。そうすると、組織境界上には多光子励起による非線形発光を起こす物質がないので、スペクトル／光電変換部１６では欄（ｂ）−（２）のように弱い蛍光スペクトルが検出される。次に、パルス幅制御部９により発生された非短パルス光を試料１２に照射する。そうすると、エネルギー密度が低いため非線形発光は起こらないが、屈折率境界（組織境界）での線形のフレネル反射による反射光が発生し、光電変換部１３又はロックインアンプ１４では欄（ｂ）−（３）のように強い信号が検出される。

欄（ｃ）−（１）の場合について説明する。まず、パルス幅制御部９により発生された短パルス光を試料１２に照射する。そうすると、欄（ａ）−（２）の場合と同様に、エネルギー密度が高いため多光子励起による非線形発光を起こすので、スペクトル／光電変換部１６では欄（ｃ）−（２）のように下層の組織構造に特有なスペクトルが検出される。次に、パルス幅制御部９により発生された非短パルス光を試料１２に照射する。この場合に、欄（ａ）−（３）の場合と同様に、エネルギー密度が低いため非線形発光は起こらず、さらに屈折率境界ではないため線形のフレネル反射による反射光は弱い。そのため、光電変換部１３又はロックインアンプ１４では欄（ｃ）−（３）のように弱い信号が検出される。

図５は、従来のＯＣＴ方式と本実施形態に係る境界面の検出方式とを比較する模式図である。図５に示すように、本実施形態に係る境界面の検出方式は、従来のＯＣＴ方式に比べ、検出できる被検面の傾き範囲が大きい。

ＯＣＴ方式は、干渉を利用して境界面を検出するものであり、検出できる深さは光源のコヒーレント長に依存する。一方で、照射する被検箇所におけるスポットサイズは２０μｍ程度にして焦点深度を深くする。このためＮＡが０．０３２と小さくなり、検出可能な境界面の角度範囲が小さい。それに対して、本実施形態は、屈折率界面からのフレネル反射による反射強度を直接検出する方式を利用しているため、集光スポットサイズを１μｍ程度とし、ＮＡを０．５９と大きくして照射した方が境界面の検出感度がよい。

従って、境界面からの反射光を検出するための被検面の傾きθの範囲は、ＯＣＴ方式が０．９°までなのに対し、本実施形態に係る検出方式では１８．２°までと約２０倍大きい。このように、本実施形態に係る検出方式の方がＯＣＴ方式に比べて実用性が高いという効果がある。

次に、図６〜１３を用いて、パルス幅制御部９に含まれるパルス幅圧縮部９ｂの構成を詳細に説明する。図６は、一例としてのパルス幅圧縮部９ｂの概略構成図である。

図６に示すように、パルス幅圧縮部９ｂは、筐体２６に搭載され、互いに対向する２つの回折格子２２、２３を備えており、この２つの回折格子２２、２３は同一の格子定数（単位長さあたりの溝本数）を有する。また、パルス幅圧縮部９ｂは、入力されるパルス光及び出力されるパルス光を透過及び反射させる半透ミラー２１と、２つの回折格子２２、２３を経たパルス光を同一光路に戻す光路折り返しミラー２４とを備える。一方の回折格子２３には、２つの回折格子２２、２３の間隔ｄを変えるためのアクチュエータ２５が接続されている。アクチュエータ２５は、他方の回折格子２２に設けられてもよく、又は回折格子２２、２３の両方に設けられてもよい。図６においては、一例として、左側（入力側）からパルス幅１０ｐｓのパルス光が入力されており、下側（出力側）にパルス幅１００ｆｓのパルス光が出力される。つまり、図６のパルス幅圧縮部９ｂは、パルス幅を１００倍に圧縮できる。

図７は、図６のパルス幅圧縮部９ｂによるパルス幅制御の原理を説明する模式図である。図７においては、波長λ１、λ２（λ１＜λ２）を有する２つのパルス光が時間δｔ離れて入力されている。そして、パルス光が入射角θ０で回折格子２２に入射すると、回折格子２２から１次回折光が波長λ１、λ２のそれぞれに応じた角度で回折し、回折格子２３に入射する。回折格子２２と回折格子２３とは平行に配置されているので、回折格子２３で回折した波長λ１、λ２の光は、それぞれ回折格子２２への入射光線と平行になる。

この場合に、長波長λ２のパルス光は、短波長λ１のパルス光より長い距離を進むため、格子の間隔ｄを調整すると、波長λ１と波長λ２のパルス光の時間間隔δｔが０となり、１つの短パルス光として出射することができる。

この２つの回折格子２２、２３によって制御される時間間隔δｔは、式（５）により表される

ここで、ｃは光速度、Ｎは格子定数、θ０は回折格子２２へのパルス光の入射角である。また、２つの回折格子２２、２３で回折後の波長分離幅φは、式（６）により表される。

具体例として、式（５）において、λ１＝０．８２０μｍ、λ２＝０．８３５μｍ（δλ＝１５ｎｍ）、回折格子の格子定数Ｎ＝９００本／ｍｍ、θ０＝０とすると、間隔ｄ＝７．５ｍｍでδｔ＝１０ｐｓに圧縮できることがわかる。また、式（６）により、この時のミラー２４上の波長分離幅はφ＝１．６３ｍｍとなることがわかる。

図８は、別の例としてのパルス幅圧縮部９ｂの概略構成図である。図８のパルス幅圧縮部９ｂは、図６のパルス幅圧縮部９ｂよりも高速に変調可能である。図８に示すように、パルス幅圧縮部９ｂは、チャープド・ファイバー・ブラッグ・グレーティング３１（ＣＦＢＧ）と、円柱状のピエゾ圧電素子３２とを備え、ＣＦＢＧ３１及びピエゾ圧電素子３２のそれぞれの両端は共通の筐体３３に固定されている。ＣＦＢＧ３１は、伸縮することによってパルス幅を変調することができる。ピエゾ圧電素子３２は、信号処理部１５及び電圧発生器３４に接続されており、信号処理部１５からの指示に基づいて電圧発生器３４によりピエゾ圧電素子３２を長手方向に伸縮させる。ピエゾ圧電素子３２の伸縮は筐体３３を介してＣＦＢＧ３１に伝わり、パルス幅を変調する。

図９は、ＣＦＢＧ３１の機能を説明する模式図である。ＣＦＢＧ３１は、ファイバーの導波方向に屈折率を周期的に変化させた回折格子で構成されている。ＣＦＢＧ３１の回折格子のピッチは、チャープ状に、すなわち一方端から他方端へゆるやかに変化している。ＣＦＢＧ３１の回折格子においては、長波長側の光波が、短波長側の光波より、長い光路を往復するように回折格子のピッチが刻んである。パルス幅が広がった（パルス光の先頭は長波長、末尾は短波長）光波がＣＦＢＧ３１に入力され、このＣＦＢＧ３１を往復して出力されると、該光波のパルス幅は狭まり、パルス圧縮されることになる。

図１０は、ＣＦＢＧ３１の斜視図である。ＣＦＢＧ３１は、コア部３１ａと、クラッド部３１ｂとを備え、コア部３１ａ中には上述のように周期的に変化した回折格子３１ｃが形成されている。図１０に示すように、ＣＦＢＧ３１を長手方向に機械的に伸縮させることによりパルス圧縮を行うことができる。

図１１は、伸縮前後のＣＦＢＧ３１の特性変化を示す模式図である。試料深さを５ｍｍとすると、補正すべきパルス幅はδｔ＝０．１５ｐｓである。ここで波長幅はδλ＝１５ｎｍであり、補正前後で変わらないことが肝要である。波長幅δλのパルス光を反射する間隔をｄ、ファイバーコアの平均屈折率（＝１．５）をｎ、光速度をｃとすると、ベースとなる遅延時間δｔ_０とｄとの関係は、式（７）で表される。

ここで、ベース遅延時間δｔ_０＝１５ｐｓとすると、間隔ｄは式（８）で表される。

このときのピッチＰ_λは、波長λを用いて、式（９）で表される。

ここで、Ｍは干渉次数であり、実際には製作可能な次数となる。Ｍ＝１００とすると、波長λ=０．８２μｍのときのピッチＰ_{λ＝０．８２}、及び波長λ=０．８３５μｍのときのピッチＰ_{λ＝０．８３５}は、それぞれ式（１０）、（１１）で表される。

式（８）で示したように、間隔ｄ＝１５００μｍであるので、これを１％伸ばせば、パルス幅を１％変化させることができる。すなわち、ＣＦＢＧ３１を１％伸ばすことによって、ベース遅延時間δｔ_０＝１５ｐｓの１％、つまりパルス幅δｔ＝０．１５ｐｓの分、高速に補正可能である。

以上のように、ＣＦＢＧ３１を用いるパルス幅圧縮部９ｂは、ピエゾ圧電素子３２により高速にＣＦＢＧ３１を伸縮させるという簡単な作用で、パルス幅を高速に変えることができる。そのため、実質的に同一の場所及び時間で、多光子励起蛍光を検出して分子組成に関連するスペクトル情報を検出するとともに、屈折率界面での反射光強度変化から生体の構造境界形状に結びつく情報を得ることができる。

図１２は、別の例としてのパルス幅圧縮部９ｂの概略構成図である。図１２に示すように、パルス幅圧縮部９ｂは、円柱状のピエゾ圧電素子３５と、ピエゾ圧電素子３５の側面に沿って巻き付けられたＣＦＢＧ３１とを備える。ピエゾ圧電素子３５に信号処理部１５及び電圧発生器３４から電圧を印加することにより、ピエゾ圧電素子３５は半径方向に膨張し、それに伴ってＣＦＢＧ３１が長手方向に伸縮し、パルス幅を変調する。

図１３は、別の例としてのパルス幅圧縮部９ｂの概略構成図である。図１３に示すように、パルス幅圧縮部９ｂは、ＣＦＢＧ３１と、ＣＦＢＧ３１の側面を囲むように設けられた円筒状のピエゾ圧電素子５５とを備え、ＣＦＢＧ３１及びピエゾ圧電素子５５のそれぞれの両端は共通の筐体５６に固定されている。ピエゾ圧電素子５５に不図示の信号処理部及び電圧発生器から電圧を印加することにより、ピエゾ圧電素子５５は長手方向に伸縮し、ピエゾ圧電素子５５の伸縮は筐体５６を介してＣＦＢＧ３１に伝わり、パルス幅を変調する。

図１４は、ビーム走査制御部１１の概略構成図である。図１４を用いて、観察試料面とパルス走査方向を説明するとともに、光電変換部１３とその信号強度に基づいて第２パルス幅制御部９０を制御する方法について説明する。

ビーム走査制御部１１は、パルス光の光束を光束照射方向（Ｚ方向）に対し垂直面内（ＸＹ方向）に移動させる。ここではＸＹ方向を試料１２中の観察面に一致させ、その観察面に対し図１４に示すように座標軸Ｘ、Ｙを定義する。

ビーム走査制御部１１は、Ｘ方向スキャンミラー４２と、Ｙ方向スキャンミラー４１とを備える。ビーム走査制御部１１の入射側（種光部１０１側）には、第２パルス幅制御部９０と、入射側からのパルス光及び試料１２からの検出光を透過及び反射させる半透ミラー１９とが設けられている。第２パルス幅制御部９０は図１には図示されていないが、パルス幅制御部９とビーム走査制御部１１との間の任意の場所に設けられる。第２パルス幅制御部９０は、パルス幅制御部９と同様の構成を有しており、信号処理部１５からの信号に従って、通過するパルス光の時間幅を伸長及び圧縮することができる。Ｙ方向スキャンミラー４１及びＸ方向スキャンミラー４２は、不図示の駆動部によって信号処理部１５からの信号に従ってそれぞれ駆動可能であり、第２パルス幅制御部９０からのパルス光を試料１２中の観察面上でＸＹ方向に二次元に走査する。ここではパルス光を不図示の集光光学系１０により試料１２中に集光し、多光子励起光の光密度が所定の閾値以上になると非線形現象による発光が発生する。

その発光は、検出光としてＸ方向スキャンミラー４２及びＹ方向スキャンミラー４１を通って入射方向に戻り、半透ミラー１９により反射され、光電変換部１３に入力される。検出光の光強度信号は、光電変換部１３に導かれ電気信号に変換され、信号処理部１５に入力される。信号処理部１５は、この電気信号に基づいて、第２パルス幅制御部９０に接続された電圧発生器３４を通して、非線形現象による発光の強度が大きくなるように、第２パルス幅制御部９０をリアルタイムにフィードバック制御する。

このように第２パルス幅制御部９０を設けることによって、試料１２からリアルタイムに得られる情報に基づいて、非線形現象による発光の強度を最適化するように、パルス幅の圧縮を調整することができる。本実施形態ではパルス幅制御部９と第２パルス幅制御部９０とは別に設けられているが、パルス幅制御部９が第２パルス幅制御部９０の機能を有してもよい。

（第２の実施形態）
図１５は、本実施形態に係る検査装置としてのマルチモダリティ内視鏡２００の概略構成図である。マルチモダリティ内視鏡２００は、短パルス光の照射によって試料１２から発生する多光子励起発光と、非短パルス光の照射による反射光とを、照射に用いたものと同じ集光光学系１０で取り込む。これらの光を、略コリメートビームとし、２つの半透ミラー１９ａ、１９ｂを介して光電変換部１３及びスペクトル／光電変換部１６で電気信号として検出する構成を有する。

マルチモダリティ内視鏡２００の種光部１０１からパルス幅制御部９までの構成は、マルチモダリティ顕微鏡１００のものと同様である。

パルス幅制御部９の出力部からパルス光が出射される方向には、パルス幅制御部９からのパルス光及び試料１２から戻ってきた検出光を透過及び反射させる２つの半透ミラー１９ａ、１９ｂとが設けられる。パルス光が半透ミラー１９ａ、１９ｂを透過する方向には、パルス光を２次元（ＸＹ方向）に走査するビーム走査制御部１１と、ビーム走査制御部１１からのパルス光を試料１２上に集光する集光光学系１０とが設けられる。集光光学系１０を通るパルス光の光軸方向（Ｚ方向）に沿った集光位置は、フォーカス制御部１８によって移動可能である。フォーカス制御部１８は、信号処理部１５により制御される。

試料１２に近い方の半透ミラー１９ａは多光子励起発光の波長帯域を主に反射するように構成されており、試料１２から遠い方の半透ミラー１９ｂは反射光の波長帯域を主に反射するように構成されている。例えば、波長１μｍ程度のパルス光を用いる場合には、半透ミラー１９ａの反射波長帯域を５００ｎｍ近傍とし、半透ミラー１９ｂの反射波長帯域を１μｍ近傍とすればよい。

試料１２に近い方の半透ミラー１９ａにより試料１２から戻ってきた検出光が反射される方向には、バンドパスフィルタ１７ａと、試料１２を透過した多光子励起発光（非線形発光）の強度を検出するスペクトル／光電変換部１６とが設けられる。バンドパスフィルタ１７ａは、多光子励起の波長帯域を通過させて該波長帯域以外をフィルタリングする。スペクトル／光電変換部１６は、信号処理部１５に接続される。スペクトル／光電変換部１６と信号処理部１５との間には、微弱な検出光を電気的に増幅するロックインアンプが接続されてもよい。

試料１２から遠い方の半透ミラー１９ｂにより試料１２から戻ってきた検出光が反射される方向には、バンドパスフィルタ１７ｂと、試料１２の組織境界においてフレネル反射により反射された（線形な）反射光の強度を検出する光電変換部１３が設けられる。バンドパスフィルタ１７ｂは、フレネル反射の波長帯域を通過させて該波長帯域以外をフィルタリングする。光電変換部１３は、微弱な検出光を電気的に増幅するロックインアンプ１４を介して信号処理部１５に接続される。ロックインアンプ１４は省略されてもよい。

図１で示したマルチモダリティ顕微鏡１００では、試料１２の裏面側（照射面と反対の面）に多光子励起発光を測定するためのバンドパスフィルタ１７ａ及びスペクトル／光電変換部１６が配置されていた。それに対して、本実施形態に係るマルチモダリティ内視鏡２００の構成では、集光光学系１０によって多光子励起発光と反射光との両方を取り込み、半透ミラー１９ａ、１９ｂによりそれらを分離して検出する。そのため、測定に係る光学部材および機器を試料１２（例えば、生体）の裏面側に配置する必要がない。このような構成ではパルス光の照射のための集光光学系と検出光を取り込むための光学系とが共通化されているため、体内で測定を行うマルチモダリティ内視鏡の構成として有利である。また、これと同様の構成をマルチモダリティ顕微鏡として用いることも可能である。

図１６は、マルチモダリティ内視鏡２００における集光光学系１０及びフォーカス制御部１８の概略構成図である。マルチモダリティ内視鏡２００は、ファイバー５１を用いて照射及び検出のための光学系が構成されており、ファイバー５１を体内に入れることによって、体内での短パルス光および非短パルス光の照射、および多光子励起発光と反射光の測定が可能となる。マルチモダリティ内視鏡２００の少なくとも一部の光路を、ファイバーではなくファイバー以外の光導波路又は空間伝搬により構成してもよい。

ファイバー５１の先端にはパルス光及び試料１２から戻ってきた光を反射するためのミラー５２と、パルス光及び試料１２から戻ってきた光を集光するための集光光学系１０と、フォーカス制御部１８とが設けられる。フォーカス制御部１８は、集光光学系１０で集光される短パルス光および非短パルス光の焦点位置を制御する。フォーカス制御部１８は、互いに対向する２枚のウェッジ１８ｂ、１８ｃと、ウェッジ１８ｂ、１８ｃの少なくとも一方を駆動させるウェッジ駆動部１８ａとを備える。２枚のウェッジ１８ｂ、１８ｃはそれぞれ光束照射方向（Ｚ方向）に対して傾斜した斜面Ｐを有しており、ウェッジ１８ｂの斜面Ｐとウェッジ１８ｃの斜面Ｐとは平行になるように配置されている。２枚のウェッジ１８ｂ、１８ｃは、ウェッジ駆動部１８ａによって、光束照射方向（Ｚ方向）に対し垂直面内に沿ってスライドされる。ウェッジ１８ｂ、１８ｃをスライドさせることにより、ウェッジ１８ｂ、１８ｃの光束照射方向（Ｚ方向）に沿った厚みの合計が変化する。そのため、パルス光および非パルス光がウェッジ１８ｂ、１８ｃの内部を通過する距離が変化し、それらの光束照射方向（Ｚ方向）の焦点位置を変化させることができる。このような、ウェッジ１８ｂ、１８ｃを用いた焦点位置の制御は構成が簡単であることから、ファイバーを用いるマルチモダリティ内視鏡での使用に適している。また、これと同様の構成をマルチモダリティ顕微鏡に用いることも可能である。

本発明は、上述の実施形態に限定されることなく、本発明の趣旨を逸脱しない範囲において適宜変更可能である。本発明に係る検査装置の構成は、マルチモダリティ顕微鏡及びマルチモダリティ内視鏡だけでなく、任意の検査装置、測定装置又は撮像装置に用いることができる。

１００マルチモダリティ顕微鏡
１０１種光部（レーザ発振部）
２００マルチモダリティ内視鏡
５パルス幅伸長部
８利得媒体部
９パルス幅制御部
１０集光光学系
１１ビーム走査制御部
１２試料
１２ａステージ
１３光電変換部
１５信号処理部
１６スペクトル／光電変換部１８フォーカス制御部
９０第２パルス幅制御部

Claims

単一のレーザ発振部と、
前記レーザ発振部から出力された光の時間幅を変更するパルス幅制御部と、
前記光を被測定物に集光して照射する光学系と、
前記パルス幅制御部を用いて前記時間幅を変更することによって、前記被測定物の上の集光箇所からのフレネル反射光の強度と非線形発光の情報とを取得する信号処理部と、
を備えることを特徴とする検査装置。
前記パルス幅制御部は、前記時間幅を第１の時間幅及び第２の時間幅のいずれか一方に変更するように構成され、
前記信号処理部は、前記時間幅が前記第１の時間幅の場合に前記非線形発光の情報を検出し、前記時間幅が前記第２の時間幅の場合に前記フレネル反射光の強度を検出するように構成されている
ことを特徴とする請求項１に記載の検査装置。
前記第１の時間幅は１０ｐｓ以下であり、前記第２の時間幅は前記第１の時間幅より大きいことを特徴とする請求項２に記載の検査装置。
請求項１に記載の検査装置を備えることを特徴とする顕微鏡。
前記集光箇所を前記光の光軸方向及び前記光軸方向に対する垂直方向に移動させる制御部をさらに備えることを特徴とする請求項４に記載の顕微鏡。
請求項１に記載の検査装置を備えることを特徴とする内視鏡。
前記集光箇所を前記光の光軸方向に移動させる制御部をさらに備えることを特徴とする請求項６に記載の内視鏡。